Nghiên cứu và xây dựng phương pháp xác định urê trong nước mắm việt nam

Hiện nay, trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều phương pháp phân tích dư lượng urê trong máu, rượu, sữa, thức ăn chăn nuôi, sản phẩm thủy sản [1], [2], vì trên thế giới người ta ít sử dụ

PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Nước mắm là sản phẩm truyền thống của người dân Việt Nam từ bao đời nay Đây là thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn của mỗi gia đình Bên cạnh việc mang lại giá trị dinh dưỡng cao, nước mắm còn tạo hương vị hấp dẫn, làm bữa ăn trở nên đậm đà, không những nổi tiếng ở trong nước mà còn được biết đến ở nhiều nước trên thế giới

Trong những năm gần đây, nhờ việc cải tiến quy trình công nghệ và chủ động nguồn nguyên liệu sản xuất mà sản lượng nước mắm được duy trì

ổn định cả về số lượng và chất lượng Tuy nhiên, bên cạnh mục đích nâng cao hàm lượng các chất dinh dưỡng, nhiều xí nghiệp đã có biểu hiện gian lận thương mại Những biểu hiện tiêu cực như pha loãng nước mắm, dùng hoá chất độc hại như urê để bảo quản cá hay tăng độ đạm một cách giả tạo

Trước đây, việc kiểm tra chất lượng nước mắm tiêu thụ nội địa hầu như bị lãng quên nên không có gì đảm bảo về chất lượng sản phẩm Hiện nay, việc kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm đối với nước mắm đã được kiểm tra chặt chẽ hơn Nhưng kết quả giám sát chất lượng nước mắm của các cơ quan chức năng gần đây khiến người dân Việt Nam không yên tâm khi sử dụng các sản phẩm này vì hàm lượng urê cao quá mức cho phép theo tiêu chuẩn Bộ Y tế Việt Nam rất nhiều lần [9] Bên cạnh đó, việc xử lý, thu hồi sản phẩm có hàm lượng urê chưa chặt chẽ dẫn đến nhiều lô hàng vẫn trôi nổi trên thị trường không thể kiểm soát được

Trong khi đó, những phương pháp xét nghiệm urê trong nước mắm ở Việt Nam hiện nay đều không thể xác định được đâu là urê hình thành trong quá trình thủy phân đạm để sản xuất nước mắm và đâu là urê cho thêm vào Đồng thời cũng chưa có nghiên cứu khoa học nào về hàm lượng urê cao nhất và thấp nhất sinh ra trong quá trình chế biến nước mắm Trong thời gian qua, các cơ

quan chức năng hết xử phạt rồi lại rút lại quyết định xử phạt (Trung tâm Kỹ thuật Đo lường Chất lượng 3 đã thu hồi lại các kết quả kiểm nghiệm urê chưa chính xác) Điều này ảnh hưởng rất lớn đến uy tín của nhà sản xuất do sự nhạy cảm của người tiêu dùng đồng thời đã làm cho các cơ quan lúng túng trong việc

xử lý những sản phẩm nước mắm có hàm lượng urê cao vì chưa có một khung tiêu chuẩn rõ ràng

Hiện nay, trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều phương pháp phân tích dư lượng urê trong máu, rượu, sữa, thức ăn chăn nuôi, sản phẩm thủy sản [1], [2], vì trên thế giới người ta ít sử dụng các sản phẩm nước mắm do vậy phương pháp phân tích chất lượng nước mắm nói chung và chỉ tiêu urê nói riêng chưa được quan tâm đúng mức Mỗi phương pháp phân tích trên cùng một mẫu do đó có thể cho kết quả khác nhau, vì vậy, vẫn còn nhiều vấn đề đáng tranh luận về kết quả phân tích hàm lượng urê trong nước mắm Xuất phát từ thực tế nêu trên, mục đích của đề tài là nghiên cứu một số phương

pháp phân tích hoá lý hàm lượng urê trong nước mắm Từ đó tìm ra một phương pháp tối ưu nhất trong việc phân tích và đánh giá kết quả trên một số

loại nước mắm có mặt trên thị trường Việt Nam là rất cần thiết

1.2 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu một số phương pháp phân tích hoá học hàm lượng urê trong nước mắm và đánh giá kết quả của phương pháp này trên một số loại

nước mắm có mặt trên thị trường Việt Nam

1.3 Yêu cầu của đề tài

Xây dựng, hoàn thiện các phương pháp phân tích hàm lượng urê trên các sản phẩm nước mắm khác nhau

Tiến hành phân tích đồng thời các phương pháp trên một số sản phẩm nước mắm tại Việt Nam và so sánh các kết quả thu được

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nước mắm ở Việt Nam

Việt Nam là nước sản xuất nước mắm với sản lượng lớn và ổn định, khoảng 170-180 triệu lít/năm Các xí nghiệp sản xuất nước mắm phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung và miền Nam như: Nha Trang, Phan Thiết, Phú Quốc, Thanh Hóa, Nghệ An Ở miền Bắc chủ yếu là Hải Phòng có một vài xí nghiệp lớn với công suất 2-4 triệu lít nước mắm/năm còn lại sản xuất với quy

mô hộ gia đình Xét về mặt cơ cấu các mặt hàng thủy sản thì nước mắm là loại sản phẩm thủy sản chế biến đang có khả năng cạnh tranh với nhiều sản phẩm khác như tôm, nhuyễn thể

Hiện nay, nước mắm tiêu thụ gồm nhiều nguồn khác nhau Tất cả các tỉnh ven biển đều có các cơ sở sản xuất nước mắm và tiêu thụ trên thị trường

cả nước Ở miền Bắc, luồng nước mắm chủ yếu được đưa ra từ Phan Thiết, Phú Quốc, Thành phố Hồ Chí Minh, Nha Trang Qua số liệu điều tra của Bộ Thủy sản cho thấy tổng sản lượng nước mắm tiêu thụ trên toàn quốc năm

1992 là 100 triệu lít, đến năm 1996 là 100 triệu lít, lượng nước mắm tiêu thụ ở miền Bắc khoảng 50 triệu lít được đưa ra từ miền Nam [1]

Sản lượng nước mắm sản xuất vào năm 2004 [1]:

Miền Bắc: 10-15 triệu lít (Hải Phòng là 5-8 triệu lít, Quảng Ninh 3 triệu lít)

Miền Trung: Đà Nẵng đến Khánh Hòa là 47 triệu lít, Ninh Thuận và Bình Thuận là 20-30 triệu lít

