Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung indol hướng ức chế enzym histon deacetylase

Thử tác dụng ức chế HDAC2 và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được .... Nhóm chất này có cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp và hoạt tính ức chế HDAC mạnh, trong đó A

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

MANG KHUNG INDOL HƯỚNG ỨC CHẾ

ENZYM HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

MANG KHUNG INDOL HƯỚNG ỨC CHẾ

ENZYM HISTON DEACETYLASE

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình

và nhiều giúp đỡ quý báu của các thày cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè

Từ tận đáy lòng mình, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu sắc

tới GS.TS Nguyễn Hải Nam và ThS Trần Thị Lan Hương, những người thầy đã

chỉ dẫn tôi tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em làm việc và thực hiện đề tài tại bộ

môn Hóa dược, đặc biệt là em Lê Văn Cường và em Dương Tiến Anh đã ủng hộ

và giúp đỡ tôi rất nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi cũng nhận được sự phối hợp và giúp đỡ từ các cán bộ làm việc tại Khoa Hóa – trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên, Viện hóa học Việt Nam, Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, cùng toàn thể các thầy cô trong các phòng, ban, thư viện Tôi xin chân thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bè bạn – những người luôn sát cánh, động viên và khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập

Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2017

Học viên

Phạm Thu Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 3

1.1.1 Cấu trúc nhiễm sắc thể và histon 3

1.1.2 Khái niệm về Histon Deacetylase 3

1.1.3 Phân loại HDAC 4

1.1.4 Cấu trúc của HDAC 5

1.1.5 Mối quan hệ giữa HDAC và ung thư 6

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDIs) 8

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC 8

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các HDIs 9

1.2.3 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 10

1.3 MỘT SỐ THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG INDOL TRÊN THẾ GIỚI 12

1.3.1 Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC 12

1.3.2 Một số thiết kế nghiên cứu và tổng hợp acid hydroxamic mang khung indol trên thế giới 12

1.4 CÁC PHẢN ỨNG DÙNG TRONG TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG INDOL 20

1.4.1 Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử 20

1.4.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 21

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 22

2.1.1 Hóa chất 22

2.2.1 Tổng hợp hóa học 23

2.2.2 Thử tác dụng ức chế HDAC2 và hoạt tính gây độc tế bào ung thư

của các dẫn chất tổng hợp được 23

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.3.1 Tổng hợp hóa học 24

2.3.2 Thử tác dụng sinh học 25

2.3.3 Đánh giá mối liên quan cấu trúc tác dụng và đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được 27

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 HÓA HỌC 28

3.1.1 Tổng hợp hóa học 28

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 38

3.1.3 Khẳng định cấu trúc 39

3.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC 46

3.2.1 Tác dụng ức chế HDAC 46

3.2.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 47

3.3 SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC 48

Chương 4 BÀN LUẬN 50

4.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 50

4.2 KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 51

4.2.1 Phổ hồng ngoại (IR) 51

4.2.2 Phổ khối (MS) 53

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1 H-NMR, 13C-NMR) 53

4.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC 57

4.3.1 Tác dụng ức chế HDAC2 57

4.3.2 Tác dụng thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AsPC-1 : Tế bào ung thư tuyến tụy

DMSO : Dimethyl sulfoxide

FBS : Huyết thanh thai bò

1

H – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H HAT : Histon acetyltranferase

H1299 : Tế bào ung thư phổi

HCT116 : Tế bào ung thư đại tràng

HDAC : Histon deacetylase

HDI, HDIs : Histon deacetylase Inhibitor(s)

Hep G2 : Tế bào ung thư gan

HT1080 : Tế bào u sợi

IR : Phổ hồng ngoại

K562 : Tế bào ung thư máu

Lovo : Tế bào ung thư đại tràng

MCF-7 : Tế bào ung thư vú

MDA435 : Tế bào ung thư biểu mô tuyến vú

MS : Phổ khối lượng

PC-3 : Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến PLZF : Promyelocytic leukemia zinc finger PML : Promyelocytic leukemia gene

RAR : Retinoid acid receptor

SAHA : Acid suberoylanilid

SW620 : Tế bào ung thƣ đại tràng

TSA : Trichostatin A

TCA : Tricloroacetic

U266 : Tế bào đa u tủy

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại các chất ức chế HDAC 8

Bảng 1.2: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và kháng tế bào ung thƣ in vitro của N-hydroxycinnamamid có vòng indol 13

Bảng 1.3: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của N-hydroxybenzamid có vòng indol 14

Bảng 1.4: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và kháng tế bào ung thƣ in vitro của dẫn chất 3 16

Bảng 1.5: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC

của các acid hydroxamic amid 17

Bảng 1.6: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và khả năng ức chế tế bào ung thƣ của các acid hydroxamic amid mang khung indol 18

Bảng 1.7: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và khả năng ức chế tế bào 19

Bảng 3.1: Giá trị Rf của các chất IIIa-c, Va-c và VIIa-c 39

Bảng 3.2: Số liệu phân tích phổ IR của IIIa-c, Va-c và VIIa-c 40

Bảng 3.3: Số liệu phân tích phổ khối lƣợng của các chất IIIa-c, Va-c và VIIa-c 41

