Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và nghiên cứu một số tác dụng dược lý của phương thuốc vị tràng an

Nhằm hướng tới mục đích: đưa ra một chế phẩm từ nguyên liệu thảo dược điều trị bệnh viêm đại tràng cho cộng đồng chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và nghiên cứ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phùng Hòa Bình và TS Bùi Hồng Cường đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Công ty TNHH Anvy Miền Bắc đã tạo điều kiện và tài trợ kinh phí cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển cùng các thầy cô bộ môn Dược Học

Cổ Truyền đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Tôi xin cảm ơn PGS TS Đào Thị Vui cùng các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực và TS Phạm Thị Nguyệt Hằng cùng các anh chị trong khoa Dược lý Sinh hóa Viện Dược liệu đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu tác dụng sinh học Tôi xin cảm ơn PGS TS Trần Việt Hùng cùng các đồng nghiệp trong Phòng Nghiên cứu phát triển Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình khảo sát tiêu chuẩn định lượng

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn bên cạnh ủng hộ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 02 tháng 04 năm 2017

Phùng Bá Đức

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Bệnh viêm đại tràng mạn tính theo y học hiện đại 2

1.1.1 Nguyên nhân 2

1.1.2 Triệu chứng lâm sàng 2

1.1.3 Điều trị 3

1.1.4 Tiến triển và tiên lượng 4

1.2 Bệnh viêm đại tràng mạn theo y học cổ truyền 4

1.2.1 Tiêu chảy mạn tính thể tỳ vị hư hàn 4

1.2.2 Tiêu chảy mạn tính thể can tỳ bất hòa 5

1.2.3 Lỵ mạn tính: 5

1.2.4 Vị quản thống thể tỳ vị hư hàn 5

1.3 Phương thuốc Vị tràng an 6

1.3.1 Mộc hương 6

1.3.2 Sa nhân 11

1.3.3 Hoàng liên 13

1.4 Tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc 19

1.4.1 Khái niệm 19

1.4.2 Yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc 20

Phần 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Bào chế cao đặc 23

2.2.2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc 23

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 26

Phần 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Bào chế cao đặc 36

3.2 Khảo sát các chỉ tiêu của cao đặc Vị tràng an 36

3.2.1 Khảo sát các chỉ tiêu vật lý 36

3.2.2 Xác định hàm ẩm của cao đặc 37

3.2.3 Xác định pH của cao đặc 37

3.2.4 Khảo sát chỉ tiêu định tính 38

3.2.5 Khảo sát chỉ tiêu định lượng 44

3.2.6 Xác định giới hạn kim loại nặng 48

3.2.7 Xác định giới hạn nhiễm khuẩn 48

3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 50

3.3.1 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn 50

3.3.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp tính 51

3.3.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm ở đại tràng 52

3.3.4 Nghiên cứu tác dụng giảm co thắt cơ trơn 58

3.3.5 Nghiên cứu tác dụng chống tiêu chảy 60

3.3.6 Nghiên cứu tác dụng lợi mật 62

4.1 Cơ sở lý luận của phương thuốc Vị tràng an 64

4.1.1 Biện giải tác dụng phương thuốc Vị tràng an theo lý luận y học cổ truyền 64

4.1.2 Biện giải tác dụng phương thuốc Vị tràng an theo cơ chế tác dụng của y học hiện đại ………64

4.2 Điều trị viêm đại tràng theo y học hiện đại 65

4.3 Kết quả nghiên cứu 66

4.3.1 Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học 66

4.3.2.Kết quả nghiên cứu về vật lý, hóa học, vi sinh 66

4.4 Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao đặc Vị tràng an 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DĐVN IV: Dƣợc điển Việt Nam IV

DANH MỤC BẢNG, SỐ LIỆU

Bảng 3.4 Đánh giá kết quả định tính cao đặc bằng các phản ứng hóa học

chung

38

Bảng 3.5 Kết quả phân tích dịch chiết HL và cao VTA bằng SKLM (hệ dung

môi n-butanol: acid acetic: nước (7:2:1) hiện màu bằng soi UV 366)

40

Bảng 3.6 Kết quả phân tích dịch chiết MH và cao VTA bằng SKLM (hệ

dung môi n-hexan: aceton (7:4) hiện màu bằng phun thuốc thử)

Bảng 3.8 Kết quả định lượng berberin và palmatin trong Hoàng liên 47

Bảng 3.13 So sánh tác dụng giảm phù của VTA với lô chứng bệnh lý (n=8-9)

ở 3 thời điểm

51

Bảng 3.15 Tác động cao đặc VTA lên vi thể đại tràng (theo thang điểm

Vilaseca)

55

Bảng 3.16 Tác động của cao đặc VTA đến mức độ hoại tử đại tràng 57 Bảng 3.17 Tác động của cao VTA lên biên độ co bóp cơ trơn hỗng tràng cô

Bảng 3.21 Tác động của cao đặc VTA lên tỉ lệ số lần đại tiện phân ƣớt /tổng

số lần đại tiện

61

Bảng 3.23 Tác dụng làm tăng dịch mật của VTA so với lô chứng sinh lý 63

Hình 3.4 Sắc kí đồ định lượng berberin và palmatin trong mẫu chuẩn 45

Hình 3.6 Sắc kí đồ định lượng berberin và palmatin trong cao đặc VTA 46

Hình 3.10 Hình ảnh về độ sâu của tổn thương đại tràng ở các lô thử 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm đại tràng mạn là một bệnh phổ biến trên thế giới Ở Việt Nam, theo thống kê của hiệp hội tiêu hóa Việt Nam thì tỉ lệ mắc viêm đại tràng mạn là khoảng 15-20% dân

số Sở dĩ có con số cao như trên là do chế độ dinh dưỡng không hợp lý, không đảm bảo

vệ sinh an toàn thực phẩm và con người thiếu nhận thức về bệnh viêm đại tràng Nhiều người không biết mình mắc bệnh viêm đại tràng hoặc có bệnh nhưng tự điều trị không theo phác đồ y học dẫn tới bệnh trở nên trầm trọng

Các nhà y dược học thế giới đã chứng minh được tác dụng và hiệu lực điều trị bệnh bằng thuốc thiên nhiên Điều đó mở thêm một hướng lựa chọn phù hợp Trước những căn bệnh mạn tính, việc điều trị kéo dài: hàng tháng, hàng năm thì sự lựa chọn theo 2 yêu cầu: hiệu lực và an toàn là rất cần thiết Thuốc thiên nhiên thường gây tác dụng bất lợi ít hơn và ít độc hại hơn so với tân dược Xu hướng lựa chọn sử dụng thảo dược không chỉ ở Việt Nam mà là nhu cầu của nhiều nước trên thế giới

PGS TS Phùng Hòa Bình đã thiết kế công thức phương thuốc Vị tràng an dựa trên

lý luận đông y kết hợp với bằng chứng nghiên cứu của khoa học hiện đại Thực tế trị bệnh được tổng kết đánh giá qua 30 năm cho thấy: Vị tràng an có tác dụng tốt với các chứng tiêu chảy, viêm đại tràng cấp và mạn lại an toàn cho người dùng Nhằm hướng tới mục đích: đưa ra một chế phẩm từ nguyên liệu thảo dược điều trị bệnh viêm đại tràng cho cộng đồng chúng tôi thực hiện đề tài:

“Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và nghiên cứu một số tác dụng dược lý của phương thuốc Vị tràng an” Đề tài gồm có 2 mục tiêu:

- Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao đặc Vị tràng an

- Đánh giá một số tác dụng dược lý của cao đặc Vị tràng an theo hướng tác dụng điều

trị viêm đại tràng

Phần 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh viêm đại tràng mạn tính theo y học hiện đại

Viêm đại tràng mạn là tổn thương mạn tính của niêm mạc đại tràng, tổn thương có thể khu trú một vùng hoặc lan tỏa khắp đại tràng Viêm đại tràng mạn là bệnh phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam [8]

1.1.1 Nguyên nhân

- Sau các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm kí sinh trùng đường ruột cấp:

+ Nhiễm khuẩn: lao, Clostridium, Shigella, Escherichia coli, Salmonella,

Campylobacter…những vi khuẩn thường gây nhiễm trùng và mất nước do tiêu chảy

+ Nhiễm ký sinh trùng: lỵ amip, Giardia lamblia

+ Nhiễm virus: Cytomegalovirus, Herpes simplex

+ Nhiễm nấm: Candida albican

- Nguyên nhân dị ứng

- Nguyên nhân bệnh miễn dịch (viêm đại tràng, loét không đặc hiệu, bệnh Crohn)

- Rối loạn thần kinh thực vật (lúc đầu là rối loạn chức năng về sau thành tổn thương

- Do thuốc chống viêm NSAID

- Viêm loét đại tràng không rõ nguyên nhân [8]

1.1.2 Triệu chứng lâm sàng

1.1.2.1 Triệu chứng toàn thân

- Người mệt mỏi, ăn ngủ kém, đầy bụng, giảm trí nhớ, hay cáu gắt, có thể có sốt, nếu

bị nặng thì cơ thể gầy sút, hốc hác [8]

1.1.2.2 Triệu chứng cơ năng

- Đau bụng: xuất phát đau thường ở vùng hố chậu hai bên hoặc vùng hạ sườn phải, trái (vùng đại tràng góc góc, góc lách) Đau lan dọc theo khung đại tràng, thường đau quặn từng cơn, có khi đau âm ỉ; khi đau thường buồn đại tiện, khi đại tiện được thì giảm đau Cơn đau dễ tái phát

- Rối loạn đại tiện:

Chủ yếu là đại tiện lỏng nhiều lần 1 ngày, phân có lẫn nhầy máu

Táo bón, sau bãi phân có nhầy máu

Táo lỏng xen kẽ nhau (hay gặp ở viêm đại tràng khu vực)

Mót rặn, đại tiện giả, sau đại tiện đau trong hậu môn [8]

1.1.2.3 Triệu chứng thực thể

- Ấn hố chậu hai bên có thể có tiếng óc ách, chướng hơi, ấn dọc khung đại tràng đau

- Có thể sờ thấy thừng sig - ma (+): co thắt như một ống chắc ít di động [8]

1.1.3 Điều trị

1.1.3.1 Chế độ ăn uống, sinh hoạt

- Chế độ ăn uống sinh hoạt rất quan trọng, cần phải :

+ Ăn các chất dễ tiêu, giàu năng lượng, giảm mỡ, giảm rau sống và rau quả xanh + Giảm các chất kích thích

+ Không ăn các thức ăn ôi thiu, các chất có nhiều xơ

+ Hạn chế mỡ, cá, những thức ăn gây ỉa lỏng

+ Ăn uống đúng giờ giấc

- Làm việc, nghỉ ngơi hợp lý; tập thể dục đều đặn và thường xuyên

- Đại tiện đúng giờ giấc [8]

1.1.3.2 Dùng thuốc

a Điều trị nguyên nhân

- Do nhiễm khuẩn: dùng kháng sinh đặc hiệu như: klion (metronidazol), flagentyl (secnidazol), intestrix (bao gồm tiniquinol, tiniquinol laurylsulfat và tibroquinol)

- Viêm đại tràng tự miễn dùng corticoid liệu pháp (liều dùng 30 - 40mg/50kg/24h rồi giảm liều dần)

- Điều trị viêm loét đại tràng: kiểm soát quá trình viêm [8]

b Điều trị triệu chứng

- Điều trị rối loạn tiêu hóa:

+ Táo bón dùng thuốc nhuận tràng như macrogol, nhóm xơ thực vật…

+ Tiêu chảy: dùng thuốc băng se niêm mạc đại tràng (smecta, actapulgit…)

- Giảm đau

- Điều chỉnh nhu động đại tràng: điều hòa rối loạn cơ năng nhu động đại tràng: nhóm trimebutin, nhóm mebeverin hydroclorid

- Ngoài ra còn có thể dùng thêm thuốc an thần, tâm lý liệu pháp [8]

c Tăng sức bền cho niêm mạc

Thường dùng vitamin B1, vitamin C [8]

1.1.4 Tiến triển và tiên lượng

Điều trị không tốt sẽ đưa tới tình trạng cơ thể gầy yếu, ăn kém, có thể dẫn tới suy kiệt và tử vong

Bệnh dễ tái phát, dai dẳng khó điều trị khỏi hoàn toàn; mỗi khi có những sai lầm về

ăn uống, lo nghĩ bệnh lại tăng lên [8]

1.2 Bệnh viêm đại tràng mạn theo y học cổ truyền

Y học cổ truyền không có bệnh danh viêm đại tràng mạn, căn cứ vào triệu chứng của một số thể bệnh trong các chứng tiêu chảy, lỵ, phúc thống ta thấy có sự tương đồng với triệu chứng của viêm đại tràng mạn

Một số thể bệnh liên quan đến viêm đại tràng mạn theo y học cổ truyền:

1.2.1 Tiêu chảy mạn tính thể tỳ vị hư hàn

Triệu chứng: phân sống và nát, người mệt mỏi, sắc mặt vàng nhợt, có thể phù, chất lưỡi nhợt, mạch nhu hoãn

Phương pháp điều trị: bổ tỳ vị

Phương thuốc: có thể dùng các phương thuốc tứ quân tử gia vị [5], [6]

Đẳng sâm 12g Trần bì 8g

1.2.2 Tiêu chảy mạn tính thể can tỳ bất hòa

Triệu chứng: thần kinh bị kích động gây ỉa chảy hoặc ỉa chảy nhiều hơn; đầy bụng, đau bụng, sôi bụng, ngực sườn đầy tức, ợ hơi

Phương pháp điều trị: điều hòa can tỳ

Phương thuốc: Thống tả yếu phương hợp với tứ nghịch tán gia giảm [5], [6]

Phương pháp điều trị: ôn bổ tỳ vị, cố sáp

Phương thuốc: chân nhân dưỡng tạng thang [5], [6]

Phương pháp điều trị: ôn trung kiện tỳ

Phương thuốc: Hoàng kỳ kiến trung thang gia giảm [5], [6]

Hoàng kỳ 16g Quế chi 8g

- Tên khoa học: Radix Saussureae lappae [3], [7]

- Bộ phận dùng: rễ đã phơi hay sấy khô của cây Mộc hương (Saussurea lappa (DC)

C.B.Clarke, họ Cúc (Asteraceae) [3], [7]

1.3.1.1 Tóm tắt thành phần hóa học

- Alcaloid: Saussurin 0,05% [2], kushtin [20]

- Tinh dầu:

+ Sesquiterpen lacton: chứa dehydrocostus lacton và costusolid với tỷ lệ 50%; α

và β-cyclocostunolid; alantolacton; isoalantolacton; cynaropicrin [2]

+ Nhiều sesquiterpen khác như: α, costol; elema- 1,3,11(13)- trien-12-ol; α, selinen; β- elemen; elemol; caryophylen; caryophylen oxyd; ar- curcumen; α-costal; (E)-9-isopropyl-6-methyl- 5,9- decadien-2-on; phelandren; ionon; myrcen; p-cymen; linalol; humulen; cedren; cedrol; α và β-costen15-hydroxycostuslacton; isodehydrocotus lacton; isozaluzanin C [2]

