Xây dựng các mô hình toán học dự đoán tác dụng ức chế xathin oxidase của các hợp chất flavonoid

Mô hình QSAR cho phép dự đoán hoạt tính hoặc độc tính của hợp chất khi biết cấu trúc phân tử của nó mà không cần phải tiến hành thực nghiệm, do đó có thể tiến hành sàng lọc tác dụng của

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

HÀ NỘI - 2016

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

1 Bộ môn Dược liệu

2 Bộ môn Hóa dược

HÀ NỘI - 2017

Bằng cả tấm lòng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thu

Hằng (Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội), người đã dìu dắt em vào

con đường nghiên cứu khoa học; đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kinh nghiệm nghiên cứu, kinh nghiệm sống cho em; đã không quản ngại khó khăn, dồn tâm huyết, sức lực

để tôi luyện, rèn giũa cho em kĩ năng và đạo đức nghiên cứu

Em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phạm Thế Hải (Bộ môn Hóa dược

- Trường Đại học Dược Hà Nội), người đã tận tình hướng dẫn em trong nghiên cứu QSAR Không có thầy, khóa luận của em không thể hoàn thành được Em tin rằng, dưới sự dẫn dắt của thầy, nhiều sinh viên Dược sẽ được tiếp cận với các xu hướng học thuật mới mẻ và đạt được nhiều thành công

Em cũng xin được cảm ơn PGS.TS Hồ Đăng Phúc (Viện Toán học - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), người thầy đã tận tình hướng dẫn em xử lí

các vấn đề thống kê Em xin cảm ơn DS Nguyễn Ngọc Cầu, bạn Nguyễn Văn

Phương, GS Alexander Tropsha (University of North Carolina) và các thầy cô Bộ

môn Dược liệu, Bộ môn Hóa dược đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài Cuối cùng, con xin cảm ơn bố mẹ đã sinh thành, nuôi dạy con nên người; cảm

ơn mẹ đáng kính đã luôn bên con, ủng hộ con; cảm ơn anh trai, chị gái và bạn bè đã

luôn dõi theo em trên mỗi chặng đường Đặc biệt, em xin cảm ơn anh Lê Thiên Kim

đã luôn đồng hành, hỗ trợ, động viên em trong việc trình bày kết quả khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Cao Huy Bình

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về enzym xanthin oxidase 3

1.1.1 Những đặc điểm cơ bản của enzym xanthin oxidase 3

1.1.2 Một số chất ức chế xanthin oxidase 3

1.1.3 Vai trò của các chất ức chế xanthin oxidase trong một số bệnh lý 5

1.2 Tổng quan về mối quan hệ định lượng cấu trúc-tác dụng của hợp chất (QSAR) 9 1.2.1 Khái niệm và nguyên lý chung của QSAR 9

1.2.2 Xây dựng và đánh giá mô hình QSAR 10

1.2.3 Ứng dụng của QSAR trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Cơ sở dữ liệu 15

2.1.2 Phần mềm sử dụng 15

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp xây dựng và đánh giá các mô hình QSAR 16

2.3.2 Phương pháp ứng dụng các mô hình QSAR để sàng lọc 17

2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế XO in vitro 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Kết quả xây dựng và đánh giá các mô hình QSAR 20

3.1.1 Các mô hình QSAR IC 50 20

3.1.2 Các mô hình QSAR I% 23

3.2 Ứng dụng mô hình QSAR để sàng lọc 28

3.3 Kết quả thực nghiệm đánh giá hoạt tính ức chế XO in vitro 29

3.4 Bàn luận 31

3.4.1 Về kết quả xây dựng và đánh giá mô hình 31

3.4.2 Về kết quả ứng dụng các mô hình để sàng lọc 31

3.4.3 Về kết quả thực nghiệm in vitro đánh giá hoạt tính ức chế XO 32

3.4.4 Về hoạt tính ức chế XO của các hợp chất flavonoid 32

3.4.5 Về xu hướng thuốc có tác dụng điều trị đa đích 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMP Adenosine monophosphate

ANN Artificial neural networks

(Mạng nơ-ron nhân tạo) COX-2 Cyclooxygenase-2

CSDL Cơ sở dữ liệu

DMSO Dimethyl sulfoxyd

FAD Flavin adenin dinucletid

GAG Glycosaminoglycan

GMP Guanosine monophosphate

HGPRtase Hypoxanthinguanin phosphoribosyl transferase

IMP Inosine monophosphate

MLR Multiple linear regression

(Hồi quy đa biến tuyến tính) MOE Molecular operating environment

OECD Organisation for economic co-operation and development

(Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế) PCR Principal component regression

(Phân tích thành phần chính) PLS Partial least squares

(Bình phương tối thiểu từng phần) PRPP Phosphoribosyl pyrophosphatase

QSAR Quantitative structure-activity relationship

(Tương quan định lượng cấu trúc-tác dụng) ROS Reactive oxygen species

(Gốc tự do chứa oxy hoạt động) STT Số thứ tự

TLTK Tài liệu tham khảo

DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang

Bảng 3.1 Thông số thống kê của các mô hình QSAR IC50 21 Bảng 3.2 Kết quả dự đoán nội của các mô hình QSAR IC50 22 Bảng 3.3 Kết quả dự đoán ngoại của các mô hình QSAR IC50 22 Bảng 3.4 Thông số thống kê của các mô hình QSAR I% 24 Bảng 3.5 Kết quả dự đoán nội của các mô hình QSAR I% 25 Bảng 3.6 Kết quả dự đoán ngoại của các mô hình QSAR I% 26 Bảng 3.7 Kết quả sàng lọc CSDL3 của mô hình M2 28 Bảng 3.8 Kết quả sàng lọc CSDL3 của mô hình M6 29 Bảng 3.9 Kết quả thực nghiệm đánh giá hoạt tính ức chế XO in vitro

của quercetin, quercitrin và kaempferol 29 Bảng 3.10 Kết quả dự đoán giá trị pIC của mô hình M2 so với thực

Bảng 3.11 Kết quả dự đoán giá trị pI của mô hình M6 so với thực

Hình 3.5 Ứng dụng sàng lọc in silico trong nghiên cứu phát triển thuốc

tác dụng đa đích

36

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong quá trình sinh tổng hợp acid uric, xanthin oxidase (XO) là enzym chìa khóa xúc tác cho quá trình chuyển hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric [54] Hoạt động quá mức của enzym này dẫn đến tăng sinh tổng hợp acid uric, là nguyên nhân quan trọng dẫn đến nhiều bệnh lý trong đó có bệnh gút Vì vậy,

XO được xác định là mục tiêu phân tử quan trọng trong điều trị các bệnh lý có liên quan đến hoạt động quá mức của enzym này [54], [71]

Cho đến nay, allopurinol vẫn là thuốc ức chế XO được sử dụng phổ biến nhất trên lâm sàng [73] Tuy nhiên, một trong những hạn chế lớn nhất của thuốc này là các tác dụng không mong muốn như phản ứng dị ứng, hội chứng Steven-Johnson, gây suy giảm chức năng gan, thận, có thể dẫn đến tử vong [5] Nỗ lực tìm kiếm thuốc thay thế allopurinol đã dẫn đến sự ra đời của một thuốc ức chế XO mới được phê duyệt là febuxostat Mặc dù đã khắc phục được một số hạn chế của allopurinol, tuy nhiên độc tính của febuxostat vẫn là vấn đề đáng lo ngại [71] Vì vậy, việc tìm kiếm các thuốc thay thế an toàn hơn, hiệu quả hơn là cần thiết

Những nghiên cứu gần đây đã dẫn đến những phát hiện mới về vai trò của XO trong một số bệnh lý khác như các bệnh tim mạch, thiếu máu hoại tử mô, sốc tuần hoàn, viêm đường tiêu hóa, nhiễm độc đa phủ tạng [6], [33], [32] Điều này khiến các nhà nghiên cứu phải thay đổi nhìn nhận về tầm quan trọng của XO cũng như vai trò điều trị tiềm năng của các chất ức chế XO Và một lần nữa, cuộc tìm kiếm các chất

