Ứng dụng của chiết pha rắn SPE trong việc nâng cao kết quả phân tích y dược

 SPE là một công nghệ chuẩn bị mẫu có sử dụng hạt rắn, vật liệu cơ bản dựa trên nguyên lý của sắc ký, là quá trình phân bố của các chất giữa 2 pha, trong đó lúc đầu chất mẫu ở dạng l

Trang 1

“Ứng dụng của chiết pha rắn

SPE trong việc nâng cao kết

quả phân tích y dược"

Trang 2

 SPE là một công nghệ chuẩn bị mẫu có sử

dụng hạt rắn, vật liệu cơ bản dựa trên nguyên

lý của sắc ký, là quá trình phân bố của các

chất giữa 2 pha, trong đó lúc đầu chất mẫu ở

dạng lỏng (pha nước, hay hữu cơ), chất chiết

ở dạng rắn, dạng hạt nhỏ và xốp đường kính

25 - 70 μm được nhồi trong 1 loại thiết bị cột

để tách các thành phần khác nhau của 1 mẫu

Chiết pha rắn là gì?

chiết pha rắn (Solid Phase Extraction ), hay chiết rắn-lỏng

Trang 3

Điều kiện chiết pha rắn SPE

không có tương tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn và chất phân tích

bất kỳ từ nguồn nào

phải lặp lại được tốt và tất nhiên là càng đơn giản dễ thực hiện thì càng tốt.

Trang 4

Kết hợp SPE với một số thiết bị hiện đại

Trang 5

MSMS EIC 20 ng/mL Salbutamol – 1 mL Urine 78:20:2 Elution Solvent

NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 certify

NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 clean scrn

NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 oasis

CLEAN SCREEN ®

Trang 6

2000000 4000000 6000000

Time >

Abundance

Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3795.D

PC: CONDOA BEG-TMS Cerex

10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS CleanScreen

10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS Cerex

So sánh kết quả thu hồi Benzoylecgonine từ 1ml nước tiểu ngựa

( quá trình làm sạch đường nền bằng chiết pha rắn)

Trang 7

Kỹ thuật chiết pha rắn được coi là “bước nhảy vọt” trong xử lý mẫu

Trang 8

THIẾT BỊ

Trang 9

Cartric, cột nhồi đơn giản

Trang 10

Chất nhồi cột SPE

Trang 11

Thiết bị đi kèm SPE

Trang 12

Thiết bị SPE kết nối

Trang 13

Cơ chế

Trang 15

2.2 Phân loại cơ chế

Trang 16

2.2.1 Chiết pha thường NPE

 Tính năng chính pha tĩnh: ái lực mạnh, phân cực (liên kết H)

 Liên kết liên quan: pi-pi và tương tác lưỡng cực

 Chất hấp phụ: - silica, diol, diethylamino, cyanopropyl

 Ứng dụng tách: - Chất béo, chất phụ gia giàu, carbohydrates, phenols, vitamins tan trong dầu

 Phân tích: - amines, hydroxyls, carbonyls, vòng thơm, các dị tố (O, S, N, P)

 Hỗn hợp: - Không phân cực, hữu cơ

 Dung môi rửa giải: - Trung bình đến phân cực cao

Trang 17

2.2.2 Chiết pha đảo RPE

 Tính năng chính pha tĩnh: Kỵ nước, không phân cực

 Lực liên kết: Lực Vabvander, lực phân tán

 Chất hấp phụ: - C2, C3,C4, iC4, tC4, C5, C6, C7, C8, C10, C12, C18, C20, C30 phenyl, cyclohexyl

 Ứng dụng: - Dược phẩm, Thuốc trừ sâu

 Phân tích: - Chất trung tính hoặc proton hóa, vòng thơm, chuỗi ankyl

 Nền mẫu (maxtric): - Sinh học, nước, dung dịch đệm

 Dung môi rửa giải: - Không phân cực đến phân cực yếu

Trang 18

Nguyên lý pha đảo

Trang 19

2.2.3 Chiết rây phân tử (loại cỡ, gel)

 Các chất hấp thu là các hạt silicagen có diện tích bề mặt lớn, trên bề mặt hạt silic, có các mao quản kích thước

lỗ lớn, 275-300A o

 Áp dụng: Chiết tách các hợp chất có khối lượng lớn cỡ 2000D

 Tương tác: Đi vào lỗ xốp nhờ tương tác phân cực, kỵ nước hay trao đổi ion Thí dụ chất hấp thụ kỵ nước kiểu butyl với hàm lượng Cacbon nạp khoảng 6%, loại khác là có gắn nhóm trao đổi ion –COOH, hàm lượng C khoảng 12,2%

Trang 20

Cột chiết C8 và polyme (áp dụng chiết pha đảo)

