Phân lập và đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của một số hợp chất từ thân cây dâu tằm

Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm .... Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ MỸ LINH

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG

ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO

CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ

THÂN CÂY DÂU TẰM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ MỸ LINH

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG

ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO

CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ

THÂN CÂY DÂU TẰM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tại tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội và Khoa Hóa Thực vật 2 – Viện Dược liệu, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô, anh chị, các bạn và các em sinh viên Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc tới

PGS TS Nguyễn Thu Hằng, người thầy đã luôn giành thời gian, tâm huyết chỉ

bảo tôi thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Đỗ Thị Hà đã nhiệt tình hướng

dẫn, giúp đỡ và động viên tôi để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Dược liệu, trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị nhân viên khoa Hóa Thực vật 2 - Viện Dược liệu đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè – những người đã luôn gắn bó, ủng hộ và khích lệ tôi trong trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 4 năm 2017

Học viên

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Về thực vật 3

1.2 Thành phần hóa học 4

1.3 Tác dụng sinh học 11

1.4 Công dụng 15

1.5 Độc tính cấp 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Hóa chất, dung môi 16

2.1.3 Máy móc, thiết bị và dụng cụ 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm 17

2.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm 18

2.2.3 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ thân dâu tằm 18

2.2.4 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các hợp chất phân lập được 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm 19

2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch chiết

methanol, các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm và các chất phân

lập từ thân cây dâu tằm 19

2.3.3 Phân lập các hợp chất từ thân dâu tằm 20

2.3.4 Xử lý kết quả thực nghiệm 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm 21

3.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm 23

3.3 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của vỏ thân dâu tằm 24

3.4 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được 27

3.4.1 Hợp chất Me01 27

3.4.2 Hợp chất Me02 29

3.4.3 Hợp chất Me04 29

3.5 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của các hợp chất phân lập được ……… 31

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BHA beta hydroxy acid

HDL high density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng cao)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Các hợp chất polyphenol trong thân và cành dâu tằm 4

1.2 Các hợp chất triterpenoid trong thân và cành dâu tằm 6

1.3 Thành phần hóa học các bộ phận khác của cây dâu tằm 7

3.1 Kết quả chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn

từ dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm

23

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro

của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi

thân và vỏ thân dâu tằm

23

3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro

của acid ursolic, oxyresveratrol và kuwanon G

31

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất dịch chiết methanol và

các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm

22

3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập các hợp chất từ phân

đoạn ethyl acetat của vỏ thân dâu tằm

27

3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất Me01: Acid ursolic 28

3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất Me02: Oxyresveratrol 29

3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất Me04: Kuwanon G 31

4.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình nghiên cứu phát triển thuốc từ

dược liệu với cách tiếp cận phân lập theo định hướng tác

dụng sinh học

34

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong quá trình sinh tổng hợp acid uric, xanthin oxidase được coi là enzym chìa khóa do xúc tác phản ứng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và phản ứng oxy hoá xanthin thành acid uric Do đó, các chất ức chế xanthin oxidase - điển hình là allopurinol đang được sử dụng phổ biến trong lâm sàng để điều trị bệnh gút và các bệnh có liên quan đến tăng acid uric máu [116] Tuy nhiên, nhược điểm của hợp chất này là các tác dụng không mong muốn, đặc biệt là phản ứng quá mẫn và không hiệu quả trong điều trị cơn gút cấp vì không có tác dụng chống viêm [111] Vì vậy, việc tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính ức chế xanthin oxidase và khắc phục được những nhược điểm kể trên của allopurinol là cần thiết, trong đó các hợp chất tự nhiên là đối tượng đáng chú ý và được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây

Cây Dâu tằm có tên khoa học là Morus alba L., thuộc họ Dâu tằm

(Moraceae), là loại cây được trồng phổ biến ở nhiều nơi để làm thức ăn cho tằm, lấy quả, làm thuốc Các bộ phận của cây dâu tằm như lá (tang diệp), quả (tang thầm), cành (tang chi), vỏ rễ (tang bạch bì) đều là những vị thuốc có giá trị trong

y học cổ truyền, được dùng để chữa nhiều bệnh như đau nhức đầu, hoa mắt chóng mặt, cao huyết áp, ho hen, đau nhức xương khớp, phù thũng, bụng trướng, mắt có màng,… [4], [10] Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh tác dụng sinh học của các bộ phận cây dâu tằm (lá, quả, rễ,…) như tác dụng chống oxy hóa [33], [38], [45], [137], hạ glucose máu [137], [13], [14], [53], [101], hạ lipid máu [49], [67], [82], [151], kháng khuẩn [112], [130], [63], kháng virus [48], [84], chống viêm [50], bảo vệ gan [69], [108], chống ung thư [52], [90] … Đáng chú ý, dịch chiết cành dâu tằm có tác dụng hạ acid uric huyết thanh và tăng thải trừ acid uric nước tiểu trên chuột nhắt trắng có tăng acid uric máu [125] Một nghiên cứu ở Việt Nam đã công bố cao chiết cồn tang chi