ức chế XO vẫn tiếp tục là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu và phát triển thuốc mới Trong quá trình này, rất nhiều nhóm hợp chất đã được chứng minh hoạt tính ức chế XO, trong đó flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên đáng chú ý với nhiều ưu điểm như hoạt tính mạnh, có tác dụng chống viêm, tác dụng chống oxy hóa, dọn gốc

tự do [9], [71]

Tuy nhiên, nghiên cứu và phát triển thuốc mới là công việc rất gian nan, tiêu tốn nhiều thời gian công sức, tiền của Một trong những thách thức lớn nhất của quá trình này là tìm kiếm được các hợp chất có tác dụng điều trị và an toàn từ thư viện khổng lồ các hợp chất Các mô hình toán học biểu diễn quan hệ định lượng cấu trúc-

2

tác dụng QSAR (Quantitative structure-activity relationship) là giải pháp ứng dụng hiệu quả để giải quyết vấn đề này Mô hình QSAR cho phép dự đoán hoạt tính hoặc độc tính của hợp chất khi biết cấu trúc phân tử của nó mà không cần phải tiến hành thực nghiệm, do đó có thể tiến hành sàng lọc tác dụng của các hợp chất trong thư viện một cách hiệu quả, tiết kiệm thời gian và chi phí Vì vậy, QSAR được đánh giá là công cụ đắc lực hỗ trợ quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới nhằm sàng lọc ra các chất dẫn đường tiềm năng

Hơn nửa thế kỷ qua, trên thế giới, sự phát triển của QSAR đã mang đến nhiều thành tựu đáng kể Tại Việt Nam, QSAR vẫn còn là một lĩnh vực khá mới mẻ và chưa

có một nghiên cứu nào về xây dựng mô hình QSAR đối với các hợp chất ức chế

xanthin oxidase Vì vậy, đề tài “Xây dựng các mô hình toán học dự đoán tác dụng

ức chế xanthin oxidase của các hợp chất flavonoid” được tiến hành với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng và đánh giá các mô hình toán học biểu thị mối quan hệ định lượng cấu trúc-tác dụng (QSAR) dự đoán tác dụng ức chế xanthin oxidase của các hợp chất flavonoid

2 Ứng dụng mô hình QSAR để sàng lọc các flavonoid có tác dụng ức chế xanthin oxidase tiềm năng và khảo sát kết quả sàng lọc trên một số hợp chất bằng

thực nghiệm in vitro

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về enzym xanthin oxidase

1.1.1 Những đặc điểm cơ bản của enzym xanthin oxidase

Xanthin oxidase (XO) và xanthin dehydrogenase (XDH) là sản phẩm của cùng một gen, có thể chuyển dạng qua lại lẫn nhau [14] Trong cơ thể động vật có vú, enzym được sinh tổng hợp dưới dạng XDH và nhanh chóng chuyển đổi thành dạng

XO [32] XO thuộc họ enzym hydroxylase chứa molypden, là flavoprotein cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị giống nhau và hoạt động độc lập, khối lượng mỗi tiểu đơn vị xấp

xỉ 145 kDa [66] Mỗi tiểu đơn vị bao gồm một molybdopterin cofactor (85 kDa) nằm gần đầu C, một flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor (40kDa) nằm ở giữa và hai trung tâm [2Fe-2S] không giống nhau (20 kDa) nằm ở đầu N [32]

XO là enzym phổ biến trong giới sinh vật học, XO được tìm thấy trong vi khuẩn, động vật không xương sống, động vật có xương sống, [75], [93] XO phân

bố tại nhiều cơ quan khác nhau trong cơ thể như gan, ruột, phổi, thận, tim, não và trong huyết tương, sữa [73], [94] XO chứa khoảng 1330 amino acid với trình tự sắp xếp giống nhau đến 90% giữa XO của chuột và bò so với XO của người [66] XO xúc tác cho phản ứng chuyển hóa nhiều nhóm hợp chất có trọng lượng phân tử và cấu trúc trung tâm oxy hóa-khử tương tự nhau như purin, pyrimidin, pterin và aldehyd [73], [62] Trong cơ thể người, XO là enzym đóng vai trò quan trọng trong các bước chuyển hóa cuối cùng của các hợp chất purin: oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric [67] Các quá trình oxy hóa này diễn ra tại trung tâm molybdoterin, các electron được vận chuyển nhanh chóng tới phân tử oxy tại FAD qua trung gian

là trung tâm [2Fe-2S] Quá trình này sinh ra các gốc tự do hoạt động mạnh chứa oxy (Reactive Oxygen Species-ROS) Phản ứng oxy hóa hypoxanthin và xanthin dưới xúc tác của XO được coi là một nguồn chủ yếu sinh ra ROS [25]

(1,5-dihydro-4H-pyrazolo[3,4-4

trị lâm sàng từ năm 1966 Kết quả này cùng một số thành tựu khác đã mang đến cho

G Elion và G Hitchings vinh dự nhận giải Nobel Y học năm 1988 [73] Cho đến nay, allopurinol vẫn đang là chỉ định đầu tay trong điều trị tăng acid uric nguyên phát cũng như thứ phát [8], [82] Ở nồng độ thấp, allopurinol ức chế cạnh tranh XO; ở nồng độ cao, allopurinol là chất ức chế không cạnh tranh Sau khi bị oxy hóa bởi XO, allopurinol tạo thành oxypurinol là chất ức chế không cạnh tranh tại trung tâm molybdoterin của XO Mặc dù ái lực của oxypurinol khá cao nhưng sự ức chế này bị mất đi sau một vài giờ do quá trình oxy hóa tự động của enzym [71]

Sự đề kháng allopurinol xảy ra trong một số trường hợp bệnh viêm nhiễm, khi

XO bám vào màng trong tế bào mạch máu (GAG-immobilized XO) và bị thay đổi ái lực với cơ chất xanthin tại trung tâm hoạt động molybdoterin Điều này khiến cho hoạt tính ức chế XO của allopurinol bị giảm [43] Ngoài ra, việc allopurinol hay oxypurinol gắn vào XO gây ra sự khử và hình thành ROS ngay trước khi quá trình ức chế xảy ra [58]

Tiếp nối thành công của allopurinol, một số dẫn chất purin khác đã được tổng hợp như 2-alkylhypoxanthin [7], pterin, 6-formylpterin, [70] Tuy nhiên, các hợp chất này cũng không tránh khỏi các hạn chế kể trên của allopurinol Bên cạnh đó, do bản chất là khung cấu trúc purin, allopurinol và các dẫn chất kể trên làm ảnh hưởng đến hoạt động của các enzym chuyển hóa purin, pyrimidin trong cơ thể [87] Các tác dụng không mong muốn chính là hạn chế lớn nhất của allopurinol Nghiêm trọng nhất

có thể kể đến phản ứng dị ứng trên da và niêm mạc xảy ra tần suất cao 2-8% [25] với các biểu hiện ngứa, phát ban, hội chứng quá mẫn do thuốc, hội chứng Stevens-Johnson, có thể dẫn đến tử vong [9] Nguyên nhân có thể do sự chuyển hóa thuốc bởi phosphoribosyl transferase tạo ra nucleotid tương ứng [73] Phản ứng dị ứng này thậm chí có thể xuất hiện vài tháng hay vài năm sau khi sử dụng thuốc và thường xuyên xảy ra với bệnh nhân có suy giảm chức năng thận mà không hiệu chỉnh liều [9], [73] Ngoài ra, các tác dụng không mong muốn khác có thể kể đến của allopuriol là suy giảm chức năng gan, nôn, buồn nôn, tăng huyết áp [17], [41] Do đó, hướng nghiên cứu mới của các nhà khoa học đó là tìm kiếm các chất ức chế xanthin oxidase (XOI) khung cấu trúc khác purin (các non-purin) [9]

5

Trong các hợp chất non-purin đã được nghiên cứu, thành công nhất phải kể đến các “stat” như febuxostat, pyranostat, topiroxostat [83] Các “stat” không tạo liên kết cộng hóa trị với trung tâm molybdoterin nhưng chúng tạo hàng loạt liên kết ion, liên kết hydro, liên kết tương tác -, van der waals Do đó, hiệu quả ức chế XO của các

“stat” cao hơn allopurinol trên cả dạng oxy hóa và dạng khử [72] Ngoài ra, chúng còn khắc phục được hiện tượng kháng thuốc do GAG-immobilized XO xảy ra với allopurinol cũng như giảm thiểu sự sản sinh các ROS [71]

Tuy nhiên, các “stat” vẫn tồn tại nhiều tác dụng không mong muốn: đau đầu, tiêu chảy, nôn, buồn nôn, dị ứng da và đặc biệt là một tỷ lệ khá cao các trường hợp nhiễm độc gan đã được quan sát thấy trong các thử nghiệm lâm sàng của febuxostat [55] Do đó, nỗ lực nghiên cứu tìm kiếm các XOI vẫn được tiếp tục

Những nỗ lực này đã dẫn đến hàng loạt XOI thuộc nhiều khung cấu trúc đa dạng (polyphenol, coumarin, anthranoid, alcaloid, dị vòng tổng hợp, ) được công bố trong những thập kỷ vừa qua [9] Trong đó, flavonoid là một nhóm hợp chất rất đáng chú ý Kết quả thực nghiệm đã chứng minh một số flavonoid có hoạt tính ức chế XO mạnh hơn chất đối chứng allopurinol như apigenin [85], hydroxychavicol [63], myricetin và glycitein [91] Và ngày nay, khi vai trò quan trọng của XO trong nhiều bệnh lý khác ngoài bệnh gút đang ngày càng được chú ý thì việc tìm kiếm các XOI hiệu quả và an toàn vẫn tiếp tục là một lĩnh vực được các nhà nghiên cứu quan tâm

1.1.3 Vai trò của các chất ức chế xanthin oxidase trong một số bệnh lý

1.1.3.1 Bệnh gút

Gút là một trong những bệnh lý phổ biến nhất trong nhóm các bệnh khớp do tinh thể, trong đó có hiện tượng tăng nồng độ acid uric trong máu dẫn đến lắng đọng tinh thể urat trong dịch khớp và các tổ chức khác Tăng acid uric đơn thuần thường không có triệu chứng lâm sàng, tuy nhiên nó là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất dẫn tới bệnh gút Ở mức acid uric máu lớn hơn hoặc bằng 540 µmol/L (9,0 mg/dL), thì tỷ

lệ mắc bệnh gút là khoảng 4,9% (nồng độ trung bình của acid uric trong huyết tương

ở nam bình thường là 415 µmol/L (6,8 mg/dL) và ở phụ nữ là 360 µmol/L (6,0

mg/dL)) [1]

Hình 1.1 Vai trò của xanthin oxidase trong quá trình sinh tổng hợp acid uric

Trong thực hành lâm sàng, thuốc chống viêm, thuốc ức chế XO, thuốc tăng thải trừ acid uric được kết hợp trong điều trị bệnh gút [45] Trong đó, XOI có vai trò đặc biệt quan trọng trong điều trị bệnh gút mạn tính [48] Như đã đề cập, hiện nay allopurinol vẫn đang là thuốc được sử dụng phổ biến nhất trong điều trị bệnh gút với vai trò là chất ức chế XO [8], [82] Ngoài ra, febuxostat là một thuốc mới được phê duyệt, giá thành cao và chưa được sử dụng phổ biến [42] Một trong những hạn chế lớn nhất của của các thuốc này là các tác dụng không mong muốn [17], [41]

Acid uric

GMPGuanosin

Acid

nucleic

Acid nucleic

Xanthin oxidase

Xanthin oxidase

7

1.1.3.2 Các bệnh liên quan đến tăng acid uric máu

Các nghiên cứu cho thấy tăng acid uric máu là một yếu tố nguy cơ độc lập và quan trọng trong các bệnh tim mạch, bệnh thận và đái tháo đường [73] Các bệnh lý mạch vành được cho là có liên quan đến sự hình thành tại chỗ các ROS, mà trong đó

XO đóng vai trò lớn Các XOI với khả năng ức chế sự hình thành acid uric cũng như giảm thiểu quá trình oxy hóa tạo ROS, là những hợp chất có tiềm năng điều trị đối với các bệnh liên quan đến tình trạng tăng acid uric máu [38], [96]

1.1.3.4 Hội chứng ly giải tế bào u

Sau một đợt hóa trị liệu ung thư, hàng loạt tế bào đồng thời bị hủy diệt, dẫn đến

sự giải phóng ồ ạt base purin và sự chuyển hóa sản phẩm này sẽ làm tăng đột ngột acid uric máu Do đó, trên thực tế lâm sàng, với các bệnh nhân điều trị ung thư bằng phương pháp hóa trị liệu, XOI thường được chỉ định để dự phòng tăng acid uric máu [60], [86]

1.1.3.5 Tổn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu (Ischemia-Reperfusion Injury)

Giả thuyết về cơ chế tổn thương mô do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu được đưa

ra như sau: Thiếu máu cục bộ xảy ra có thể do cục máu đông, do viêm nhiễm chèn ép mạch, hay chấn thương dẫn tới thiếu oxy và dinh dưỡng, tích tụ sản phẩm chuyển hóa của tế bào tại mô bị tổn thương Màng trong tế bào sản sinh ra các gốc tự do gây

ra phản ứng viêm Quá trình tái tưới máu xảy ra tiếp tục sinh ra các yếu tố gây viêm

và các gốc tự do (bởi hóa ứng động bạch cầu, quá trình khử oxy không hoàn toàn) Các yếu tố gây viêm và gốc tự do phá hủy màng tế bào, protein, DNA càng làm tăng giải phóng chính bản thân chúng Sự phá hủy dây chuyền này có thể kích hoạt quá trình tự chết theo chu kì của tế bào (apoptosis) Ngoài ra, bạch cầu có thể bám vào màng trong của mao mạch gây tắc mạch, dẫn đến thiếu máu cục bộ thứ phát [13] Trong giai đoạn thiếu máu cục bộ, tính thấm màng tế bào thay đổi, nồng độ

Ca2+ nội bào tăng, hoạt hóa enzym protease chuyển hóa XDH thành XO Đồng thời, quá trình thoái giáng phân tử ATP tích tụ sản phẩm là hypoxanthin Khi quá trình tái tưới máu diễn ra, XO xúc tác phản ứng oxy hóa hypoxanthin và xanthin, sử dụng oxy được máu mang đến, hình thành các ROS [29], [61] Vai trò của XO trong tổn thương

do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu được mô tả trong hình 1.2 [73]

8

Hình 1.2 Vai trò của XO trong tổn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu

Tổn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu có thể xảy ra ở tim, não gây ra tình trạng suy tim, đột quỵ [6]; hoặc xảy ra ở các cơ quan khác như phổi, thận, ruột,

gân, [3], [23], [24] Mặc dù còn nhiều tranh cãi, các thử nghiệm in vivo cũng như

các thử nghiệm trên lâm sàng và các cuộc điều tra phân tích đã cho thấy XOI (allopurinol) có vai trò trong trong hạn chế những tổn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu kể trên, đặc biệt là vai trò trong cải thiện tình trạng bệnh tim mạch [6], [11], [18], [37]

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra bằng chứng về vai trò của các XOI trong điều trị các bệnh khác như viêm ruột, viêm thận [40], hồng cầu hình lưỡi liềm [73], tổn thương thần kinh, sốc tuần hoàn [39], Vì vậy, liệu pháp ức chế XO không chỉ còn là chỉ định chính trong điều trị bệnh gút mà còn là hướng điều trị tiềm năng đối với rất nhiều bệnh lý khác Và việc tìm kiếm các XOI hiệu quả hơn, an toàn hơn allopurinol hay febuxostat vẫn tiếp tục là một hướng đi đầy triển vọng cho các nhà nghiên cứu và phát triển thuốc mới

9

1.2 Tổng quan về mối quan hệ định lượng cấu trúc-tác dụng của hợp chất (QSAR)

1.2.1 Khái niệm và nguyên lý chung của QSAR

QSAR là một hàm số biểu thị mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học hoặc hóa học của hợp chất có dạng tổng quát như sau [26]:

Y = f1(x1) + f2(x2) + + fn(xn) Trong đó, Y là biến đáp ứng sinh học hoặc hóa học thường thu được từ thực nghiệm và thể hiện bằng các giá trị như nồng độ ức chế 50% đối tượng đích (IC50), giá trị phần trăm ức chế (I%), nồng độ 50% tác dụng tối đa (EC50) Các biến x1,

x2,…xn là các đại lượng được sử dụng để mô tả cấu trúc phân tử hợp chất gọi là các tham số phân tử (molecular descriptors) [26] Đến nay đã có hàng nghìn tham số phân

tử (TSPT) được sử dụng trong nghiên cứu xây dựng mô hình QSAR Các TSPT này thu được bằng thực nghiệm hoặc tính toán bằng lý thuyết bởi các phần mềm chuyên dụng như Dapt, Dragon, Padell, MOE, Hyperchem

Các mô hình QSAR được xây dựng trên nguyên lý cơ bản là cấu trúc của mỗi phân tử chứa các yếu tố quyết định đặc tính sinh học, vật lý, hóa lý của nó; do đó, các hợp chất có cấu trúc giống nhau thường có hoạt tính tương tự nhau [76]

Từ năm 1868, Crum-Brown và Fraser đã đưa ra nhận định tác dụng sinh học là hàm số của cấu trúc hóa học [10]:

 f (C) Đến năm 1893, Richet đã cho rằng sự khác nhau về tác dụng sinh học là do sự thay đổi về tính chất hóa học hay lý hóa [84]:

 f (C) Đây là hai tư tưởng nền tảng để thiết lập các mô hình QSAR sau này

Năm 1900, Meyer và Overton tìm ra mối quan hệ tuyến tính giữa mức độ thân dầu và hoạt tính của thuốc gây mê [81]

Và đến năm 1935, phương trình Hammett ra đời, được coi là phương trình đầu tiên biểu diễn mối quan hệ định lượng hoạt tính-cấu trúc [81]:

Log𝐾

𝐾𝑜

1.2.2 Xây dựng và đánh giá mô hình QSAR

Xây dựng các mô hình QSAR trên các nhóm chất khác nhau, các đích tác dụng khác nhau cơ bản đều trải qua năm bước được tóm tắt ở sơ đồ hình 1.3 [64]

Hình 1.3 Sơ đồ tóm tắt các bước xây dựng mô hình QSAR

Bước 1: Chuẩn bị cơ sở dữ liệu

Cơ sở dữ liệu (CSDL) để xây dựng các mô hình QSAR thường là hoạt tính, độc tính, đặc tính dược động học của các hợp chất được công bố trong các nghiên cứu khoa học tạo thành dữ liệu toàn cầu (global database) CSDL cho một mô hình QSAR

cụ thể sẽ bao gồm cấu trúc phân tử của dãy chất và hoạt tính của chúng, thường gặp

nhất là hoạt tính thu được bằng thực nghiệm in vitro [51]

CSDL ban đầu được chia thành tập huấn luyện (training set) và tập kiểm nghiệm (test set) Tập huấn luyện chiếm khoảng 80-90% CSDL ban đầu và được sử dụng để xây dựng mô hình QSAR [59], [90] Tập kiểm nghiệm được sử dụng để đánh giá mô hình

Chuẩn bị

cơ sở dữ liệu

Tính toán tham số phân tử

Xử lý

số liệu

Xây dựng

mô hình QSAR Đánh giá

mô hình QSAR

11

Bước 2: Tính toán tham số phân tử

Cấu trúc phân tử hợp chất được vẽ bằng các phần mềm như Chemdraw, hoặc bằng chức năng tích hợp trong các phần mềm xây dựng mô hình QSAR chuyên dụng

Từ các cấu trúc này, tham số phân tử (TSPT) mô tả thông tin cấu trúc 1D, 2D, 3D của hợp chất được tính toán bằng phần mềm máy tính Một số phần mềm thường được sử dụng để tính toán các TSPT hiện nay là Dragon, Padell, MOE, Hyperchem, Cùng với sự phát triển của QSAR, ngày càng nhiều nhóm TSPT được tính toán để mô tả chi tiết, chính xác hơn cấu trúc của hợp chất Phiên bản cập nhật Dragon 7.0 (2017)

có thể tính toán được đến 5270 TSPT [98]

Các TSPT có thể được phân loại thành 3 nhóm như sau:

 Tham số phân tử 1D: Những TSPT có thể thu được từ công thức tổng quát của hợp chất (khối lượng phân tử, số nhóm thế, số nguyên tử C, ) hoặc là những TSPT tính toán từ sự tổng hợp các nguyên tử thành phần như chỉ số khúc xạ, độ phân cực Trong đó hệ số phân bố n-octal/nước là tham số thường sử dụng để đánh giá sinh khả dụng, khả năng thấm qua màng tế bào của hợp chất

 Tham số phân tử 2D: Những TSPT để mô tả hình dạng, trật tự liên kết của các nguyên tử trong cấu trúc của hợp chất (liên kết -, số vòng thơm, số liên kết H, )

 Tham số phân tử 3D: Những TSPT mô tả cấu trúc không gian hợp chất, được xác định bằng hệ trục tọa độ nguyên tử thành phần, bao gồm các TSPT như mô men lưỡng cực (dipole moment), diện tích bề mặt cực (polar surface area), thể tích van der Waals,

Bước 3: Xử lí số liệu

Để xây dựng được một mô hình QSAR một cách thuận tiện và đảm bảo tính tin cậy, dữ liệu ban đầu cần được xử lí sơ bộ Công việc này có thể bao gồm loại bỏ các giá trị nằm ngoài (outlier), chuẩn hóa đơn vị, chuyển đổi hàm thức (logarit hóa, mũ hóa, nghịch đảo, ) Những công việc này giúp loại bỏ các TSPT gây nhiễu khi xây dựng mô hình [64]

Bước 4: Xây dựng mô hình QSAR

Ngày nay, nhiều phương pháp xây dựng mô hình QSAR được phát triển và ứng dụng phổ biến Tuy nhiên, không có phương pháp nào được coi là hiệu quả nhất Một

12

phương pháp có thể phù hợp để xây dựng mô hình QSAR này nhưng có thể sẽ không hiệu quả khi xây dựng các mô hình QSAR khác vì mỗi CSDL, mỗi mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính sẽ có sự phụ thuộc khác nhau giữa biến TSPT và biến đáp ứng

Có hai dạng mô hình QSAR chính: một là mô hình QSAR định lượng, biến đầu

ra là biến liên tục; hai là mô hình QSAR định tính, biến đầu ra là giá trị nhị phân có

hoặc không, âm tính hoặc dương tính (còn gọi là mô hình QSAR phân loại) [51] Đối với dạng thứ nhất, các phương pháp xây dựng mô hình thường áp dụng là hồi quy đa biến tuyến tính-Multiple Linear Regression (MLR), bình phương tối thiểu từng phần-Partial Least Squares (PLS), phân tích thành phần chính-Principal Component Analysis (PCA)

Đối với dạng thứ hai, các phương pháp thường dùng để xây dựng mô hình QSAR là mạng nơ-ron nhân tạo-Artificial Neural Networks (ANN), phân tích cụm (Cluster Analysis), thuật toán k láng giềng gần nhất (k-nearest neighbors algorithm) [95]

Các phương pháp này có thể có nguyên tắc lựa chọn biến giống hoặc khác nhau tuy nhiên đều nhằm mục đích chung là TSPT nào có ảnh hưởng nhiều nhất đến hoạt tính của phân tử sẽ được ưu tiên đưa vào mô hình trước; nhờ đó, giá trị biến đáp ứng

dự đoán được sẽ gần với giá trị thực nghiệm nhất

Bước 5: Đánh giá mô hình QSAR

Đánh giá mô hình QSAR là công việc quan trọng nhất quyết định việc mô hình xây dựng được có thể sử dụng để dự đoán hoặc sàng lọc hay không [92] Chất lượng

mô hình QSAR thường được đánh giá trên tập huấn luyện (đánh giá nội) và trên tập kiểm nghiệm (đánh giá ngoại) dựa vào 2 tiêu chí: thông số thống kê và độ chính xác

dự đoán [28], [92]

Đánh giá nội bao gồm việc xác định hệ số xác định R2, hệ số đánh giá chéo Q2,

độ chính xác dự đoán nội P, Đánh giá ngoại được tiến hành dựa trên hệ số xác định

R2

test và độ chính xác dự đoán trên tập kiểm nghiệm Ptest

 Hệ số xác định R 2 (tập huấn luyện), R 2 test (tập kiểm nghiệm): Đặc trưng cho sự

phù hợp giữa mô hình và bộ dữ liệu thực nghiệm Giá trị của R2 càng gần 1, mô hình

mô tả càng tốt các số liệu thực nghiệm R2thể hiện tính chính xác của mô hình Thông

∑𝑛 (𝑦i dự đoán− 𝑦̅)𝑖 2 𝑖=1

Trong đó 𝑦̅ là giá trị trung bình của các giá trị y i thực tế

 Hệ số đánh giá chéo Q 2: Tính toán bằng phương pháp tham số chéo một lần cắt (cross validation leave one out) bằng cách lần lượt loại 1 quan sát ra khỏi tập huấn luyện và tính toán lại các thông số R2 Q2 càng gần 1, tính tổng quát hóa và khả năng

dự đoán của mô hình càng cao Q2thể hiện tính bền vững của mô hình Thông thường, yêu cầu Q2 > 0,5 thì mô hình mới bền vững Giá trị Q2 được tính toán như sau [90]:

Q2 = 1 −∑ (𝑦i dự đoán− 𝑦i thực tế)

2 𝑛

𝑖=1

∑𝑛 (𝑦i dự đoán− 𝑦̅)𝑖 2 𝑖=1

 Khả năng dự đoán nội P và khả năng dự đoán ngoại P test: Lần lượt là độ chính xác giữa giá trị dự đoán của mô hình so với số liệu thực nghiệm trên tập huấn luyện

và tập kiểm nghiệm Giá trị Ptest chính là mục tiêu cao nhất của mô hình Ptest càng lớn, khả năng dự đoán của mô hình càng tốt, mô hình có khả năng ứng dụng cao Giá trị P và Ptest được tính toán như sau:

P =

∑ (1 − |𝑦i dự đoán𝑦 − 𝑦i thực tế

i thực tế |) 𝑥 100%

𝑛 𝑖=1

𝑛Ngoài ra, để đánh giá một cách đầy đủ một mô hình QSAR, Tổ chức Hợp tác

và Phát triển Kinh tế thế giới (OECD) đã đưa ra 5 tiêu chí như sau [69]:

Tiêu chí 1: Có đích cụ thể

Tiêu chí 2: Thuật toán rõ ràng

Tiêu chí 3: Miền cấu trúc ứng dụng xác định

Tiêu chí 4: Có thước đo phù hợp để đánh giá độ chính xác, độ bền vững,

khả năng dự đoán

Tiêu chí 5: Giải thích cơ chế tác dụng nếu có thể

14

1.2.3 Ứng dụng của QSAR trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới

Để ra đời được một thuốc mới, kể từ giai đoạn tìm kiếm đích phân tử, quá trình nghiên cứu phát triển thường kéo dài trung bình khoảng 12 năm [47] và tiêu tốn khoảng 868 triệu đô la Mỹ [2] Chi phí khổng lồ về thời gian và tiền bạc chủ yếu do nguy cơ thất bại gây ra trong quá trình này Ước tính chỉ khoảng 11% trong số những thuốc đã hoàn thành giai đoạn nghiên cứu phát triển được cho phép lưu hành bởi cơ quan quản lý tại Mỹ và châu Âu, nguyên nhân của những thất bại này có thể do sinh khả dụng thấp (10%), hiệu quả điều trị kém (30%), độc tính (30%) và một số nguyên nhân khác [46] Vì vậy, việc dự đoán trước những thất bại này sẽ giúp giảm thiểu đáng kể chi phí nghiên cứu phát triển thuốc mới Ước tính những dự đoán này sẽ giúp tiết kiệm được khoảng 100 triệu đô la Mỹ chi phí [95] Chính vì vậy, với sự hỗ trợ

của khoa học máy tính, rất nhiều phương pháp sàng lọc in silico đã được ứng dụng

trong giai đoạn nghiên cứu sớm để sàng lọc loại bỏ những hợp chất không có tiềm năng phát triển thành thuốc Xây dựng các mô hình QSAR là một trong những phương pháp đã được ứng dụng hiệu quả [51], [95]

Trong giai đoạn tìm kiếm và tối ưu hóa hợp chất dẫn đường, các tiêu chí trọng tâm bao gồm tối ưu hóa tác dụng, cải thiện sinh dược học, giảm thiểu độc tính [51] Các mô hình QSAR cho phép sàng lọc từ thư viện khổng lồ các hợp chất ra những hợp chất tiềm năng nhất có khả năng trở thành chất dẫn đường bằng cách dự đoán trước tác dụng sinh học, độc tính hay đặc tính sinh dược học của chúng Ngoài ra, các

mô hình QSAR còn có thể được sử dụng để tính toán giả định sự thay đổi hoạt tính của hợp chất khi thay đổi cấu trúc phân tử, từ đó định hướng để tổng hợp ra hợp chất

có đặc tính mong muốn [51], [95]

15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Cơ sở dữ liệu

 Cơ sở dữ liệu xây dựng mô hình QSAR IC50 (CSDL1) gồm cấu trúc và hoạt tính ức chế XO thể hiện qua giá trị phần trăm ức chế (IC50) của 22 hợp chất flavonoid được thu thập từ các nghiên cứu được công bố trong các TLTK [16], [27], [36], [49], [74], [80]

 Cơ sở dữ liệu xây dựng mô hình QSAR I% (CSDL2) gồm cấu trúc và hoạt tính

ức chế XO thể hiện qua giá trị phần trăm ức chế (I%) của 31 hợp chất flavonoid có giá trị I% ≥ 5% được thu thập từ nghiên cứu của Cotelle Nicole và cộng sự [20]

 Cơ sở dữ liệu để sàng lọc (CSDL3) gồm cấu trúc của 2038 hợp chất flavonoid thu thập từ http://www.mapsdatabase.com/ [99]

2.1.2 Phần mềm sử dụng

 Phần mềm vẽ cấu trúc hóa học: ChemBioDraw 13.0

 Phần mềm tính toán TSPT: Dragon 6.0

 Phần mềm xây dựng mô hình QSAR: VlifeMDS 4.6

 Phần mềm xử lý số liệu: SPSS 22.0, Excel 2013, Graphpad Prism 5

2.1.3 Hóa chất và thiết bị

2.1.3.1 Hóa chất

 Quercetin, quercitrin, kaempferol (Viện Dược liệu)

 Xanthin, ≥ 99% (Sigma Aldrich)

 Xanthin oxidase từ sữa bò (0,8 U/mg protein, 9 mg protein/ml, Sigma Aldrich)

 Hóa chất pha đệm Na2HPO4.2H2O, KH2PO4, HCl, NaOH (Sigma Aldrich)

 Các hóa chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn dược dụng

2.1.3.2 Thiết bị

 Đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3655 (Corning)

 Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay (Biotek) và máy ủ lắc khay (Awareness)

 Máy đo pH (EUTECH)

16

 Cân phân tích Sartorius TE 214S, độ chính xác 0,1 mg

 Cân kỹ thuật Sartorius TE 3102S, độ chính xác 0,01 g

 Tủ ấm điều nhiệt Memmert

 Các dụng cụ sử dụng lấy mẫu và thí nghiệm: dụng cụ thủy tinh, pipet , ống

nghiệm các loại

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện 2 mục tiêu đã đề ra, đề tài gồm các nội dung sau:

- Nội dung 1: Xây dựng và đánh giá các mô hình QSAR dự đoán tác dụng ức chế

XO (I%) của các hợp chất flavonoid

- Nội dung 2: Xây dựng và đánh giá các mô hình QSAR dự đoán tác dụng ức chế

XO (IC50) của các hợp chất flavonoid

- Nội dung 3: Từ kết quả đánh giá, lựa chọn 1 mô hình QSAR I% và 1 mô hình

QSAR IC50 để áp dụng dự đoán hoạt tính hoạt tính ức chế XO của các flavonoid trong CSDL3

- Nội dung 4: Kiểm tra kết quả dự đoán của các mô hình bằng thí nghiệm in vitro

đánh giá hoạt tính ức chế XO của 3 flavonoid: quercetin, quercitrin, kaempferol

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xây dựng và đánh giá các mô hình QSAR

Bước 1: Chuẩn bị cơ sở dữ liệu

Cấu trúc của các hợp chất trong các CSDL (1, 2, 3) được kiểm tra bằng dữ liệu

từ thư viện cấu trúc hóa học của Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ [101] Mã hóa các hợp chất theo ID

Bước 2: Tính toán tham số phân tử

Cấu trúc phân tử hợp chất được vẽ bằng các phần mềm ChemBioDraw 13.0

Mã hóa cấu trúc các hợp chất dưới dạng các dãy SMILES tương ứng và tính toán TSPT bằng phần mềm Dragon 6.0

17

Bước 3: Xử lí số liệu

Việc xử lý TSPT đóng vai trò quan trọng vì có ý nghĩa làm giảm sự gây nhiễu

và tăng tính ổn định của mô hình Quá trình này gồm các công việc sau:

 Logarit hóa giá trị IC50 để thu được biến đáp ứng là pIC = log(IC50)

 Logarit hóa giá trị I%để thu được biến đáp ứng là pI = log(I%)

 Loại bỏ hiện tượng đa cộng tuyến: Loại bỏ các TSPT có tương quan chéo r2 > 0,9 và các TSPT có 100% giá trị giống nhau bằng phần mềm SPSS 22.0

 “Tỉ lệ hóa” (scale) các TSPT bằng chức năng Auto scaling của phần mềm VlifeMDS 4.6 Việc tỉ lệ này hóa này có tác dụng làm giảm mức độ dao động lớn giữa các TSPT nhằm tránh ảnh hưởng đến kết quả dự đoán

 Đánh giá quan hệ phi tuyến bằng phần mềm SPSS 22.0 để kiểm tra sự phụ

thuộc phi tuyến của pIC, pI và TSPT

Bước 4: Xây dựng mô hình QSAR

Lựa chọn ngẫu nhiên 18 hợp chất từ CSDL1 (81,8%) và 27 hợp chất từ CSDL2 (87,1%) làm tập huấn luyện để xây dựng các mô hình QSAR IC50 và QSAR I% tương ứng Các mô hình được xây dựng bằng các phương pháp: hồi quy đa biến tuyến tính (MLR), bình phương tối thiểu (PLS), phân tích thành phần chính (PCR) sử dụng phần

mềm VlifeMDS 4.6

Bước 5: Đánh giá mô hình QSAR

Các mô hình QSAR được đánh giá dựa trên những thông số thống kê R2, R2

test,

Q2 và khả năng dự đoán P, Ptest; đồng thời đánh giá theo 5 tiêu chí của OECD [69]

2.3.2 Phương pháp ứng dụng các mô hình QSAR để sàng lọc

2.3.3.1 Xác định miền cấu trúc ứng dụng của mô hình

Miền cấu trúc ứng dụng là khoảng không gian cấu trúc được xác định bởi các hợp chất trong tập huấn luyện để xây dựng mô hình Xác định miền cấu trúc theo phương pháp ba lân cận gần nhất Những hợp chất được coi là nằm trong miền xác định của mô hình nếu Di ≤ Dk + 0,5 × Sk Trong đó: Dk là trung bình khoảng cách Euclid trong không gian các TSPT của mô hình giữa mỗi hợp chất trong tập huấn luyện đến 3 hợp chất gần nó nhất; Sk là độ lệch chuẩn của Dk; Di là trung bình khoảng

18

cách Euclid giữa hợp chất cần dự đoán i đến 3 hợp chất gần nhất trong tập huấn luyện [90] Khoảng cách Euclid giữa 2 hợp chất là khoảng cách giữa 2 điểm biểu diễn 2 hợp chất đó trong không gian với các hệ trục tọa độ tương ứng với các TSPT xuất hiện trong mô hình

Việc xác định miền ứng dụng của mô hình là một trong những bước quan trọng trong nghiên cứu QSAR Không có miền ứng dụng, mô hình QSAR có thể được sử dụng để dự đoán hoạt tính của các hợp chất có cấu trúc rất khác các hợp chất trong tập huấn luyện xây dựng mô hình, dẫn tới dự đoán ngoại suy, và kết quả này có khả năng sai số rất cao Miền ứng dụng của mô hình cho phép xác định những hợp chất

được phép dự đoán bởi mô hình để thu được kết quả đáng tin cậy

2.3.3.2 Ứng dụng mô hình để dự đoán hoạt tính ức chế XO và phân loại các hợp chất flavonoid

Tiến hành xác định Di của từng hợp chất trong CSDL3, tìm ra những hợp chất thuộc miền ứng dụng của mô hình QSAR I% và mô hình QSAR IC50 để dự đoán giá trị biểu thị hoạt tính ức chế XO tương ứng

2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế XO in vitro

Tác dụng ức chế xanthin oxidase được đánh giá trên đĩa UV 96 giếng Costar

3635 theo phương pháp của Noro T [68] và Nguyễn Thị Thanh Mai [65], với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm

Chuẩn bị dung dịch thử: Chất thử (quercetin, quercitrin, kaempferol) được hòa

tan trong dimethyl sulfoxyd (DMSO) thu được dung dịch gốc có nồng độ 10 mg/ml Dung dịch gốc tiếp tục được pha loãng bằng đệm phosphat pH = 7.5 thành các dung dịch có nồng độ 0,3 µg/ml; 1 µg/ml; 3 µg/ml; 10 µg/ml; 30 µg/ml; 50 µg/ml; 100 µg/ml; 300 µg/ml để thực hiện các phản ứng enzym Mẫu chứng có thành phần tương

tự mẫu thử nhưng dung dịch chất thử được thay thế bằng dung dịch đệm phosphat

Tiến hành: Trên mỗi đĩa UV 96 giếng Costar 3635 gồm có: giếng chứng và các

giếng thử Trong các giếng chứng/thử được cho tương ứng gồm: 50 µl dung dịch đệm/dung dịch thử; 35 µl dung dịch đệm phosphat 70 mM, pH = 7.5; 30 µl dung dịch enzym (0,01 U/ml trong dung dịch đệm phoshat 70 mM, pH = 7.5) được chuẩn bị

độ nhất định được tính theo công thức:

20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả xây dựng và đánh giá các mô hình QSAR

3.1.1 Các mô hình QSAR IC50

Sử dụng chức năng lựa chọn ngẫu nhiên của phần mềm SPSS 22.0, 18 hợp chất được lựa chọn vào tập huấn luyện, 4 hợp chất còn lại (IC_3, IC_8, IC_12, IC_6) được lựa chọn vào tập kiểm nghiệm

Xây dựng các mô hình QSAR trên tập huấn luyện lần lượt bằng các phương pháp MLR, PLS, PCR thu được kết quả như sau:

 Mô hình QSAR IC50 xây dựng bằng phương pháp hồi quy tuyến tính (MLR):

 Mô hình QSAR IC50 xây dựng bằng phương pháp bình phương tối thiểu từng

phần (PLS):

pIC = - 4,3750GATS8s - 1,6817CATS2D_07_AA - 3,4492MATS5v

- 2,3952GATS4s + 0,1119F09[O-O] -0,3461SpMax4_Bh(s)

pIC = - 3,4769GATS8s - 1,4362CATS2D_07_AA - 2,7815MATS5v

-10,7921SpMax2_Bh(s) + 0,3821GATS7s - 1,7010GATS4s

+ 0,2014CATS2D_09_DA + 79,9935 (M2)

21

 Mô hình QSAR IC50 xây dựng bằng phương pháp phân tích thành phần chính

(PCR):

3.1.1.2 Đánh giá các mô hình

Thông số thống kê của các mô hình M1, M2, M3 được tóm tắt trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Thông số thống kê của các mô hình QSAR IC50

Ký hiệu mô hình Phương pháp xây dựng R2 Q2 R2

test lại thấp nhất trong cả 3 mô hình Mô hình M3 có kết quả đánh giá nội lại kém hơn hai mô hình M1

và M2 Mô hình M2 với các giá trị R2,Q2, R2

test lớn hơn 0,9, vừa đảm bảo tính chính xác, độ bền vững cao, vừa có kết quả đánh giá ngoại đáng tin cậy

Kết quả dự đoán nội, dự đoán ngoại của các mô hình M1, M2, M3 lần lượt được trình bày ở các bảng 3.2 và bảng 3.3

pIC = - 2,3104GATS8s - 106,3130 JGI9 - 0,7680CATS2D_07_AA

+ 0,4599Depressant-80 + 8,1303 (M3)

P test trung bình 93,73 96,39 95,56

23

Nhận xét: Cả 3 mô hình M1, M2, M3 đều có khả năng dự đoán nội cũng như

khả năng dự đoán ngoại rất tốt Độ chính xác dự đoán đối với từng hợp chất đều lớn hơn 90% Trong đó độ chính xác dự đoán nội của cả 3 mô hình đều xấp xỉ 98% Độ chính xác dự đoán ngoại của mô hình M1 là thấp nhất, nhưng cũng xấp xỉ 94% Mô hình M2 có độ chính xác dự đoán ngoại rất cao (96,39%)

Sử dụng chức năng lựa chọn ngẫu nhiên của phần mềm SPSS 22.0, 27 hợp chất được lựa chọn vào tập huấn luyện, 4 hợp chất còn lại (IC_5, IC_11, IC_17, IC_26) được lựa chọn vào tập kiểm nghiệm

Xây dựng các mô hình QSAR trên tập huấn luyện lần lượt bằng các phương pháp MLR, PLS, PCR thu được kết quả như sau:

 Mô hình QSAR I% xây dựng bằng phương pháp hồi quy tuyến tính (MLR):

 Mô hình QSAR I% xây dựng bằng phương pháp bình phương tối thiểu từng

phần (PLS):

pI = 3,5591Eig03_AEA(ri) - 1,7850SpMin8_Bh(p) + 0,2176GATS8s

+ 0,8502Eig05_AEA(ed) - 0,1366F09[O-O] - 0,2619Hypnotic-50

- 5,0497SIC1 + 102,0660X4A + 0,2703Eig04_EA(dm) - 19,2937 (M4)

pI = 2,6128Eig03_AEA(ri) - 43,0819Eta_L_A + 0,5175Psychotic-80

- 45,9718JGI8 + 31,1847X4A - 0,4049MATS8m

- 0,3293SM15_AEA(ri) - 1,7064 (M5)

24

 Mô hình QSAR I% xây dựng bằng phương pháp phân tích thành phần chính

(PCR):

3.1.1.2 Đánh giá các mô hình

Thông số thống kê của các mô hình M4, M5, M6 được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Thông số thống kê của các mô hình QSAR I%

có giá trị Q2 cao hơn M5 và M6, tuy nhiên giá trị R2test của M4 lại thấp hơn nhiều so với M6 Mô hình M6 có giá trị R2, Q2, R2

test đều cao hơn 0,9; trong đó R2

test của M6 cao vượt trội so với M4 và M5

Kết quả dự đoán nội, dự đoán ngoại của các mô hình M4, M5, M6 lần lượt được trình bày ở bảng 3.5 và bảng 3.6

pI = 1,6987Eig03_AEA(ri) + 0,2981Psychotic-80

+ 11,4965VE2_D/Dt + 0,1852SpMax5_Bh(s) + 48,1211X4A

+ 0,8931SpMAD_EA(ed) -12,8456 (M6)

P trung bình 98,12 97,63 97,22

P test trung bình 92,05 88,28 96,61

Nhận xét: Cả 3 mô hình M1, M2, M3 đều có khả năng dự đoán nội rất tốt (trên

97%) Độ chính xác dự đoán ngoại của M5 thấp hơn hẳn so với M4 và M6 nhưng vẫn

ở mức 88,28% Mô hình M6 có độ chính xác dự đoán ngoại rất cao (96,91%)

3.1.3 Đánh giá các mô hình QSAR IC50 và QSAR I% theo 5 tiêu chí của OECD

Mục đích của tiêu chí này để đảm bảo mô hình QSAR xây dựng nhằm dự đoán một giá trị cụ thể như giá trị IC50, I%, , trên một tác dụng, hoạt tính cụ thể, trong một điều kiện cụ thể

Áp dụng đánh giá: Các mô hình M1, M2, M3 được xây dựng nhằm dự đoán giá

trị pIC (logIC50) thể hiện hoạt tính ức chế XO của các hợp chất flavonoid, với đơn vị của giá trị IC50 là nM Các mô hình M4, M5, M6 được xây dựng nhằm dự đoán giá trị pI (logI%) thể hiện hoạt tính ức chế XO của các hợp chất flavonoid, với giá trị phần trăm ức chế (I%) được đo tại nồng độ 100 µg/ml dung dịch thử

Tiêu chí này nhằm đảm bảo mô hình QSAR được xây dựng dựa trên một thuật toán cụ thể Tính lặp lại cuả mô hình phụ thuộc vào điều kiện này Một số mô hình mang tính chất thương mại hóa không được công bố thuật toán sử dụng Tuy nhiên, đây có thể trở thành vấn đề rào cản pháp lý bởi kết quả của mô hình không thể được công bố độc lập mà không có thuật toán trình bày cụ thể

27

Áp dụng đánh giá: Các TSPT tính toán bởi phần mềm Dragon 6.0 được liệt kê

và định nghĩa đầy đủ [100] Mô hình M1 và M4 được xây dựng bằng thuật toán MLR, M2 và M5 được xây dựng bằng thuật toán PLS, M3 và M6 được xây dựng bằng thuật toán PCR Các thuật toán này là những thuật toán thống kê thường quy được áp dụng phổ biến trong xây dựng các mô hình QSAR [95]

Một mô hình QSAR không thể được ứng dụng để dự đoán hoạt tính của tất cả các hợp chất Kết quả dự đoán chỉ đáng tin cậy đối với những hợp chất thuộc giới hạn cấu trúc nhất định Phương pháp xác định miền cấu trúc ứng dụng được trình bày cụ thể trong mục 1.1.3

Áp dụng đánh giá: Giá trị Di giới hạn của mô hình M2 và M6 được xác định tại mục 3.2 Trước khi ứng dụng các mô hình này để dự đoán, các hợp chất trong tập

huấn luyện, trong CSDL3 và trong thí nghiệm in vitro đều được tính toán giá trị Di,

so sánh với Di giới hạn để đảm bảo kết quả dự đoán là đáng tin cậy

năng dự đoán

Đây là tiêu chí chung, có tính chất bao hàm một số tiêu chí khác Các giá trị R2,

Q2 và khả năng dự đoán nội, khả năng dự đoán ngoại, chính là những thước đo phù hợp và phổ biến để đánh giá chất lượng mô hình QSAR được các nhà nghiên cứu QSAR đề xuất sử dụng [28]

Áp dụng đánh giá: Từ kết quả đã trình bày, các mô hình xây dựng được không

chỉ đạt yêu cầu thống kê, đảm bảo tính chính xác và bền vững (R2 [0,8717; 0,9884],

Q2 [0,7938; 0,9645]) mà còn có độ chính xác dự đoán nội, dự đoán ngoại cao (P 

[97,22; 98,78], Ptest [88,28; 96,61]),

Đây là tiêu chí không bắt buộc Theo quan điểm của các nhà nghiên cứu QSAR, không phải bao giờ mô hình QSAR cũng đưa ra được một hay nhiều cơ chế tác dụng Điều này không có nghĩa là mô hình đó không có khả năng ứng dụng Tiêu chí này đưa ra không phải để loại bỏ các mô hình không chỉ rõ cơ chế tác dụng, mà chỉ nhằm

28

đảm bảo nếu mô hình có chỉ ra được cơ chế tác dụng cụ thể nào đấy, thì cơ chế này cần được chỉ ra cùng với sự công bố của mô hình

Áp dụng đánh giá: Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng các mô hình QSAR

dự đoán tác dụng ức chế XO của các hợp chất flavonoid, không nhằm mục đích phân tích cơ chế tác dụng

Bảng 3.7 Kết quả sàng lọc CSDL3 của mô hình M2

pIC Số hợp chất Tỉ lệ (%)

6 ≤ pIC < 7 226 17,77

4 ≤ pIC < 6 801 62,97 pIC < 4 204 16,04

 Với mô hình M6: Xác định giá trị Di của các hợp chất trong CSDL3 cho kết quả 615/2038 hợp chất thỏa mãn Di ≤ 0,2879 Dự đoán giá trị pI của 615 hợp chất này, kết quả được trình bày tóm tắt trong bảng 3.8 Kết quả chi tiết được trình bày tại Phụ lục 4

(M2): Di ≤ Dk + 0,5 × Sk = 0,6011 + 0,5 × 1,1453 = 1,1737 (M6): Di ≤ Dk + 0,5 × Sk = 0,2180 + 0,5 × 0,1396 = 0,2879

Nhận xét: Mô hình M2 có miền ứng dụng lớn hơn nhiều so với mô hình M6

Trong số 1272 hợp chất thuộc miền ứng dụng của M2, hơn một nửa số hợp chất có giá trị pIC thuộc khoảng 4-6 Số hợp chất có pIC nhỏ hơn 4 chiếm khoảng 16% Trong số 615 hợp chất thuộc miền ứng dụng mô hình M6, gần 62% số hợp chất có giá trị I% dự đoán thuộc khoảng 25-75% và có đến 143 hợp chất được dự đoán là có giá trị I% lớn hơn 70%

3.3 Kết quả thực nghiệm đánh giá hoạt tính ức chế XO in vitro

Tiến hành đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của 3 hợp chất quercetin,

quercitrin, kaempferol theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.4 Giá trị phần trăm ức chế (I%) XO của 3 hợp chất tại các nồng độ khác nhau và giá trị IC50 tương ứng được trình bày trong bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả thực nghiệm đánh giá hoạt tính ức chế XO in vitro của

quercetin, quercitrin và kaempferol

30

Tiến hành dự đoán hoạt tính 3 hợp chất trên bằng mô hình M2 và M6, so sánh với giá trị thực nghiệm, thu được kết quả được trình bày tương ứng trong các bảng 3.10 và 3.11

Bảng 3.10 Kết quả dự đoán giá trị pIC của mô hình M2 so với thực nghiệm

Trung bình độ chính xác dự đoán 95,06

Bảng 3.11 Kết quả dự đoán giá trị pI của mô hình M6 so với thực nghiệm

Nhận xét: Kết quả dự đoán hoạt tính ức chế XO của mô hình M2 và M6 rất

gần với kết quả thực nghiệm in vitro thu được So với kết quả thực nghiệm, độ chính

xác dự đoán đối với mỗi hợp chất đều cao hơn 90% Mô hình M6 có độ chính xác trung bình rất cao (98%) Đặc biệt độ chính xác kết quả dự đoán của cả hai mô hình đối với quercitrin so với kết quả thực nghiệm đều gần 100%

Trung bình độ chính xác dự đoán 98,00

31

3.4 Bàn luận

3.4.1 Về kết quả xây dựng và đánh giá mô hình

Trên thế giới, mặc dù đã có nhiều nghiên cứu liên quan cấu trúc-tác dụng (SAR)

về hoạt tính ức chế XO của các hợp chất flavonoid [19], [22], [54], tuy nhiên chưa có

nhiều nghiên cứu xây dựng mô hình liên quan định lượng cấu trúc-tác dụng (QSAR)

cho đối tượng này [4], [44] Nếu như mục đích chính của các nghiên cứu SAR là tìm

ra đặc điểm cấu trúc có ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất thì các phân tích QSAR lại nhằm định lượng hóa mức độ ảnh hưởng của các đặc điểm đó

Theo các tài liệu thu thập được, lần đầu tiên tại Việt Nam, các mô hình QSAR

dự đoán hoạt tính ức chế XO của các hợp chất flavonoid được xây dựng và đánh giá Các mô hình này đảm bảo tính chính xác, bền vững và khả năng dự đoán tốt đồng thời thỏa mãn các tiêu chí bắt buộc do Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế thế giới (OECD) đã đề ra để đánh giá mô hình QSAR

Các mô hình QSAR được xây dựng bằng nhiều phương pháp khác nhau nhằm tìm ra được mô hình có chất lượng tốt nhất Trong các mô hình QSAR IC50, mô hình M2 được xây dựng theo phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS) thể hiện chất lượng tốt hơn hai mô hình còn lại Trong khi đó, mô hình M6 được xây dựng theo phương pháp phân tích thành phần chính (PCR) lại là mô hình QSAR I% tốt nhất Điều này một lần nữa khẳng định không có một phương pháp nào là tối ưu nhất

để xây dựng các mô hình QSAR và việc xây dựng mô hình bằng các phương pháp khác nhau sẽ giúp đạt kết quả tốt hơn Kết quả của nghiên cứu này có thể là cơ sở để xây dựng phương pháp tiến hành các nghiên cứu QSAR trên các đích phân tử khác

3.4.2 Về kết quả ứng dụng các mô hình để sàng lọc

Từ các CSDL trình bày ở Phụ lục 1 và Phụ lục 2 cho thấy cấu trúc các hợp chất trong CSDL1 đa dạng hơn các hợp chất trong CSDL2 rất nhiều, điều này lý giải cho việc miền ứng dụng của mô hình M2 lớn hơn nhiều so với mô hình M6 Trong các giá trị dự đoán của mô hình M2, M6 đối với những hợp chất không thuộc miền ứng dụng của mô hình, có rất nhiều giá trị âm hoặc rất lớn Điều này chứng tỏ các giá trị