Trang 21

Ảnh hưởng của độ dài chuỗi

(Kết quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE)

C2

1 2 3

1 23

area = 11,257

Trang 22

5

ISTD

Đỉnh nội sinh:

area = 1,336

Ảnh hưởng của loại mạch

(Kết quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE)

Trang 23

2.2.4 Cơ chế trao đổi ion

 Tương tác ion xảy ra giữa chất hấp phụ và chất phân tích

 Duy trì pH thích hợp cho quá trình phân tích

 Liên kết ion đủ mạnh, giữ lại chất phân tích

 Loại bỏ các chất bẩn bằng dung môi thích hợp

 Dung môi rửa giải có lực kéo mạnh hơn hoặc thay đổi pH

 Cơ chế rửa giải bằng cách đồng thời phá vỡ tất cả các tương tác

 Có 2 loại trao đổi ion là trao đổi cation và trao đổi anion

Trang 24

pKa, pH & trạng thái ion hóa

Phase Modification Key feature

SB (SAX) quaternary amine strongly basic anion exchanger

SA (SCX) benzenesulphonic acid strongly acidic cation exchanger

PCA (WCX) propylcarboxylic acid weakly acidic cation exchanger

PSA propylsulphonic acid very strong cation exchanger

Trang 25

Chiết trao đổi cation

 Chất trao đổi cation tích điện âm

 Chất phân tích mạng điện tích dương

 Hình thành liên kết mới

 Chất hấp phụ

– Benzenesulfonic acid (mạnh)

– Propylsulfonic acid (mạnh)

– Carboxylic acid (yếu)

 Áp dụng: Dược phẩm, thuốc diệt cỏ

Trang 26

Chiết trao đổi anion

 Chất hấp phụ trao đổi anion mang điện tích dương

 Chất phân tích có tính axit mang điện tích âm

Trang 27

Cột trao đổi anion

Silica Backbone Quaternary Amine anion exchanger Acetate counter ion

(Standard anion exchanger carries Cl - )

Silica Backbone

CAQAX

Trang 28

Khả năng thay thế của các ion

Strong Anion Exchanger

Quaternary Amine (QAX)

SO-3Si

- Si - (CH2)3 N+ (CH3)3

Độ chọn lọc ion

Trang 29

Polymer được thế hóa bề

mặt

(-CH-CH2)n N-CH3C=O

-CH3

R

Trang 30

Polymer được thế hóa bề

mặt

(-CH-CH2)n N-CH3 C=O

Trang 31

4 3 2

1

pH 6

1 2

3 4

5

pH 5

Ibuprofen Meprobamate Glutethimide

123

Ảnh hưởng của pH đến khả

năng thu hồi khi dùng cột SPE

Trang 32

Kỹ thuật

Trang 33

Quy trình chiết SPE

Trang 34

Bước 1

Hoạt hóa

cột sắc

ký

 Làm ướt vật liệu nhồi

 Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp chất của cột

 Không được để chất trong cột bị khô

 …

34

Trang 35

 Các thành phần không tương tác bị loại ra làm sạch chất phân tích

35

Trang 36

Bước 3

Loại bỏ các

chất gây

ảnh hưởng

 Giữ lại chất phân tích

 Nếu mẫu là dung dịch nước, sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nước-dung môi hữu cơ

 Nếu mẫu hoà tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể

sử dụng chính dung môi đó

36

Trang 37

 Dung môi sử dụng rửa giải đồng thời càng ít chất gây ảnh hưởng tới phép phân tích càng tốt.

37

Trang 39

Ảnh hưởng của dung môi rửa

giải đến độ thu hồi

Ibuprofen1

1 2

Trang 40

Amphetamine pKa = 9.9

Trang 41

Trang 42

Trang 43

ROBINUL (GLYCOPYRROLATE) FROM EQUINE URINE BY SPE-LCMSMS

1 5 ml nước tiểu + 3 ml đệm phosphate (0,1M , pH 7.0)

2 Thêm 12.5 (ng) of mepenzolate (chuẩn nội)

Trang 44

LCMSMS of Glycopyrrolate

Trang 45

Phân tích

Trang 46

Đưa mẫu lên trên cột tách

46

Trang 47

Rửa loại bỏ chất bẩn

47

Trang 48

Rửa giải

48

Trang 49

Thảo luận

Trang 52

4.2 Ưu điểm

 Có tính chọn lọc đối với một nhóm hợp chất phân tích

 Cân bằng chiết nhanh đạt được và có tính thuận nghịch,

 Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất,

 Thao tác đơn giản và nhanh hơn các kỹ thuật chiết khác,

 Trong quá trình chiết luôn luôn có cả sự làm giầu chất phân tích,

 Chất chiết pha rắn không đắt (khoảng 50.000 đ.VN/1cột chiết)

Trang 53

Ưu điểm

Trang 54

4.3 Vi chiết pha rắn

Trang 56

Kiểu chiết và cơ chế chiết Kiểu chiết

 Không gian mẫu

Trang 57

Các bước

Trang 66

THANKS!

