Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây riềng meng hai (alpinia SP ), họ gừng (zingiberaceae)

Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Riềng meng hai Alpinia sp., họ Gừng Zingiberaceae” được thực hiện với mục đích nhằm giám định tên khoa học,

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của thầy cô, bạn bè và gia đình

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin được gửi đến TS Nguyễn Hoàng Tuấn, người thầy tận tụy đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thanh Tùng cùng toàn thể các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Tôi xin cảm ơn toàn thể thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình dạy bảo tôi suốt những năm tháng ngồi trên ghế nhà trường

Xin cảm ơn toàn thể anh chị, bạn bè cùng nghiên cứu trên Bộ môn Dược liệu,

đã động viên, giúp đỡ tôi trong quãng thời gian thực hiện khóa luận này

Cuối cùng, cho tôi được gửi sự biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân, bạn

bè, đã luôn ở bên cạnh, động viên, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Huyền

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ………

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN………

1.1 Tổng quan về họ gừng (Zingiberaceae)………

1.1.1 Vị trí phân loại………

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Gừng………

1.1.3 Phân loại thực vật họ Gừng………

1.2 Tổng quan về chi Alpinia………… ………

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Alpinia…… ………

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật của chi Alpinia.………… ………

1.2.1.2 Chi Alpinia ở Việt Nam……… ………

1.2.2 Phân loại chi Alpinia……… …… …….………

1.2.3 Thành phần hóa học chi Alpinia………

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ………… ………

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu……….………

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu……… ………

2.2 Nội dung nghiên cứu………

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật………

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học………

2.3 Phương pháp nghiên cứu………

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu cảm quan………

2.3.2 Phương pháp giám định tên khoa học ………

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hiển vi ………

1

3

3

3

3

3

6

6

6

7

10

13

15

15

15

15

16

16

16

16

16

17

17

2.3.4 Phương pháp hóa học……… …

2.3.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng……….…

2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng nước trong dược liệu………

2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu…………

2.3.8 Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ……… …

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN… ……… …

3.1 Nghiên cứu về thực vật……… …

3.1.1 Đặc điểm thực vật……… …

3.1.2 So sánh đặc điểm của mẫu nghiên cứu với một số loài gần nhất………

3.2 Nghiên cứu về vi học vi phẫu dược liệu……… …

3.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá……… …

3.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân rễ……… …

3.3 Nghiên cứu vi học bột dược liệu ……… …

3.3.1 Bột lá……….…

3.3.2 Bột thân rễ……….…

3.4 Định tính bằng phản ứng hóa học………

3.5 Xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu………

3.6 Sắc ký lớp mỏng tinh dầu dược liệu……….…………

3.7 Sắc ký khí kết hợp khối phổ tinh dầu ….………

3.8 Bàn luận……… …

3.8.1 Về thực vật……… …

3.8.2 Về thành phần hóa học………… ………

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… …

4.1 Kết luận……… …

4.2 Kiến nghị……….…

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

17

23

24

25

25

27

27

27 30

34

34

35

37

37

37

38

40

41

43

47

47

48

50

50

50

51

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Dd Dung dịch

DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV

GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry (sắc ký khí kết

hợp khối phổ)

HPTLC High performance thin layer chromatography (sắc ký lớp

mỏng hiệu năng cao)

HNU Herbarium of National University

KUN Phòng tiêu bản Viện Thực vật Côn Minh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Gừng ở Việt Nam sắp xếp

theo hệ thống J Kress & al (2002)

4

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật giữa mẫu nghiên cứu với

Bảng 3.3 Kết quả xác định hàm lượng tinh dầu trong quả, cụm hoa,

lá, thân giả, thân rễ Riềng meng hai sau 3 lần cất

40

Bảng 3.4 Kết quả định tính tinh dầu trong từng bộ phận của cây

Riềng meng hai bằng SKLM

41

Bảng 3.5 Thành phần cấu tử trong tinh dầu từng bộ phận của cây

Riềng meng hai

43

Bảng 3.6 Bảng so sánh thành phần cấu tử trong các bộ phận của cây

Riềng meng hai

45

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.1 Ảnh chụp cây và một số bộ phận của cây Riềng meng hai 29

Hình 3.6 Sắc ký đồ tinh dầu các bộ phận của cây Riềng meng hai

Hệ dung môi khai triển: n-hexan:EtOAc (85:15)

41

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Riềng (Alpinia) là một chi lớn, phổ biến và phức tạp về thực vật nhất trong

họ Gừng (Zingiberaceae) với khoảng 230 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á [14], [18], trong đó có Việt Nam Từ xa xưa, các loài thuộc chi Riềng đã được sử dụng rộng rãi để lấy tinh dầu, làm gia vị, thực phẩm và thuốc chữa bệnh Tinh dầu của các loài này có giá trị cao nên được ứng dụng làm

mỹ phẩm, dược phẩm, y học… Nhiều loài được sử dụng để bồi bổ sức khỏe, hoặc kết hợp với các vị thuốc khác để chữa các bệnh tiêu hóa, bệnh do thời tiết, đau dạ

dày, hô hấp, xương khớp… điển hình như Riềng nếp (Alpinia galanga (L.) Willd.), Riềng thuốc (Alpinia officinarum Hance), Riềng bắc bộ (Alpinia tonkinensis

Gagnep.) [8] Lá và ngọn một số loài được sử dụng như rau ăn hàng ngày như

Riềng Quảng Tây (Alpinia kwangsiensis T L Wu & S.J Chen) [8] Hạt, thân rễ, lá

của nhiều loài được dùng làm gia vị cho các món ăn hàng ngày như Riềng nếp

(Alpinia galanga (L.) Willd.), Riềng thuốc (Alpinia officinarum Hance), Riềng tàu (Alpinia oblongifolia Hayata) [8] Với những vai trò như vậy, việc nghiên cứu về

các loài thuộc chi Riềng là vô cùng cần thiết

Trong chuyến điều tra thực địa tại xã Minh Lập, huyện Đồng Hỷ, thành phố Thái

Nguyên, chúng tôi đã phát hiện ra một loài thuộc chi Alpinia (tên địa phương là

Riềng meng hai) Quả của loài này được sử dụng như một loại đậu khấu Qua tra cứu các tài liệu trên thế giới [18], [21] và tài liệu Việt Nam [1], tôi nhận thấy loài

này mang những đặc điểm phù hợp với loài Alpinia menghaiensis S Q Tong & Y

M Xia, tuy nhiên được nhận định là loài Alpinia blepharocalyx K Schum theo tài

liệu [12] Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa

học của cây Riềng meng hai (Alpinia sp.), họ Gừng (Zingiberaceae)” được thực hiện với mục đích nhằm giám định tên khoa học, xác định thành phần hóa học của loài phát hiện, làm cơ sở cho việc nghiên cứu phát triển và xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu sau này

2

Để thực hiện mục đích trên, đề tài được tiến hành với các mục tiêu sau:

 Xác định đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học, đặc điểm vi phẫu lá và thân rễ, đặc điểm bột lá và thân rễ của mẫu nghiên cứu

 Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong thân rễ mẫu nghiên cứu thông qua phản ứng hóa học

 Xác định hàm lượng tinh dầu trong thân rễ, thân giả, lá, cụm hoa và quả của mẫu dược liệu nghiên cứu

 Xác định thành phần cấu tử trong tinh dầu cất được bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về họ gừng Zingiberaceae

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo Thực vật chí Đông Dương [20] và hệ thống phân loại của Takhtajan [16] vị trí của họ Gừng (Zingiberaceae) trong giới thực vật như sau:

Giới (Kingdom) Thực vật (Planta)

Ngành (Division) Ngọc lan (Magnoliophyta)

1.1.3 Phân loại thực vật họ Gừng

Tháng 7 năm 2002, tại hội nghị chuyên đề lần III về Zingiberaceae tổ chức tại Thái Lan, Dr W John Kress đã đề nghị một cách phân loại họ Gừng mới Đây là hệ thống phân loại đầy đủ và tiên tiến nhất hiện nay, dựa trên phân tích phân tử sinh

4

học và hình thái học để xác định mối liên hệ giữa các taxon, phù hợp với nguyên tắc phân loại hiện đại, có ưu điểm vượt trội so với các hệ thống phân loại họ gừng trước đây Theo hệ thống phân loại này thì họ Gừng được xếp thành 4 phân họ là: Siphonochiloideae, Tamijoideae, Alpinioideae và Zingiberoideae với 53 chi và 6 tông [1]

Ở Việt Nam, các chi trong họ Gừng được sắp xếp trong 2 phân họ và 3 tông như bảng sau:

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Gừng ở Việt Nam sắp xếp theo hệ thống

J Kress & al (2002) [1]

Phân họ 1 Alpinioideae Phân họ 2 Zingiberoideae

Tông 1 Alpinieae Tông 2 Zingibereae Tông 3 Gobbeae

2 Siliquamomum 10 Stahlianthus 19 Gagnepainia

Cụ thể khóa định loại các chi họ Gừng ở Việt Nam như sau:

1A Nhị lép bên tiêu giảm hay dạng răng, dạng dùi, hiếm khi là dạng trứng hẹp

(Phân họ.1 Alpinioideae) (Tông.1 Alpinieae)

2A Cụm hoa trên ngọn thân có lá

3A Nhị lép bên tiêu giảm hay dạng răng, dạng dùi; quả hình cầu, bầu dục, hiếm

khi là hình thoi… ……… … ……1 Alpinia 3B Nhị lép bên hình trứng ngược hẹp; quả dạng quả cải…… 2 Siliquamomum

2B Cụm hoa mọc từ thân rễ, riêng với thân có lá

5

4A Hoa nhiều, xếp sít nhau trên trục cụm hoa; các lá bắc xếp lợp lên nhau

5A Lá bắc con hình trứng, mở đến gốc ……… ……… ….3 Hornstedtia

5B Lá bắc con hình ống, không mở

6A Các hoa xếp theo vòng tròn đồng tâm….………….………….4 Etlingera

6B Các hoa xếp dọc theo trục cụm hoa; cánh môi hình tròn, trứng hay hình

bầu dục………….…… ……… ………… 5 Amomum

4B Hoa ít, xếp thưa trên trục cụm hoa; các lá bắc không xếp lợp lên nhau

7A Lá bắc con hình ống; phần trên đài xẻ một bên……….… 6 Geostachys

7B Lá bắc con mở đến gốc; phần trên đài xẻ thành 2-3 răng ngắn

8A Trục cụm hoa mảnh, dài, cong xuống; lá bắc bao 1 cụm nhò có 3-4

10A Nhị lép bên dạng cánh tràng dính với cánh môi; vòi nhụy được bao bởi

phần phụ trung đới của bao phấn kéo dài ……….…9 Zingiber

10B Nhị lép bên dạng cánh tràng không dính với cánh môi; vòi nhụy không được bao bởi phần phụ trung đới của bao phấn kéo dài

11A Cụm hoa được bao bởi lá bắc hình chuông… ……… …10 Stahlianthus

11B Cụm hoa không được bao bởi lá bắc hình chuông

12A Các lá bắc dính với nhau ở nửa dưới làm thành dạng túi 11 Curcuma

12B Các lá bắc không dính nhau ở nửa dưới và không thành dạng túi

13A Cụm hoa trên ngọn thân có lá

14A Lá bắc con hình ống………… ….……… ……….12 Hedychium

14B Lá bắc con không hình ống, mở đến gốc hay tiêu giảm

15A Lá bắc hình mũi mác hẹp, bao một cụm nhỏ có 1-4 hoa; gốc 2 thùy

tràng bên không dính với cánh môi 13 Caulokaempferia

9B Bầu 1 ô, noãn đính vách (Tông.3.Globbeae)

18A Cánh môi khía mép hay chia thùy, không có thùy giữa; cụm hoa trên ngọn

thân có lá ……… ……….………18 Globba

18B Cánh môi chia 3 thùy, thùy giữa nhỏ như chỉ, 2 thùy bên dạng cánh hoa,

cụm hoa mọc từ gốc thân……… …….…19 Gagnepainia

1.2 Tổng quan về chi Alpinia

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Alpinia

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật của chi Alpinia

Cây cỏ, thân rễ khỏe và phát triển phân nhánh, thường nằm trên hoặc ngay dưới mặt đất, có thể nằm sâu trong lòng đất [13] Thân giả phát triển, cao 0,5-3m [12], có loài cao tới hơn 10m [13], đôi khi không có [18] Cây có nhiều lá, hiếm khi 1-4 lá Phiến lá hình thuôn hoặc hình mác Cụm hoa hình chùy, chum hoặc bông, dày đặc hoặc thưa thớt, được bao bởi 1 đến 3 tổng bao lá bắc hình thìa khi còn non Lá bắc thường mở tới gốc, hiếm khi dạng túi Lá bắc con mở tới gốc hoặc hình ống, đôi khi

bị tiêu giảm Đài hoa thường dạng ống, đôi khi xẻ 1 bên Thùy trung tâm của tràng hoa thường rộng hơn các thùy bên Nhị lép nhỏ hoặc tiêu biến, hình giùi hoặc răng Nhị hữu thụ đính ở gốc cánh môi Cánh môi thường sặc sỡ, rộng hơn thùy tràng, đôi khi khó thấy; mép chia thùy hoặc nguyên vẹn tùy loài Bầu nhụy mẫu 3, đính noãn trung trụ Đầu nhụy thường lớn, đôi khi hình chùy, hiếm khi cong gập Quả nang,

7

thường hình cầu, khô hoặc thịt, không mở hoặc mở không đều Hạt nhiều, thường

có góc cạnh [18]

1.2.1.2 Chi Alpinia ở Việt Nam

Alpinia là một trong những chi lớn của họ gừng Theo thống kê trong luận án

tiến sỹ sinh học “Nghiên cứu phân loại họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.) ở Việt

Nam” của Nguyễn Quốc Bình, đến năm 2011, chi Alpinia ở Việt Nam có khoảng 31 loài khác nhau [1] Năm 2015, bổ sung thêm vào hệ thực vật Việt Nam loài Alpinia

polyantha D Fang (Riềng nhiều hoa) [7] Năm 2017, bổ sung thêm loài Alpinia newmanii N.S Lý (Riềng newman) [15] và loài Alpinia rugosa S J Chen & Z

Y Chen (Riềng lá nhăn) [9], nâng tổng số loài thuộc chi riềng ở Việt Nam lên 34 Các loài được liệt kê dưới bảng sau:

Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Alpinia ở Việt Nam [1], [7], [15], [9]

STT Tên khoa học Tên Việt

2 Alpinia officinarum Hance Riềng

4 Alpinia siamensis K Schum Riềng

Lai Châu, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Hà Nội, Hải

Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hải Phòng, Ninh Bình, Kon Tum

8 Alpinia gagnepainii K

Schum

Riềng gagnepain

Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Ninh Bình, Quảng Bình, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng

9 Alpinia zerumbet (Pers.)

Burtt & R M Smith

Riềng đẹp Lào Cai, Cao Bằng, Hà Nội, Ninh

Bình, Đắk Lắc, Khánh Hòa

10 Alpinia breviligulata

(Gagnep.) Gagnep

Riềng lưỡi ngắn

Mới thấy ở Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế

11 Alpinia velutina Ridl Riềng

lông

Mới thấy ở Cao Bằng, Quảng Trị

12 Alpinia galanga (L.) Wild Riềng nếp Mọc hoàng và được trồng nhiều ở

Việt Nam

không mũi

Lào Cai, Hà Giang, Phú Thọ, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Quảng Bình, Đà Nẵng, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Đồng Nai, Tp Hồ Chí Minh

14 Alpinia oxyphylla Miq Ích trí Mới gặp ở Hà Giang, Hà Nội,

Thừa Thiên Huế và Nam Bộ

15 Alpinia pumila Hook.f Riềng lá

Bắc Kạn, Lạng Sơn, Hà Nội, Hòa Bình, Ninh Bình, Hà Tĩnh

9

17 Alpinia hainanensis K

Schum

Riềng Hải Nam

Lào Cai, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Phú Thọ, Vĩnh Phúc,

Hà Nội, Hòa Bình, Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Kon Tum, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu

18 Alpinia blepharocalyx K

Schum

Riềng dài lông mép

Lào Cai, Sơn La, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Hòa Bình, Ninh Bình, Lâm Đồng

19 Alpinia stachyoides Hance Riềng

Lào Cai, Sơn La, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Hòa Bình, Nghệ

An, Thừa Thiên Huế

21 Alpinia strobiliformis T L

Wu & S J Chen

Riềng bông tròn

Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Hà Tĩnh

22 Alpinia hirsuta (Lour.)

Horan

Riềng lông

Mới gặp ở Bắc Kạn và Nam Bộ

23 Alpinia purpurata (Vieill.)

K Schum

Riềng tía Tp Hồ Chí Minh

24 Alpinia oxymitra K Schum Riềng núi Bà Rịa – Vũng Tàu, Kiên Giang

25 Alpinia calcicola Q B

Nguyen & M F Newman

Riềng đá vôi

Mới thấy ở Quảng Ninh

26 Alpinia oblongifolia Hayata Lương

28 Alpinia intermedia Gagnep Riềng Mọc hoang dại từ miền bắc đến

nam Trung Bộ Việt Nam

30 Alpinia tonkinensis Gagnep Ré bắc bộ Lào Cai, Sơn La, Phú Thọ, Vĩnh

Phúc, Hà Nội, Hòa Bình, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Bình, Quảng Nam

31 Alpinia latilabris Ridl Ry Lào Cai, Tuyên Quang, Hà Nội,

Quảng Bình, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Bà Rịa – Vũng Tàu, cũng được trồng ở miền nam Việt Nam

32 Alpinia polyantha D Fang Riềng

nhiều hoa

Nghệ An, Quảng Ngãi

33 Alpinia newmanii N.S Lý Riềng

Thừa Thiên Huế

1.2.2 Phân loại chi Alpinia ở Việt Nam

Tính đến 2011, ở Việt Nam có 31 loài thuộc chi Alpinia [1]

Khóa định loại các loài Alpinia ở Việt Nam [1]:

1A Cụm phụ trung đới không kéo dài thành mào

2A Cụm hoa dạng chùy

3A Lá bắc con dạng vảy, dài dưới 1mm

4A Cụm hoa nhiều nhánh 1 A globosa 4B Cụm hoa không phân nhánh 2 A officinarum

3B Lá bắc con không dạng vảy, dài hơn 1cm

11

5A Lá bắc con không mở đến gốc, dạng phễu hay ống

6A Cánh môi hình trứng ngược, dài 4-5mm, đầu xẻ thành 3 thùy; vòi nhụy

lép hình nón tù, sần sùi 3 A conchigera

6B Cánh môi hình trái xoan, dài 8-10mm, đầu xẻ thành 2 thùy nông; vòi nhụy

lép hình trái xoan hẹp, dạng bản dày……… …… 4 A siamensis

5B Lá bắc con mở đến gốc, không dạng phễu hay ống

7A Đầu ống đài chia thành 4 thùy 5 A menghaiensis

7B Đầu ống đài chia thành 3 thùy

8A Lá bắc tiêu giảm hay dài đến 1mm

9A Mặt dưới phiến lá có lông

10A Cụm hoa phân nhánh, nhị lép mảnh, dài đến 4mm… 6 A macroura

10B Cụm hoa không phân nhánh, nhị lép tiêu giảm thành dạng thể chai

………… 7 A malaccensis

9B Mặt dưới phiến lá nhẵn (trừ mép và mép đầu phiến có gai hoặc lông)

11A Đài hoa xẻ xiên xuống 1 bên

12A Cuống lá không có; thùy tràng dài 1,5-1,8 cm 8 A gagnepainii 12B Cuống lá dài 1-2 cm; thùy tràng dài 3-3,5 cm 9 A zerumbet

11B Đài hoa không xe xiên xuống 1 bên

13A Ống đài dài 0,8-1 cm 10 A breviligulata 13B Ống đài dài 1,8-2 cm 11 A velutina

8B Lá bắc dài hơn 1 mm

14A Đài hoa dạng ống, dài 7-8 mm; cánh môi màu trắng, đầu xẻ sâu xuống

½ chiều dài thành 2 thùy 12 A galanga

14B Đài hoa dạng phễu, dài 1,5-2 cm; cánh môi màu vàng, có nhiều đốm

đỏ, đầu chia 3 thùy không rõ 13 A mutica

2B Cụm hoa dạng chùm hay dạng bông

15A Cụm hoa dạng chùm

16A Lá bắc con tiêu giảm; ống đài dài 0,8-1,2 cm

16B Lá bắc con dài 2-4cm; ống đài dài 1,8-3 cm

18A Cuống lá dài 4-8 cm; thùy tràng dài 1,8-2cm 16 A kwangsiensis

18B Cuống lá dài 0,5-2cm; thùy tràng dài 2,5-3cm

19A Lá bắc dài 4-4,5 cm; ống tràng dài 1-1,2 cm; chỉ nhị dài 1,3-1,5cm

20B Mặt dưới phiến lá nhiều lông, cánh môi dài gần bằng thùy tràng

21A Cuống lá dài 2,5-4,5 cm; cụm hoa bông gần như hình trụ

……… 20 A pinnanensis

21B Cuống lá dài đến 1cm; cụm hoa bông, dạng gần tròn hay hình nón

……… 21 A strobiliformis

1B Phần trung đới kéo dài thành mào

22A Đầu ống đài chia thành 4 thùy dạng răng; cánh môi chia 4 thùy

23B Lá bắc không có màu đỏ tươi; đầu ống đài chia thành 3 thùy dạng răng

24A Cuống lá không có hay dài dưới 1cm

25A Quả hình thoi, có 10-12 cạnh nổi 24 A oxymitra

13

25B Quả hình bầu dục hay hình cầu, không có cạnh nổi

26A Lá bắc con cỡ 1,2-1,4 x 0,8-1 cm, bao 2-3 hoa 25 A calcicola 26B Lá bắc con cỡ 0,2-0,4 x 0,1-0,2 cm, bao 1 hoa 26 A oblongifolia

24B Cuống lá dài trên 1cm

27A Lá bắc dài 4-6 cm; cánh môi nguyên… 27 A phuthoensis

27B Lá bắc dài dưới 4 cm hay tiêu giảm; cánh môi xẻ 2 hay 3 thùy

28A Lưỡi lá dài dưới 1 cm 28 A intermedia

28B Lưỡi lá dài trên 1cm

29A Lá bắc con dài 0,7-0,8 cm; thùy tràng dài 1-1,2 cm 29 A maclurei

29B Lá bắc con dài 1,2- 3,5 cm; thùy tràng dài 1,5-3,8 cm

30A Lá bắc con dài 1,2-1,4 cm; đài dài 0,8-0,9 cm; thùy tràng dài 1,5-1,8

cm 30 A tonkinensis

30B Lá bắc con dài 3-3,5 cm; đài dài 2-2,5 cm; thùy tràng dài 3,2-3,8

cm 31 A latilabris

1.2.3 Thành phần hóa học chi Alpinia

Hiện nay chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu một cách tổng quát về thành phần

hóa học của các loài thuộc chi Alpinia, các thông tin về thành phần hóa học chủ yếu

dựa trên các nghiên cứu về loài đơn lẻ Thành phần hóa học chính của các loài

thuộc chi Alpinia bao gồm:

 Tinh dầu:

Hầu như các loài thuộc chi Alpinia đều có chứa tinh dầu với thành phần chủ yếu

là các hợp chất mono- và sesquitecpenoid, tuy nhiên, tùy từng loài mà có sự tích lũy hàm lượng tinh dầu khác nhau

Một số loài đã được phân tích thành phần hóa học tinh dầu như:

Ry (Alpinia latilabris Ridl.) được thu ở Vườn Quốc gia Pù Mát Hàm lượng tinh

dầu: 0,23%; 0,20% và 0,30% tương ứng với lá, thân, rễ Thành phần chính chung của 3 mẫu tinh dầu là α-terpinen (2,9%; 5,6% và 6,5%), β-pinen (4,0%; 6,9% và 7,9%), γ-terpinen (8,8%; 10,7% và 10,7%), α-cadinol (26,4%; 31,4% và 38,9%) tương ứng với lá, thân và rễ [8]

14

Riềng malacca (Alpinia malaccaensis (Burm.f.) Rosc.) được thu ở Kỳ Sơn, Nghệ

An Hàm lượng tinh dầu: 0,25%; 0,19%; 0,32% và 0,25% tương ứng lá, thân, rễ và quả Các hợp chất chính là β-pinen (56,0%; 46,0%; 31,7% và 18,5%) và α-pinen (10,3%; 9,8%; 6,3% và 5,9%) tương ứng với các bộ phận lá, thân, rễ và quả [8]

Riềng nhiều hoa (Alpinia polyantha D Fang) được thu ở Kỳ Sơn, Nghệ An

Hàm lượng tinh dầu: 0,21%; 0,15%; 0,25% và 0,23% tương ứng với lá, thân, rễ và quả Thành phần chính ở lá: Camphor (16,1%), α-pinen (15,2%) và β-agarofuran (12,9%); ở cành là α-pinen (12,4%), β-cubeben (10,6%), β-agarofuran (10,3%) và globulol (8,8%); ở rễ là β-cubeben (12,6%), fenchyl acetat (10,8%), β-maalien (9,0%), aristolon (8,8%) và α-pinen (8,2%); ở quả là δ-cadinen (10,9%), β-caryophyllen (9,1%), β-pinen (8,7%) và α-muurolen (7,7%) [8]

Các flavonoid như galangin, 3-O-methyl galangin đã được phân lập từ thân rễ

cây Alpinia officinarum Hance [18]; 4’,7-dimethylkaempferol,

5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavanone, 4’,5,7-trimethoxyflavonol, kaempferol đã được phân lập từ

thân rễ cây Alpinia tonkinensis Gagnep [19]

15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (lá, thân giả, cụm hoa, quả) và phần

dưới mặt đất (thân rễ) được thu hái tại xã Minh Lập, huyện Đồng Hỷ, thành phố Thái Nguyên Tiêu bản thực vật khô có bẹ lá mang lưỡi nhỏ, cuống lá, phiến lá, cụm hoa và hoa đang được lưu giữ tại Bảo tàng Sinh học, khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với mã số tiêu bản HNU 021745 Mẫu quả được thu hái vào tháng 6/2016, mẫu cụm hoa, lá, thân giả, thân rễ được thu hái vào tháng 3/2017 Sau khi thu hái, mẫu quả được làm khô tự nhiên trong bóng râm; mẫu cụm hoa, lá, thân giả, thân rễ được sử dụng dạng tươi để cất tinh dầu Một phần mẫu

lá và thân rễ được bảo quản trong cồn 90% để làm vi phẫu thực vật Một phần mẫu

lá, thân rễ được để khô tự nhiên, bảo quản trong túi nilon sạch, sử dụng để định tính

sơ bộ các hợp chất hữu cơ khác (thân rễ) và làm mẫu vi học bột (lá, thân rễ)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất, dung môi

 Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: cloramin B, nước javen, cloralhydrat 75%, đỏ son phèn, xanh methylen, glycerin, nước cất

 Dùng trong định tính sơ bộ thành phần hóa học và sắc ký lớp mỏng

 Hóa chất: các thuốc thử định tính (NaOH 10%, FeCl3 5%, TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, acid picric…)

 Dung môi: Ethanol, nước cất, chloroform, ethyl acetat, n-hexan…

 Bản mỏng Silicagel 60 - F254 của Merk

 Cân kỹ thuật Sartorius TE412

 Bộ dụng cụ cất tinh dầu theo dược điển Mỹ (USP29)

 Máy sắc ký khí kết hợp khối phổ Agilent Technologies

 Hệ thống sắc ký bản mỏng bán tự động CAMAG (HPTLC)

 Kính hiển vi LEICA DM 1000, máy ảnh kĩ thuật số SONY Cybershot

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

 Mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu:

 Vi phẫu: Lá, thân rễ

 Bột: Lá, thân rễ

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

 Định tính sơ bộ các hợp chất hữu cơ có trong thân rễ

 Xác định hàm lượng tinh dầu có trong quả, cụm hoa, lá, thân giả, thân rễ

 Định tính các thành phần hóa học có trong tinh dầu quả, cụm hoa, lá, thân giả, thân rễ bằng sắc ký lớp mỏng

 Xác định thành phần cấu tử của tinh dầu trong quả, cụm hoa, lá, thân giả, thân rễ bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu cảm quan

17

Quan sát và mô tả cây về các đặc điểm thực vật, hình dáng, kích thước, màu sắc, mùi bằng mắt thường và chụp ảnh trong điều kiện có đủ ánh sáng tự nhiên, tốt nhất

là ánh sáng mặt trời

2.3.2 Phương pháp giám định tên khoa học

Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm của bộ phận sinh sản, so sánh, đối chiếu với mẫu tiêu bản khô lưu trữ tại Phòng tiêu bản Viện thực vật Côn Minh (online), đối chiếu với khóa phân loại thực vật trong tài liệu [1], cùng với sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực vật để xác định tên khoa học của loài

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hiển vi

 Đặc điểm vi phẫu: Mẫu dược liệu (lá, thân rễ) được cắt, nhuộm, lên tiêu bản theo các bước như trong tài liệu [10] và chụp ảnh

 Đặc điểm bột: Lá và thân rễ của dược liệu được nghiền nhỏ thành bột bằng thuyền tán, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản và quan sát, mô tả đặc điểm của bột và chụp ảnh [10]

2.3.4 Phương pháp hóa học

Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa học [2], [3] Quy ước: Ống nghiệm nhỏ: dung tích 5ml ; ống nghiệm lớn: dung tích 20 ml

2.3.4.1 Định tính flavonoid

Tiến hành: Lấy 20 g dược liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm 40 ml ethanol

90% Đun cách thủy sôi 5 phút Lọc nóng, dịch lọc thu được đem đun cách thủy ở nhiệt độ 80oC Gạn lấy phần dịch, bỏ phần tạp tách ra dưới đáy bình, cô cách thủy đến cắn Hòa tan cắn trong 5 ml ethanol 70%, được dịch chiết cồn, thực hiện các phản ứng định tính sau:

a Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)

 Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 – 5 giọt) Để yên một vài phút, phản ứng dương tính nếu dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ

b Phản ứng với kiềm

18

 Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng thấy màu vàng của vết đậm lên rõ rệt thì phản ứng dương tính

 Phản ứng với dd NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi thấy dịch chiết chuyển từ vàng sang vàng đậm

2.3.4.2 Định tính coumarin

Tiến hành: Lấy khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml, thêm 30 ml

ethanol 90% Đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua bông Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:

a Phản ứng mở đóng vòng lacton:

 Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 1 ml dịch chiết

 Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

 Ống 2: để nguyên

 Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi Để nguội rồi quan sát

 Ống 1: có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng

 Ống 2: trong suốt

 Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát

 Ống 1: trong suốt

 Ống 2: có tủa

c Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại

 Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy nhẹ Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút Bỏ đồng xu ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che

d Vi thăng hoa

 Cho một ít bột dược liệu vào nắp chai bằng nhôm Đặt lên bếp điện có lưới amian, cho bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt trên miệng nắp nhôm một phiến kính trên đó có đặt ít bông thấm nước lạnh Đun nhẹ dưới nắp nhôm, sau 5 phút lấy lam kính ra, để nguội, quan sát dưới kính hiển vi thấy tinh thể hình kim Nhỏ thêm 1 giọt dd KI 10% lên phiến kính, quan sát dưới kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu nâu sẫm hoặc tím

2.3.4.3 Định tính saponin

Tiến hành: Quan sát hiện tượng tạo bọt

 Cho vào ống nghiệm lớn 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước Lắc mạnh trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

2.3.4.4 Định tính alcaloid

Tiến hành: Cân 15 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 40

ml dung dịch acid sulfuric 1N Đun đến sôi Để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8 ml) đến

pH = 9 - 10 (thử bằng giấy quỳ) Chiết alcaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần,

- 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

 Ống 1: thuốc thử Mayer, phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu từ trắng đến vàng

 Ống 2: thuốc thử Bouchardat, phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu đến đỏ nâu

 Ống 3: thuốc thử Dragendorff, phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng cam

đến đỏ

2.3.4.5 Định tính tanin

Tiến hành: Lấy khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml,

thêm 30 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội, lọc Dịch lọc được dùng để định tính

 Ống 1: lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT), phản ứng dương tính khi xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt

 Ống 2: lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT), phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông

 Ống 3: lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%, phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông trắng

2.3.4.6 Định tính anthranoid

Tiến hành: Lấy khoảng 15 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm

30 ml nước cất Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 100 ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5 ml ether (hoặc chloroform) Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước Giữ lớp ether (hoặc chloroform) để làm phản ứng

2.3.4.7 Định tính glycosid tim

Tiến hành: Cho vào bình nón 250 ml khoảng 20 g dược liệu, đun cách thủy với

80 ml ethanol 50% trong 30 phút, lọc lấy dịch lọc Dịch chiết thu được đem loại tạp bằng chì acetat 30%, khuấy đều Thêm dd Na2SO4 15% để loại chì dư Lọc bỏ tủa, đun cách thủy tới cắn Hòa tan cắn vào CHCl3, lọc lấy dịch và đem cô bay hơi thu được cắn Cắn đem làm các phản ứng sau:

a Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann – Burchardat

 Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng ở phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá – phản ứng dương tính

a Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh

 Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) mới pha, phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu đỏ da cam

22

 Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều sẽ thấy xuất hiện màu đỏ cam

b Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy:

 Phản ứng Keller – Kiliani

Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45 Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính khi mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ

2.2.4.8 Định tính acid hữu cơ

Tiến hành: Cân khoảng 3 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10 ml

nước cất đem đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 ml dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí

2.3.4.9 Định tính đường khử

Tiến hành: Cho khoảng 3 g dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 1 ml nước

cất, đun sôi Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác Thêm 1 ml dung dịch thuốc thử Felling A và 1 ml dung dịch Felling B Đun cách thủy sôi vài phút Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu đỏ gạch

2.3.4.10 Định tính acid amin, polysaccharid

Tiến hành: Cân khoảng 5 g dược liệu cho vào cốc có mỏ, thêm 30 ml nước cất,

đun sôi vài phút Lọc qua giấy lọc vào 4 ống nghiệm nhỏ

a Định tính acid amin

 Ống 1: Thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3% vào ống nghiệm thứ nhất Đun cách thủy sôi 10 phút Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu tím

b Định tính polysaccharid

 Ống 2: 4 ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol

 Ống 3: 4 ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

23

 Ống 4: 4 ml dịch chiết

Kết quả dương tính khi ống 2 có màu xanh đen đậm hơn ống 3 và ống 4

2.3.4.11 Định tính chất béo, caroten, sterol

Tiến hành: Cân khoảng 5 g bột dược liệu vào cốc có mỏ 100 ml, thêm 10 ml

ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 1 giờ Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc thu được dịch lọc

 Định tính chất béo: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung môi Phản ứng dương tính khi trên giấy lọc còn vết mờ

 Định tính caroten: Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa trên, cô cách thủy đến cắn, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu xanh ve

 Định tính sterol: Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 ml dịch chiết ether dầu hoả trên, cô cách thủy đến cắn Thêm vào ống nghiệm khoảng 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn Để nghiêng ống nghiệm 45o, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính khi mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng

24

 Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel 60 - F254 của Merk

 Pha động: Hệ dung môi khai triển: Hệ 1: Toluen – EtOAc – Acid acetic (5:4:1)

2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng nước trong dược liệu

Hàm lượng nước trong dược liệu được xác định bằng phương pháp cất với dung

môi [5]

Cách tiến hành:

 Cho vào bình cầu (đã được làm khô) 200 ml toluen hoặc xylen, 2 ml nước Lắp dụng cụ (đã được sấy khô) Cất khoảng 2 giờ, để nguội trong 30 phút rồi đọc thể tích nước cất được ở ống hứng (V1) chính xác đến 0,05 ml

 Thêm vào bình cầu một lượng mẫu thử đã cân chính xác tới 0,01 g có chứa khoảng 2 - 3 ml nước Đun nóng nhẹ, khi toluen đã bắt đầu sôi thì điều chỉnh nguồn cấp nhiệt để cất với tốc độ 2 giọt dịch cất trong 1 giây Khi đã cất được phần lớn nước sang ống hứng thì nâng tốc độ cất lên 4 giọt dịch cất trong 1 giây Tiếp tục cất cho đến khi mực nước cất được trong ống hứng không tăng lên nữa

 Dùng 5 - 10 ml toluen rửa ống sinh hàn rồi cất thêm 5 phút nữa Sau đó, tách bộ cất ra khỏi nguồn cấp nhiệt, để cho ống hứng nguội đến nhiệt độ phòng Nếu còn

có những giọt nước đọng lại trên thành ống sinh hàn thì dùng 5 ml toluen để rửa kéo xuống Khi lớp nước và lớp toluen đã được phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng (V2)

Độ ẩm (X%) của dược liệu được tính theo công thức sau:

25

V 2 : số ml nước cất được sau lần cất thứ hai

m: số gam mẫu đã cân đem thử

2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu

Cách tiến hành: Sử dụng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo Dược điển Mỹ

(USP29)

 Thân rễ, thân giả, lá, cụm hoa, quả của dược liệu được làm nhỏ Cân chính xác 1 lượng dược liệu phù hợp đã được xác định hàm ẩm

 Cho dược liệu vào nồi cất, rồi thêm nước ngập dược liệu khoảng 3 - 4 cm

 Lắp đặt bộ dụng cụ cất tinh dầu và tiến hành cất kéo hơi nước, cất cho đến khi thể tích tinh dầu không tăng lên nữa (khoảng 5 - 6 h) Đọc thể tích tinh dầu sau khi cất (V)

 Xác định hàm lượng tinh dầu theo tỷ lệ phần trăm thể tích trên khối lượng dược liệu khô tuyệt đối theo công thức:

Hệ thống máy sắc ký GC-MS: được thực hiện trên hệ thống GC: Agilent Technologies 7890 A, hệ thống MS: Agilent Technologies 5975 C, cột sắc ký HP-5MS với chiều dài cột 30m, đường kính cột 0,25mm Khí mang Heli, tốc độ khí mang 1 ml/phút, tinh dầu được pha loãng bằng dung môi chloroform Thể tích tiêm mẫu 1 microlit, chia dòng 1:50 Cài đặt các thông số nhiệt độ thích hợp Phổ được

so sánh với thư viện Willey, Flavor và Nist để phân tích kết quả

26

Tiến hành:

 Pha loãng mẫu tinh dầu cất được bằng dung môi chloroform đến nồng độ 1/1000

 Khởi động hệ thống sắc ký khí

 Cài đặt chương trình nhiệt độ: 40C trong 2 phút; sau đó tăng dần nhiệt độ lên

220C (tốc độ 4C/phút) và giữ ở nhiệt độ 220C trong 10 phút

 Tiến hành phân tích

27

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây thuộc loại thân thảo, sống nhiều năm Thân khí sinh do các bẹ lá hình lòng

máng ôm chặt nhau tạo thành; cao khoảng 1,5 m, có khi cao tới 3 m, đường kính từ

1,5 - 3,0 cm; có màu xanh, hơi xám vàng, bề mặt có khía, không lông (A) Thân rễ

khỏe, bò dưới lòng đất, bề mặt có lá tiêu giảm thành vảy mỏng, màu nâu, có mùi

thơm rất nhẹ (U) Tiết diện ngang của thân rễ có màu trắng, đường kính từ 1,0 cm

đến 2,5 cm

Lá đơn, mọc so le, hướng lên trên, cuống lá hợp với thân một góc khoảng 45 Phiến lá mỏng, hình mũi mác, dài khoảng 10 - 110 cm, rộng khoảng 15 - 20 cm Ngọn lá nhọn Mặt trên phiến lá có màu xanh đậm, không lông Mặt dưới phiến lá

có màu xanh nhạt, bao phủ bởi các lông tơ dày đặc Độ dày phiến lá giảm dần từ cuống lên ngọn và từ gân ra mép lá Phần mép và ngọn lá phủ nhiều lông mịn Ở giữa phiến lá có gân lớn chạy thẳng từ cuống tới ngọn lá Gân chính này lồi ở mặt dưới và hơi lõm ở mặt trên Gân nhỏ dần về phía ngọn lá Phần gân gần cuống có đường kính khoảng 0,3 - 0,4 cm Các gân phụ rất nhỏ, chạy song song với nhau hợp với gân chính một góc khoảng 45 về phía ngọn lá (T) Cuống lá dài 1,0 - 5,5 cm,

hình tròn, tiết diện có đường kính khoảng 0,5 - 0,7 cm, màu xanh, trên bề mặt phủ

lông Lưỡi nhỏ dài 1,0 - 1,5 cm, có lông nhiều ở mép và đỉnh (S)

Cụm hoa dạng chùy, mọc ở ngọn thân, dài khoảng 20 - 30 cm, cuống màu xanh,

có lông, mang nhiều hoa (B) Khi còn non, cụm hoa được bao bọc bởi 1 tổng bao lá bắc lớn, xẻ đến gốc (A1) Hoa to, không đều, lưỡng tính, mẫu 3 Hoa dài khoảng 5,0

- 6,0 cm, có cuống rất ngắn, khoảng 2 - 3 mm, mang 1 hoa (C, D, E) Lá bắc con màu nâu, dai, dài 3,0 - 4,0 cm, xẻ sâu đến gốc, đỉnh chia thành 4 thùy (Q) Đài hoa

hình ống, dài khoảng 1,5 cm, đỉnh chia 4 thùy, màu trắng và chuyển dần sang màu

nâu (R) Ống tràng dài khoảng 1 cm Tràng hoa màu trắng, mép có lông tơ, chia thành 3 thùy, các thùy dài khoảng 3 - 5 cm Thùy lưng hình trứng (H), hai thùy bên hẹp hình elip (I) Thùy lưng rộng gấp đôi thùy bên Cánh môi lớn, dài khoảng 3 - 5

28

cm, hai bên cánh rộng, phần đầu chia 2 thùy, hơi nhăn; Ở giữa màu đỏ, vàng ở mép,

có vân đỏ tỏa tia lên phía trên (G) Hoa chỉ còn 1 nhị thụ với bao phấn 2 ô, chỉ nhị màu trắng, hình lòng máng ôm lấy vòi nhụy, dài khoảng 4 cm tính cả bao phấn (J) Bao phấn dài khoảng 1,4 cm, có màu vàng và trắng, hướng trong (K) Nhị hữu thụ

thuộc vòng trong, đứng đối diện với cánh môi, hai nhị còn lại hợp thành cánh môi Vòng nhị ngoài mất hẳn Ba lá noãn tạo thành bầu dưới, 3 ô, mỗi ô chứa nhiều

noãn, noãn đính trung trụ (O) Bầu hình bầu dục, dài đến 6 mm, đường kính bầu khoảng 5 mm, bên ngoài bao phủ nhiều lông màu vàng nâu (N) Một vòi nhụy hình

sợi, màu trắng, dài khoảng 4,2 cm, chui qua khe hở giữa hai ô phấn và thò ra ngoài

(M) Đầu nhụy màu trắng, loe thành hình phễu rộng khoảng 2 mm, bên ngoài có lông mi (L)

Quả nang, hình cầu, hoặc hình bầu dục, đường kính khoảng 1,5 -1,7 cm (P) Bên

ngoài có nhiều lông Khi non có màu xanh, chín có màu vàng hoặc đỏ Bên trong

chứa nhiều hạt hình đa giác, kích thước khoảng 3 - 4 mm Hạt có nội nhũ (V)

29

Hình 3.1 Ảnh chụp cây và một số bộ phận của cây Riềng meng hai

A Toàn cây; A1 Cụm hoa và tổng bao lá bắc; B Cụm hoa; C, D, E Hoa; F Cụm quả; G

Cánh môi; H Thùy lưng tràng; I Thùy bên tràng; J Bộ nhị; K Bao phấn; L Phần nhụy nhô lên khỏi ống tràng; M Vòi nhụy và đầu nhụy; N Bầu; O Mặt cắt ngang bầu; P Quả, mặt cắt dọc quả, mặt cắt ngang quả; Q Lá bắc con; R Đài; S Lưỡi nhỏ; T Lá;

30

3.1.2 So sánh đặc điểm của mẫu nghiên cứu với một số loài gần nhất

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật giữa mẫu nghiên cứu với A menghaiensis và

- Cao 1,5 - 3,0 m - Cao 1 - 3 m

Thân rễ

- Bề mặt có vảy mỏng, màu nâu

- Tiết diện ngang màu trắng, đường kính từ 1,0 - 2,5 cm, thơm nhẹ

- KT 10 - 110 x 15 - 20

cm

- Hình thuôn , hình mác, ngọn lá nhọn, ngắn, gốc hình nêm -KT 10 - 120 x 16 -

20 cm

- Lá mỏng, hình mác hoặc hình mác ngược, ngọn lá nhọn

- Ở giữa có gân chính chạy dọc lá, các gân

- Có lông tơ ở xa cuống, mép có lông mịn dày đặc

31

phụ song song, hợp với gân chính góc 45 độ về phía ngọn

- Độ dày giảm dần từ gốc đến ngọn, từ gân ra

mép lá

Cuống

lá

- Tròn, dài 1 - 5,5 cm, đường kính tiết diện 0,5 - 0,7 cm, phủ nhiều lông

- Bẹ lá có khía, không lông

Lưỡi

nhỏ

- Dài 1 - 1,5 cm, có lông nhiều ở mép và đỉnh

- Nguyên, dài 1,4 - 1,6 cm, phủ lông tơ màu nâu dày đặc

- Dài 6 mm, có lông

tơ ở đỉnh

Cụm hoa

- Dạng chùy, mọc ở ngọn thân, dài khoảng

- Màu nâu, dài 3 - 4

32

Đài hoa

- Hình ống, dài khoảng 1,5 cm, đỉnh chia 4 thùy

- Màu trắng hoặc vàng nâu

- Hình ống, dài 2 -

2,3 cm, đỉnh chia 4 thùy

Tràng hoa

- Ống dài khoảng 1 cm

- Màu trắng, có lông tơ

ở mép, chia 3 thùy, các thùy dài khoảng 3 - 5

cm

- Thùy lưng hình trứng, hai thùy bên hình elip

Thùy lưng rộng gấp đôi thùy bên

- Trắng đục, hình

ống dài 1 cm, có lông tơ ở phần giáp với cuống

- Thùy giữa gần tròn, rộng 2 cm;

- Ở giữa màu đỏ, vàng

ở mép, có vân đỏ tỏa tia lên phía trên

- Hình trứng rộng

- KT: 3,5 - 4,0 x 2,1

- 2,6 cm, đỉnh hẹp, 2 thùy

- Màu cam – vàng, ở giữa có màu đỏ tươi, vàng ở mép, có vằn

- Chỉ nhị màu trắng, hình lòng máng ôm vòi nhụy

- Dài khoảng 4 cm tính

cả bao phấn

- Nhị dài 3 cm, chỉ nhị dài 1,2 cm

- Chỉ nhị dài 7 mm,

bao phấn 1,7 cm