Miền Nam: 60-70 triệu lít trong đó Kiên Giang là 22 triệu lít, Thành phố

Hồ Chí Minh là 30 triệu lít

Tổng sản lượng cả nước vào thời điểm đó là 168 triệu lít với tổng doanh thu khoảng 1008 tỷ đồng Về mặt giá cả, đối với nước mắm có chất lượng tốt giá bản khoảng 10000 - 20000 đồng/lít Bên cạnh đó trên thị trường vẫn lưu hành

các loại nước mắm rẻ tiền với giá từ 4000 - 5000 đồng/lít chất lượng thấp, sản xuất bằng cách pha đấu, chủ yếu tiêu thụ cho các quán ăn bình dân Trong tất cả các cơ sở sản xuất nước mắm, riêng hãng nước mắm Phú Quốc hiện nay đang

và đã chiếm lĩnh thị trường trong và ngoài nước đặc biệt là thị trường châu Âu Hiện nay, mức sống của người dân ngày càng được cải thiện, nhu cầu về mặt thực phẩm nói chung và nước mắm nói riêng ngày càng lớn Chất lượng nước mắm không chỉ dừng lại ở các thông tin về thành phần dinh dưỡng mà quan trọng hơn cả là đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Trong thời gian qua, vấn đề nước tương có chất 3-Monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) vừa tạm lắng xuống thì dư luận một lần nữa lại xôn xao vì thông tin nhiều loại nước mắm bày bán trên thị trường có chứa urê gây hoang mang cho người tiêu dùng Vấn đề ở chỗ hiện nay chưa có một tài liệu nào công bố tác hại của urê trong nước mắm đối với cơ thể con người để có thể yên tâm khi sử dụng mà không lo ngại đến sức khỏe Và con số 0,05 g/l mà bộ tiêu chuẩn cho phép hiện diện trong thực phẩm chỉ mang tính chất tham khảo Lý do vì phương pháp phân tích urê trong nước mắm hiện nay không thể phân biệt được đâu là urê nội sinh và urê được bổ sung từ bên ngoài vào

2.2 Tình hình nghiên cứu nước mắm

Xét về mặt hàng nước chấm thì đã có từ lâu nhưng từ năm 1914 nghiên cứu

về nước mắm mới bắt đầu chính thức Nghiên cứu đầu tiên là những nhà khoa học người Pháp như: Tiến sĩ khoa học Rose, bác sĩ Mesnard đã điều tra các phương pháp chế biến khác nhau ở các địa phương Việt Nam và bán đảo Đông Dương Năm 1924 đến năm 1927, nhà bác học Krempf phát hiện ra sản phẩm sản xuất bằng cá trong điều kiện vô trùng thiếu hẳn hương vị của nước mắm

Năm 1930, hai nhà bác học Pháp Boez và Guillerm đã nghiên cứu về vai trò

của một số vi sinh vật trong quá trình sản xuất nước mắm có thể là Clostridium, một

loại vi khuẩn kị khí, có nha bào, và có khả năng tạo protease cao, sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 28oC - 45oC

Năm 1939 đến 1944, Antret và Vialardgoudon đã nghiên cứu về thành phần của các acid amin có mặt trong nước mắm và tìm thấy Histamin một chất gây độc trong nước mắm Tiền dẫn xuất của amin này chính là acid amin Histidin được hình thành trong quá trình thủy phân protein cá

Năm 1959, bác sĩ dược phẩm Laurescu (Rumani) đã nghiên cứu thấy rằng

sự phân giải protein của thịt cá là do protease có sẵn trong cá Ngoài ra, nếu có tác động của các loại enzyme được lấy ra từ ruột cá loại cá ăn thịt, trong tạng lợn, nhớt trong ruột non lợn, chượp chín tốt, papain trong nhựa đu đủ khô và quả

đu đủ Các chế phẩm này đều hoạt động mạnh ở tỉ lệ muối thấp Do vậy, tác giả giảm độ muối ban đầu xuống 20% và thêm 150g KNO3 (diêm tiêu)/100 kg cá để giảm thối, sau đó cho đủ muối Như vậy, có thể rút ngắn thời gian chế biến chượp

từ các nguồn chế phẩm enzyme bổ sung Theo nghiên cứu của các tác giả Amano, Beddows.C.G.(1997), Meinkew.W.(1959) Vanven.A.G.(1953), Sanpano (1965)

cho thấy việc cấy thêm vi khuẩn Baccillus mensentenricus với tỉ lệ 10 lít/100kg cá

không có tác dụng rõ rệt trong việc cải thiện quá trình thủy phân protein cá

Ở Việt Nam, Lương Hữu Đồng và tập thể nhiều nhà nghiên cứu đã đề cập tới các giải pháp công nghệ nhằm tác động vào hệ vi sinh vật trong quá trình chượp cá Như vậy, mục đích của các nhà nghiên cứu trên là tìm cách rút ngắn thời gian và cải tiến các phương pháp chế biến, bên cạnh đó có các công trình hợp lý hóa sản xuất, cải tiến trang thiết bị bước đầu dùng hơi nước vào công đoạn sản xuất nước mắm

3.3 Thành phần hóa học chính của nước mắm

3.3.1 Thành phần các acid amin

Acid amin có vai trò quan trọng đối với cơ thể con người Trong nước mắm hàm lượng này chiếm tỷ lệ khá cao, đặc biệt là nước mắm cao đạm Mỗi loại cá có thành phần hóa học khác nhau, nước mắm của mỗi loại cá cũng ngon một cách khác nhau Trong nước mắm người ta đã tìm thấy 17 acid amin: Lysine, Valine, Methionine, Isoleucine, Glycine, Alanine, Proline, Glutamic acid, Phenylalanine, Triptophan, Xistin, Arginine, Aspatic, Serine, Threonine, Leucine, Lysine Trong cá

và trong nước mắm đều có đầy đủ 8 loại acid amin không thay thế: Valine, Leucine, Isoleucine, Threonine, Methionine, Lysine, Phenylalanine, Triptophan

Bảng 2.1 Hàm lượng một số acid amin trong cá

Bảng 2.2 Thành phần các acid amin có trong nước mắm [14]

Stt Acid amin Mẫu số 1(g/100g) Mẫu số 2 (g/100g) Mẫu số 3 (g/100g)

2.3.2 Thành phần nitơ trong nước mắm

Khi phân tích các mẫu nước mắm từ các loại cá và phương pháp chế biến khác nhau, hàm lượng này có sự khác nhau rõ rệt Nitơ toàn phần và đạm hữu cơ cao cho nước mắm ngon [14]

Bảng 2.3 Thành phần nitơ trong nước mắm

Các loại nitơ Đơn vị

Nước mắm cá biển thủ công dài ngày

Nước mắm cá biển xí nghiệp dài ngày

Nước mắm cá nước ngọt

3.3.3 Thành phần các chất bay hơi trong nước mắm [5]

Chất bay hơi trong nước mắm là các chất có trọng lượng phân tử nhỏ,

dễ bay hơi và có mùi thơm Thành phần các chất này trong nước mắm rất phức tạp và nó quyết định hương vị của nước mắm Theo nghiên cứu của Nonaka và cộng sự cho thấy hàm lượng các chất bay hơi trung tính 12 loại, acid bay hơi 4 loại, cacbonyl bay hơi là 6 loại và amin là 7 loại Hàm lượng các chất bay hơi được xác định như sau (mg/100ml nước mắm):

Các chất cacbonyl bay hơi 407 - 512

Các acid bay hơi (tính theo acid acetic) 404 - 533

Các amin bay hơi 9,5 - 11,3

Các chất trung tính bay hơi: 5,1 - 13,2

Theo nghiên cứu của Teruo, trong nước mắm tồn tại nhiều loại acid, các acid bay hơi và hàm lượng của chúng giảm dần theo thứ tự: acid butyric, iso-butyric, propyonic, fumaric, succinic, lactic, pyroglutamic Trong các loại acid này thì acid iso-butyric và butyric

chiếm trên 30% tổng lượng acid hữu cơ trong nước mắm

3.3.4 Thành phần Vitamin

Người ta đã tìm thấy trong cá có nhiều loại Vitamin khác nhau (B1, B2, B12, PP, ) tuy nhiên trong nước mắm chủ yếu Vitamin tan trong nước Thành phần và hàm lượng thay đổi tùy thuộc vào loại cá và phương pháp chế biến nước mắm

3.3.5 Các chất vô cơ

Trong nước mắm có chứa nhiều thành phần các chất vô cơ khác nhau Muối NaCl là thành phần chủ yếu, ngoài ra còn có Kali, Phospho, Canxi, Magie, lưu huỳnh Canxi và Magie tồn tại ở dạng vô cơ (anhydride phosphoric) và vừa ở dạng hữu cơ (Cistine) Hàm lượng các chất vô trong một lít nước mắm trung bình/1 lít nước mắm là: Phospho (0,266-0,556g), lưu huỳnh (0,546-1,165g), canci (0,439-0,541g), (magie 2,208-2,320g), bromua (68,8-97,5mg)

2.4 Các phương pháp nghiên cứu phân tích urê trong nước mắm

2.4.1 Thông tin chung về urê

Danh pháp quốc tế (IUPAC): Diaminomethanal

Tính chất lý học:

Urê (Tên quốc tế là Urea hay Cacbamide) là chất rắn không mùi màu trắng, dạng tinh thể hình kim hoặc lăng trụ Tỷ lệ %N rất cao (46%)

Điểm nóng chảy: 132,7oC (406oK) - bị phân hủy

Urê dễ bị chảy nước, do đó khi bị ẩm urê biến đổi dần thành amoni cacbonate theo phương trình phản ứng:

(NH2)2CO + 2H2O = (NH4)2CO3

Urê được Hilaire Rouelle phát hiện năm 1773 Nó là hợp chất hữu cơ được tổng hợp lần đầu tiên từ các chất vô cơ và được Friedrich Woehler thực hiện vào năm 1828 bằng cách cho xyanate kali phản ứng với sulfat ammonia Như vậy urê là hợp chất hữu cơ của cacbon, nitơ, oxy và hidro với công thức CON2H4 hay (NH2)2CO Trong một số động vật, các phân tử urê được tạo từ cacbon dioxide, nước, muối aspartat và ammonia trong quá trình trao đổi chất được biết đến như chu trình urê (chu trình ocmithine) - một chu trình đồng hóa

Sự tiêu hao năng lượng này là cần thiết do ammonia, một chất thải phổ biến trong quá trình trao đổi chất, là một chất độc và cần được trung hòa Việc sản xuất urê diễn ra trong gan và dưới sự điều chỉnh của N-acethylglutamate

Urê có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau và trong y học Trong công nghiệp được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau, trong nông nghiệp urê được dùng làm phân bón nhằm nâng cao năng suất cây trồng và bổ sung vào thức ăn gia súc với tỷ lệ 3% so với ngũ cốc hoặc 1% trong tổng số khối lượng; đối với sản phẩm tiêu dùng thì urê được sử dụng trong sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, các mỹ phẩm như kem, dầu gội đầu, thuốc nhuộm tóc với tỷ lệ 1% Urê có thể dùng thay thế cho muối NaCl trong việc loại bỏ băng hay sương muối của lòng đường hay đường băng sân bay,

nó không gây ra hiện tượng ăn mòn kim loại như muối Trong thực phẩm urê

được xếp vào danh mục phụ gia thực phẩm theo Codex (CAC/GL, 26-1989, soát xét 2005) với chỉ số INS là 972b, nhưng chưa được quy định Tiêu chuẩn chính thức về phụ gia thực phẩm Urê được sử dụng trong kẹo cao su nhằm ổn định cấu trúc, như một thành phần bổ sung trong thuốc lá, nó được thêm vào

để tăng hương vị và có thể được sử dụng là chất tạo màu nâu vàng trong sản xuất kẹo bích quy Bản thân urê là chất biến tính protein mạnh, vì thế thuộc tính này có thể khai thác làm tăng độ hòa tan của một số protein Urê có thể hòa tan được protein đặc tới 10M và thường áp dụng trong quy mô phòng thí nghiệm Trong y học, urê được sử dụng trong các sản phẩm da liễu cục

bộ để giúp cho quá trình tái hydrate hóa của da Đối với chuẩn đoán sinh lý học, do urê được sản xuất và bài tiết khỏi cơ thể với một tốc độ gần như không đổi, nồng độ urê cao trong máu chỉ ra vấn đề với sự bài tiết nó hoặc trong một số trường hợp nào đó là sự sản xuất quá nhiều urê trong cơ thể Nguyên nhân phổ biến của bệnh uremia là các vấn đề về hệ tiết niệu Nó được lấy thông số cùng với creatinine để chỉ ra các vấn đề trực tiếp liên quan tới thận (ví dụ: hư thận mãn tính) hay các vấn đề thứ cấp như chứng giảm hoạt động tuyến giáp Trong các chuẩn đoán khác, các loại urê chứa cacbon 14 - đồng vị phóng xạ, hay cacbon 13 - đồng vị ổn định) được sử dụng trong xét nghiệm thở urê, được sử dụng để phát hiện sự tồn tại của

Helicobacter pylori (H pylori, một loại vi khuẩn) trong dạ dày và tá tràng người Xét nghiệm này phát hiện enzym urease đặc trưng, được H pylori

sản xuất ra theo phản ứng để tạo ra ammonia từ urê để làm giảm độ pH của môi trường trong dạ dày xung quanh vi khuẩn [20]

2.4.2 Các nguy cơ độc hại từ nguyên liệu cá chế biến nước mắm [15]

Con người là sinh vật dị dưỡng nên các nhu cầu về dinh dưỡng của mình thường được thỏa mãn bằng các thực phẩm có nguồn gốc động thực vật Tiêu chuẩn để lựa chọn thực phẩm ngoài giá trị chất lượng dinh dưỡng, khả năng cung cấp và bảo quản thì sự vắng mặt các độc tính là yếu tố quyết định Những

sản phẩm có lợi ích nào đó về mặt dinh dưỡng nhưng hàm chứa một độc tính nội tại cao thì sẽ bị loại bỏ ra bộ sưu tập thực phẩm của con người

Đối với nguyên liệu cá dùng chế biến nước mắm có thể tìm thấy một số chất độc và nó có thể hiện diện trong nước mắm nếu như quá trình chế biến không được loại bỏ Một số độc tố điển hình như ciguatoxin đã được tìm thấy

ở khoảng 300 - 400 loài cá và nhuyễn thể Đây là độc tố do vi khuẩn ký sinh tích lũy độc tố trên cá Khi cơ thể ăn phải độc tố này sau từ 1 - 4h là buồn nôn đau bụng tiêu chảy và gây độc lên hệ thần kinh, tê liệt tay chân và có thể tử vong Độc tố histamin từ các loại cá có khả năng gây độc cho người sử dụng Biểu hiện của người ăn phải độc tố sau khi ăn từ vài phút đến 4 giờ như hoa mắt, chóng mặt, nổi mày đay, hạ huyết áp hay buồn nôn

Nước mắm ngoài hương vị thơm ngon còn có tác dụng kích thích sự thèm

ăn Nước mắm sản xuất theo phương pháp cổ truyền tuy có hàm lượng đạm thấp nhưng thơm ngon, hấp dẫn còn nước mắm sản xuất công nghiệp tuy giàu đạm (có thể lên đến 55-60 g/l) tạo cảm giác ngon miệng nhưng hương vị không bằng Nước mắm đạt tiêu chuẩn là nước mắm có độ đạm ammonia, acid amin và protid chưa phân giải, trong đó hàm lượng acid amin phải lớn hơn hoặc bằng 30%

Ngoài ra, các chỉ số về muối natri, hàm lượng Histamine, dư lượng tối đa về chì

cũng như các chỉ tiêu vi sinh (E Coli, Staphyllococcus aureus, nấm mốc…)

cũng là các yếu tố cần kiểm định để xác định tiêu chuẩn chất lượng nước mắm Nhiều người nghĩ rằng nước mắm có độ đạm càng cao thì càng tốt nhưng thật ra việc dùng nước mắm cao đạm không cần thiết vì đạm được cung cấp từ thức ăn

Ngoài ra trong quá trình chế biến nước mắm nếu không thực hiện theo đúng quy trình công nghệ có thể nhiễm vi sinh vật lạ đôi khi là chất độc đối với cơ thể Có những chất độc con người có thể kiểm soát được để hạn chế hoặc khử chúng sinh ra trong sản phẩm thực phẩm, có những chất độc mà con

người không thế kiểm soát được Tuy nhiên vì mục đích thương mại mà các nhà sản xuất vẫn cố ý cho vào mà hậu quả vẫn là người tiêu dùng

2.4.3 Đánh giá nguy cơ độc hại của urê

Urê là chất kết tinh, có thể hòa tan trong nước, rượu etylic và ammonia Hiện nay danh mục các chất phụ gia cho phép của Bộ Y tế Việt Nam không có urê Gần đây người dân chưa hết bàng hoàng lo lắng vì nước tương có chứa chất 3-MPCD thì người tiêu dùng lại xôn xao trước thông tin nước mắm chứa urê

Từ trước đến nay, người ta ít đề cập đến ảnh hưởng của urê đối với sức khỏe con người mà chủ yếu nghiên cứu ảnh hưởng của nó đối với da và một vài nghiên cứu về áp dụng trong điều trị y học Người ta sử dụng urê với hàm lượng 10% trong thuốc mỡ và kem để điều trị da khô và sau một thời gian dài theo dõi cho thấy urê không gây dị ứng Nhiều bệnh nhân có thể chịu được lượng urê khác nhau, nhưng một số bị tiêu chảy sau khi ăn vào 60-90 g/ngày Một bệnh nhân đã ăn vào 30g urê (khoảng 470 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày) và tiêu thụ trong 5 năm mà không có biểu hiện ảnh hưởng gì đến sức khỏe [18]

Theo một nghiên cứu khác thì không thấy biểu hiện độc tố đối với những người có hàm lượng nitơ urê trong máu thấp hơn 45 mg/100ml (khoảng 96 mg urê/100ml máu), trong trường hợp hàm lượng nitơ urê trong máu lên đến 70 mg/100ml (khoảng 150 mg urê/100ml) thì bị mất cảm giác thèm ăn, buồn nôn và nôn mửa (Crawford và McIntosh 1925)

Urê là hợp chất thành lập trong gan từ ammonia do sự thoái biến của acid amin và thải ra ngoài qua đường nước tiểu Lượng urê tăng lên trong cơ thể báo hiệu tình trạng yếu thận Khi thận bị yếu, lượng urê trong máu tăng cao vì lượng urê trong máu tùy thuộc chức năng thận, bình thường từ 0,18-0,45 g/l đối với nam), 0,15-0,42 g/l đối với nữ, tăng ở người cao tuổi, người vận động gắng sức lâu dài, người có chế độ ăn giàu protein, người bị suy thận cấp hoặc mãn, bệnh tim, mất nước, hậu phẫu [18], [20]

Tăng urê nói lên sự thiểu năng thận, giảm độ lọc của cầu thận và giảm bài tiết của ống thận Trong lâm sàng, người ta thường tính toán độ thanh lọc creatinin (huyết tương) và độ thanh lọc urê của thận để đánh giá chức năng lọc của thận và xét nghiệm urê máu và nước tiểu được làm nhiều để đánh giá chức năng lọc cầu thận và tái hấp thu ở ống thận Bình thường: Nồng độ urê máu: 3,6 – 6,6 mmol/l Nồng độ urê nước tiểu : 250 – 500 mmol/24 giờ [18], [20] Một nghiên cứu của Johnson và cộng sự (1972), các bệnh nhân bị mắc bệnh thận có các biểu hiện khó chịu, nôn mửa, yếu, hôn mê và chảy máu khi urê

ở mức 300-600 mg/100ml trong thời gian từ 60 - 90 ngày Mức urê trong máu dưới 300 mg/100ml chịu được đối với các bệnh nhân Với những người mà dạ

dày bị nhiễm H.pylori có thể bị ảnh hưởng do việc sinh ra ammonia từ urê [18]

Giá mua và giá bán sản phẩm nước mắm được quyết định bởi chỉ số đạm toàn phần, tức là tổng số gram nitơ trong 1 lít nước mắm Thành phần đạm trong nước mắm bao gồm nitơ toàn phần, nitơ formol và nitơ ammonia Theo tiêu chuẩn Việt Nam, một mẫu nước mắm tốt phải có tỷ lệ nitơ formol/nitơ toàn phần lớn hơn 60% và tỷ lệ nitơ ammonia/nitơ formol nhỏ hơn 50% Hiện nay, để tăng độ đạm trong nước mắm, có người cho vào “phân urê” Bởi vì phương pháp phân tích urê trong nước mắm không thể phân biệt được đâu là urê nội sinh và đâu là urê được bổ sung vào

Urê là sản phẩm tự nhiên cuối cùng của quá trình đồng hóa acid amin trong cơ thể con người được biết đến là chu trình urê, lượng urê này sẽ được đào thải qua nước tiểu Người lớn thải khoảng 20 g/ngày và lượng urê trong kẹo cao su lên tới 3% không gây độc đối với người [20].Urê có sẵn trong thịt

cá, các loại sụn biển có chứa một lượng lớn urê (1-2,5%), nói chung hàm lượng này có ít hơn 0,05% đối với thịt cá có xương [4]

Qua thống kê kết quả phân tích cho thấy hàm lượng urê trong nước mắm nằm trong khoảng 12 - 30 g/l tùy thuộc loại nước mắm Hàng ngày trung bình mỗi người Việt Nam tiêu thụ 10 - 15 ml Như vậy, trong một lít nước mắm chứa khoảng 20g urê thì mỗi người ăn vào nhiều nhất là 0,3

g/ngày là thấp hơn so với liều gây độc Urê được ngư dân sử dụng như một chất bảo quản hải sản tươi sống Urê không ức chế sự phát triển của vi sinh vật mà nó còn là nguồn cung cấp thêm nitơ dễ hấp thu làm cho vi sinh vật phát triển

Urê nội sinh không gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng, vấn đề ở chỗ các nhà sản xuất sử dụng urê bổ sung từ bên ngoài vào dưới dạng phân đạm

để tăng độ đạm của nước mắm hoặc sử dụng cá đã ướp urê làm nguyên liệu trong quá trình sản xuất nước mắm, đây chính là nguyên nhân dẫn đến tăng hàm lượng urê trong nước mắm thành phẩm Vấn đề đáng lo ngại ở chỗ urê dưới dạng phân đạm thường có lẫn các tạp chất kim loại nặng như asen, chì, thủy ngân, niken đều là nhóm chất có độc tính đặc biệt gây ung thư cho người và động vật

2.4.4 Nguyên nhân và mức độ hiện diện của urê trong nước mắm

Thực phẩm là yếu tố quan trọng song hành với sự sinh tồn của loài người Theo quá trình tiến hoá và phát triển của loài người, thực phẩm cũng được phát triển theo Cùng với sự tiến triển của khoa học công nghệ, công nghệ chế biến thực phẩm cũng phát triển Nguy cơ tác hại đến sức khỏe của thực phẩm từ nguồn thức ăn thô là nguy cơ tự nhiên đến từ chính thành phần chứa trong thực phẩm hoặc tạp nhiễm môi trường, cũng biến đổi theo quy trình chế biến thực phẩm công nghiệp là tạp nhiễm và phát sinh Có nhiều nguồn nguy cơ tác hại đến sức khoẻ của thực phẩm, nhưng tựu trung lại có thể sắp thành hai nhóm chính là nhóm vi sinh vật và nhóm hoá chất Đối với nguồn độc tố là hoá chất, ngoài nguồn nguy cơ tự sinh trong quá trình chế biến hoặc bị nhiễm từ bên ngoài Nguồn nguy cơ do phát sinh trong dây chuyền chế biến có thể lại là một tai nạn nghề nghiệp mà cũng có thể do nhà sản xuất cố ý để đạt được hiệu ứng thành phẩm Nhu cầu về một thực phẩm đáp ứng không những về dinh dưỡng mà còn về tính an toàn và không gây hại cho sức khỏe đối với người tiêu dùng là cần thiết

Chất 3-MPCD hình thành trong quá trình chế biến khi có hội tụ cả 3 điều kiện đó là acid clohidric, nhiệt độ và chất béo bậc cao Sự hiện diện của chất này có mặt trong rất nhiều thực phẩm khi có đủ 3 điều kiện trên nhưng người ta tìm thấy nhiều nhất trong nước tương, xì dầu là một trong những mặt hàng nước chấm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày[11].

Đối với sản phẩm nước mắm, nguồn nguy cơ vừa tự sinh trong quá trình chế biến, vừa bị nhiễm từ bên ngoài do nhà sản xuất cố ý bổ sung vào Như vậy, urê xuất hiện trong nước mắm có thể từ 3 nguyên nhân: nội sinh từ

cá trong quá trình phân hủy, ngư dân dùng để ướp cá với mục đích bảo quản,

và do gian lận thương mại của các nhà sản xuất với mục đích tăng độ đạm trong quá trình chế biến nước mắm Nguyên nhân gia tăng hàm lượng urê trong nước mắm do nội sinh là rất nhỏ và không đáng lo ngại đối với sức khỏe người tiêu dùng

Trong khi đó, những phương pháp xét nghiệm urê trong nước mắm ở Việt Nam hiện nay đều không thể xác định được đâu là urê hình thành trong quá trình thủy phân đạm để sản xuất nước mắm và đâu là urê cho thêm vào Đồng thời cũng chưa có nghiên cứu khoa học nào về hàm lượng urê cao nhất

và thấp nhất sinh ra trong quá trình chế biến nước mắm Trong thời gian qua, các cơ quan chức năng hết xử phạt rồi lại rút lại quyết định xử phạt do Trung tâm Kỹ thuật Đo lường Chất lượng 3 đã thu hồi lại các kết quả kiểm nghiệm urê chưa chính xác Điều này ảnh hưởng rất lớn đến uy tín của nhà sản xuất

do sự nhạy cảm của người tiêu dùng đồng thời đã làm cho các cơ quan lúng túng trong việc xử lý những sản phẩm nước mắm có hàm lượng urê cao vì chưa có một khung tiêu chuẩn rõ ràng Hiện nay, Hiệp hội lương thực thực phẩm và tiêu chuẩn Codex đều cho phép mức độ hiện diện của urê tối đa trong nước mắm là 0,05g/l

2.4.5 Các phương pháp phân tích urê hiện nay

2.4.5.1 Phương pháp so màu [8], [10]

Phương pháp so màu hiện nay được thực hiện dựa trên phản ứng giữa p-Dimethylamonobenzaldehyde (DMAB) và urê có trong mẫu tạo

phức màu vàng, sau đó đo ở bước sóng 420 nm hoặc 435 nm trên máy quang phổ UV-VIS Phương pháp này được áp dụng để xác định urê trong thức ăn gia súc theo AOAC 2006 (967.07) trong sữa bột, thủy hải sản, nước tiểu và trong máu

Ngoài phản ứng tạo phức với DMAB còn cho phản ứng tạo phức với hợp chất Diacethylmonoxime (DAM) tạo phức màu hồng và đo ở bước sóng 540 nm trên máy quảng phổ UV-VIS

Ưu điểm của phương pháp này là tiến hành nhanh, đơn giản, không tốn nhiều chi phí phục vụ cho việc phân tích

Nhược điểm của phương pháp là ảnh hưởng của nền mẫu nước mắm,

do bản chất của sản phẩm nước mắm trong quá trình tự thuỷ phân hình thành các acid amin tự do, các acid amin tự do này có khả năng cũng phản ứng với thuốc thử nên gây sai số thừa khi áp dụng phép thử Vì vậy phương pháp này chịu ảnh hưởng rất nhiều của nền mẫu nước mắm và không phù hợp cho việc

áp dụng trong phân tích Tuy nhiên, phương pháp so màu cũng đã có một số phòng thí nghiệm áp dụng để phân tích hàm lượng urê trong nước mắm

và sau khi được thủy phân bằng enzyme urease Phương pháp này thường áp dụng phân tích hàm lượng urê trong nước tiểu, rượu và thức ăn gia súc Ưu điểm của phương pháp là khá nhanh và đơn giản, tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn chế do việc sử dụng và bảo quản enzyme này dẫn đến phương pháp này không nhạy, giới hạn phát hiện cao vì bản thân mẫu bị ảnh hưởng bởi hợp chất ammonia

2.4.5.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [21]

Ngoài phương pháp trên, một số nhà phân tích đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao năng - đầu dò huỳnh quang để xác định urê Nguyên lý của phương pháp này là cho urê tạo dẫn xuất với thuốc thử xanthydrol tạo thành hợp chất N-9H-xanthen-9 -ylurea và được đo bằng đầu dò huỳnh quang với bước sóng kích thích ex = 213 nm, bước sóng phát xạ em = 308 nm sau khi tách bằng cột sắc kí pha đảo (C18) trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao năng Phương pháp này thường được áp dụng để phân tích hàm lượng urê trong nước tiểu, rượu và trong máu [21] Phương pháp này ưu việt hơn so với phương pháp so màu và phương pháp enzyme do tính chọn lọc, độ nhạy và khả năng phát hiện cao, có thể phát hiện được hàm lượng urê ở dạng vết do loại bỏ được ảnh hưởng của nền mẫu Nhược điểm của phương pháp là phức tạp, đầu tư lớn không chỉ về mặt hóa chất thiết bị mà còn thời gian phân tích

Trong các phương pháp phân tích nói trên, mỗi phương pháp thể hiện tính ưu việt và hạn chế riêng Vì thế, tùy thuộc vào điều kiện tiến hành thí nghiệm, thời gian và việc chuẩn bị hóa chất phục vụ cho phân tích mà có thể

áp dụng các phương pháp khác nhau Độ chính xác của phương pháp phân tích còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ nhạy của thiết bị đo, dụng cụ, thao tác thực hiện, loại mẫu và phương pháp xử lý mẫu phù hợp

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng urê trong một số mẫu nước mắm dựa trên phương pháp so màu và phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao năng Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đánh giá các thông số về độ nhạy và độ chính xác cho từng phương pháp, sau đó tiến hành phân tích một số mẫu nước mắm trên thị trường Việt Nam và so sánh kết quả phân tích hàm lượng urê trong cùng mẫu nước mắm bằng các phương pháp khác nhau

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

Nguyên liệu nghiên cứu trong đề tài này là các loại nước mắm thu thập trên thị trường, thời điểm lấy mẫu là tháng 10 năm 2009

3.2 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: urê

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Phân tích, Trung tâm Giáo dục và Phát triển sắc ký, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Thời gian nghiên cứu: 24 tháng (từ tháng 4 năm 2009 đến tháng 3 năm 2011)

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Nội dung 1: Xây dựng, hoàn thiện các phương pháp phân tích hàm lượng urê trên các sản phẩm nước mắm khác nhau

Thí nghiệm 1: Xác định hàm lượng urê bằng phản ứng với chất tạo phức Dimethylaminobenzaldehyde và đo trên máy quang phổ UV-VIS [8]

* Giới hạn định lượng (Limit of of quantitation): Giới hạn định lượng urê với thiết bị quang phổ UV-VIS được xem là nồng độ nhỏ nhất mà thiết bị phân tích có thể xác định được

* Độ đúng bao gồm 2 thành phần là:

- Độ chụm (CV %): Thể hiện bằng độ lệch chuẩn (Relative standard - SD) và độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation - RSD)

- Độ chính xác: Thể hiện bằng độ thu hồi (Recovery - R)

4 Các công thức tính toán các thông số

a) Nồng độ trung bình

n

x x

n

i i tb

∑

=

(1)

Trong đó: x i: Là nồng độ chất phân tích ở thí nghiệm thứ i

n: Là số lần lặp lại của thí nghiệm b) Độ thu hồi

xt: Nồng độ phân tích được của mẫu thêm chuẩn

xspike: Nồng độ chất chuẩn thêm vào

c) Độ thu hồi trung bình

n

R R

n

i i tb

Ri%: Độ thu hồi trung bình ở nồng độ thứ i

n: Tổng số lần thực hiện độ thu hồi trung bình ở n mức nồng độ

d) Độ lệch chuẩn (SD)

1

) (

n i

i tb

(4)

SD: Độ lệch chuẩn

xtb: Nồng độ trung bình của mẫu với n lần lặp lại

f) Độ lệch chuẩn tương đối tổng (RSDpool)

n i

i i

pool

n

RSD n

) )

1 ((

LOQ = 10 × SD (9)

5 Dụng cụ và hóa chất tiến hành nghiên cứu

- Ống nghiệm 25 ml, có nút mài thủy tinh

- Giấy lọc mịn và các dụng cụ thí nghiệm của phòng phân tích thông

thường

Tất cả hóa chất và thuốc thử có chất lượng tinh khiết phân tích Nước sử dụng là nước cất 2 lần hoặc nước có độ sạch tương ứng phòng thí nghiệm thông thường

b) Chuẩn bị hóa chất và thuốc thử

* Dung dịch p-Dimethylaminobenzaldehyde (DMAB-Trung Quốc): Hòa tan 16,0 g DMAB trong 1 lít rượu etylic 96% và thêm 100 ml acid clohydric đậm đặc (p20 = 1,19 g/ml), dung dịch có thể giữ tối đa 1 tháng Pha dung dịch thuốc thử mới trước khi xây dựng đường chuẩn mới

* Dung dịch Carrez I: Hòa tan 22,0g kẽm axetat dihydrat [Zn(CH3COO)2.2H2O] trong bình định mức 100 ml, thêm 3 ml acid acetic

CH3COOH, định mức đến vạch bằng nước cất, khuấy đều

* Dung dịch Carrez II: Hòa tan trong nước 10,6 g kali hexacyanoferrate (II) trihydrat (kali ferrocyanide trihydrate) {K4[Fe(CN)6].3H2O} vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng nước cất

* Dụng dịch đệm Phosphate, pH = 7: Hòa tan 3,403 g KH2PO4 khan trong khoảng 100 ml nước cất, hòa tan 4,355 g K2HPO4 trong khoảng 100 ml nước cất Sau đó trộn các dung dịch lại với nhau vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nước cất

* Than hoạt tính: không hấp phụ urê

* Dung dịch urê chuẩn gốc (5g/l): hòa tan 5 g urê vào bình định mức

1000 ml, định mức tới vạch bằng nước cất

* Dung dịch urê chuẩn: sử dụng dung dịch urê chuẩn có hàm lượng 0,1 g/l như là chất chuẩn đối chiếu Bảo quản ở nhiệt độ <24oC, ổn định trong 1 tuần

* Pha dung dịch chuẩn làm việc: sử dụng các dung dịch có hàm lượng urê

là 0,020; 0,025; 0,050; 0,100; 0,250; 0,500; 0,600; 0,750 g/l Dùng pipet hút chính xác 0,25; 0,5; 1; 2; 5; 10; 12; 15 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào các bình định mức 100 ml, định mức tới vạch bằng dung dịch đệm phosphate

6 Các bước tiến hành phân tích

a) Xây dựng đường chuẩn

Dùng pipet hút chính xác 5 ml mẫu dung dịch chuẩn làm việc cho vào ống nghiệm (25 ml) và bổ sung 5 ml dung dịch thuốc thử DMAB

Chuẩn bị mẫu trắng bằng 5 ml dung dịch đệm và 5 ml dung dịch DMAB

Lắc các ống nghiệm cho đều và để ổn định 10 phút ở nhiệt độ phòng

Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng λmax = 420 nm với mẫu trắng

Lập phương trình hồi quy tuyến tính y = ax + b theo công thức [7], [12]:

tb tb i i

i

tb i i

tb i tb i

nx x

y nx y x x

x

y y x x

) (

) )(

i

n

i

tb i tb i

y y x

x

y y x x R

2 2

2

)(

)(

))(

xtb: Nồng độ trung bình của mẫu với n lần lặp lại

ytb: Độ hấp thụ trung bình của mẫu với n lần lặp lại

b) Chuẩn bị mẫu phân tích

Dùng pipet hút chính xác 1 ml dung dịch nước mắm cho vào bình định mức 200 ml, thêm 1g than hoạt tính

Thêm 100 ml nước, 5 ml dung dịch Carrez I và 5 ml dung dịch Carrez

Để yên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10 phút Đo mẫu thử ở bước sóng 420 nm so sánh với mẫu trắng

8 Tính toán kết quả [8]

V A

A l

g Ure

solution f

solution Test

1 , 0 ) /

Trong đó:

0,1: Nồng độ urê trong mẫu đối chiếu (g/l)

ARef solution: Độ hấp thụ của dung dịch mẫu đối chiếu

ATest.solution:Độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử

V: Thể tích mẫu thử (1 ml)

200: hệ số pha loãng

Thí nghiệm 2 Xác định hàm lượng urê bằng chất tạo phức Diacethylmonoxime

và đo trên máy quang phổ UV - VIS [10]

1 Nguyên tắc của phương pháp

Mẫu được chiết bằng nước cất, urê sẽ phản ứng với hợp chất Diacethylmonoxime (còn gọi là 2,3 - Butadione-Monoxime), đây là phản ứng oxi hóa - khử Trong môi trường acid và đun nóng với sự hiện diện của ion

Fe3+ Urê sẽ phản ứng với hợp chất Diacethylmonoxime (DAM) tạo ra phức chất màu hồng, màu của phức chất càng đậm sắc (đỏ tím) thì nồng độ urê càng cao Hợp chất Thiosemicarbazide (TSC) có tác dụng đệm và giữ cho phức chất được bền nhờ vào gốc :C=S Ngoài ra, hợp chất TSC còn giúp ta không cần khử tạp chất như protein, nó giúp cho phản ứng sẽ nhậy hơn Vì vậy, nồng độ urê trong mẫu kiểm sẽ tuyến tính theo mật độ quang OD (Optical Density)

4 Dụng cụ và hóa chất tiến hành nghiên cứu

- Các dụng cụ thí nghiệm của phòng thí nghiệm thông thường

b) Chuẩn bị hóa chất và thuốc thử

Tất cả hóa chất và thuốc thử có chất lượng tinh khiết phân tích Nước

sử dụng là nước cất 2 lần hoặc nước có độ sạch tương ứng

* Dung dịch DAM-TSC: Hòa tan 1,860 g hợp chất Diacethylmonoxime (CH3C:NOHCOCH3) và 0,0 g Thiosemicarbazide (NH2CSNHNH2) vào chai sậm màu, định mức vừa đủ 1000 ml Dung dịch bảo quản trong tủ lạnh và có thể sử dụng tối đa 1 tháng

* Dung dịch sắt III dự trữ (dung dịch mẹ): Hòa tan 1,90 g sắt III clorour (FeCl3.6H2O) vào bình định mức 100 ml có sẵn 50 ml nước cất, sau đó thêm

30 ml dung dịch acid phosphoric (H3PO4) 85% Định mức đến vạch bằng nước cất Lắc cho tan đều, bảo quản trong chai sậm mầu và giữ trong tủ lạnh, dung dịch có thể sử dụng trong vòng 1 năm

* Dung dịch sắt III kiểm nghiệm (dung dịch con): Hút chính xác 1 ml dung dịch sắt III dự trữ và 200 ml dung dịch acid sunfuric (H2SO4, d =1,84) vào chai sậm màu, lên thể tích vừa đủ 1000 ml Lắc cho tan đều và giữ trong

tủ lạnh, dung dịch có thể sử dụng tối đa 6 tháng

* Dung dịch urê chuẩn dự trữ (dung dịch urê mẹ có nồng độ 5 g/l): Cân chính xác 5g urê, 1g acid benzoic tinh thể vào bình định mức 1000 ml Định mức tới vạch bằng nước cất Lắc cho tan đều và bảo quản trong tủ lạnh, dung dịch sử dụng tối đa 3 tháng

* Dung dịch urê chuẩn kiểm nghiệm (dung dịch urê con): Hút chính xác 2 ml dung dịch urê chuẩn mẹ vào bình định mức 100 ml đã có sẵn 50 ml nước cất và 1 ml dung dịch acid sunfuric (d = 1,84) Định mức tới vạch bằng nước cất Lắc cho tan đều và bảo quản trong tủ lạnh, dung dịch có thể sử dụng tối đa 1 tháng

* Than hoạt tính: không hấp phụ urê

* Dung dịch urê chuẩn gốc (5 g/l): Hòa tan 5 g urê chuẩn vào bình định mức 1000 ml, định mức tới vạch bằng nước cất

* Pha dung dịch chuẩn làm việc: sử dụng các dung dịch có hàm lượng urê là 0,020, 0,025; 0,050; 0,100; 0,250; 0,500; 0,750 g/l Dùng pipet hút chính xác 0,25; 0,5; 1; 2; 5; 10; 12; 15 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào các bình định mức 100 ml, định mức tới vạch bằng nước cất

5 Các bước tiến hành

a) Xây dựng đường chuẩn

Dùng pipet hút lấy 0,5 ml mẫu trong các dung dịch chuẩn làm việc cho vào các ống nghiệm (25 ml) và bổ sung 2,5 ml nước cất; 1,5 ml dung dịch

DAM-TSC và 0,5 ml dung dịch sắt III kiểm nghiệm

Chuẩn bị mẫu trắng bằng 3 ml nước cất; 1,5 ml dung dịch DAM-TSC

và 0,5 ml dung dịch sắt III kiểm nghiệm

Lắc các ống cho đồng đều, đun cách thủy với mực nước cao hơn dung dịch của ống trong vòng 10 phút, sau đó làm nguội dưới vòi nước lạnh

Đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng λ = 540 nm với mẫu trắng

b) Chuẩn bị mẫu phân tích

Lấy 1 ml nước mắm cho vào bình định mức 200 ml, bổ sung 1 g than hoạt tính, định mức tới vạch bằng nước cất

Lắc cho tan đều, sau đó để yên cho kết tủa lắng xuống Lọc kết tủa qua giấy lọc mịn, thu lấy dịch lọc trong

Tiến hành kiểm nghiệm mẫu theo sơ đồ như sau:

Bảng 3.1 Sơ đồ tiến hành kiểm nghiệm mẫu

Cho vào ống nghiệm

(các thành phần và thứ tự thực hiện)

Ống kiểm (T) Ống chuẩn (S) trắng (B) Ống

1 Dung dịch trích ly mẫu (ml) 0,50

2 Dung dịch urê chuẩn 0,01‰ (ml) 0,50

5 Dung dịch sắt III kiểm nghiệm (ml) 0,50 0,50 0,50

6 Đạy nắp ống nghiệm, đun cách thủy ở mực nước cao hơn dung dịch của ống

7 Thời gian đun sôi 10 phút kể từ lúc nước đã sôi mạnh

8 Lấy ống nghiệm ra và làm nguội dưới vòi nước lạnh

9 Tiến hành đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm

6 Tính toán kết quả [16]

Hàm lượng urê trong mẫu phân tích tính toán dựa vào công thức sau:

) / ( )

/

OD

OD l g Ure

S

Trong đó:

ODT: Mật độ quang của ống kiểm nghiệm

ODs: Mật độ quang của ống dung dịch urê chuẩn (0,01‰ = 0,1g/l)

C (g/l) = 0,1: Nồng độ urê trong dung dịch chuẩn sử dụng

V (ml): Thể tích dung dịch trích ly ở mẫu kiểm từ bình định mức

P (ml): lượng mẫu kiểm sử dụng để kiểm nghiệm

N = V/P: hệ số pha loãng của mẫu kiểm

Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng urê bằng sắc ký lỏng hiệu cao năng và đo bằng detector huỳnh quang sau khi tạo dẫn xuất với xanthydrol [21]