β-1β-hydroxycolartin; 5α-hydroxy-β-costic acid; 11α,13-dihydroxydehidrocostuslacton; 11,13-dihydro-7,11-dehydro-13-hydroxy-3-desoxyzaluzanin C; Scopoletin [22], [53]; 10α-hydroxyl-artemisinic acid [22]

- Flavonoid [14], [35], saponin, tanin [14]

- Sterol: Stigmasterol [2], β-sitosterol, daucosterol [19]

- Các saussureamin A,B,C,D,E; 5-aminosesquiterpen; saussureal; và một ligan glycosid là massoniresiniol-4’’-O-β-D-glucopyranosid [2]

- Một số thành phần khác nhƣ: Belutin; 18% inulin và chất nhựa; acid amin; cholamin[2] ; trans-syingin [22]

1.3.1.2 Tác dụng sinh học:

- Tác dụng kháng khuẩn, kháng đơn bào:

Cao chiết ethanol MH ức chế in vitro các chủng vi khuẩn: Staphylococus aureus,

Shigella shigae, Enterococus faecalis, Escherichia coli, Shigella sonnei , Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi Ngoài ra, còn có tác dụng ức chế Trichophyton rubrum và Entamoeba histolytica [2]

Tinh dầu MH có tác dụng kháng khuẩn và tẩy uế mạnh đặc biệt với liên cầu và tụ cầu [2]

- Tác dụng kháng virus: các hoạt chất phân lập từ MH nhƣ costunolid,

dehydrocostus lacton ức chế sự biểu hiện của HBsAg với IC50 là 1,0 và 2,0 mmol/l [50]

- Tác dụng kháng nấm: 4 flavonoid phân lập từ cao chiết ethanol của MH kháng

các chủng nấm: Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus versicolor,

Aspergillus flavus, Penicillium ochrochloron, Penicillium funiculosum, Trichoderma viride, Cladosporium cladosporiodes và Alternaria [35]

- Tác dụng giảm đau, chống viêm:

+ MH có tác dụng giảm đau: giảm cơn đau quặn khi tiêm phúc mạc dung dịch acid acetic 1% trên chuột nhắt trắng [2]

+ Tác dụng chống viêm: trên chuột cống trắng gây phù bàn chân với kaolin và gây

u hạt thực nghiệm với amian; gây thu teo tuyến ức ở chuột cống non [2]

Tác dụng chống viêm có thể là do ổn định màng lyzosom của secquiterpen lacton [2], [19]

Cao chiết ethanol MH với liều 50 - 200mg/kgtt có tác dụng chống viêm cấp trên chuột gây ra bởi carrageenan [50]

Costunolid ức chế protein và sự biểu hiện mRNA của interleukin - 1b và phiên mã

AP -1 [50]

- Tác dụng trên hệ tiêu hóa:

+ Tác dụng trên nhu động ruột và cơ trơn:

Tinh dầu MH ức chế nhu động ruột Cao toàn phần tinh dầu đã khử lacton và dihydrocotusnolid, các phân đoạn lacton và dihydrocostunolid đều ức chế sự co thắt hồi tràng cô lâp của chuột lang gây bởi acetylcholin, histamin và BaCl2 Hầu hết các phân đoạn của tinh dầu đều có tác dụng làm giảm sự co thắt phế quản gây bởi khí dung histamin và acetylcholin trên chuột lang [2], [15]

Alcaloid saussurin gây giãn cơ trơn, đặc biệt là cơ trơn phế quản tương tự adrenalin, xuất hiện chậm nhưng tồn tại dài hơn Tác dụng chủ yếu thông qua trung tâm phế vị ở tủy sống [2], [15]

MH làm giảm co thắt gây ra bởi cacbachol liều 30µmol/L Thành phần có tác dụng

có thể là sesquiterpen Sesquiterpen kích thích bài xuât ion K+ và làm giảm nồng độ ion

Ca++ thông qua con đường hoạt hóa cGMP và PKG [50]

+ Ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori với nồng độ ức chế tối thiểu 40µg/ml đối

với cao chiết ethanol 95% và >100 µg/ml đối với cao chiết nước [29]

+ Bảo vệ niêm mạc dạ dày: costunolid, saussureamines, dehydrocotus lacton phân lập từ cao chiết methanol của MH có tác dụng bảo vệ niêm mạc dạ dày chuột trên mô hình gây tổn thương dạ dày bằng ethanol với liều 5mg và 10mg/kgtt [50]

+ Tác dụng lên chức năng dạ dày: cao chiết nước MH có tác dụng làm tăng tốc độ tháo rỗng dạ dày nhưng không ảnh hưởng đến nồng độ gastrin, acid dạ dày và somatostatin [50]

+ Tác dụng cầm tiêu chảy: Cao chiết methanol MH với liều 100, 300, 500mg/kgtt chuột Wistar có tác dụng ức chế tiêu chảy tương ứng 26.33, 32.28, 66.77% trên mô hình gây tiêu chảy bằng dầu thầu dầu [32]

+ Tác dụng lợi mật: Cao chiết aceton MH lợi mật trên chuột cống trắng, chuột lang [2]

+ Tác dụng bảo vệ gan: cao chiết methanol - nước MH liều 150, 300 và 600mg/kgtt chuột có tác dụng hạn chế tổn thương gan gây ra bởi D-glactosamin và lipopolysaccarid, làm giảm đáng kể nồng độ transaminase trong huyết tương, cải thiện cấu trúc của tế bào gan, làm giảm đáng kể các tế bào viêm và chết [47]

Bảo vệ gan chống lại tổn thương gan do CCl4 [2]

+ Tác dụng làm mòn sỏi mật in vitro [2]

- Tác dụng trên hệ thần kinh:

+ Tác dụng hiệp đồng, làm kéo dài thời gian gây ngủ của natri barbital Những thành phần bay hơi trong tinh dầu có tác dụng ức chế thần kinh trung ương Hít khói của bột MH gây ức chế rõ rệt thần kinh trung ương [2]

+ Tác dụng chống co giật: cao chiết ethanol liều 300mg/kgtt, cao chiết nước liều 300mg/kgtt và cao chiết ete dầu hỏa liều 100mg/kgtt MH có tác dụng chống co giật gây bởi pentylenetetrazol và picrotoxin ở chuột Cơ chế tác dụng đó là tăng ngưỡng đáp ứng thông qua thụ thể GABA [37]

- Tác dụng trên hệ hô hấp, tiết niệu:

Tác dụng long đờm, lợi tiểu: tinh dầu MH được hấp thụ qua đường tiêu hóa, bài tiết một phần qua phổi gây tác dụng long đờm, một phần qua thận gây tác dụng lợi tiểu [2]

- Tác dụng trên chuyển hóa:

+ Tác dụng hạ lipid máu: cao chiết nước MH dùng bằng đường uống liều 2mg/kgtt thỏ làm hạ lipid máu [50]

+ Tác dụng trên đường huyết: cao chiết nước MH dùng bằng đường uống liều 500mg/ngày, thời gian 30 ngày có tác dụng hạ đường huyết trên lâm sàng [2]

1.3.1.3 Tác dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị: cay, đắng; tính ấm

- Quy kinh: phế, can, tỳ

- Công năng: hành khí chỉ thống, bình can giáng áp, kiện tỳ hòa vị [3], [7]

- Chủ trị:

+ Can, tỳ, vị khí trệ, ngực bụng đầy trướng, đau bụng, đại tiện lỏng [3]

+ Bệnh can đởm cường thịnh gây cao huyết áp [3]

+ Viêm túi mật, sỏi mật [44]

+ Loét dạ dày, ruột [44]

+ Ngộ độc thức ăn, chữa ho, làm an thai [2]

Ngoài ra còn chữa [2]:

+ Sốt rét từng cơn (sao với gừng và các vị thuốc khác)

+ Dùng làm thuốc gây ngủ, trừ giun, cầm máu, giải độc, trị rắn cắn, sâu bọ cắn, nhiễm độc thai nghén

- Cách dùng: ngày 6-12 g dạng thuốc sắc hoặc bột [3]

- Kiêng kị: các chứng bệnh do khí hƣ, huyết hƣ mà táo thì không dùng [3], âm hƣ nội nhiệt [44]

1.3.2 Sa nhân

- Tên khoa học: Fructus Amomi [3], [7]

- Bộ phận dùng: quả gần chín đã bóc vỏ và phơi khô của cây Sa nhân (Amomum

vilosum Lour ), họ Gừng (Zingiberaceae) [7]

1.3.2.1 Tóm tắt thành phần hóa học

- Tinh dầu có hàm lƣợng 2-3% gồm: D-camphor (33,2%), d-bornyl acetat (26,5%), borneol (19,4%), d-limonen (7%), camphen (7%), paramethoxy trans- cinnamat, phellandren (2,3%), pinen (1,1%), myrcen, ethyl octacosat, docosyl hexylat, stigmat-4-en-3-dion [2]

- Kháng khuẩn, kháng đơn bào:

Tinh dầu SN có tác dụng ức chế các vi khuẩn theo thứ tự hoạt tính giảm: Bacillus

subtilis, Bacillus mycoides, Diplococus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi Có tác dụng diệt Entamoeba moshkowskii với nồng độ ức chế thấp nhất là 1:2560 [2]

- Tác dụng giảm đau, chống viêm:

+ Bornyl acetate trong tinh dầu SN làm giảm đau do acid acetic và mâm nóng [45], [46] Cơ chế tác dụng của nó có thể liên quan đến cả tác dụng giảm đau trung ương và giảm đau ngoại vi (nhưng không có liên quan đến các thụ thể opioid) [46] + Bornyl acetate có tác dụng chống sưng tai chuột do dimethylbenzen [45]

- Tác dụng khác

+ Tác dụng trên chuyển hóa lipid: thuốc hoàn bào chế từ SN, Câu đằng, Lá tre non

và 7 dược liệu khác điều trị trên 32 bệnh nhân bị xơ vữa động mạch sau 30-60 ngày Kết quả tốt 22, vừa 9 người Kết quả tốt hơn ở bệnh nhân tăng cholesterol máu mà không kèm tăng huyết áp [2]

+ Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan: polysaccharide trong SN ức chế

sự tăng trưởng tế bào HepG2, tác dụng quét gốc tự do mạnh trong ống nghiệm, ngăn chặn đáng kể sự hình thành malondialdehyd, tăng cường hoạt động của các enzym chống oxy hóa ở chuột bị tổn thương gan gây bởi CCl4 [51]

+ Tăng thời gian sống ở chuột: Cao chiết nước được bào chế từ SN, Nhân sâm, Cam thảo, Kim ngân và một số dươc liệu khác làm tăng thời gian sống của chuột nhắt trắng được cấy sarcom 180 trong phúc mạc

+ Làm giảm tác dụng hại thận của cis-platin ở chuột nhắt trắng và chuột cống trắng, giảm độc tính về huyết học của cis-plantin trên hồng cầu và bạch cầu [2]

Có hoạt tính estrogen tương đối cao [25]

+ Đau bụng, đầy bụng, buồn nôn, ỉa chảy, đại tiện ra máu

+ Phong thấp: đau nhức cơ, thần kinh ngoại biên

+ Động thai hoặc có xuất huyết [3] [7]

Ngoài ra còn dùng:

+ Dùng làm gia vị và chế rượu mùi [2], [9]

+ Chữa đau răng: SN giã nhỏ thành bột chấm vào răng hoặc ngâm rượu cho đặc rồi chấm vào răng [10]

+ Điều trị phụ nữ có thai nghén, nôn vào buổi sáng [44]

- Cách dùng: Ngày dùng từ 3-6g [3]

- Kiêng kị: Âm hư nội nhiệt không nên dùng [3]

1.3.3 Hoàng liên

- Tên khoa học: Rhizoma Coptidis [3], [7]

- Bộ phận dùng: thân rễ phơi loài Hoàng liên chân gà như Coptis chinensis Franch.,

họ Hoàng liên (Ranunculaceae) [3], [7]

1.3.3.1 Tóm tắt thành phần hóa học:

- Alcaloid: Berberin, palmatin, coptisin, worenin, jatrorrhizin, columbamin, epiberberin, berberastin, magnoflorin, groenlandicin, obacunon, obaculacton, acid ferulic, urbenin [1]

- Polysaccharid [49]

- Flavonoid: rhamnetin, wogonin [17]

- Phenylpronanoid: chlorogenic acid, ferulic acid, z-octadecyl caffeat [17]

- Acid phenolic: acid vanillic [17]

- Ligan: erythro-guaiacylglycerol-8-O-4'-(coniferyl alcohol) ether, threo - guaiacylglycerol-8-O-4'-(coniferyl alcohol) ether, (+)-pinoresinol, (+)-medioresinol, (+)-lariciresinol, (+)-5'-methoxylariciresinol, (+)-isolariciresinol [17]

- Các chất vô cơ (Cu, Mn, Zn, Se… ) [1]

1.3.3.2 Tác dụng sinh học

- Tác dụng kháng khuẩn:

Dịch chiết nước HL có phổ kháng khuẩn rộng với các vi khuẩn gram (+) và gram (-):

Shigella dysenteriae, Shigella shigae, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Bacillus tuberculosis, Bacillus pertis, Streptococcus, Vibri cholera, Pneumococcus,

Staphylococus aureus, Bacillus parathyroid A, Escherichia coli, Bacilus proteus, Bacillus pyocyaneus [1]

Berberin ức chế các vi khuẩn: Streptococcus, Pneumococcus, Vibri cholera,

Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Shigella shiga, Shigella flexneri, Bacillus subtilis, Bacilus proteus, Bacillus typhoid [1]

Đối với Vibrio cholera đã được xử lý trước với berberin truyền cho thỏ non thì

không gây nên những triệu chứng ỉa chảy thực nghiệm Điều đó chứng tỏ độc tố của vi khuẩn đã bị bất hoạt Trên thỏ non, cho uống trước berberin, sau 18 - 24h bơm vào ruột thỏ liều độc tố vi khuẩn tả gây chết thì phòng ngừa được triệu chứng tiêu chảy do độc

tố gây lên và kéo dài thời gian sống của thỏ [1]

Cơ chế tác dụng của berberin: ức chế sinh tổng hợp RNA DNA, protein của vi khuẩn Nhóm amin bậc 4 rất cần thiết cho tác dụng kháng khuẩn [1]

- Tác dụng kháng virus

Dịch chiết nước HL với nồng độ 50% ức chế sự phát triển của virus cúm PR8, 56S8, P.M [1]

- Tác dụng kháng nấm

Berberin sulfat với nồng độ 10 - 25mg/ml ức chế sự sinh trưởng của các nấm

Alternaria spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Curvularia spp., Derechslera spp., Fusarium spp., Rhizopus oryae, Scopulariopsis spp

[1]