Bảng 3.4: Số liệu phân tích phổ 1 H-NMR 42

Bảng 3.5: Số liệu phân tích phổ 13 C-NMR 45

Bảng 3.6: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IIIa-c, Va-c và VIIa-c 47

Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ in vitro của các chất IIIa-c, Va-c và VIIa-c 48

Bảng 3.8 Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất IIIa-c, Va-c

và VIIa-ctheo quy tắc Lipinsky 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: HAT và HDAC điều hòa quá trình phiên mã 4

Hình 1.2: Phân loại HDAC ở người 5

Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong hoạt động tế bào ung thư 7

Hình 1.4: Các chất ức chế HDAC điều hòa sự phát triển tế bào theo 3 cơ chế 10

Hình 1.5: Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 11

Hình 1.6: Cấu trúc của một số chất ức chế HDAC đang được sử dụng

và thử nghiệm trên lâm sàng 11

Hình 1.7: Cấu trúc của Panobinostat 20

Hình 4.1: Phổ hồng ngoại của dẫn chất IIIa 52

Hình 4.2: Phổ khối lượng của dẫn chất IIIb 53

Hình 4.3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H-NMR của dẫn chất IIIc 56

Hình 4.4: Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất VIIa-c với SAHA 57

Hình 4.5 : Biểu đồ so sánh hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất Vb-c và VIIa-c với SAHA trên 4 dòng tế bào thử nghiệm 60

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân SN2 20

Sơ đồ 2.1: Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung indol 24

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất IIIa 28

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất IIa 28

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất IIIa 29

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất IIIb 31

Sơ đồ 3.5: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất IIIc 32

Sơ đồ 3.6: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Va 33

Sơ đồ 3.7: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vb 34

Sơ đồ 3.8: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vc 35

Sơ đồ 3.9: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất VIIa 36

Sơ đồ 3.10: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất VIIb 37

Sơ đồ 3.11: Sơ đồ tổng hợp chất VIIc 38

Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân alkyl tạo IIa-c, IVa-c và VIa-c 50

Sơ đồ 4.2: Cơ chế phản ứng tạo thành IIIa-c, Va-c và VIIa-c 51

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đang trở thành một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn cầu cũng như tại châu Á và Việt Nam Theo thống kê của Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới IARC, trong năm 2012, có khoảng 14 triệu trường hợp ung thư được phát hiện mới và có đến 8,2 triệu ca tử vong liên quan đến ung thư Dự tính từ nay đến năm 2030, mỗi năm sẽ có thêm 22 triệu trường hợp mới mắc bệnh

và 13 triệu người tử vong vì căn bệnh nan y này [42]

Để giảm thiểu tỉ lệ tử vong do ung thư thì việc nghiên cứu thuốc chống ung thư có vai trò quan trọng hàng đầu

Trong những năm gần đây, nhóm các chất ức chế HDAC đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu để tìm ra các chất có tiềm năng trở thành các thuốc mới có tác dụng điều trị ung thư

Một trong các nhóm ức chế HDAC được tập trung nghiên cứu hiện nay

là các dẫn chất acid hydroxamic Nhóm chất này có cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp và hoạt tính ức chế HDAC mạnh, trong đó Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) (Vorinostat, Zolinza®) là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da [49]

Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế, tổng hợp, thử tác dụng sinh học của các acid hydroxamic mới với sự thay đổi nhóm khóa hoạt động và cầu nối dựa trên khung của SAHA Các nghiên cứu này sử dụng các dị vòng thay thế như vòng benzothiazol, 5-aryl-1,3,4-thiadiazol, 2-oxoindolin và đã thu được những kết quả rất đáng lưu ý Các hợp chất tổng hợp được thể hiện rất mạnh hoạt tính ức chế HDAC so với SAHA, đồng thời một số chất trong các dãy nghiên cứu cũng cho tác dụng tốt trên một số dòng tế bào ung thư thử nghiệm [32,33,34] Dựa vào các kết quả khả quan đó, chúng tôi tiếp tục mở rộng nghiên cứu về các acid hydroxamic mới, trong đó sử dụng dị vòng indol với vai trò là một

nhóm khóa hoạt động Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung indol hướng ức chế ezym histon deacetylase”

với 2 mục tiêu chính:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung indol

2 Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase và tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư người

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

1.1.1 Cấu trúc nhiễm sắc thể và histon

Nhiễm sắc thể là một phức hợp đại phân tử protein-ADN được tổ chức cao,

có cấu trúc động, bao gồm ADN, các protein histon và protein không phải histon Histon là các protein cơ bản giàu acid amin như lysin, arginin, được chia thành

5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4) Từng cặp của H2A, H2B và H3, H4 cùng nhau tạo nên lõi protein octomer hình đĩa Lõi protein này được quấn quanh bởi

146 cặp ADN tạo nên nucleosom (hình 1.1) Các nucleosom nối với nhau nhờ phần amino tận của các histon Bốn cặp histon lõi có 2 phần quan trọng: phần đuôi

C nằm bên trong lõi của nucleosome và phần đầu N với acid amin kết thúc là lysine nằm bên ngoài nucleosome [30] Đầu amin này mang nhiều điện tích dương nên tương tác mạnh với phần phosphate mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosome và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể

Việc tích điện dương của chiston mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon Ở dạng deacetyl hóa, histon tích điện dương lớn, tương tác điện tích với ADN mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch mã và tổng hợp protein, ức chế biểu hiện gen Ngược lại, khi bị acetyl hóa, điện tích dương bị trung hòa, nhiễm sắc thể được tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra và đặc tính của gen được biều hiện Trong tế bào, quá trình acetyl hóa này được điều hòa bởi 2 enzym: histon acetyltransferase (HAT) và

histon deacetylase (HDAC) [1,22,40,43]

1.1.2 Khái niệm về Histon Deacetylase

Histon Deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl từ ε-N-acetyl lysine amino acid của histon HDAC có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase (HAT) - enzyme xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzyme A đến ε-amino của lysine ở đầu N của histon [47]

Hình 1.1: HAT và HDAC điều hòa quá trình phiên mã [22]

* Chú thích: HAT: histon acetyltransferase; HDAC: histon deacetylase; Ac: acetyl

1.1.3 Phân loại HDAC

Các 18 HDAC ở người được chia thành 4 nhóm dựa trên sự tương đồng cấu

trúc của chúng lần lượt với Rpd3, Hdal và Sir2 trong nấm men [16, 37]:

ở đáy của túi Những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+

như các acid hydroxamic Ngược lại, những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất này vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+

như một cofactor cơ bản [37]

Hình 1.2: Phân loại HDAC ở người [11]

* Chú thích: Hình chữ nhật màu xanh dương là vùng xúc tác được bảo tồn của HDAC; N: nhân; C: bào tương; Mit: ty thể; Ac: acetyl hóa; P: phosphoryl hóa; S: sumoyl hóa; Ub: ubiquitin hóa N.D: chưa xác định

1.1.4 Cấu trúc của HDAC

Việc xác định cấu trúc của HDAC là rất cần thiết kế công thức cho các chất

ức chế HDAC Về cơ bản, cấu trúc của các HDAC khá giống nhau đều có trung tâm hoạt động gồm 2 phần chính: ion Zn2+, kênh enzym dạng túi hình ống

- Ion Zn2+ là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng Đây là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với đuôi histon bằng liên kết phối trí Thông thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+

thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [21,26,49]

- Kênh enzym là nơi chứa đựng cơ chất và tạo nhiều liên kết Van der Waals với cơ chất Kênh có dạng túi hình ống hẹp, được cấu tạo từ các acid amin thân dầu: Phe, Tyr, Pro, His Cấu trúc túi rất linh động, có thể biến đổi để phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau Trên miệng túi có 1 vành nhỏ được tạo nên từ 1 vài vòng xoắn protein (phần vành sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC) Đối với các hợp chất acid hydroxamic chiều dài của kênh này là tối ưu với khoảng

5-6 liên kết carbon [21,26,40]

1.1.5 Mối quan hệ giữa HDAC và ung thư

HAT acetyl hóa histon làm trung hòa cực dương trên lysin và giúp tháo xoắn cấu trúc của nucleosom, do đó giúp cho các nhân tố sao mã dễ dàng tiếp cận ADN Ngược lại, các HDAC xúc tác loại bỏ nhóm acetyl từ histon và protein không phải histon, làm tăng sự tích điện dương trên đầu N của histon và đóng xoắn nhiễm sắc thể, kết quả là ức chế quá trình phiên mã do ngăn cản các nhân tố sao mã tiến đến đích của chúng trên ADN Như vậy, sự acetyl hóa và deacetyl hóa nhiễm sắc thể đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen Việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có thể dẫn đến những bất thường biểu hiện gen và do đó dẫn đến ung thư [11,22,23,27,30]

Hoạt động của HAT liên quan đến sự di chuyển, xâm lấn, sự biểu thị quá mức hoặc sự đột biến trong rất nhiều loại ung thư kể cả ung thư máu và ung thư biểu mô Hai HAT bị biến đổi rõ nhất trong một số bệnh ung thư do đột biến hoặc

di chuyển là p300 và CBP [14,35]

Trong khi đó, sự huy động bất thường của các HDAC vào chuỗi điều hòa của gen đích có thể xảy ra thông qua tương tác biến đổi của chúng với việc tăng cường vai trò của các protein gắn kết ADN gây ung thư Ví dụ như receptor αRAR gắn kết gen PML (promyelocytic leukemia gene) hoặc PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger) trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp Trong điều kiện sinh

lý, αRAR là nhân tố sao mã hoạt hóa acid retinoic giúp giải phóng phức hợp đồng ức chế chứa HDAC và làm gia tăng các chất đồng hoạt hóa sao mã (bao gồm cả HAT) Điều này dẫn đến sự acetyl hóa histon và ức chế gen đẩy mạnh sự biệt hóa tế bào Trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp, protein gắn kết αRAR/PML hoặc αRAR/PLZF giữ HDAC và phối hợp với phức hợp đồng ức chế Do đó tăng methyl transferase histon và ADN, dẫn đến ngăn cản sự phiên

mã [11,13,22] Do vậy, tế bào ung thư không trải qua giai đoạn biệt hóa và phát triển quá mức Biểu thị quá mức HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6 còn

gặp trong một số bệnh ung thư tạng đặc như ung thư tiền liệt tuyến, ung thư

dạ dày, trực tràng, ung thư vú và ung thư não [17,38,41] cũng như trong các bệnh lý ác tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T ngoại vi, bệnh u lympho tế bào B và bệnh u lympho da tế bào T) [31] Tóm lại, các biến đổi sau phiên mã của HDAC có thể làm thay đổi tương tác của chúng với phức hợp đồng ức chế mà các phức hợp này liên quan đến quá trình phiên mã của các gen gây ung thư

Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình, kể cả sự di chuyển,

sự xâm lấn và sự tạo mạch Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thư được tóm tắt ở hình 1.1 [7,12,15,36]

Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong hoạt động tế bào ung thư

Có thể thấy rằng việc ức chế phiên mã bị ảnh hưởng bởi sự gia tăng hoạt động của HDAC và có thể kiểm soát ung thư bằng cách ức chế HDAC Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã và đang được triển khai nhằm tìm kiếm các chất

ức chế HDAC - một mục tiêu phân tử rất hấp dẫn trong điều trị ung thư

8

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDIs)

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC đang đƣợc nghiên cứu rộng rãi, cho đến nay, chúng

đƣợc biết đến với bốn nhóm chính sau: [2]

- Các benzamid: MS-275, CI-994

- Các tetrapeptid vòng: trapoxin, apicidin và depsipeptid

- Các acid béo chuỗi ngắn: 4-phenylbutyrat, acid valproic

- Các acid hydroxamic: SAHA, pyroxamid, TSA, oxamflatin và các CHAP

(acid hydroxamic mang peptid vòng)

Bảng 1.1: Phân loại các chất ức chế HDAC

O

N OH

O HOHN

H3C

CH3

O NH O

CH3

CH3O

HN

O

S S

Acipidin

Mỗi nhóm có những hạn chế riêng: các acid hydroxamic là những chất bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC; các benzamid và các acid béo có hiệu lực hạn chế, trong khi các peptid vòng gây ra sự chảy máu khó chữa [20]

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các HDIs

Các chất ức chế HDAC tác động lên tế bào ung thư theo ba cơ chế chủ yếu:

[2]

- Các chất ức chế HDAC tác động lên những tế bào bình thường và tế bào

ung thư với cùng mức độ gây ra G2 checkpoint (vị trí mà tại đó chu trình tế bào tạm thời dừng lại, chờ đến khi các điều kiện trở nên phù hợp thì chu trình lại tiếp tuc) Những tế bào bình thường trải qua G2 checkpoint và tiếp tục phát triển, trong khi đó những tế bào ung thư tái tạo ADN tạo thành dạng 4nADN và chuyển sang

giai đoạn gây chết tế bào theo chương trình

- Các chất ức chế HDAC tác động lên các tế bào ung thư gây ra sự ngừng tế

bào ở pha G1, kết quả là gây ra sự biệt hóa tế bào ung thư

- Các chất ức chế HDAC tác động lên các tế bào ung thư làm tăng tính sinh

miễn dịch của tế bào ung thư và ức chế sự tạo mạch

Hình 1.4: Các chất ức chế HDAC điều hòa sự phát triển tế bào theo 3 cơ chế

Như vậy, các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thư do tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung thư của HDIs là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào Ngoài tác dụng trực tiếp lên sự phát triển và sống sót của tế bào ung thư, các chất ức chế HDAC còn tác dụng gián tiếp đến sự phát triển khối u Các chất ức chế HDAC

có thể hoạt hóa phức hợp hòa hợp mô (MHC) nhóm I và II liên quan đến phiên mã, những phân tử đồng kích thích CD40, CD80 và CD86, phân tử gắn vào khoảng gian bào ICAM1, và các interferon loại I và II, nhằm làm tăng sự nhận dạng và

hoạt hóa của các tế bào miễn dịch (hình 1.4) [22]

1.2.3 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Các HDIs được chia thành nhiều nhóm khác nhau nhưng có một số đặc điểm chung về mặt cấu trúc, bao gồm 3 phần chính [2,5,9,28]:

- Nhóm gắn với ion Zn2+ (A - Zinc Binding Group, ZBG): như acid hydroxamic, thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, α-cetoester, ceton thân dầu

quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của HDIs

- Vùng cầu nối sơ nước (B): thường là mạch hydrocarbon thân dầu có thể tạo nhiều liên kết Van der Waals với kênh enzym

- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (C):

thường là các aryl hoặc 1 số vòng khác, ằm trên bề mặt enzym

Hình 1.5: Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC liên kết với 1 số chất ức chế HDAC cho thấy phần A, B và 1 phần của C nằm trong túi enzym, làm đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym Phần còn lại của C tương tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym Nhóm nhận diện bề mặt C có thể liên kết với phần cầu nối thông qua 1 số liên kết peptid, làm tăng khả năng phân cực và góp phần cải thiện dược động học cho HDIs Việc nghiên cứu thiết kế công thức cho các HDIs mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này

Hình 1.6: Cấu trúc của một số chất ức chế HDAC đang được sử dụng và thử

nghiệm trên lâm sàng [18]

1.3 MỘT SỐ THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG INDOL TRÊN THẾ GIỚI

1.3.1 Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC

Acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC được nghiên cứu rộng rãi nhất, với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol.Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl- acid hydroxamic đã được biết đến nhiều (ví dụ

SAHA) Cấu trúc của nhóm chất này gồm 3 phần chính như sau [29]:

- Nhóm khóa hoạt động liên quan đến tính đặc hiệu và hiệu lực ức chế

enzyme HDAC, thường là các aryl, các nghiên cứu về các chất tổng hợp được cho

thấy kích thước vòng nhân thơm lớn sẽ cho tác dụng tốt hơn vòng nhỏ

- Cầu nối sơ nước: liên quan đến khả năng ức chế enzym, quyết định sự phù

hợp về cấu trúc của các chất với chiều dài của kênh enzyme Phần này thường có cấu trúc amid-alkyl, là các hydrocarbon mạch hở hoặc các vòng thơm có kích thước nhỏ Trong cầu nối liên kết amid là quan trọng nhưng không phải là then chốt, độ

dài mạch carbon tối ưu là 5 - 6C

- Nhóm gắn kết với Zn2+: acid hydroxamic, là phần không thể thiếu để có tác

Trong khi đó dị vòng indol giữ vai trò quan trọng không chỉ trong hóa học hữu cơ mà còn cả trong hóa dược Indol là một trong những đơn vị cấu trúc quan

trọng được tìm thấy trong một loạt các phân tử có hoạt tính sinh học có tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, chống trầm cảm, chống hen, chống HIV và chống ung thư [6] Trong những năm gần đây, indol dần trở thành một thành phần cấu trúc quan trọng trong thiết kế các chất mới và các chất này cũng thể hiện hoạt tính chống ung thư khi tương tác với các đích tác dụng khác nhau [44] Một số thuốc có chứa khung indol trong phân tử bao gồm vincristin, vinblastin, perindopril, pindolol Sau đây là một số nghiên cứu trên thế giới về thay đổi cấu trúc của các acid hydroxamic trong đó sử dụng vòng indol với vai trò như một nhóm khóa hoạt động Yingjie Zhang và các cộng sự thuộc trường đại học Shangdong đã thiết kế

và tổng hợp các N-hydroxycinnamamid chứa nhóm khóa hoạt động indol Kết quả

cho thấy chất 1c, 1g, 1h, 1j và 1k thể hiện khả năng ức chế HDAC và hoạt tính

gây độc tế bào mạnh hơn hoặc tương đương với SAHA đặc biệt trên dòng tế bào

U937 Riêng hợp chất 1a tuy khả năng ức chế HDAC khiêm tốn hơn nhiều so với

SAHA (kém hơn 5 lần) nhưng lại thể hiện hoạt tính gây độc tế bào vượt trội hơn các hợp chất còn lại trong dãy và SAHA Điều này đã được giải thích là do hợp

chất 1a có khả năng thấm tốt vào tế bào nên mặc dù khả năng ức chế HDAC kém

hơn SAHA nhưng hoạt tính độc tế bào lại mạnh hơn [44]

Bảng 1.2: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư

in vitro của N-hydroxycinnamamid có vòng indol

Chất

R

HDAC

IC 50 (μM)

U937

IC 50 (μM)

HDAC

IC 50 (μM)

U937

IC 50 (μM) 1a 1,08 1,8 1h 0,18 2,2

khả quan Trong dãy chất tổng hợp được, chất 2r và 2l có hoạt tính kháng ung thư in vitro tương đương hoặc tốt hơn SAHA, đặc biệt là dẫn chất 2r [24]

Bảng 1.3: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

của N-hydroxybenzamid có vòng indol

Chất R IC 50 (μM)

U937 U266 HCT116 PC3 2r 1,09 1,01 1,45 0,47

2l 3,43 3,76 2,27 3,34

Cùng mục tiêu tìm ra cầu nối và nhóm khóa hoạt động thích hợp, các nhà khoa học thuộc viện dược phẩm và hiệp hội hóa học Trung Quốc đã nhận thấy trong những năm gần đây, rất nhiều các hợp chất được tổng hợp mang vòng indol có hoạt tính chống tăng sinh đối với các tế bào ung thư Ngoài ra, một số chất ức chế HDAC chứa vòng indol có vai trò như một nhóm khóa hoạt động cũng cho thấy tiềm năng trong điều trị ung thư Đồng thời, sự có mặt của vòng triazol làm tăng sự tương tác của hợp chất với HDAC Từ những ý tưởng đó, các dẫn chất acid hydroxamic có vòng indol được nối với N-hydroxyarylamid bằng vòng triazol được

thiết kế và tổng hợp Đánh giá in vitro hoạt tính sinh học, hầu hết các hợp chất tổng

hợp đều cho thấy tác dụng chống ung thư đầy hứa hẹn Trong đó dẫn chất 3 có hoạt

tính ức chế HDAC và chống tăng sinh tế bào ung thư mạnh hơn so với SAHA Dẫn chất này thể hiện chống tăng sinh tế bào ung thư mạnh với giá trị IC50 từ 3,57-6,21 mmol/L đối với mỗi thử nghiệm tế bào ung thư, trong khi giá trị này ở SAHA là 4,95-7,11 mmol/L Ngoài ra, kết quả còn cho thấy khi có mặt nhóm thế 5-OCH3trên vòng indol sẽ làm tăng hoạt tính ức chế tế bào ung thư Tiếp tục, hầu hết các dẫn chất tổng hợp được đánh giá invitro hoạt tính ức chế HDAC1, HDAC6 và HDAC8 đều đem lại kết quả rất khả quan, đặc biệt là tác dụng đối với HDAC1

Trong đó dẫn chất 3 có IC50 /HDAC1 là 0,078 mmol/L, nhỏ hơn 4 và 5 lần so với

IC50/ HDAC6 và HDAC8 tương ứng, điều này không thấy ở hợp chất SAHA Ngoài ra khi phân tích mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng chống khối u ở các dẫn chất, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sự thay đổi chiều dài của mạch carbon nối

giữa vòng triazol và indol cũng ảnh hưởng tới hoạt tính chống ung thư in vitro của

các dẫn chất Các hợp chất với n=1 cho thấy hoạt tính chống ung thư tương đối mạnh hơn so với hợp chất có n=2 Điều này có thể do với n=1 hợp chất có thể có kích cỡ phù hợp với phần cấu trúc túi của phân tử HDAC Từ kết quả trên cho thấy rằng bên cạnh vai trò của N-hydroxyarylamin, vòng indol thì vòng triazol cũng có những đóng góp nhất định vào hoạt tính chống ung thư của hợp chất [25]

Bảng 1.4: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư

hydroxamic amid mang các loại vòng khác nhau ở vị trí nhóm khóa hoạt động

Bảng 1.5: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC

của các acid hydroxamic amid

vòng pyridin Ngoài ra, vòng indol có thể đƣợc thay thế bởi vòng benzofuran mặc

dù hợp chất chứa vòng này có hoạt tính kém hơn 2 lần so với hợp chất mang vòng indol

Từ kết quả khả quan này, các tác giả tiếp tục khảo sát một loạt các acid hydroxamic amid mang vòng indol có các nhóm thế khác nhau ở vị trí khác nhau

Kết quả cho thấy ngoài các hợp chất 5h và 5i thì các hợp chất còn lại đều thể hiện

khả năng ức chế HDAC mạnh hơn so với hợp chất 4c ban đầu không có nhóm thế, đặc biệt là các chất 5a (4-OCH3), 5d (5-Br) và 5g (4-OCH3, 6-OCH3) hoạt tính tăng gấp 4 lần Khi thử hoạt tính chống tăng sinh tế bào ung thƣ trên dòng tế bào HT1080 và MDA435, tất cả các chất đều có tác dụng mạnh hơn so với SAHA,

trong đó các chất 4c, 5a và 5e cho hoạt tính vƣợt trội gấp hơn 10 lần so với SAHA

[48]

Bảng 1.6: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và khả năng ức chế tế

bào ung thư của các acid hydroxamic amid mang khung indol

Trên con đường tìm ra các thuốc mới hiệu quả để điều trị ung thư, các nhà khoa học thuộc viện nghiên cứu của Novartis cũng đã tìm kiếm, thiết kế, tổng hợp

và thử hoạt tính sinh học của các acid hydroxamic mới Trong đó phải kể đến dacinostat (LAQ824), một acid hydroxamic mang khung indol và hợp chất này đã thể hiện khả năng ức chế HDAC cũng như hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư rất tốt ở nồng độ nanomol Năm 2002, dacinostat được tiến hành thử nghiệm lâm sàng phase I, tuy nhiên các thử nghiệm này đã dừng lại vào năm 2005 [45] Nhận thấy tiềm năng phát triển việc tìm kiếm các chất ức chế HDAC mới từ dacinostat, các nhà khoa học lại tiếp tục nghiên cứu, thay đổi một vài nhóm cấu trúc trên phân tử này và đã tìm thấy các acid hydroxamic mang nhóm 3-piperidin-3-

ylindol cho tác dụng tốt, đặc biệt dẫn chất 6 cho hoạt tính ức chế HDAC và khả

năng gây độc tế bào vượt trội so với dacinostat [46]

Bảng 1.7: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và khả năng ức chế tế bào

ung thư của các acid hydroxamic amid mang khung nhóm 3-piperidin-3-ylindol

6 7,5 ± 0,7 0,8 ± 0,3 5,4 ± 0,3

Bên cạnh đó năm 2015, panobinostat (LBH-589), một acid hydroxamic mang khung indol đã được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa kỳ (FDA)

cho phép được đưa vào sử dụng trên lâm sàng để điều trị bệnh đa u tủy với tên thương mại là Farydak® sau khi trải qua đầy đủ các phase thử nghiêm trên lâm sàng [10]

Hình 1.7: Cấu trúc của Panobinostat

Các nghiên cứu và thành công trên cho thấy hướng thiết kế HDIs có vòng indol trong vai trò một nhóm khóa hoạt động mang lại nhiều hợp chất mới có triển vọng trong nghiên cứu các chất có tác dụng kháng tế bào ung thư, đây chính là định hướng thực hiện đề tài này

1.4 CÁC PHẢN ỨNG DÙNG TRONG TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG INDOL

1.4.1 Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử

Đây là phương pháp tổng hợp các dẫn chất ở vị trí 1 (nhóm NH) trên vòng indol bằng cách cho indol tác dụng với các dẫn chất halogen R-X trong môi trường kiềm Phản ứng N-alkyl hóa indol xảy ra theo cơ chế SN2 Cơ chế của phản ứng SN2 diễn ra như sau:

Sơ đồ 1.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân S N 2

Phản ứng được tiến hành với xúc tác là kali carbonat, dung môi DMF, bởi phản ứng cho hiệu suất cao, cách tiến hành và quá trình tinh chế đơn giản

Trạng thái chuyển tiếp

1.4.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester

Acid hydroxamic là sản phẩm của phản ứng giữa dẫn chất của acid carboxylic

và hydroxylamin Dẫn chất của acid carboxylic có thể là ester, acid clorid, anhydrid… Cho đến nay, nhiều phương pháp tổng hợp acid hydroxamic sử dụng các xúc tác khác nhau đã được công bố Tuy nhiên sau khi tham khảo tài liệu cũng như dựa trên điều kiện hóa chất, dung môi phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester Tùy thuộc vào bản chất của chất tham gia phản ứng, điều kiện phản ứng và dung môi có thể thay đổi cho phù hợp Trong nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic có cầu nối chứa vòng triazol, Chen và cộng sự [9] tiến hành tổng hợp acid hydroxamic từ dẫn chất methyl ester với dung dịch hydroxylamin trong hỗn hợp KCN:THF (1:1) ở nhiệt độ phòng, hiệu suất phản ứng cũng rất cao (>80%)

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp được đặt mua từ các nhà cung cấp trong nước hoặc nước ngoài (Merck, Sigma-Aldrich) Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm Bao gồm:

Các hóa chất và dung môi khác: N,N-dimethylformamid (DMF),

dicloromethan (DCM), methanol, aceton, NaOH, HCl, FeCl3, KI, nước cất, silica gel dùng cho sắc ký cột pha thường (Merch Kielselgel 60, cỡ hạt 0,06 – 0,2 mm)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

 Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, ống đong, sinh hàn hồi lưu, pipet, phễu thủy tinh, cốc có mỏ các loại, bình chạy sắc ký lớp mỏng, bản mỏng silicagel GF254 (Merck)

 Cân phân tích, cân kỹ thuật, tủ lạnh

 Máy cất quay chân không, máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

 Máy đo phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Agilent 660 FTIR tại bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội

 Máy đo phổ khối lượng (MS) được ghi trên máy LTQ Orbitrap XLTM

,

Khoa hóa - trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, máy MSD-Trap-SL và máy FT-ICR-MS, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

LC- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

H - NMR) và carbon (13C - NMR) Bruker AV-500 MHz, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tổng hợp hóa học

2.3.1.1 Tổng hợp

- Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất Tổng hợp 9 dẫn chất theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất

acid hydroxamic mang khung indol

Tác nhân và điều kiện: i)Br-CH 2 -(CH 2 ) n - CH 2 -COOCH 3 (n=2,3,4), NaH, KI, DMF,

24giờ; ii) NH 2 OH HCl, NaOH, MeOH, -5 o C, 30-60 phút

- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM (xác định thời điểm kết thúc phản ứng, kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau tinh chế)

Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế

Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm của từng chất Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp

Để bản mỏng trong bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng, cho

dung môi chạy khoảng 8 cm

Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

2.3.1.3 Xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được

Các dẫn chất sau khi tổng hợp được khẳng định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H-NMR và 13C-NMR

- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược

Hà Nội trên máy Agilent 660 FTIR với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600

cm-1 Các mẫu được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy LTQ Orbitrap XLTM, Khoa hóa - trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, máy LC-MSD-Trap-

SL và máy FT-ICR-MS, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMR được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam, dung môi DMSO-d6 Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng

đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội trimethylsilan (TMS)

2.3.2 Thử tác dụng sinh học

2.3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC

Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Enzym HDAC2 được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) và sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience) Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit thử nghiệm Tóm tắt các bước như sau:

- Bước 1: Enzym HDAC2 được ủ với KBH-A42 ở nhiều nồng độ khác nhau

ở 37oC trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang

- Bước 2: Thêm HDAC assay developer vào mỗi lô Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

- Bước 3: Đọc kết quả độ hấp thụ trên máy đo hấp thụ huỳnh quang tại bước sóng kích thích 350-360 nm và bước sóng phát quang 440-460 nm

Kết quả được ghi lại và giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)

* Nguyên tắc thử

Dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượng protein, từ đó suy ra số lượng tế bào Phương pháp có độ nhạy, độ tuyến tính cao, điểm kết thúc

ổn định và không yêu cầu độ chính xác về thời gian, giá thành thấp Nhược điểm của phương pháp nằm ở bước thêm TCA (tricloroacetic) để cố định tế bào Nếu TCA không được thêm vào từ từ, nhẹ nhàng, nó có thể làm vỡ tế bào trước khi tế bào được cố định, làm giải phóng các thành phần có thể làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng

* Các bước tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị tế bào (đĩa A)

Các tế bào ở pha logarit được trypsin hoá và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM hoặc RPMI được bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ 5.104

tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng

180 μl Các đĩa sau đó được ủ ở 370C trong điều kiện 5% CO2 Sau 24h ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 μl môi trường DMEM/RPMI bổ sung 5% FBS từ dung

dịch gốc trong DMSO rồi được thêm vào các đĩa ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48h Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là nhỏ hơn 0,1%

Bước 2: Tiến hành thử

Các tế bào được cố định bằng những lớp mỏng 50 μl dung dịch TCA 50% lạnh lên trên môi trường nuôi cấy trong mỗi đĩa và được ủ ở 40C trong 1h rồi sau đó rửa 5 lần với nước máy Các đĩa được để khô trong không khí và được nhuộm với SRB 0,4% trong acid acetic 1% trong 30 phút rồi rửa bằng acid acetic 1% để loại thuốc nhuộm không kết dính Sau đó, các đĩa này được để khô ở nhiệt độ phòng và phần thuốc nhuộm còn dính lại sẽ được hòa tan bởi 100ml dung dịch chứa 10 mM Trizma base không đệm (pH 10,5) Độ hấp thụ được đọc bằng thiết bị ELISA ở 540

nm

Bước 3: Tính toán kết quả:

Giá trị IC50 là nồng độ mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy), kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với độ sai khác không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp Probits

2.3.3 Đánh giá mối liên quan cấu trúc tác dụng và đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được

Tính giá trị logP của các dẫn chất tổng hợp được bằng phần mềm ChemDraw 9.0

Nhận xét mối liên quan giữa hoạt tính và cấu trúc của các dẫn chất

Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất dựa trên quy tắc Lipinsky:

- Khối lượng phân tử của các chất : phải nhỏ hơn 500g/mol

- Số lượng tương tác hydro:

+ Ít hơn 10 trung tâm nhận liên kết hydro (N, O)

+ Ít hơn 5 trung tâm cho liên kết hydro (OH, NH)

- Cân bằng giữa tính thân nước/dầu: logP < 5

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hợp hóa học

3.1.1.1 Tổng hợp chất N-hydroxy-5-(1H-indol-1-yl) pentanamid (IIIa)

Chất IIIa được tổng hợp theo sơ đồ 3.1:

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất IIIa Tác nhân và điều kiện: i) Methyl 5-bromopentanoat, NaH, KI, DMF, 24 giờ;

ii) NH 2 OH HCl, NaOH, MeOH, -5 o C, 30-60 phút

a Tổng hợp chất ethyl 5-(1H-indol-1-yl)pentanoat (IIa)

Tổng hợp chất IIa từ indol (Ia) bằng phản ứng thế với methyl

5-bromopentanoat với xúc tác là KI, NaH trong dung môi DMF theo sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất IIa

 Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 0,234 g (2 mmol) indol (Ia) trong 3ml dung môi DMF trong bình

cầu đáy tròn dung tích 50ml Thêm khoảng 0,120 g (5 mmol) NaH

- Hỗn hợp trong bình phản ứng được khuấy trộn ở 800C trong 2 giờ Sau đó

cho thêm 0,033 g (2 mmol) KI Tiếp tục khuấy trộn trong 10 phút

- Hòa tan 0,390 g (2 mmol) methyl 5-bromopentanoat trong 0,2 ml DMF sau

đó nhỏ từ từ vào bình phản ứng

- Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động là DCM

 Xử lý phản ứng

- Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh bình phản ứng

- Trung hòa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl 5% về pH = 6-7

- Thêm nước cất, sau đó chiết với DCM 3 lần, mỗi lần khoảng 10ml Gộp

chung dịch 3 lần chiết vào bình chiết khác, thêm nước cất đồng lượng Sau đó bỏ lớp nước để loại bớt DMF

- Lớp dịch DCM cho qua Natri sulfat khan Cất loại hết DCM thu được dẫn

Chất IIIa được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic giữa chất IIa và

hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ 3.3:

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất IIIa

 Tiến hành phản ứng

- Cho 0,231 g (1 mmol) ester IIa vào bình cầu dung tích 50ml Hòa tan bằng

một lƣợng methanol vừa đủ (10 ml), sau đó thêm tiếp 0,695 g (10,0 mmol)

NH2OH.HCl Khuấy hỗn hợp trong bình đồng thời làm lạnh bình phản ứng xuống

-5oC bằng hỗn hợp đá muối

- Chuẩn bị dung dịch NaOH bão hòa, đã đƣợc làm lạnh Thêm từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng cho đến khi pH = 12 Luôn duy trì nhiệt độ ở -5o

C

- Hỗn hợp tiếp tục đƣợc khuấy trộn cho đến khi phản ứng kết thúc

- Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử FeCl3 5% và TCL, thực hiện nhƣ sau: +Lấy khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng cho vào khay sứ, acid hóa bằng 1 giọt HCl 5% Nhỏ một giọt dung dịch FeCl3 5% vào hỗn hợp trên, nếu xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã có acid hydroxamic đƣợc tạo ra

+ Lấy khoảng 0,1 ml hốn hợp phản ứng cho vào vial, acid hóa bằng 1 giọt dung dịch HCl 5%, thêm ethyl acetat để chiết lấy sản phẩm Tiến hành SKLM với

pha động là DCM/MeOH = 10/1 Khi thấy vết ester IIa đã mất đi hoàn toàn thì

cỡ hạt 0,06-0,2 mm với hệ dung môi rửa giải là DCM/MeOH = 25/1 Sử dụng TLC

để xác định phân đoạn cần lấy Cất quay hết dung môi thu sản phẩm

 Kết quả

- Cảm quan: chất lỏng sệt màu nâu đen