(cành non) có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro [15] Thân là bộ phận có

2

đặc tính sinh học rất gần gũi với cành dâu tằm Cho đến nay tác dụng ức chế xanthin oxidase của thân dâu tằm còn chưa được nghiên cứu

Mặt khác, phân lập các hợp chất theo định hướng tác dụng sinh học đang là

xu hướng chung của hóa thực vật trong giai đoạn hiện nay Phương pháp tiếp cận này giúp việc tìm kiếm và phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học tiết kiệm được đáng kể chi phí và thời gian thực hiện với xác suất thành công cao hơn so với phương pháp phân lập ngẫu nhiên được áp dụng phổ biến vài thập kỷ trước [119] Vì vậy, đề tài “Phân lập và đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase

in vitro của một số hợp chất từ thân cây dâu tằm” được thực hiện nhằm mục

đích nghiên cứu thành phần hóa học của thân dâu tằm theo định hướng tác dụng

ức chế xanthin oxidase với hai mục tiêu sau:

1 Phân lập 2-3 hợp chất từ thân cây dâu tằm theo định hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase

2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các chất phân lập

được

3

PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1 Về thực vật

1.1.1 Vị trí phân loại chi Morus

Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [133], chi Morus có vị trí phân

loại như sau:

Giới: Plantae (Thực vật)

Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan)

Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan) Phân lớp: Dilleniidae (Sổ) Bộ: Urticales (Gai) Họ: Moraceae (Dâu tằm)

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Morus

Cây bụi, rụng lá, có nhựa mủ; đơn tính cùng gốc hoặc khác gốc Đâm chồi vào mùa đông, có 3-6 vảy chồi xếp đè lên nhau, có lá kèm Lá có nhiều hình dạng; mép lá nguyên hay xẻ thùy sâu, có răng cưa; gân lá hình lông chim, có từ 3-5 gân nhỏ từ gân chính Hoa đực mọc ở nách lá, mọc thành dạng bông, có nhiều hoa, cuống ngắn; có 4 cánh, xếp đè lên nhau; nhị hướng vào trong Hoa cái mọc thành dạng bông hay đầu, không cuống; có 4 cánh xếp đè lên nhau, bầu nhụy 1 ô; núm nhụy xẻ đôi, có lông tơ hoặc nốt sần Đài hoa mọng nước tạo thành quả tụ Hạt hình cầu, có nội nhũ, phôi hướng vào trong, có lá mầm hình elip [29]

Trên thế giới, chi Morus có khoảng 16 loài, phân bố rộng rãi ở khu vực ôn

đới, miền núi nhiệt đới châu Phi, Indonesia và Nam Mỹ [29]

Ở Việt Nam, chi Morus có 5 loài và gần như tất cả đều đã được đưa vào trồng trọt Đó là các loài: Morus alba L (dâu tằm), Morus nigra L (dâu quả đen), Morus australia Poir (dâu tàu), Morus macroura Miq (dâu chùm dài),

Morus cathayana Hemsl.f culta Gagnep (dâu bầu) [8], [11] Trong số đó, loài Morus alba L là loài phổ biến nhất

4

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Morus alba L

Cây bụi, cao khoảng 3-10 m Cành có lông mịn, chồi mọc vào mùa đông, màu đỏ nâu, hình trứng, có lông mịn Lá kèm hình mũi mác, dài 2-3,5 cm, có lông ngắn [29] Lá mọc so le [10], cuống lá dài 1,5-5,5 cm, có lông, phiến lá có hình bầu dục hoặc hình trứng rộng [29]; mép có răng cưa, có khi chia thùy [10], [29], đỉnh nhọn hoặc tù [10], [29], dài 5-30 cm, rộng 5-12 cm, có lông mịn trên gân lá [29] Ra hoa khoảng từ tháng 3-tháng 5 [29] Hoa đực có 4 lá đài [10], [29], mọc thành dạng bông [10], [29] dài 2-3,5 cm; có lông dày màu trắng; có đài màu xanh nhạt, hình elip rộng, chỉ nhị hướng trong, bao phấn 2 ô, hình cầu hoặc hình thận [29] Hoa cái dài 1-2 cm, có lông mịn, cuống dài 5-10 mm, có lông [29]; không cuống, cánh hoa hình trứng, bầu nhụy không cuống, vỏ thân có nốt sần, cành phân nhánh [29] Mùa quả từ tháng 5-tháng 8 [29] Quả non màu xanh trắng hoặc đỏ, khi chín chuyển sang đen tím [10], [29], hình trứng, hình elip hoặc hình trụ, dài 1-2,5 cm [29]

Cây dâu có nguồn gốc Trung Quốc, đã được di thực và trồng nhiều nơi ở Việt Nam [10]

1.2 Thành phần hóa học

1.2.1 Thành phần hóa học của thân và cành dâu tằm

Căn cứ vào các tài liệu thu thập được, thành phần hóa học của thân dâu tằm

(Morus alba L.) gồm hai nhóm hợp chất chính là polyphenol và triterpenoid

1.2.1.1 Polyphenol

Cho đến nay đã phát hiện 10 hợp chất polyphenol trong thân và cành dâu tằm Kết quả được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Các hợp chất polyphenol trong thân và cành dâu tằm