- Tác dụng kháng đơn bào

Berberin trên ống kính với nồng độ 1:5000 và trên chuột nhắt trắng đã gây nhiễm amip với liều 50mg/kg bằng đường uống có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của amip Đối với kí sinh trùng sốt rét hoàng liên không có tác dụng nhưng lại có tác dụng với

+ Tác dụng chống viêm loét đường tiêu hóa:

Cao chiết bằng methanol và alcaloid chiết từ HL: ức chế loét dạ dày do stress trên chuột cống trắng bằng đường uống Berberin tiêm dưới da chuột cống trắng ức chế sự hình thành vết loét và hiện tượng chảy máu dạ dày trong mô hình gây loét do thắt môn

vị [1]

Cao chiết nước HL, Hoàng bá bắc và berberin có tác dụng ức chế enzyme urease

của vi khuẩn Helicobacter pylori Tác dụng ức chế của cao chiết nước HL tốt hơn so

với cao chiết nước Hoàng bá bắc và berberin tinh khiết Cơ chế tác dụng có thể do tương tác với nhóm sulfuhydryl tại trung tâm hoạt động của enzyme urease Đây là loại

ức chế không cạnh tranh và có thể đảo ngược bằng glutathione [28]

Berberin liều 30 và 120mg/kgtt chuột, cao chiết nước HL (chứa 9,9% berberin) liều 300mg/kgtt chuột ức chế sự tăng tumor necrosis factor-a (TNF –α), interleukin-1b (IL-1β), NO huyết tương và ức chế sự hoạt hóa thụ thể toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear factor-jB (NF-jB) ở hồi tràng do lipopolysaccharide gây ra Ngoài ra berberin và cao chiết nước HL còn làm tăng đáng kể nồng độ superoxide dismustase, glutathion peroxidase, ngăn cản sự tăng malondialdehyde, NO và tổn thương nhung mao ở hồi tràng [52]

+ Tác dụng lợi mật:

Thí nghiệm trên chuột cống trắng berberin bằng đường uống, tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm dưới da làm tăng cường sự phân tiết bilirubin mật Berberin sulfat tiêm tĩnh mạch (liều 10mg/kgtt) tăng cường lưu lượng mật [1]

- Tác dụng trên hệ thần kinh

Berberin có tác dụng an thần trên mèo bằng đường tiêm phúc mạc, tăng cường thời gian gây ngủ của pentobarbital nhưng không có tác dụng kháng co giật, giảm đau [1] Tác dụng ức chế acetylcholinesterase: bằng phương pháp Ellman, cao chiết methanol và nước HL có tác dụng ức chế acetylcholinesterase với IC50 lần lượt là 0,031µg/ml và 2,5µg/ml - gấp hơn 100 lần so với chất ức chế acetylcholinesterase đã biết là galantamine (IC50 là 4.33µg/ml) Sự kết hợp của các alcaloid berberin, coptisin

và palmatin có tác dụng hiệp đồng tác dụng ức chế acetylcholinesterase Nghiên cứu trên dòng tế bào COS7 thấy rằng không có chất nào gây độc tế bào ở nồng độ ức chế acetylcholinesterase [27]

- Tác dụng chống viêm:

Trên mô hình gây viêm bằng tiêm màng bụng chuột lipopolysaccharid (LPS) liều

35mg/kgtt, cao chiết nước HL với liều dùng 500 - 1000mg/kgtt làm giảm thay đổi mô

bệnh học ở gan chuột HL ức chế sự bài tiết các cytokines tiền viêm (do LPS) như interleukin - 6 (IL-6), ức chế sự hoạt hóa NF-ĸB thông qua sự ức chế IĸB-α phosphoryl hóa, cũng như ức chế sự phosphoryl hóa của ERK1/2, JNK, and p38 MAPKs Kết quả này có liên quan tới sự giảm biểu hiện của cyclooxygenase-2 (COX-2) và và có khả năng kích thích nitric oxide synthase (I-NOS) [18]

- Tác dụng trên hệ tim mạch

+ Tác dụng trên huyết áp

Berberin sulfat tiêm truyền tĩnh mạch thỏ gây hạ huyết áp Dịch chiết nước HL tiêm dưới da chuột cống trắng cũng có tác dụng hạ huyết áp

Berberin clorid dùng liều từ 0,5mg/kg cho thỏ gây mê bằng urethane gây hạ huyết

áp kéo dài Tác dụng hạ huyết áp có thể do ức chế các thụ thể α-adrenoreceptor chứ không phải do tác dụng giãn mạch

+ Tác dụng trên tim: làm chậm nhịp tim Tác dụng này cũng xuất hiện ở chuột cống trắng đã cắt dây X ở cả hai bên

+ Tác dụng trên mạch: đối kháng với tác dụng co mạch do các chất giống adrenalin gây nên [1]

- Tác dụng trên chuyển hóa

+ Tác dụng trên chuyển hóa glucid

Cao chiết nước từ HL thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, berberin thí nghiệm trên chuột bình thường và chuột tiểu đường do alloxan gây nên đều có tác dụng hạ đường huyết Trên chuột nhắt trắng berberin cũng có tác dụng đối kháng với hiện tượng tăng đường huyết do tiêm glucose hoặc adrenalin gây lên [1]

Polysaccharid của HL có tác dụng cải thiện cân nặng, nồng độ insulin huyết tương, nồng độ glucose máu, giảm những bất thường về hình thái học trong tuyến tụy và gan ở chuột bị tiểu đường do streptozotocin gây ra [49]

Chuột đực Wistar được nuôi với chế độ giàu chất béo và gây đái tháo đường bằng streptozocin Polysaccharid HL dùng với liều 200; 100; 50mg/kgtt chuột có tác dụng làm giảm glucose huyết lúc đói 51,2, 42,7 và 23,3%; triglycerid 19,2, 12,1 và 7,4%; cholesterol toàn phần 24,2, 20,9 và 18,7% Polysaccharide Hoàng liên cũng thể hiện khả năng chống oxy hóa [24]

Cao chiết phân đoạn dichloromethan và n-butanol từ cao ethanol toàn phần của HL liều 50µg/ml làm tăng cường khả năng hấp thu glucose vào tế bào cơ vân C2C12 [48] Cao chiết methanol 70% HL ức chế α-glucosidase với IC50 là 3,528mg/ml, thành phần có tác dụng ức chế là coptisine, epiberberin, jatrorrhizin và berberin [23]

+ Tác dụng trên chuyển hóa lipid

Tác dụng phòng ngừa xơ vữa động mạch: dịch chiết nước từ HL bằng đường uống

có tác dụng làm cho tỷ lệ cholesterol/lipid toàn phần trở về bình thường trên thỏ thí nghiệm được nuôi bằng chế độ ăn uống có hàm lượng cholesterol cao [1]

Berberin sulfat trên thỏ thí nghiệm dùng bằng đường uống hoặc tiêm bắp thịt làm

+ Tetrahydro berberin có tác dụng an thần, ức chế hoạt động tự nhiên của súc vật thí nghiệm, giãn cơ và gây hạ huyết áp nhẹ [1]

+ Trên chuột cống trắng bằng đường uống berberin sulfat có LD50 là 1g/kg, bằng đường tiêm phúc mạc là 90mg/kg Nghiên cứu về tổ chức cho thấy berberin không gây nên những thay đổi đáng kể về tổ chức học các cơ quan trong cơ thể cả khi dùng berberin sulfat liều lớn 50mg/kg trong 6 tuần liên tục [1]

+ LD50 của HL là 4,89g/kgtt chuột, Hoàng liên có thể gây ra vàng da tan máu và vàng da nhân não ở trẻ sơ sinh thiếu hụt glucose-6-phosphat dehydrogenase [40]

+ Berberin có thể thay thế bilirubin gắn vào protein huyết tương gây ra hiện tượng vàng da, vàng da nhân não và tổn thương não ở trẻ sơ sinh [40]

+ Berberin và dịch chiết HL được bài tiết vào sữa mẹ, chưa phát hiện độc hại trên trẻ Khuyến cáo không sử dụng Hoàng liên cho phụ nữ có thai, phụ nữ đang cho con bú [33]

+ Berberin dạng tiêm có thể gây dị ứng [1]

Nghiên cứu về chuyển hóa cho thấy berberin bằng đường uống hấp thu chậm và không hoàn toàn, sau 8h đạt nồng độ tối đa Sau khi hấp thu vào máu thuốc được phân

bố nhanh chóng vào các tổ chức tim gan thận Nồng độ berberin trong máu thấp khó đạt được nồng độ ức chế vi khuẩn Do đó berberin dùng bằng đường uống chủ yếu chữa các bệnh về đường ruột [1]

+ Các protoberberine như berberin, palmatin và jatrorrhizin ức chế hoạt tính của cytochrom P1A1.1 (CYP1A1.1) và cytochrome P1B1.1 (CYP1B1.1) trong khi cytochorom P1A2.1 (CYP1A2.1) không bị ảnh hưởng

Phân tích động học cho thấy rằng berberin ức chế không cạnh tranh CYP1A1.1 và CYP1B1.1, trong khi đó palmatin và jatrorrhizin sự ức chế cạnh tranh hoặc hỗn hợp Trong số các protoberberin berberin gây ra tác dụng ức chế mạnh nhất và chọn lọc trên CYP1B1.1 với giá trị ki là 44 ± 16 nM Berberin cũng ức chế CYP1B1.1 giống với 7-ethoxycummarin và 7-methoxyresorufin Berberin ức chế các biến thể đa hình CYP1B1.3 (V432L) và CYP1B1.4 (N453S), với giá trị IC50 tương đương với sự ức chế

CYP1B1.1 Sự ức chế của Berberin bị loại bỏ bởi một đột biến của Asn228 thành Thr228 trong CYP1B1.1, trong khi sự ức chế được tăng cường bởi một đột biến đảo ngược của Thr223 thành Asn trong CYP1A2.1 Kết quả này kết hợp với mô hình phân

tử cho thấy vai trò quan trọng của tương tác hydro của Asn228 trong CYP1B1.1 với nhóm methoxy của berberin Những phát hiện này cho thấy berberin gây ra sự ức chế CYP1B1 chọn lọc, trong đó Asn228 có vai trò quan trọng [30]

1.3.3.3 Tác dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị : vị đắng, tính hàn

- Quy kinh: tâm, tỳ, vị, can, đởm, đại tràng

- Công năng: Thanh nhiệt táo thấp, thanh tâm, trừ phiền, thanh can sáng mắt, tả hỏa,

Âm hư phiền nhiệt, tỳ hư tiết tả không nên dùng [3], [7]

1.4 Tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc

1.4.1 Khái niệm

Cao thuốc là chế phẩm điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các

dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp

Các dược liệu trước khi chiết xuất, được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) Với một số dược liệu đặc biệt, có chứa men phân huỷ hoạt chất, cần phải diệt men trước khi sử dụng làm nguyên liệu chiết xuất bằng hơi cồn sôi, hơi nước sôi, hoặc phương pháp thích hợp khác để bảo vệ hoạt chất trong dược liệu

Phân loại: Cao thuốc được chia thành ba loại:

- Cao lỏng: thể chất lỏng hơi sánh, mùi vị đặc trưng của dược liệu dùng để điều chế

cao

- Cao đặc: khối đặc quánh, hàm lƣợng dung môi dùng để chiết xuất còn lại trong cao

không quá 20%

- Cao khô: một khối hoặc bột khô, đồng nhất, có độ ẩm không lớn hơn 5% [7]

1.4.2 Yêu cầu tiêu chuẩn chất lƣợng cao thuốc

Đạt yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng và các yêu cầu chung sau đây:

- Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao

- Độ trong, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã đƣợc mô tả trong chuyên luận riêng, phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dƣợc liệu và vật lạ

- Định tính: Phải có phản ứng định tính của các dƣợc liệu dùng để bào chế cao thuốc

- Định lƣợng: Tuỳ theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu định lƣợng hoạt chất trong cao

- Tỷ trọng: Tuỳ theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu về tỷ trọng của cao

- Mất khối lƣợng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác) cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%

- Các chỉ tiêu khác: Giới hạn nhiễm khuẩn, dƣ lƣợng hoá chất bảo vệ thực vật, giới hạn kim loại nặng… [7]

Phần 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cao đặc phương thuốc Vị tràng an

Các vị thuốc trong phương thuốc (Hoàng liên, Mộc hương, Sa nhân) được cung cấp bởi công ty TNHH Anvy Miền Bắc, đạt tiêu chuẩn DĐVN IV (Phụ lục 1)

Dược liệu chuẩn (Hoàng liên số hiệu CV 0115007.01, Mộc hương số hiệu CV 0115005.01, Sa nhân) do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Thiết bị nghiên cứu:

- Tủ sấy: Memmert, Shellab

- Cân phân tích: Sartorius BP 221S (Germany)

- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

- Cân kỹ thuật Presica-BJ610C, TE412 (Sartorius)

- Thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02 mm

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510

- Máy UV-VIS Hitachi U - 1800

- Hệ thống SKLM hiệu năng cao Linomat 5 (Camag)

- Hệ thống HPLC (Water)

- Máy đo biến đổi thể tích (Ugo basile)

- Bể nuôi cơ quan cô lập Ugo Basile 4000

- Thiết bị chuyển đổi tín hiệu Ugo Basile 7006

- Bộ ghi và in kết quả Uni record 7050

- Kim bướm, đồng hồ bấm giây

- Các dụng cụ: micropipet, dụng cụ thủy tinh, ống nghiệm các loại, kéo, banh, kẹp

- Lồng kính quan sát chuột

- Các dụng cụ sử dụng lấy mẫu, bơm và kim đầu tù để cho chuột uống thuốc

2.1.2.2 Hóa chất - dung môi:

- Dung môi, hóa chất: ethanol, ether dầu hỏa, ethyl acetat… tiêu chuẩn phân tích

- Magnesi chlorid, calci chlorid, natri chlorid, natri hydrocarbonat, kali chlorid, glucose (dùng pha dung dịch Tyrod): tiêu chuẩn phân tích

- Chất đối chiếu berberin clorid hàm lượng 87,10 %, số lô WS.0215168.02 Palmatin clorid hàm lượng 84,48% %, số lô WS.0115313.01 do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cấp

- Caragenin (Sigma)

- Dung dịch nước muối đẳng trương tiệt trùng

- Dung dịch chống thấm do viêm (Ugo basile)

- Magie sulphat 5g (công ty cổ phần Hoá dược) SĐK VD.16351-12; Số lô 0002; HSD 01- 08- 2019

- Loperamid 2mg (Brown.res); SĐK VN-14938-12; Số lô 671; HSD 20-11-2019

- Acetylcholin lọ (Kanto Chemical, Nhật Bản )

- Atropin sulphat 0,25 mg/ml (Vinphaco, Việt Nam)

- Salazopyrin (Sulfasalazin 500mg) (Pfizer), số lô 047086, hạn dùng 7/2018

- Acid acetic (Merck)

- Bản sắc ký lớp mỏng Silica gel 60 F254 (MERCK)

2.1.2.3 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng giống đực chủng Swiss, khối lượng từ 20 - 25 g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả 2 giống, khoẻ mạnh, khối lượng 23,0

2,0g do Học Viện Quân Y cung cấp

- Chuột cống trắng Wistar, cả 2 giống, khỏe mạnh, khối lượng 90 - 130 g, do Học Viện Quân Y cung cấp

- Chuột cống trắng, chủng Wistar, cả hai giống, khỏe mạnh, khối lượng 150-200 g,

do Học viện quân y cung cấp

- Thỏ cả hai giống khỏe mạnh, khối lượng 2,0- 2,2kg, do học viện Quân Y cung cấp

2.1.2.4 Vi sinh vật

- Chủng vi khuẩn: 6 chủng vi khuẩn do bộ môn Vi sinh-Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp, gồm 2 chủng Gram (+) và 4 chủng Gram (-)

2 chủng Gram (+) gồm:

Bacillus cereus, viết tắt là B cereus (ký hiệu ATCC 9946 )

Staphylococcus aureus, viết tắt là S aureus (ký hiệu ATCC 1128)

4 chủng Gram (-) gồm:

Escherichia coli, viết tắt là E coli (ký hiệu ATCC 25922 )

Proteus mirabilis, viết tắt là P mirabilis (ký hiệu BV 108 )

Salmonella typhi, viết tắt là S typhi (ký hiệu DT 220 )

Shigella flexneri, viết tắt là S flexneri (ký hiệu DT 112)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Bào chế cao đặc

- Chiết xuất, bào chế cao đặc

Dược liệu được thái nhỏ, phối hợp theo tỉ lệ công thức phương thuốc

Đun sôi 3 lần, mỗi lần sôi 2h Gộp dịch chiết Cô dịch chiết đến cao lỏng sánh, cô cách thủy đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%)

Xác định khối lượng cao thu được

2.2.2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc

2.2.2.1 Xác định các tính chất vật lý: quan sát, mô tả tính chất cao đặc về cảm quan

(thể chất, mùi vị, màu sắc, độ đồng nhất…) [7]

2.2.2.2 Xác định hàm ẩm:

Xác định bằng phương pháp cân: cân khoảng 1g cao, trải đều trên đĩa bạc, đặt lên cân Sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi Đọc kết quả, tính hàm ẩm Thực hiện 3 mẫu, hàm ẩm trong cao tính theo giá trị trung bình [7]

2.2.2.3 Xác định pH cao đặc pha loãng thành nồng độ 1% (g/100ml):

Tiến hành: cân chính xác khoảng 1g cao, hòa tan bằng nước cất cho vừa đủ 100ml Xác định giá trị pH của dung dịch này bằng máy đo pH Eutech Instruments pH 510

2.2.2.4 Giới hạn nhiễm khuẩn: thử theo phụ lục 13.6 DĐVN IV [7]

2.2.2.5 Xác định giới hạn kim loại nặng:

Lấy 1g chế phẩm, xác định theo phương pháp 3, phụ lục 9.4.8 DĐVN IV [7]

2.2.2.7 Chỉ tiêu định lượng: định lượng berberin và palmatin trong Hoàng liên và

trong cao đặc bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao [7]

- Pha động: Hoà tan 3,4 g kali dihydrophosphat, 1,7 g natri laurylsulfat trong 1000

ml hỗn hợp dung môi gồm nước - acetoniltril (1 : 1), lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm

- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch đối chiếu có chứa 0,015 mg palmatin clorid và

0,060 mg berberin clorid trong 1 ml methanol (TT)

- Dung dịch thử:

+ Hoàng liên: cân chính xác khoảng 0,07g bột dược liệu Hoàng liên (đã rây qua rây 0,25mm) cho vào bình nón nút mài có dung tích 100 ml, thêm 25 ml hỗn hợp dung môi gồm methanol - acid hydrocloric (100 : 1) và đun hồi lưu trên cách thuỷ 30 phút,

để nguội, gạn lấy dịch chiết Tiến hành tương tự thêm 2 lần nữa Gộp các dịch chiết, làm bốc hơi trong cách thuỷ tới cắn Chiết cắn với nước nóng 5 lần, mỗi lần 15 ml, lọc

và gộp các dịch lọc lại, làm bay hơi trong cách thuỷ tới cắn khô Cắn được hoà tan trong methanol (TT) và chuyển vào bình định mức 50 ml, thêm methanol (TT) đến vạch, lắc đều, lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm, thu được dung dịch thử + Cao đặc: cân chính xác lượng cao đặc tương đương với 0,07g Hoàng liên, tiến hành tương tự như trên

- Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử

- Chỉ tiêu theo dõi: diện tích pic thể hiện trên sắc ký đồ

- Chỉ tiêu đánh giá:

+ Hàm lƣợng berberin và palmatin trong Hoàng liên (tính theo dƣợc liệu khô tuyệt đối) đƣợc tính theo công thức:

+ Hàm lƣợng berberin và palmatin trong cao khô tuyệt đối đƣợc tính theo công thức:

Trong đó: lần lƣợt là diện tích pic của

berberin chuẩn, thử và palmatin chuẩn, thử

, lần lƣợt là nồng độ berberin chuẩn và palmatin chuẩn

mcd, mhl: khối lƣợng cao đặc, Hoàng liên đem cân

: lần lƣợt là nồng độ % hàm lƣợng berberin và palmatin trong cao khô tuyệt đối

%Berhl, %Palhl: lần lƣợt là nồng độ % hàm lƣợng berberin và palmatin trong Hoàng liên tính theo dƣợc liệu khô tuyệt đối

H: độ ẩm của cao đặc, Hoàng liên

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học

2.2.3.1 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn

Theo quy trình kháng sinh đồ [7]

- MNC: Cao đặc VTA

- Mẫu chứng:

+ Streptomycin: 20 µg/mL đối với vi khuẩn Gr (-)

+ Benzathin penicillin: 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gr (+)

- Nguyên tắc: Dựa trên sự khuếch tán của dịch thử vào môi trường thạch: ức chế sự

phát triển của vi khuẩn tạo ra vòng vô khuẩn có đường kính tỷ lệ với các hoạt lực kháng khuẩn của thuốc

- Tiến hành:

+ Chuẩn bị MNC: cao đặc VTA được pha trong nước với nồng độ các mẫu như sau:

Nồng độ 1: 0,5g cao đặc/ml (độ pha loãng là 1/2)

Nồng độ 2: 0,25g cao đặc/ml (độ pha loãng là 1/4)

Nồng độ 3: 0,125g cao đặc/ml (độ pha loãng là 1/8)

Nồng độ 4: 0,0625g cao đặc/ml (độ pha loãng là 1/16)

Nồng độ 5: 0,0312g cao đặc/ml (độ pha loãng là 1/32)

+ Tẩm dịch mẫu nghiên cứu, mẫu chứng vào giấy lọc: Các khoanh giấy lọc vô trùng được tẩm 3 lần với các mẫu nghiên cứu hoặc mẫu chứng Sau mỗi lần tẩm sấy ở nhiệt độ < 600C đến hết dung môi

+ Cấy vi khuẩn vào môi trường:

Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, ủ trong tủ ấm 37o

C trong 24 giờ đến nồng độ 108 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dẫy dịch chuẩn) Môi trường thạch thường được làm lạnh về 45-500

C Cấy các giống vi sinh vật kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/ 100 ml Lắc tròn để vi sinh vật kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch; đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/đĩa Để thạch đông lại

+ Đưa mẫu nghiên cứu hoặc mẫu chứng vào môi trường đã cấy vi khuẩn:

Đặt khoanh giấy lọc đã được tẩm mẫu nghiên cứu hoặc mẫu chứng lên bề mặt môi trường thạch thường chứa vi sinh vật kiểm định

+ Ủ mẫu thử và chứng trong tủ ấm ở toC = 37oC trong 24h, lấy ra đọc kết quả Đo đường kính vòng vô khuẩn

- Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, kết quả được đánh giá

theo công thức:

Dtb=

Dtb: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn

Di: Đường kính vòng vô khuẩn

n: Số thí nghiệm làm song song

2.2.3.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp

- MNC: Cao đặc VTA

- Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng Wistar, khối lượng 90 -130g.

- Nguyên tắc: theo Winter và cộng sự [11]: gây phù bằng cách tiêm dưới da dung

dịch carrageenan

- Tiến hành: chuột được nuôi ổn định 5 ngày trước khi thí nghiệm Chia chuột ngẫu

nhiên thành các lô thí nghiệm:

Lô chứng bệnh lý: uống nước cất

Lô chứng dương: uống indomethacin liều 10 mg/kgtt

Lô thử 1: uống cao VTA với liều 315mm/kgtt

Lô thử 2: uống cao VTA liều 630mg/kgtt

Ngày 1 đến 3 được uống mẫu thử (các lô uống cao VTA, indomethacin) và uống nước (lô chứng bệnh lý) Ngày thứ 4, cho chuột uống nước hoặc mẫu thử, đo thể tích bàn chân (từ khuỷu chân trở xuống) của chuột trước khi gây viêm (chỉ số V0)

Gây phù bàn chân chuột: tiêm dưới da gan bàn chân dung dịch Carragenin 1% pha trong dung dịch NaCl 0,9% (liều 0,1 ml/1 bàn chân) Ngay sau khi gây viêm, cho chuột của tất cả các lô uống nước: 3,5 ml/100g Đo thể tích bàn chân của chuột ở các thời điểm 3h, 5h và 24h sau khi tiêm Carragenin, được các thông số V3 và V5 và V24

- Chỉ tiêu quan sát: Chênh lệch thể tích chân chuột trước và sau khi gây viêm

- Chỉ tiêu đánh giá: Tính mức độ phù chân chuột và so sánh giữa các lô thử và lô

chứng theo công thức Fontaine

+ Độ tăng thể tích chân của từng chuột:

∆V% =Trong đó: Vt: thể tích chân chuột sau khi gây viêm

V0: thể tích chân chuột trước khi gây viêm + Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%)

I% = Trong đó:

: Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô đối chứng

: Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô uống thuốc

I%: Mức độ giảm phù của lô uống thuốc so với lô đối chứng

2.2.3.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm ở đại tràng

- MNC: cao đặc VTA

- Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng Wistar, khối lượng từ 150 đến 200g

- Nguyên tắc: gây viêm đại tràng bằng dung dịch acid acetic 3% đưa qua đường hậu môn

[26]

- Tiến hành: chuột được nuôi ổn định 5 ngày trước khi thí nghiệm Chia chuột ngẫu

nhiên thành các lô thí nghiệm

+ 7 ngày đầu cho chuột uống:

Lô chứng trắng: uống nước cất 1ml/100g

Lô chứng bệnh: uống nước cất 1ml/100g

Lô chứng dương: uống sulfasalazin 100mg/kgtt

Lô thử 1: uống cao đặc VTA 2,0g/kgtt

Lô thử 2: uống cao đặc VTA 4,0g/kgtt

+ Ngày thứ 6, thứ 7 không cho chuột ăn

+ Ngày thứ 8 cho chuột uống các chất thử như trên

Sau 1h, chuột cả 5 lô được gây mê bằng thiopental

Dùng dây polyethylen để đưa 2ml dung dịch acid acetic 3% vào sâu 6 cm trong đại tràng tính từ hậu môn

Giữ chuột ở tư thế Trendelenburg trong 30s Với chuột ở lô 1, thay dung dịch acid acetic 3% bằng dung dịch NaCl 0,9% [26]

Sau 24h: giết chuột, mổ lấy đại tràng Đánh giá mức độ viêm đại thể và vi thể suy ra tác dụng chống viêm

- Chỉ tiêu theo dõi

+ Quan sát đại thể đại tràng

Quan sát phần đại tràng sau khi được bóc tách

Đánh giá mức độ tổn thương của đại tràng theo thang điểm như bảng 2.1 [13], [31]

Các mẫu đại tràng được đánh giá dưới kính hiển vi soi nổi và điểm tổn thương được đánh giá bởi một người quan sát độc lập, các mẫu nghiên cứu được làm mù

Bảng 2.1 Thang điểm đánh giá mức độ tổn thương của đại tràng

2 Sung huyết và dày thành, gần loét ( biểu mô bong trợt)

4 2 hoặc nhiều vị trí viêm và loét ở =< 1 cm

5 2 hoặc nhiều vị trí viêm và loét ở > 1 cm

6 Khu vực tổn thương >= 2 cm dọc theo chiều dài đại tràng

7 Khu vực tổn thương >= 3 cm dọc theo chiều dài đại tràng

8 Khu vực tổn thương >= 4 cm dọc theo chiều dài đại tràng

9 Khu vực tổn thương >= 5 cm dọc theo chiều dài đại tràng

10 Khu vực tổn thương >= 6cm dọc theo chiều dài đại tràng

+ Quan sát vi thể đại tràng

Mô bệnh học: sau khi giết động vật, mẫu đại tràng được cố định bằng dung dịch Carnoy, vùi trong parafin, cắt lát mỏng 5-7 µm, nhuộm hematoxylin-eosin và quan sát dưới kính hiển vi quang học để đánh giá mức độ tổn thương và mức độ hoại tử trên hình ảnh vi thể đại tràng của các mẫu nghiên cứu Mức độ tổn thương được đánh giá theo thang điểm ở bảng 2.2 [34], [41], [54] Mức độ hoại tử được mô tả theo 4 cấp độ: không hoại tử, hoại tử rải rác, hoại tử ổ nhỏ và hoại tử diện rộng Mỗi lô được đánh giá

6 tiêu bản Tiêu bản được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, trường Đại học Y Hà Nội

Bảng 2.2 Thang đánh giá tổn thương theo Vilaseca et al (1990)

Loét

Độ sâu tổn thương

- Nguyên tắc: đánh giá tác dụng của thuốc trên hoạt động cơ trơn ruột thỏ cô lập

theo “phương pháp Magnus” [42]:

+ Nhu động cơ trơn ruột thỏ được khuyếch đại và được ghi trên băng

+ Gây tăng co bóp cơ trơn ruột cô lập bằng acetylcholin, nhỏ thuốc nghiên cứu ở những nồng độ khác nhau

+ So sánh biên độ và tần số co bóp sau khi nhỏ acetylcholin và sau khi nhỏ mẫu thử thuốc

- Tiến hành

+ Cao đặc Vị tràng an được phân tán đều trong nước cất với tỷ lệ 0,1 g cao/ 1ml Dùng dịch này để pha thành các dung dịch chế phẩm thử trong dung dịch Tyrod có nồng độ : 2,5 x 10-4 g/ ml, 5 x 10-4 g/ ml, 1 x 10-3 g/ ml, 1,5 x 10-3 g/ ml,

2 x 10-3 g/ml, 2,5 x 10-3 g/ ml

+ Cô lập ruột thỏ từ hỗng tràng, nuôi trong dung dịch Tyrod ruột