1 Các giai đoạn phân tích định lượng urê

Phân tích đinh lượng urê trong nước mắm được chia làm 4 giai đoạn: Sau khi bơm mẫu vào thiết bị HPLC, sau một thời gian sẽ tách sắc ký, tức thu tín hiệu ở detector

Chuyển tín hiệu detector thành số liệu (đo diện tích)

Chuyển các số liệu đo để so sánh (tính toán)

Giải thích các số liệu (thống kê)

Trong phương pháp này để phân tích hàm lượng urê trong nước mắm trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao năng, trước hết ta giả thiết rằng các biến đổi tín hiệu S của detector có quan hệ nghiêm ngặt với sự biến đổi nồng độ urê được tách ra trong dung dịch rửa giải theo một tương quan tỷ lệ thuận Vì thế, mỗi diện tích peak A i =∫S i dt đại diện cho một cấu tử i trong mẫu

2 Nguyên tắc của phương pháp

Urê trong mẫu nước mắm được tạo dẫn xuất với xanthydrol 9-ol), tạo ra N-9H-Xanthen-9-ylurea và được đo bằng đầu dò huỳnh quang với bước sóng kích hoạt λex = 213 nm và bước sóng phát xạ λem = 308 nm sau khi tách trên cột sắc ký pha đảo (C18) trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao năng (HPLC)

a) Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện urê với thiết bị phân tích HPLC được xem là nồng

độ nhỏ nhất mà thiết bị phân tích có thể phát hiện được Trong phương pháp,

2

việc đánh giá giới hạn phát hiện urê dựa vào kết quả phân tích mẫu chuẩn gốc

và mẫu trắng Dựa vào diện tích của urê trong mẫu chuẩn và mẫu trắng, xác định được nồng độ urê mà thiết bị có thể phát hiện được trong mẫu trắng Tiêu chí chấp nhận được để xác định LOD là ≥ 3

N

S và số mẫu không phát hiện được không vượt quá 5% Hệ số signal to noise được tính theo công thức [23]:

SD

x h

H N

S tb

n

=

= 2 (14) Trong đó:

H: Chiều cao peak

Hn: Hệ số lớn nhất của mẫu trắng trong khoảng 20 lần độ rộng peak ở nửa chiều cao peak và được xác định từ những điểm đối xứng qua vị trí thời gian lưu của peak cần phân tích

xtb: Nồng độ trung bình phân tích được trong mẫu trắng

Độ chụm: Được thể hiện bằng độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối

Độ chính xác: được thể hiện bằng độ thu hồi (R) Độ thu hồi trong phương pháp này được xác định dựa trên tỷ lệ của nồng độ phân tích của mẫu thêm chuẩn và nồng độ chuẩn thêm vào Độ thu hồi được tính dựa vào công thức (2) và (3), độ biến thiên được tính dựa vào công thức (7) [6]

d) Độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối, hệ số biến thiên đều được tính toán dựa vào các công thức trên

5 Thiết bị dụng cụ và hóa chất phân tích

a) Thiết bị và dụng cụ

Máy sắc ký lỏng hiệu cao năng đủ tiêu chuẩn phân tích hàm lượng urê

trong nước mắm - SHIMAZDU-10Avp - Japan

Cột sắc ký lỏng C18 - supelcosilTMLC-18 15cm × 4,6µm × 5mm Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g

Bình tam giác, bình định mức các loại phục vụ cho việc phân tích Giấy lọc 0,45µm (Whatman No1)

Xanthydrol (Mỹ - số hiệu CAS90-46-0), có độ tinh khiết 100%

6 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

a) Dung dịch chuẩn gốc:

Hòa tan 1g urê vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần

b) Dung dịch chuẩn làm việc:

Khoảng nằm giữa nồng độ thấp nhất và cao nhất, khoảng này được xác định bằng thực nghiệm và đã được kiểm chứng thống kê nhờ việc hiệu chuẩn của phương pháp Giới hạn thấp nhất của khoảng làm việc là giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích Các giá trị đo được cần có quan hệ tuyến

tính với nồng độ Điều này đòi hỏi rằng những giá trị đo thu được gần giới hạn dưới của khoảng làm việc phải phân biệt với giá trị đo từ mẫu trắng của phương pháp Do đó giới hạn dưới của khoảng làm việc cần bằng hoặc lớn hơn giới hạn phát hiện của phương pháp Từ nhận định này, bước pha loãng nước mắm theo tỷ lệ khác nhau không gây kết quả sai lệch

Sử dụng các dung dịch chuẩn có hàm lượng urê là 2; 5; 10; 15 mg/l Dùng pipet hút chính xác 0,2 ml; 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần

c) Dung dịch thử

Dung dịch xanthydrol 0,02M: Hòa tan 0,394 g xanthydrol vào 100 ml dung dịch 1-propanol

Dung dịch HCl 1,5M: Hút 4,6 ml HCl 100% vào bình định mức, định mức đến vạch bắng nước cất

7 Chuẩn bị mẫu và tạo dẫn xuất

a) Chuẩn bị mẫu thử

Lắc đều mẫu trước khi thử nghiệm Hút chính xác 1 ml nước mắm cho vào bình định mức 200 ml

b) Tạo dẫn xuất với chuẩn

Dùng pipet hút chính xác 1ml từ các dung dịch chuẩn làm việc cho vào từng bình có nút đậy kín Lần lượt thêm chính xác 3 ml ethanol và 1 ml xathydrol 0,02M trong 1-propanol Đậy kín, lắc đều và để ổn định trong 5 phút Lần lượt bơm các chuẩn đã được tạo dẫn xuất vào trong thiết bị HPLC

c) Tạo dẫn xuất với mẫu

Dùng pipet hút chính xác 1 ml từ dung dịch mẫu đã pha loãng vào bình có nút đậy kín Thêm 3 ml ethanol sau đó lọc qua giấy lọc Whatman No1 Dịch lọc thu được thêm 1 ml xanthydrol 0,02M trong 1-propanol Đậy kín bình và để ổn

định ít nhất 5 phút, bơm mẫu đã tạo dẫn xuất vào thiết bị HPLC

8 Tiến hành phân tích

a) Điều kiện phân tích

Pha động:

- Dung môi A: Acetonitrile

- Dung môi B: Acetonitrile và dung dịch natri acetate (pH = 7,2) với tỷ

Bơm mẫu được tiến hành như bơm chuẩn

9 Tính kết quả

Dựa vào đường chuẩn sẽ xác định được hàm lượng urê có trong mẫu thử Tính kết quả: Hàm lượng urê có trong mẫu nước mắm (mg/l)

Urê (mg/l) = Cm*2000 (15) Trong đó:

Cm: Hàm lượng urê có trong mẫu đã pha loãng được tính dựa vào đường chuẩn

2000: Hệ số pha loãng

Nội dung 2: Tiến hành phân tích đồng thời các phương pháp trên một số

sản phẩm nước mắm tại Việt Nam và so sánh các kết quả thu được

Sau khi xây dựng các phương pháp phân tích, tiến hành phân tích đồng thời các mẫu, so sánh kết quả thu được để tìm ra phương pháp tối ưu nhất