Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ (digenea) ký sinh ở cá chẽm (lates calcarifer bloch, 1790) nuôi ở khánh hòa (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ---oo0oo--- NGUYỄN NGUYỄN THÀNH NHƠN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ SONG CHỦ DIGENEA KÝ SINH Ở CÁ CHẼM LATES CALCARIFER BLOCH, 17

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-oo0oo -

NGUYỄN NGUYỄN THÀNH NHƠN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI SÁN

LÁ SONG CHỦ (DIGENEA) KÝ SINH Ở

CÁ CHẼM (LATES CALCARIFER BLOCH,

1790) NUÔI TẠI KHÁNH HÕA

Ngành đào tạo: Nuôi trồng thủy sản

Mã số: 62620301

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Đỗ Thị Hòa

Phản biện 1: PGS.TS Vũ Ngọc Öt

Phản biện 2: TS Nguyễn Thị Thanh Thủy

Phản biện 3: TS Nguyễn Hữu Thịnh

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp

cơ sở họp tại Trường Đại học Nha Trang vào hồi

14 giờ ngày 20 tháng 12 năm 2016

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia

Thư viện Trường Đại học Nha Trang

2 PGS.TS Glenn Allan Bristow

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI

CỦA LUẬN ÁN

1 Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi bằng sự kết hợp giữa hai phương pháp: hình thái học và kỹ thuật sinh học phân tử Kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ thuộc 5 giống, 5 họ ký sinh ở cá chẽm nuôi thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam

Đặc biệt nghiên cứu này đã xác định được loài sán

Pseudometadena celebesensis là ký sinh trùng đặc hữu trên

vật chủ là cá chẽm;

2 Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ nội ký sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi;

3 Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của 1

loài sán lá song chủ Pseudometadena celebesensis có giai

đoạn trưởng thành ký sinh ở ruột của cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

PGS TS Đỗ Thị Hòa Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung, Glenn Allan Bristow, Đỗ Thị Hòa (2010), Thành

phần ký sinh trùng trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi ở Khánh Hòa Tạp Chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Số 6/2010, trang 59-63.ISSN: 0866-7020

2 Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Đỗ Thị Hòa, Glenn Allan Bristow, Phạm Thị Hạnh (2017), “Thành phần và mức độ

nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi tại Khánh Hòa”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 6/2017, tr 90-94

3 Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Đỗ Thị Hòa, Đặng Thúy

Bình, Phạm Thị Hạnh, Trương Thị Oanh (2017), “Nghiên

cứu mối quan hệ phát sinh loài của sán lá song chủ ký sinh

trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang, 2/2017, tr 63-70

MỞ ĐẦU

Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) là đối tượng nuôi có giá

trị kinh tế ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Á và Thái Bình Dương Từ năm 2005, nghề nuôi cá chẽm mới phát triển nhanh chóng ở một số tỉnh ven biển nước ta như Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa, Vũng Tàu Hiện nay, cá chẽm được nuôi thương phẩm trong ao hoặc nuôi lồng trên biển

Tuy nhiên, trong những năm qua nghề nuôi cá chẽm thường xuyên gặp khó khăn do dịch bệnh Ký sinh trùng (KST) là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, gây tổn thất nhiều Trong đó, sán lá song chủ ( Digenea) gây ra các bệnh trên cá là c á c KST

có chu kỳ phát triển phức tạp, qua nhiều giai đoạn ấu trùng, đòi hỏi

có từ 1-2 ký chủ trung gian trong vòng đời, giai đoạn trưởng thành ký sinh trùng này thường ký sinh trong các nội quan của cá như: máu, gan, mật, ruột, dạ dày… , làm chậm sự tăng trưởng, ảnh hưởng đến chất lượng cũng như sản lượng cá nuôi

Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu định danh phân loại đến giống loài của tác nhân gây bệnh ở cá (gồm vi khuẩn và KST) bằng phương pháp truyền thống kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử, nhằm phân loại chính xác đến loài của các ký sinh trùng này và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài Tuy nhiên, dùng kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại đến giống loài của tác nhân gây bệnh như KST ở cá là lĩnh vực còn mới ở Việt Nam Xuất phát từ thực tế như trên, tôi đã được cở sở đào tạo cho phép

thực hiện đề tài nghiên cứu luận án “Nghiên cứu thành phần loài

sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer

Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa”

Mục tiêu: Xác định được thành phần giống loài sán lá song chủ

(Digenea) ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer), đánh giá mối quan

hệ di truyền của các KST này cùng mức độ nhiễm của KST ở cá chẽm nuôi và khả năng gây bệnh của các các loài sán song chủ đã phát hiện được Từ đó đánh giá khả năng gây bệnh của các loài sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

Nội dung nghiên cứu:

1 Xác định thành phần sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

2 Phân loại và xác định mối quan hệ di truyền các loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng kỹ thuật sinh học phân tử

3 Xác định mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa;

4 Khảo sát sự phát triển các giai đoạn ấu trùng của loài sán

Pseudometadena celebesensis ký sinh ở cá chẽm

Ý nghĩa của luận án

- Ý nghĩa khoa học: Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần giống loài, mức độ nhiễm và mối quan hệ di truyền của các loài sán

lá song chủ ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi thương phẩm

tại Khánh Hòa và làm cơ sở cho việc phát triển, mở rộng nghiên cứu trên các loài ký sinh trùng khác

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài này làm cơ sở

để đưa ra biện pháp phòng bệnh do sán lá song chủ gây ra trong nghề nuôi cá chẽm

Điểm mới của luận án:

- Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá song chủ ở

cá chẽm bằng phương pháp hình thái cấu tạo kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử, kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ thuộc 5 giống, 5 họ ký sinh ở cá chẽm nuôi thương phẩm

Ngoài ra đã xác định được loài sán Pseudometadena celebesensis là

ký sinh trùng đặc hữu trên vật chủ là cá chẽm bằng kết hợp phân tích đồng tiến hóa và các công trình nghiên cứu loài sán này

- Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ nội ký sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi

- Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của loài sán lá

song chủ Pseudometadena celebesensis có giai đoạn trưởng thành ký sinh

ở ruột của cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm (Lates calcarifer)

Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) thuộc phân họ cá chẽm

(Latinae) của họ Centropomidae, thuộc bộ cá vược Cá chẽm phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình Dương và

Ấn Độ Dương

Cá chẽm là loài có kích thước lớn, khối lượng tối đa có thể đạt 60

kg Cá tăng trưởng chậm ở giai đoạn đầu, khi đạt 20 – 30g tốc độ tăng trưởng nhanh hơn và chậm lại khi cá đạt khoảng 4 kg

Cá chẽm là loài chuyển đổi giới tính, lúc nhỏ là cá đực, lớn chuyển sang cái

1.2 Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thương phẩm trên

Thế giới và Việt Nam

Cá chẽm được nuôi phổ biến ở nhiều nước thuộc khu vực Châu

Á – Thái Bình Dương, đặc biệt ở các nước trong khu vực Đông Nam

Á như Thái Lan, Phillipine, Đài Loan, Singapore, Malaysia Theo FAO thì đến năm 2009, sản lượng cá chẽm của thế giới đạt 49.299 tấn với đạt giá trị gần 180 triệu USD, trong đó Thái Lan chiếm tới 36% tổng sản lượng, Đài Loan, Malaysia, Indonesia và Úc lần lượt giữ các vị trí tiếp theo

Nghề nuôi cá chẽm ở Việt Nam phát triển mạnh từ năm 2005

và được nuôi trong ao và nuôi lồng b , trong đó hình thức nuôi trong

ao phổ biến hơn Thức ăn sử dụng nuôi cá chẽm thương phẩm hiện này chủ yếu vẫn là cá tạp, do đó dễ gây ô nhiễm môi trường và là điều kiện để cá chẽm dễ bị nhiễm các loài giun sán có vòng đời phức tạp như sán lá song chủ (Digenea)

1.3 Nghiên cứu ký sinh trùng ở cá chẽm Lates calcarifer nuôi

Luận án đã sơ lược tình hình nghiên cứu và thành KST ở cá chẽm trên thế giới từ châu Âu, châu Mỹ đến châu Á như nghiên cứu của Velasquez (1962, 1975); Leong & Wong (1986, 1987, 1990); Liang

& Leong (1991); Marty et al., (2001); Anlan & Robir (2005)

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về KST trên cá biển nói chung và

cá chẽm nói riêng còn hạn chế Một số nghiên cứu KST trên chẽm như Đỗ Thị Hòa và cs (2008); Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn và cs (2010, 2015); Võ Thế Dũng và cs (2012)

Luận án cũng sơ lược tình hình nghiên cứu sán lá song chủ trên cá biển trên Thế giới và Việt Nam:

Ở Châu Âu và Châu Mỹ

Một số công trình tiêu biểu gồm Möller & Anders (1986), Gibson

& Bray (1979); Paradiznik et al (2007); Hollis & Manter (1957); Hisao (1962); Dyer et al (1986); Nahhas & Carlson (1994); Bullard

& Overstreet (2006); Braicovich et al (2009)

Ở Châu Đại Dương

Một số công trình nghiên cứu sán lá song chủ đã được công bố, trong đó nổi bật có nhiều công trình về sán lá song chủ nhất là 2 nhà khoa học Bray và Cribb, ví dụ như Cribb et al (1992, 2002); Bray et

al (1979, 1990, 1991, 1993, 1994); Bray & Palm (2009)

Ở Châu Á

Tại khu vực châu Á, Yamaguti là nhà khoa học đã công bố nhiều công trình nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở các loài cá biển bao gồm cả các bài báo và sách, trong đó phải kể đến công trình như Yamaguti (1941, 1971) Một số nghiên cứu của các tác giả khác có thể

kể đên là Valasquez (1962, 1975); Madhavi (1982); Salam et al

(1990); Nahhas & Sey (2002); Nahhas & Calson (1994); Shih et al (2004); Chai et al (1984); Chai & Lee (2002); Chai et al (2005)

Việt Nam

Nguyễn Thị Muội & Đỗ Thị Hòa (2004) đã công bố về kết quả nghiên cứu KST ký sinh trên một số loài cá có giá trị kinh tế khai thác được trên vùng biển Phú Khánh (nay là Khánh Hòa) trong thời gian từ 1978- 1980, trong đó phát hiện 29 loài sán lá song chủ Arthur và Bùi Quang Tề (2006) đã phát hiện và công bố 453 loài KST trên cá nước ngọt, lợ và mặn, trong đó có 112 loài sán lá song chủ Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn & cs (2010) đã phát hiện 4 loài

sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi Võ Thế

Dũng và cs (2010, 2012) đã công bố 6 loài sán lá song chủ, 2 loại ấu

trùng metacercaria trên các loài cá mú thuộc giống Epinephelus và 2 loài sán lá song chủ trên cá chẽm (Lates calcarifer)

1.4 Ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ

ký sinh

Luận án đã giới thiệu về khái niệm hệ thống học phân tử và hệ thống học truyền thống, về các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền của gen nhân và gen ti thể, về ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở cá như:

Nghiên cứu phát sinh loài của sán lá song chủ ở cá có thể kể đến nghiên cứu của Riutort et al (1993); Blair et al (1996); Ethes, (1984,

1985, 1986); Rohde et al (1993,1994); Baverstock et al (1991); Blair et al (1993); Nelles et al (1984); Brook et al (1989); Gibson (1987); Pearson (1992); Blair et al (1996); Carranza et al (1997); Fernandez et al (1998); Littlewood et al (1999); Olson et al (2003); Choudhury et al (2007)

Nghiên cứu về phân loại sán lá song chủ như Adlard et al (1993); Miller & Cribb (2008); Miller et al (2010); Hunter et al (2010) Ngoài ra luận án cũng đã tổng quan những công trình nghiên cứu

về vòng đời sán lá song chủ trên cá biển, ví dụ như Koei (1977, 1986,

1990, 1992); Blair et al (1996); Cribb et al (1998); Anderson (1999); Bartoli et al (2000); Pina et al (2009); Ana et al (2012)

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: Sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm

(Lates calcarifer) nuôi ở Khánh Hòa

2.1.2 Thời gian nghiên cứu: 2009-2014

Thời gian thực hiện luận án từ năm 2009 đến năm 2014 Tuy nhiên, tiến hành thu mẫu cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa để nghiên cứu thăm dò sán lá song chủ ký sinh được thực hiện từ năm 2007

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu: Tỉnh Khánh Hòa

2.2 Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu cá chẽm nuôi: thu cá ngẫu nhiên từ ngư dân tại các lồng/ao nuôi Đã thu thập 875 cá chẽm nuôi ao và 205 cá chẽm nuôi lồng để kiểm tra sán từ năm 2010 đến 2013 Ngoài ra trước đó từ 2007-2009,

169 mẫu cá chẽm được thu để nghiên cứu thăm dò

- Thu mẫu ốc và cá tạp để khảo sát vòng đời sán lá song chủ: Thu

1255 mẫu ốc ở các ao nuôi cá chẽm thương phẩm bị nhiễm sán và 5

loài cá tạp gồm cá đối (Mugil sp.), cá hố (Trichiurus sp.), cá nục (Decapterus sp.), cá liệt (Leiognathus sp.) và cá giò hay cá kình

(Siganus sp.)

2.2.2 Phương pháp phát hiện, thu thập, bảo quản,cố định và làm tiêu bản sán lá song chủ

Áp dụng phương pháp nghiên cứu KST của Dogiel (1929), được

bổ sung bởi Bychowskaija & Paploskaja (1969), Hà Ký (1969)

Thu thập sán lá song chủ: cạo nhớt da và lấy máu phết lên lam

kính; lấy não ép lên lam kính; cắt rời các vây, mang cho vào hộp lồng đựng nước biển lọc sạch; mổ bụng, tách rời các nội quan cho vào các hộp lồng đựng nước muối sinh lý

Cố định, bảo quản và làm tiêu bản: theo hướng dẫn trong các

tài liệu Berland (2005)

2.2.3 Phân loại sán lá song chủ bằng phương pháp hình thái

Phân loại sán lá song chủ theo khóa phân loại và các tài liệu: Sán trưởng thành Velasquez (1958, 1961, 1962, 1975); Yamaguti (1941,

1952, 1965, 1971); Võ Thế Dũng và cộng sự (2012)

Phân loại ấu trùng sán lá song chủ được giới thiệu bởi Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2013) dựa trên các tài liệu phân loại của Pearson (1964), Yamaguti (1971), Hong et al (2002), Bùi Quang Tề

(2006, 2007), Sohn (2009); Pinto et al (2012); Frandsen and

Christensen (1984); Ginetsinskaya (1988); Murrell et al (2005) Tiến hành xác định thành phần, mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm theo hình thức nuôi, theo thời gian nuôi và tính đặc hữu

ký chủ của từng loài sán tìm thấy

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu di truyền sán lá song chủ trên cá chẽm

Phương pháp nghiên cứu gồm các bước: chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN, khuếch đại ADN bằng kỹ thuật PCR, chạy điện di trên gel

Argarose và giải trình tự ADN Từ đó tiến hành phân loại và xác định mối quan hệ di truyền của các loài sán lá song chủ trên cá chẽm

Sử dụng các cặp mồi từ các nghiên cứu: mồi 18S rRNA của Littlewood et al (1998); 28S rRNA của Olson et al (2003); ITS1 rRNA của Bartoli et al (2000)

2.2.5 Khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm

Khảo sát ký chủ trung gian thứ nhất: kiểm tra ấu trùng cercaria ký sinh trong ốc thu từ ao nuôi cá chẽm

Khảo sát ký chủ trung gian thứ 2: kiểm tra ấu trùng metacercaria ở

5 loài cá tạp và bố trí thí nghiệm cho cá chẽm giống (7-10cm) ăn Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức: cho ăn bằng cá đối, cá liệt, cá hố, cá nục,

cá giò và thức ăn công nghiệp (Đối chứng) Cá chẽm giống được nuôi trong bể nhựa 200l, số lượng 50 con/bể Thí nghiệm được lặp lại

3 lần Sau 30 ngày thí nghiệm, kiểm tra cá chẽm

2.3 Xử lý số liệu

Nhập toàn bộ số liệu thu được vào phần mềm Excell, sau đó tùy thuộc mục đích sử dụng mà được xử lý trong các phần mềm khác nhau

- Xác định tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm theo công thức;

- Xử lý dữ liệu di truyền sán lá song chủ: các trình tự ADN sán lá song chủ được dóng hàng bằng phần mềm Bioedit, so sánh trình tự tương ứng trên Genbank được xử lý và kết nối bằng phần mềm MEGA 6.06 (Kumar et al., 2009), sau đó kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast) Xác định mức độ tương đồng và sự khác biệt di truyền của các loài sán

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.2 Phát hiện, thu thập, cố định và phân loại thành phần giống loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng phương pháp truyền thống

Nghiên cứu đã phát hiện được 6 loài sán thuộc 6 giống, 4 họ, 1 bộ

Bảng 3.2 Thành phần loài, mức độ nhiễm và vị trí ký sinh

của sán lá song chủ (n=1.080)

Loài sán Vị trí ký

sinh

Tỷ lệ nhiễm (%)

Cường độ nhiễm (trùng/cá)

Tranversotrema

1,88 ± 2,26 (1 – 28)

Helicometra

Odhner, 1902

1 H fasciata

Rudolphi, 1819 Bucephalidae

Erilepturus

Woolcock, 1952

3 E hamati

Yamaguti, 1934