8 Oxyresveratrol

[16], [65], [117]

Bảng 1.2 Các hợp chất triterpenoid trong thân và cành dâu tằm

3 Moruslanosteryl acetat

[21]

n-1.2.2 Thành phần hóa học các bộ phận khác của cây dâu tằm

Các bộ phận khác của dâu tằm gồm các nhóm chất sau: flavonoid, alcaloid, coumarin và các hợp chất phenol khác Kết quả được trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Thành phần hóa học các bộ phận khác của cây dâu tằm

Flavonoid

40 Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid Quả [137]

41 Quercetin 7-O-β-D-glucopyranosid Quả [137]

56 Cyanidin 3-O-β-D-galactopyranosid Quả [47]

11

1.3.1 Tác dụng đối với hoạt tính enzym xanthin oxidase và acid uric máu

Dịch chiết ethanol/methanol các bộ phận của dâu tằm có tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase (XO) và hạ acid uric máu Cụ thể, cao chiết cồn cành

dâu tằm (RAE) có tác dụng ức chế XOD in vitro với giá trị IC50 là 26,51 mg/ml, RAE liều 400 mg/kg có tác dụng hạ acid uric huyết với I% là 24,28 %; trong khi allopurinol 10 mg/kg (tiêm phúc mạc) có tác dụng hạ acid uric huyết với I% là 47,62 % trên chuột tăng acid uric gây bởi kali oxonat (p < 0,05) Tại nồng độ

200 µg/ml, dịch chiết ethanol của quả ức chế 21,4 % hoạt tính xanthin oxidase, trong khi allopurinol 200 µg/ml có giá trị ức chế I% là 68,2 % [30], dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 70 % có giá trị I% tương ứng là 100 % và 96,2 % ở

rễ [33]

Dịch chiết lá dâu tằm có tác dụng khả năng ức chế quá trình peroxid hóa acid linoleic [12], lipid [135], dọn gốc tự do DPPH [25], [31], [137], ức chế TBARS ở gan chuột béo phì [72] và đưa các trị số SOD, CAT, GPx, GSH về giá trị bình thường trên chuột được tiêm isoprenalin [45], [135], [137]

Dịch chiết quả dâu tằm có tác dụng dọn gốc tự do DPPH [152] và gốc hydroxyl [152] Chế độ ăn chứa bột quả giúp làm giảm nồng độ TBARS, RBC

và SOD trong máu và gan trên mô hình chuột béo phì do chế độ ăn [145]

Dịch chiết ethanol và dịch chiết nước vỏ rễ dâu tằm có khả năng dọn gốc tự

do DPPH và ức chế gốc nitric oxid [157] làm giảm nồng độ paraoxonase và chất phản ứng của acid barbituric (TBARS) trong máu trên chuột béo phì [49]

Các hợp chất emaclurin, rutin, isoquercitrin, resveratrol và morin có mặt trong cành có tác dụng ức chế gốc tự do, các ion phức và peroxid hóa lipid [33] Mulberrofuran K và steppogenin được phân lập từ cao chiết methanol lá dâu tằm

có khả năng dọn gốc tự do DPPH với IC50 tương ứng là 168,5 và 53,3 µg/ml [3]

1.3.3 Tác dụng hạ đường huyết

Dịch chiết lá dâu tằm có tác dụng ức chế α-glucosidase [148] và hạ glucose máu trên mô hình gây tăng đường huyết ở động vật và trên chuột béo phì [13], [14], [18], [53], [61], [72], [94], [118]; làm giảm nồng độ glucose máu trên người tình nguyện sau khi uống sucrose và sau ăn [79], [99]

Các anthocyan (ANCs) (Cyanidin 3-O-glucosid, Cyanidin 3-rutinosid, Pelargonidin 3-glucosid, Pelargonidin 3-rutinosid) được chiết từ quả dâu tằm

có tác dụng hạ glucose máu trên chuột béo phì Hơn nữa, ANCs có tác dụng ngăn ngừa các thoái hóa ở tế bào đảo tụy [26] Các hợp chất 2R/2S-euchrenon, chalcomoracin, moracin C và moracin D phân lập từ dịch chiết ethanol lá ức chế α-glucosidase [148] Rutin và acid chlorogenic phân lập từ lá có tác dụng hạ đường huyết trong bệnh đái tháo đường ở chuột [61]

1.3.4 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết methanol của vỏ rễ dâu tằm có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư đại tràng SW480 Phân đoạn methanol dịch chiết nước lá dâu tằm tại nồng độ tương đương 0,1 g lá/ml ức chế hơn 80 % dòng tế bào ung thư gan Hep G2 [52]

Các hợp chất quercetin–3–O-β-D-glucopyranosid và quercetin-3,7–di–O- β-D-glucopyranosid được chiết từ lá dâu tằm có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư máu HL 60 và ức chế hoạt động của topoisomerase II [73]

7, 2', 4', 6'-tetrahydoroxy-6-geranylflavanon phân lập từ rễ có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư gan dRLh84 [81] Hợp chất 5,2'-dihydroxyflavanon-7,4'-di-O-β-D-glucosid (steppogenin-7,4'-di-O-β-D-glucosid) phân lập từ vỏ rễ dâu tằm có tác dụng ức chế u nang buồng trứng HO-8910 [93] Các flavonoid (3′-geranyl-3-prenyl-2′,4′,5,7-tetrahydroxyflavon, 3′,8-diprenyl-4′,5,7-trihydroxy flavon, kuwanon S, 8-geranylapigenin, cyclomulberrin, sanggenon J và K, cyclomorusin, morusin, atalantoflavon và kaempferol) phân lập từ dịch chiết

14

methanol của lá dâu tằm có tác dụng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF–7 và ung thư gan Hep3B [2], [42]

1.3.5 Tác dụng đối với lipid máu

Dịch chiết ethanol của quả và lá dâu tằm có tác dụng giảm nồng độ triglycerid và cholesterol máu, tăng nồng độ HDL huyết thanh đồng thời làm giàm sự tích lũy mỡ ở gan và cải thiện tình trạng stress oxy hóa trên động vật béo phì và đái tháo đường[19], [32], [36], [49], [56], [60], [136], [80], [109], [113] [151] Trên bệnh nhân rối loạn lipid nhẹ, dịch chiết nước lá dâu tằm có tác dụng hạ triglycerid máu và LDL, nồng độ protein phản ứng C và tăng nồng độ HDL [82]

Mulberrosid A và oxyresveratrol được phân lập từ dịch chiết ethanol rễ dâu tằm có tác dụng hạ cholesterol, LDL và tăng nồng độ HDL (p < 0,05) trong máu

ở chuột rối loạn lipid máu do chế độ ăn giàu chất béo và do Triton WR-1339 [67]

1.3.6 Tác dụng tăng cường miễn dịch

Dịch chiết methanol lá dâu tằm (MRA) với liều 100 mg/kg (uống) làm tăng globulin huyết thanh Ngoài ra, MRA liều 100 mg/kg có tác dụng ức chế quá trình giảm bạch cầu do cyclophosphomid gây ra [28]

Polysaccharid từ dịch chiết nước của vỏ rễ dâu tằm ở các nồng độ 0,1; 1;

10 và 100 µg/ml có tác dụng tăng cường miễn dịch thông qua tăng số lượng tế bào lympho B và lympho T lách chuột [75]

15

Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của moracin M-6,

3'-di-O-β-D-glucopyranosid được phân lập từ lá dâu tằm cho thấy IC50 = 0,29 mg/ml trong khi acid kojic có IC50 = 1,30 mg/ml [85] Oxyresveratrol được phân lập từ dâu tằm nồng độ 0,3-5 µM có tác dụng ức chế quá trình oxi hóa dopa của tyrosinase

từ 25 - 84 % và IC50 = 1 µM [100]

1.3.8 Tác dụng khác

Một số tác dụng khác của dịch chiết dâu tằm đã được công bố như tác dụng chống trầm cảm [87], [144], giảm stress [62], [97], [98], [122], [123], chữa hen [76], giảm tình trạng thiếu máu não [70], kháng virus HIV [124], [122], virus herpes typ 1,2 [44], virus viêm gan B [54], tăng cường nhận thức [138], chống viêm [34], [37], [50], [69], [117], bảo vệ gan [59], [69], diệt giun sán [58], [120], kháng khuẩn[112], [130] và củng cố hệ tim mạch [74], [90], [135]

1.4 Công dụng

Các bộ phận của dâu tằm là những vị thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền Vỏ rễ dâu tằm (tang bạch bì) được dùng chữa ho lâu ngày, hen, ho có đờm, băng huyết, chữa sốt, chữa cao huyết áp Lá dâu (tang diệp) dùng chữa phong ôn biểu chứng, lao nhiệt sinh ho, đầu nhức mắt đỏ, nước mắt chảy nhiều, hoa mắt Cành dâu (tang chi) dùng chữa phế nhiệt sinh ho, ho ra máu, bụng trướng, đau nhức xương khớp, chân tay co duỗi khó khăn Quả dâu (tang thầm) dùng chữa bệnh tiêu khát, mắt có màng, tai ù, huyết hư, bí tiểu tiện [4], [10]

chiếu với khóa phân loại của Thực vật chí Trung Quốc [155] đã xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Morus alba L., họ Dâu tằm (Moraceae)

Thân cây dâu tằm sau khi thu hái, tách riêng vỏ thân và lõi thân Lõi thân được thái mỏng, vỏ thân được cắt thành những đoạn ngắn 1-2 cm, sấy khô, bảo quản trong túi nilon, để nơi khô ráo, thoáng mát

Ảnh chụp mẫu dâu tằm nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1

Hình 2.1 Ảnh chụp thân cây dâu tằm

2.1.2 Hóa chất, dung môi

Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có:

Phần lõi thân dâu tằm Phần vỏ thân dâu tằm

17

- Các dung môi: Ethanol, methanol, n-hexan, chloroform, ethyl acetat,

dichloromethan, DMSO (Sigma),

- Enzym xanthin oxidase của hãng Sigma

- Thuốc thử: Acid sulphuric 10% trong ethanol

2.1.3 Máy móc, thiết bị và dụng cụ

- Sắc ký cột: Các loại cột có đường kính từ 1,6-5,5 cm, chiều dài từ 15-50 cm; với các chất nhồi cột: Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), silica gel pha thuận (silica gel 60; 0,040-0,063 mm; 230 - 400 mesh; Merck), silica gel pha đảo YMC (30-50 m; Fujisilisa Chemical Ltd.)

- Bản mỏng tráng sẵn pha thuận DC-Alufolien 60 F254 (Merck) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck)

- Dụng cụ thủy tinh: Pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu, cốc có

mỏ, ống đong, phễu thủy tinh, ống đựng mẫu NMR,…

- Máy đo độ ẩm MB 25 Ohaus (Mỹ)

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R-200 (Đức)

- Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AVANCE AM500 NMR tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

FT Máy đo quang Hitachi UFT 1900

- Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg

- Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01 g

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Đĩa 96 giếng đáy phẳng Costar 3635 (Corning)

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kì) và máy

ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được mục tiêu nghiên cứu để ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

 Mục tiêu 1: Phân lập 2-3 hợp chất từ thân cây dâu tằm theo định hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase

2.2.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân

và vỏ thân dâu tằm

18

Chiết xuất dịch chiết methanol từ lõi thân và vỏ thân dâu tằm

Tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được 4 phân đoạn tương ứng là phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat và nước

2.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm

Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của dịch chiết

methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm Lựa chọn phân đoạn dịch chiết có tác dụng tốt nhất để tiến hành phân lập các chất tinh khiết

2.2.3 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ thân dâu tằm

Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết đã được lựa chọn ở mục 2.2.2

 Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các hợp chất phân lập được

2.2.4 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các hợp chất phân lập được

Thiết kế nghiên cứu của luận văn được tóm tắt ở sơ đồ hình 2.3

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Lõi thân và vỏ thân

Dịch chiết methanol lõi thân và vỏ thân

Dịch chiết các phân đoạn

19

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân

và vỏ thân dâu tằm

Bột dược liệu được chiết hồi lưu 3 lần với methanol ở nhiệt độ 600C với thời gian chiết tương ứng là 3 giờ, 2 giờ 30 phút và 2 giờ Gộp các dịch chiết thu được dịch chiết methanol Lấy 1/4 thể tích dịch chiết methanol cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn methanol Lấy 3/4 thể tích dịch chiết methanol còn lại đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn Phân tán cắn trong nước nóng (tỉ lệ 1:4), sau đó chiết lỏng-lỏng lần lượt với các với các dung môi n-hexan, chloroform, ethyl acetat (tỉ lệ hai pha 1:1) thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng là phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat và nước Các phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy thu được cắn phân đoạn n-hexan, cắn phân đoạn cloroform, cắn phân đoạn ethyl acetat và cắn phân đoạn nước

2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch chiết

phân lập được từ thân cây dâu tằm

Tác dụng ức chế xanthin oxidase được đánh giá trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635 theo phương pháp được mô tả bởi Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự [104], với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm Trên mỗi đĩa UV 96 giếng Costar 3635 gồm có: giếng chứng và các giếng thử Trong các giếng chứng/thử được cho tương ứng gồm: 50 µl dung dịch đệm/dung dịch thử, 35 µl dung dịch đệm phosphat 70 mM, pH= 7,5, 30

µl dung dịch enzym (0,01U/ml trong dung dịch đệm phoshat 70 mM, pH=7,5) được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng Sau khi ủ ở 25oC trong 15 phút, thêm

60 µl xanthin 150 µM, tiếp tục ủ ở 25oC trong 30 phút Ngừng phản ứng bằng cách cho thêm 25 µl HCl 1N, đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 290nm Song song với mỗi mẫu chứng, mẫu thử có một mẫu trắng của chứng, mẫu trắng

20

của thử được tiến hành tương tự nhưng thay đổi trình tự cho enzym vào giếng (enzym được cho vào sau HCl 1N) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ Giá trị phần trăm ức chế (I %) của mẫu thử tại một nồng độ nhất định được tính theo công thức:

Trong đó: OD: độ hấp thụ ở bước sóng 290 nm;

Nồng độ ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase (IC50) của mẫu được xác định dựa trên giá trị phần trăm ức chế tại các nồng độ khác nhau (6 nồng độ/mẫu), sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến với mô hình phù hợp trên phần mềm Graphpad Prism 5

2.3.3 Phân lập các hợp chất từ thân dâu tằm

- Lựa chọn phân đoạn dịch chiết từ thân cây dâu tằm có tác dụng ức chế

xanthin oxidase in vitro mạnh nhất để tiến hành phân lập các hợp chất

- Phân lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký cột [9]

- Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng [9], [17]

- Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được xác định dựa trên số liệu phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

2.3.4 Xử lý kết quả thực nghiệm

Kết quả thực nghiệm được lưu trữ và xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Graphpad Prism

21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân

và vỏ thân dâu tằm

Dược liệu (vỏ thân hoặc lõi thân) được xay thành bột thô, xác định độ

ẩm của bột dược liệu bằng máy đo độ ẩm MB 25 Ohaus (Mỹ) cho kết quả bột của lõi thân và vỏ thân có độ ẩm tương ứng là 10,15 % và 11,20 % Bột dược liệu được chiết xuất theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.1

Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm được trình bày ở hình 3.1

22

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất dịch chiết methanol và các phân

đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm

Cắn PĐ chloroform

Chloroform thu hồi

Ethyl acetat thu hồi

n-hexan thu hồi

Cắn PĐ n-hexan Cắn methanol

tổng

23

Từ 500,19 g lõi thân và 500,12 g vỏ thân dâu tằm, tiến hành chiết xuất theo sơ đồ hình 3.1 thu được cắn methanol và cắn các phân đoạn dịch chiết với khối lượng được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn từ dịch

chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm

3.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch chiết

methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm

Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch chiết methanol và các

phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm được đánh giá theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2, mỗi mẫu thử được đánh giá tại các nồng độ 3, 10, 30,

50, 100 và 300 µg/ml Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của dịch

chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết lõi thân và vỏ thân dâu tằm

tin cậy

của IC 50

38,78

- 405,6

38,17

- 189,0

-

58,51

- 359,7

41,23 – 56,04

92,80

- 247,2

21,06

- 52,31

10,70

- 26,28

24

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.2 cho thấy:

- Dịch chiết toàn phần của vỏ thân và lõi thân đều thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase với giá trị phần trăm ức chế I% ở nồng độ 100 µg/ml tương ứng là 59,39% và 46,99 %; ở nồng độ 300 µg/ml tương ứng là 78,73%

và 80,98% IC50 lần lượt là 84,94 và 125,4 µg/ml

- Trong các phân đoạn dịch chiết của vỏ thân, phân đoạn ethyl acetat có tác dụng tốt nhất với IC50 = 18,59 µg/ml Trong số các phân đoạn dịch chiết của lõi thân, phân đoạn ethyl acetat có tác dụng tốt nhất với IC50 = 33,19 µg/ml

- Trong tất cả các phân đoạn dịch chiết của vỏ thân và lõi thân, phân đoạn ethyl acetat của vỏ thân có tác dụng tốt nhất vì có IC50 nhỏ nhất (18,59 µg/ml) và tại nồng độ 50 µg/ml ức chế được đến 95,19 % hoạt tính xanthin oxidase

Vì vậy, phân đoạn ethyl acetat vỏ thân dâu tằm được lựa chọn để tiến

hành phân lập các hợp chất tinh khiết

3.3 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của vỏ thân dâu tằm

3.3.1 Sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel pha thuận

- Cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính 5,5 cm, rửa sạch, để khô, cố định

trên giá theo phương thẳng đứng Đáy cột được lót một lớp bông mỏng

- Chất nhồi cột: Silica gel pha thuận (kích thước hạt 0,040 - 0,063 mm)

được hoạt hóa trong tủ sấy (105oC trong 2-3h), để nguội trong bình hút ẩm rồi phân tán trong dung môi dichloromethan thành hỗn dịch, đổ từ từ hỗn dịch theo thành cột, vừa đổ cho vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén chặt, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt Chiều dài chất nhồi cột là 10 cm Cột được để ổn định trong 8 giờ ở nhiệt độ phòng

- Đưa chất lên cột: 25,13 g cắn ethyl acetat vỏ thân dâu tằm được hòa

tan trong một thể tích tối thiểu methanol, thêm khoảng 15 g silica gel pha thuận đã hoạt hóa, để bay hơi dung môi trong tủ sấy tới khi thu được bột khô

25

và tơi Nghiền hỗn hợp bột trong cối sứ Nhồi bột từ từ lên cột, vừa cho vừa

gõ nhẹ vào thành cột để hỗn hợp nén chặt, bằng mặt Lót một lớp bông mỏng lên trên

- Rửa giải: Sử dụng hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp dichloromethan

(DCM) và methanol (MeOH) gradient (1:0, 1:1, 0:1, v/v) Hứng các phân đoạn vào từng bình hứng riêng biệt, mỗi bình hứng thể tích khoảng 100 ml dịch rửa giải Dịch rửa giải ở các bình hứng được kiểm tra bằng SKLM pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (10:1) Các sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng UV254 nm và UV365 nm, sau đó phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng để hiện màu Gộp các bình hứng có sắc ký đồ giống nhau Kết quả thu được 12 phân đoạn ký hiệu tương ứng từ PĐ1 đến PĐ12

3.3.2 Phân lập chất từ phân đoạn PĐ 7

- Cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính 3 cm, rửa sạch để khô, cố định trên

giá theo phương thẳng đứng Đáy cột được lót một lớp bông mỏng

- Chất nhồi cột: Sephadex LH-20 được ngâm trong MeOH : H2O (5:1) trong 4 giờ, sau đó được đổ từ từ theo thành cột, vừa đổ cho vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén chặt, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt Chiều dài chất nhồi cột là 40 cm Cột được để ổn định trong 8 giờ ở nhiệt độ phòng

Mở khóa điều chỉnh cho bề mặt dung môi sát bề mặt sephadex, khóa cột

và tiến hành đưa cắn lên cột

- Đưa chất lên cột: 0,73 g cắn PĐ7 được hòa tan trong thể tích tối thiểu methanol - nước (5:1) Dùng pipet đưa dịch lên cột vòng theo thành cột để tránh xáo trộn lớp Sephadex bề mặt và dịch phân bố đều trên bề mặt Sephadex

- Rửa giải: Sử dụng hỗn hợp methanol - nước (5:1) là dung môi rửa giải

Hứng các phân đoạn vào từng bình hứng riêng biệt, mỗi bình hứng khoảng 20

ml dịch rửa giải Dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM pha thuận với hệ

26

dung môi CH2Cl2 - MeOH (8:1), SKLM pha đảo với hệ dung môi MeOH -

H2O (1:2) Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng UV254 nm và UV365 nm, sau đó phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

và hơ nóng để hiện các vết Gộp dịch rửa giải ở các bình hứng có sắc ký đồ giống nhau, thu được 6 phân đoạn (F7.1 - F7.6) Phân đoạn F7.3 thu được chất kết tủa màu vàng nhạt Sau khi gạn dịch và rửa tủa bằng dichloromethan thu được hợp chất Me02 (50 mg)

- Cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính 1,5 cm; rửa sạch, để khô, cố định

trên giá theo phương thẳng đứng Đáy cột được lót một lớp bông mỏng

- Chất nhồi cột: Silica gel pha đảo, kích thước hạt 30-50 µm, được ngâm

trong methanol, khuấy đều tạo hỗn dịch Đổ từ từ hỗn dịch thu được theo thành cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén chặt, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt Chiều dài chất nhồi cột là 30 cm Cột được để

ổn định trong 8 giờ ở nhiệt độ phòng

Cho hỗn hợp dung môi rửa giải MeOH-H2O (1:2) lên cột, mở khóa điều chỉnh cho bề mặt dung môi sát bề mặt silica gel, khóa cột và tiến hành đưa cắn lên cột

- Đưa chất lên cột: 0,85g cắn PĐ10 được hòa tan trong lượng tối thiểu methanol Dùng pipet đưa dịch lên cột vòng theo thành cột để tránh xáo trộn lớp silica gel bề mặt và dịch phân bố đều trên bề mặt silica gel

- Rửa giải: Sử dụng hỗn hợp MeOH - H2O 1:2 (khoảng 100 ml), sau đó dùng hỗn hợp MeOH – H2O (1:1) là dung môi rửa giải Hứng các phân đoạn vào từng ống hứng riêng biệt, mỗi ống hứng khoảng 5 ml dịch rửa giải Dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (7:1), SKLM pha đảo với hệ dung môi MeOH - H2O (3:1) Các sắc ký

đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng UV254 nm và UV365 nm, sau đó phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng để

27

hiện vết Gộp dịch rửa giải ở các ống hứng có sắc ký đồ giống nhau, thu được

5 phân đoạn (F10.1 – F10.5) Phân đoạn F10.2, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 1 chất sạch có khối lượng 35 mg, ký hiệu Me04

Quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của vỏ thân dâu tằm được tóm tắt ở sơ đồ hình 3.2

Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl

acetat của vỏ thân dâu tằm

3.4 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

SKC pha đảo MeOH:H 2 O (1:2, 1:1) Me01

bằng DCM

Me02

10.5 10.4

10.2

Me04 Cất thu hồi dung môi

Phân tích các phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy tín hiệu của proton của

nhóm hydroxymetin δH 3,08 ppm (1H, dd, J = 11,0 Hz, 5 Hz, H-3) tương ứng với tín hiệu cacbon ở δC 79,4 (C-3), nhóm cacbonyl chuyển dịch về trường

thấp đặc trưng ở δC 181,4 (C-28) Sự có mặt của nhóm metin olefinic thể hiện

qua tín hiệu ở δH 5,14 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-12) và δC 126,5 (C-12) Kết hợp phân tích các phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy hợp chất Me01 có 30 nguyên

tử carbon với 7 nhóm CH, 7 nhóm CH3, 9 nhóm CH2 và 7 carbon bậc 4

Với các phân tích trên, kết hợp so sánh với các số liệu phổ đã công bố

trong tài liệu tham khảo [24] cho phép xác định hợp chất Me01 là acid

3β-hydroxyurs-12-en-28-oic hay acid ursolic có cấu trúc trình bày ở hình 3.3

12 13 14 15 17 18 19 20

(C-Trên phổ 13C-NMR cho thấy 14 tín hiệu C, trong đó có bốn cacbon vòng

thơm liên kết với hydroxy xuất hiện ở δ 159,6 (C-3, C-5); δ 159,1 (C-4ꞌ) và 156,9 (C-2ꞌ) cùng với 10 cacbon lai hóa sp2 ở trong khoảng δC 102,3 đến 141,6 ppm; phổ DEPT cho thấy có 6 carbon bậc 4, 8 carbon bậc 1 và không

có carbon bậc 2 Trên cơ sở số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tài liệu đã

công bố [43], hợp chất Me02 được xác định là oxyresveratrol có cấu trúc

trình bày ở hình 3.4

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất Me02: Oxyresveratrol

3.4.3 Hợp chất Me04

Hợp chất Me04 có dạng vô định hình, màu nâu đỏ Phổ ESI-MS cho pic

ion m/z 693,0 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử là C40H36O11

6,77 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-33); 6,69 (1H, br s, H-3′); 6,56 (1H, d, J = 8,5 Hz,

30

H-5′); 6,21 (1H, br s, H-30); 6,07 (1H, d, J = 8,5Hz, H-32); 6,04 (1H, s, H-6); 5,98 (1H, br s, H-24); 5,96 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-26); 5,17-5,21 (2H, H-10, H- 15); 4,44 (1H, d, J = 7,5Hz, H-19); 3,21-4,70 (2H, m, H-14, H-20); 3,14-3,21

(1H, H-9); 1,70-1,98 (2H, m, H-18); 1,61 (3H, s, H-12); 1,52 (3H, s, H-17); 1,48 (3H, s, H-13)

(C-23); 164,9 (C-25); 162,1 (C-7); 161,5 (C-4′); 161,3 (C-8a); 160,8 (C-2); 157,3 (C-2′); 157,1 (C-5); 157,1 (C-29); 157,1 (C-31); 133,9 (C-27); 133,6 (C-16); 132,1 (C-11); 132,1 (C-33); 132,1 (C-6′); 124,4 (C-15); 122,9 (C-10); 121,4 (C-28); 115,6 (C-3); 113,2 (C-1′); 107,9 (C-26); 107,9 (C-32); 107,9 (C-5′); 107,6 (C-22); 105,4 (C-8); 103,6 (C-30); 103,6 (C-3′); 103,5 (C-4a); 102,8 (C-24); 98,3 (C-6); 47,6 (C-20); 38,6 (C-18); 38,6 (C-19); 25,8 (C-12); 24,5 (C-9); 23,1 (C-14); 23,1 (C-17); 17,7 (C-13)

Phổ 1H-NMR của hợp chất Me04 cho thấy sự có mặt của ba hệ spin

ABX với các tín hiệu δH (ppm): 7,25 (1H, m, H-6ʹ); 6,56 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5ʹ); 5,98 (1H, br s, H-24); 5,96 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-26); 7,42 (1H, m, H- 27); 6,21 (1H, br s, H-30); 6,77 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-33); 6,07 (1H, d, J = 8,5

Hz, H-32) Một nhóm prenyl được nhận biết bằng các tín hiệu đặc trưng tại δH

(ppm): 5,7-5,21 (2H, m, H-10, H-15); 1,61 (3H, s, H-12); 1,48 (3H, s, H-13) Phổ 1H-NMR của hợp chất Me04 cũng cho biết tín hiệu của nhóm

methylcylohexen gồm 4 nhóm proton methin tại δH 5,7-5,21 (2H, m, 10,

H-15); 3,21-4,70 (2H, m, H-14, H-20) và 4,44 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-19), tín hiệu nhóm methylen tại δH 1,70 - 1,98 (2H, m, H-18) và tín hiệu nhóm methyl tại

δH 1,52 (3H, s, H-17) Ngoài ra trên trường thấp còn xuất hiện tín hiệu 2 pic singlet tại 13,0 ppm đặc trưng cho nhóm OH Phổ 13C-NMR và DEPT của

hợp chất Me04 xuất hiện của 40 carbon gồm: 3 nhóm CH3, 2 nhóm CH2, 15 nhóm CH và 20 carbon bậc 4 Từ các tương tác trực tiếp H→C trên phổ HSQC cho phép xác định các vị trí carbon tương ứng Dựa vào các số liệu

31

phổ và tài liệu đã công bố [88] cho phép xác định hợp chất Me04 là kuwanon

G có cấu trúc hóa học trình bày ở hình 3.5

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất Me04: Kuwanon G

3.5 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của các hợp chất phân lập được

Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các hợp chất Me01 (acid

ursolic), Me02 (oxyresveratrol) và Me04 (kuwanon G) được đánh giá theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2 thông qua giá trị phần trăm ức chế I (%) và giá trị IC50 Kết quả được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của

acid ursolic, oxyresveratrol và kuwanon G

Nồng độ

(µg/ml)

Giá trị phần trăm ức chế I%

Me01 (Acid ursolic)

Me02 (Oxyresveratrol)

Me04 (Kuwanon G)

42,08 (55,34 - 76,57)

52,41 (38,03 - 72,75)