Trang 67

TAX Column % Recovery of Pb

Trang 68

Metal Recoveries on Various Phases

Trang 76

Technical Document P-105

Purification of Small Molecule Libraries Desalting Samples Using Pharmasil™ Reverse Phase SPE

Principle: The generation of small molecule libraries for screening against

biological targets has emerged as an area of intense interest in the

pharmaceutical industry SPE has been demonstrated to expedite work up

and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the

automated construction of small molecule libraries Samples that have been

synthesized in aqueous salt, buffer solutions, or low polarity organic solvents containing salts may require the removal of those salts prior to analysis

Pharmasil TM Reverse Phase SPE can be used to desalt these libraries.

Application: This application details the use of Pharmasil™ CEC18, a

highly loaded reverse phase sorbent, for desalting synthetic mixtures In

combinatorial chemistry and organic synthesis salts are sometimes present

in the reaction mixtures Once the reaction is complete, it is usually

necessary to separate the products of the reaction from the salts If the salt is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive

analytical equipment This can be done using a highly loaded reverse phase

SPE column to selectively remove the salt from the reaction mixture.

Trang 77

• High levels of purification of anaytes

• Applicable to a broad range of compounds

• Simple easy to develop methods

Trang 78

Purification Profile

This profile is based on the use of a Pharmasil™ CEC18 500 mg column (columns are available with varying

volumes) This column is capable of removal of salts The method can be scaled up as necessary by using

columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately

The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications Each drug class has its own

specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in

methodology Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.

Sample Pre-treatment

Samples may or may not require pretreatment before addition The primary concern using desalting

columns is to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally molecular This may require the

addition of an acid or base Desalting can be done out of low polarity organic solvents such as hexane or

methylene chloride as long as the compound of interest is protonated.

Column Conditioning

Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.

Column Equilibration

Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH to be >9

If sample is an acid, you want the pH to be<2.5 Apply the sample to the column under gravity The salts will flow through the column and the sample will

stick to the column The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the

equipment you use The critical factor is concentration and capacity of the sorbent If the concentration of the compound of exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest recovery If you think this is a

problem use a larger bed mass.

Trang 79

Purification of Small Molecule Libraries TIN (Sn) Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPE

biological targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical

industry Ion exchange chromatography has been demonstrated to expedite work

up and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the

automated construction of small molecule libraries The advantage of ion exchange chromatography over more traditional small molecule purification modes such as

flash chromatography or HPLC is that one can reliably predict the elution

characteristics of a broad range of molecules solely by the presence or absence of

an ionizable site on the molecule

Application: This application details the use of Pharmasil™ TAX, a highly loaded

weak cation exchange sorbent, for the removal of tin catalysts from organic

synthesis mixtures In combinatorial chemistry and organic synthesis tin

compounds are common catalysts Once the reaction is complete, it is usually

necessary to separate the products of the reaction from the catalysts If the catalyst

is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive

analytical equipment This can be done using a highly loaded weak cation

exchanger to selectively remove the tin catalyst from the reaction mixture.

Trang 80

Chemistry of Pharmasil™ TAX Sorbent

Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents

• Complete removal of tin catalyst

• Clean background

• High recoveries

• Simple easy to develop methods

CH2COOH

CH2CH2 N(CH2COOH)2

Trang 81

Purification Profile

This profile is based on the use of a Pharmasil™ TAX 500 mg column (columns are available with varying

volumes) This column is capable of removal of up to50mg of tin The method can be scaled up as necessary

by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately

The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications Each drug class has its own

specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in

methodology Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.

Sample Pre-treatment

Samples may or may not require pretreatment before addition The primary concern using ion exchangers is

to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized This may require the addition of an

acid or buffer Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as

the compound of interest is ionized Tin catalysts are strong cations and are charged across the complete pH

range

Column Conditioning

Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.

Column Equilibration

Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH at 7-8.

If sample is an acid, you want the pH at 3-4.

Sample Application

Apply the sample to the column under gravity The tin will stick to the column The volume of the sample is

not important and will probably be dictated by the equipment you use The critical factor is concentration

and capacity of the sorbent If the concentration of the tin of exceeds the capacity of the sorbent you will not

get the highest removal of tin If you think this is a problem use a larger bed mass.

Product Purification

Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration.

Trang 82

Purification of Small Molecule Libraries Palladium (Pd) Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPE