Sơ bộ khảo sát một số chỉ tiêu để góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu cỏ sữa lá lớn

Do đó, dược liệu cỏ sữa lá lớn cần được tiêu chuẩn hóa để quản lý chất lượng hiệu quả và nâng cao giá trị sử dụng làm thuốc.. Dịch chiết methanol của các bộ phận lá, hoa, thân, rễ của câ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn NCS.DS Nguyễn Thanh Tùng, người đã luôn

ở bên hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi để tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của

Bộ môn Dược liệu Trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận

Xin gửi lời cảm ơn đến ThS Nghiêm Đức Trọng cùng các thầy cô của Bộ môn

Thực vật đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thân yêu trong gia đình tôi, các anh chị, các bạn và các em sinh viên làm đề tài tại Bộ môn Dược liệu

đã luôn ủng hộ, cổ vũ và khích lệ tôi trong trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Đào Sơn Tùng

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1. Đặc điểm thực vật của loài Euphorbia hirta L 2

1.2 Phân bố 3

1.3 Thành phần hóa học 3

1.3.1 Flavonoid 3

1.3.2 Triterpenoid 5

1.3.3 Diterpenoid 7

1.3.4 Tinh dầu 8

1.3.5 Tanin 8

1.3.6 Một số thành phần khác 8

1.4 Tác dụng sinh học 9

1.4.1 Tác dụng chống oxy hóa 9

1.4.2 Tác dụng hạ đường huyết 9

1.4.3 Tác dụng chống viêm 10

1.4.4 Tác dụng trên hệ thống tiết niệu 10

1.4.5 Tác dụng chống dị ứng 11

1.4.6 Tác dụng ức chế miễn dịch 11

1.4.7 Tác dụng chống tiêu chảy 11

1.4.8 Tác dụng ức chế khối u 11

1.4.9 Tác dụng làm lành vết bỏng 11

1.5 Công dụng 12

1.6 Quy định chung về kiểm tra chất lượng dược liệu 12

1.7 Tiêu chuẩn hóa dược liệu cỏ sữa lá lớn 13

1.7.1 Dược điển Trung Quốc 2010 13

1.7.2 Dược điển thuốc cổ truyền Ấn Độ 1989 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Mô tả 17

2.3.2 Vi phẫu 17

2.3.3 Bột 18

2.3.4 Định tính 18

2.3.5 Định lượng 18

2.3.6 Mất khối lượng do làm khô 18

2.3.7 Tro toàn phần 19

2.3.8 Xử lý kết quả thực nghiệm 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Khảo sát và xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu cỏ sữa lá lớn 20 3.1.1 Mô tả dược liệu 20

3.1.2 Vi phẫu 20

3.1.3 Bột dược liệu 21

3.1.4 Định tính 21

3.1.5 Định lượng flavonoid toàn phần trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn 24

3.1.6 Mất khối lượng do làm khô 32

3.1.7 Tro toàn phần 33

3.2 Dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu cỏ sữa lá lớn 34

3.3 Bàn luận 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

iNO inducible nitric oxide synthase

IQR interquartile range (tứ phân vị)

RSD relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương đối)

SD standard deviation (độ lệch chuẩn)

SKLM sắc ký lớp mỏng

TLTK tài liệu tham khảo

TNF tumour necrosis factor

UV ultra violet

UV-254 ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm

UV-366 ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn 3

2.1 Số hiệu tiêu bản các mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu 15 3.1 Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ quercitrin chuẩn 26

3.4 Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn 31 3.5 Mất khối lượng do làm khô của 5 mẫu cỏ sữa lá lớn 32

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

3.1 Ảnh chụp sắc ký đồ dịch chiết methanol của 5 mẫu cỏ sữa lá lớn 23 3.2 Hình ảnh phổ quercitrin chuẩn tạo phức với nhôm clorid 25

3.3 Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ và

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mục tiêu chung của Chiến lược phát triển ngành Dược Quốc gia đến 2020, tầm nhìn 2030 là: “Cung ứng đầy đủ, kịp thời, có chất lượng, giá hợp lý các loại thuốc theo cơ cấu bệnh tật tương ứng với từng giai đoạn phát triển kinh tế - xã hội và bảo đảm sử dụng thuốc an toàn, hợp lý” [5] Trong đó, việc phát huy thế mạnh, tiềm năng của Việt Nam để phát triển thuốc từ dược liệu là một vấn đề trọng điểm

Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) là loài cây mọc hoang và và phân bố tương

đối rộng rãi ở Việt Nam [4] Bộ phận trên mặt đất của cây được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa một số bệnh như nhiễm khuẩn đường ruột, nhiễm khuẩn ngoài da, viêm phế quản, viêm thận, [4] Kết quả nghiên cứu trên các mô hình dược

lý thực nghiệm cho thấy cỏ sữa lá lớn có tác dụng chống viêm , , hạ đường huyết [46], chống oxy hóa, dọn gốc tự do [45], kháng khuẩn [29], chống dị ứng [64], ức chế miễn dịch [13] và làm lành vết bỏng [39] Hiện nay, cỏ sữa lá lớn đã được tiêu

chuẩn hóa trong Dược điển Trung Quốc 2010 [28] và Dược điển thuốc cổ truyển Ấn

Độ 1989 [18] Tuy nhiên, Dược điển Việt Nam IV [3] vẫn chưa có chuyên luận về dược liệu này Do đó, dược liệu cỏ sữa lá lớn cần được tiêu chuẩn hóa để quản lý chất lượng hiệu quả và nâng cao giá trị sử dụng làm thuốc

Vì vậy, đề tài khóa luận “Sơ bộ khảo sát và xây dựng một số chỉ tiêu để góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu cỏ sữa lá lớn” được thực hiện với mục tiêu:

Khảo sát và sơ bộ xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm bộ phận trên mặt đất

cỏ sữa lá lớn

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu

(Euphorbiaceae) [4] Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [16], chi Euphorbia

thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), bộ Thầu dầu (Euphorbiales), phân lớp Sổ (Dilleniidae), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), giới Thực vật (Plantae)

1.1 Đặc điểm thực vật của loài Euphorbia hirta L

Cây thảo, sống hằng năm [23] hoặc sống dai [7], cao 30-60 (70) cm Rễ cọc hoặc

rễ chùm [23], đường kính 3-5 mm [23] Thân thường ít phân nhánh, phân nhánh từ giữa hoặc phía trên, mọc thẳng đứng hoặc nghiêng, hiếm khi mọc bò, đường kính 3

mm [23], màu đỏ nhạt [9], có nhựa mủ trắng [4], [9] và có nhiều lông che chở dài màu vàng nâu và lông ngắn hơn màu trắng [23] Lá đơn, mọc đối, gốc cuống lá có hai lá kèm nhỏ hình tam giác [23] hay hình lông cứng [4], kích thước 0,8-1,7 mm, rụng sớm [23] Cuống lá dài 1-3,5 mm, phiến lá hình mác-thuôn, elip dài, hoặc hình trứng-mác, kích thước 10-50 x 3-16 mm, mặt trên màu không đồng đều từ xanh đến

đỏ, đôi khi có các đốm màu đỏ tía dọc theo gân giữa, mặt dưới màu xám-xanh, cả hai mặt đều có lông dày, mặt trên nhiều lông hơn [23], gốc phiến lá tròn, hơi lệch [9], mép lá nguyên hoặc một ít răng cưa nhỏ ở nửa dưới, răng cưa đều ở nửa trên [23], ngọn lá nhọn [9], [23] hoặc tù Cụm hoa dày, thường giống đầu [23], mọc ở nách lá [4], [9], dạng xim, có cuống dài 25 mm, tất cả các bộ phận đều có nhiều lông [23], tổng bao hình chuông [9], [23], kích thước 1×1 mm, có lông, mép chia 5 thùy, hình trứng-tam giác, có 4 tuyến màu đỏ, hình tròn đến elip, ở giữa hơi trũng, phần phụ có màu từ trắng đến đỏ, hình elip đến tam giác, kích thước 0,3-0,2 mm, toàn bộ mép nguyên hoặc hơi gợn sóng [23] Hoa đơn tính [23] Một cụm hoa có 4-5 hoa đực [2] Hoa đực tiêu giảm chỉ còn 1 nhị, đối diện lá bắc nhỏ [23], bao phấn màu đỏ [23], mở

ở đỉnh hoặc cạnh [9] Hoa cái có cuống ngắn, bầu cao, nhô ra khỏi tổng bao hình chuông, bầu 3 ngăn, có lông thưa thớt, vòi nhụy chia 2 thùy [23] Quả nang 3 góc, kích thước 1-1,5×1-1,5 mm, có nhiều lông ngắn, mịn, cuống dài 1,5 mm [23], có 3

3

hạt [2] Hạt thuôn, hình lăng trụ bốn mặt, 0,7-0,9×0,4-0,5 mm, hơi xù xì, màu đỏ và không có mào Số nhiễm sắc thể 2n=18 Mùa hoa và quả từ tháng 6 đến tháng 12 [23]

1.2 Phân bố

Loài Euphorbia hirta L có nguồn gốc từ vùng Trung Mỹ [52], [50] nhưng phân

bố chủ yếu ở một số nước thuộc khu vực nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á gồm Ấn

Độ, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Lào, Việt Nam và một số nơi ở phía nam Trung Quốc Ở Việt Nam, cây mọc tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh [9], thường mọc

ở ven đường, cánh đồng, bụi cây, rừng [48]

1.3 Thành phần hóa học

Theo các tài liệu thu thập được, thành phần hóa học của cỏ sữa lá lớn (Euphorbia

hirta L.) gồm flavonoid, triterpenoid, diterpenoid, sterol, acid hữu cơ, tinh dầu, tanin

và một số thành phần khác

1.3.1 Flavonoid

Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1

Ba ̉ ng 1.1 Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn

cây

[14], [33]

TMĐ

[46], [69]

cây [33]

5

TMĐ

[46], [36]

cây

[52], [38]

cây

[33], [68]

cây

[35], [51], [54]

cây

[17], [50]

cây

[11], [17], [50]

1.3.2 Triterpenoid

6

Các triterpenoid trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Các triterpenoid trong cây cỏ sữa lá lớn

25 25-hydroperoxy

cycloart-23-en-3β-ol

Toàn cây [69]

26 24-hydroperoxy

cycloart-25-en-3β-ol

Toàn cây [69]

cây

[17], [50]

7

cây

[11], [54], [69]

Các diterpenoid trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Các diterpenoid trong cây cỏ sữa lá lớn

[17], [50]

34

12-deoxyphorbol-13-phenylacetat-20-acetat

Toàn cây

[17], [50]

cây

[17], [50]

Thành phần tinh dầu lá cỏ sữa lá lớn gồm:

3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanon, hexadecanal, phyt3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol, acid n-hexadecanic, 2- butoxy ethanol, butyl tetradecyl phthalat, 13-heptadecyn-1-ol, 2-methyl-1-hexadecanol, diisooctyl 1,2-benzen dicarboxylat [58]

1.3.5 Tanin

Các hợp chất tanin đã được phát hiện trong cây cỏ sữa lá lớn đều thuộc nhóm tanin thủy phân và thường tập trung ở lá [26], [68], [22] hoặc ở bộ phận trên mặt đất [68] Một số hợp chất tanin có trong lá cỏ sữa lá lớn là euphorbin C [66], euphorbin E [67], geraniin [68],…Một số hợp chất tanin có trong bộ phận trên mặt đất cỏ sữa lá lớn là euphorbin A [68], euphorbin B [68], terchebin [68], 3,4-di-O-galloylquinic acid [68], 5-O-caffeoylquinic acid [68]

1.3.6 Một số thành phần khác

- Coumarin: scopoletin [69], isoscopoletin [69], scoparon [69]

- Acid hữu cơ: acid caffeic [33], acid ellagic [11], acid gallic [11], [25], [69], acid maleic, acid tartric [17], [50], acid syringic [33], acid tricosanoic [6]

- Sterol: brassicasterol [55], campesterol [55], cholesterol [55], stigmasterol [55], β-sitosterol [43], [49], [55], β-sitosterol-D-glucosid [69], [43], [55]

- Alcaloid, acid amin [11] và muối khoáng [17], [50]

- Alcol: quercitol [50], myricyl alcol [8], [50], inositol, L-hexacosanol [11]

- Ankan: hentriacontan [11], heptacosan, n-nonacosan [17]

- Đường: glucose, fructose, sucrose [11]

Dịch chiết nước lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng chống oxy hóa và dọn gốc tự

do trên mô hình in vitro đánh giá tác dụng chống oxy hóa, dọn các gốc tự do và ức

chế peroxid hóa lipid ở các nồng độ 0,05; 0,10; 0,15; 0,20 và 0,25 mg/ml Kết quả cho thấy các tác dụng trên thể hiện mạnh nhất ở nồng độ 0,25 mg/ml Hiệu quả dọn gốc tự do I(%) DPPH, hydroxyl và ức chế peroxid hóa lipid tương ứng là 68,80%, 73,36% và 77,45% [43]

Ngoài ra các kết quả nghiên cứu in vitro về tác dụng chống oxy hóa của cỏ sữa

lá lớn cho thấy: Dịch chiết ethanol thân cỏ sữa lá lớn ở nồng độ 250 µg/ml có khả năng dọn gốc tự do DPPH, superoxid, nitric oxid so với thuốc đối chứng acid ascorbic (250 μg/ml) với hiệu quả dọn gốc tự do (I%) tương ứng là 59,95%, 59,67% và 28,54% [47] Dịch chiết methanol của các bộ phận (lá, hoa, thân, rễ) của cây cỏ sữa lá lớn ở cùng nồng độ 1 μg/ml được đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH Dịch chiết lá thể hiện tác dụng mạnh nhất (I% = 72,96%), tiếp theo lần lượt là dịch chiết hoa (52,45%),

rõ rệt và mạnh hơn các dịch chiết khác ở cả 2 mức liều 250 mg/kg và 500 mg/kg, dịch chiết hoa, thân có tác dụng rõ ở mức liều 500 mg/kg [50]

10

Các dịch chiết ethanol và ether dầu hỏa của lá cỏ sữa lá lớn được đánh giá tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây đái thảo đường bởi alloxan [44] và streptozotocin [56] đều cho thấy tác dụng hạ đường huyết đáng kể so với nhóm chứng và thuốc đối chứng glibenclamid Trong đó, dịch chiết ethanol có tác dụng hạ đường huyết mạnh hơn dịch chiết ether dầu hỏa [44]

Phân đoạn dịch chiết ethanol và ethyl acetat của cỏ sữa lá lớn đã được chứng minh

có tác dụng hạ đường huyết theo cơ chế ức chế hoạt tính enzym α-glucosidase, chống oxy hóa và tăng khả năng tiết insulin ở tế bào β đảo tụy (đảo Langerhans) [61]

Nghiên cứu của Trương Hoàng Kiên và cộng sự [7] cho thấy trà cỏ sữa lá lớn có

khả năng kiểm soát đường huyết sau ăn trên bệnh nhân đái tháo đường typ II

Dịch chiết ethanol của cỏ sữa lá lớn và β-amyrin - một thành phần của cây có tác

dụng chống viêm vượt trội, có thể phong bế hầu hết các chức năng của protein iNOS

và sự cảm ứng NO, thể hiện tiềm năng ức chế chọn lọc NO để điều trị viêm khớp [57]

1.4.4 Tác dụng trên hệ thống tiết niệu

Dịch chiết nước và ethanol lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng lợi tiểu trên chuột Wistar ở mức liều 50 mg/kg và 100 mg/kg dùng đường tiêm so với mẫu chứng và furosemid (5 mg/kg), acetazolamid (5 mg/kg) Dịch chiết nước làm tăng đào thải Na+,

K+, HCO3- trong khi dịch chiết ethanol làm tăng đào thải HCO3- và K+, ít ảnh hưởng đến đào thải Na+ Nghiên cứu cho rằng các thành phần có hoạt tính trong dịch chiết nước lá cỏ sữa lá lớn có cơ chế lợi tiểu tương tự như acetazolamid [40]

Bên cạnh đó, dịch chiết methanol của lá và thân cỏ sữa lá lớn có tác dụng ức chế men chuyển angiotensin 90% và 50% ở các mức liều tương ứng 500 μg và 150 μg sử

11

dụng xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết enzym (ELISA) Nghiên cứu cho thấy rằng hầu hết các hợp chất ức chế men chuyển angiotensin có mặt trong phân đoạn phân cực và phân cực trung bình [30]

1.4.5 Tác dụng chống dị ứng

Dịch chiết ethanol của bộ phận trên mặt đất cây cỏ sữa lá lớn có tác dụng ức chế phản ứng quá mẫn rõ rệt trên chuột Wistar và chuột BALB/c ở các mức liều 125 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg dùng đường uống so với mẫu chứng và cetirizin (10

mg/kg) Nghiên cứu in vitro trên tế bào mast phúc mạc chuột cho thấy dịch chiết trên

có tác dụng giảm sự giải phóng TNF-α và IL-6 ở các nồng độ 10 µg/ml, 30 μg/ml, 90 μg/ml [53] Một nghiên cứu khác cũng cho thấy dịch chiết ethanol 95% từ bộ phận trên mặt đất cỏ sữa lá lớn có tác dụng ngăn chặn phản ứng dị ứng giai đoạn sớm và muộn [64]

1.4.6 Tác dụng ức chế miễn dịch

Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết ethanol toàn cây cỏ sữa lá lớn trên đáp ứng miễn dịch dịch thể và trung gian tế bào trên chuột dùng đường uống cho thấy ở mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg, dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế miễn dịch so với thuốc đối chiếu cyclosporin (5 mg/kg) và levamisol (2,5 mg/kg) [13]

1.4.9 Tác dụng làm lành vết bỏng

12

Dịch chiết ethanol toàn cây cỏ sữa lá lớn bào chế ở dạng kem 2% (kl/kl) có tác dụng làm lành vết thương do bỏng trên chuột đối chiếu với mẫu chứng và thuốc đối chứng là thuốc mỡ nitrofurazon 0,2% (kl/kl) [39]

Ngoài các tác dụng nêu trên, cỏ sữa lá lớn còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm [69], [43], giảm đau và an thần [14], [48], trị hen [32], diệt giun sán [12] và ấu trùng [41], [59], nhuyễn thể [41], chống viêm khớp [34], bảo vệ gan [24], chống virus [35]

1.5 Công dụng

Cây cỏ sữa lá lớn theo kinh nghiệm dân gian được dùng để chữa tiêu chảy, kiết

lỵ, giun sán [11], cao huyết áp, phù nề [50], dùng làm thuốc chữa ho, hen [32], viêm phế quản, khí phế thũng, chữa tắc tia sữa [11], các bệnh đường niệu, sinh dục [11], viêm thận, viêm bể thận [2] Bên cạnh đó, nhựa cỏ sữa lá lớn được dùng để chữa hột cơm, mụn cóc, vết thương [11], viêm giác mạc, loét giác mạc [2]

1.6 Quy định chung về kiểm tra chất lượng dược liệu

Dược liệu trước khi đưa vào sử dụng đều phải đưa vào kiểm tra chất lượng và phải đạt yêu cầu chất lượng theo tiêu chuẩn đã đăng ký như tiêu chuẩn dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở [3]

Kiểm tra chất lượng dược liê ̣u bao gồm viê ̣c mô tả, đi ̣nh tính, các phép thử tinh khiết, xác định hàm lượng chất chiết được và đi ̣nh lượng hoạt chất trong dược liê ̣u

Theo Phụ lục 12.2 - Dược điển Việt Nam IV [3], việc kiểm tra chất lượng dược liệu được tiến hành theo quy đi ̣nh sau:

1 Lấy mẫu kiểm nghiê ̣m (Phụ lu ̣c 12.1)

2 Sử dụng các mô tả của chuyên luâ ̣n, một mẫu đối chiếu thích hợp đã đa ̣t yêu cầu chất lượng theo chuyên luâ ̣n riêng để xác nhâ ̣n kết quả kiểm nghiê ̣m

3 Nếu dược liệu được kiểm tra đã bi ̣ vu ̣n nát thì dược liê ̣u đó vẫn phải đáp ứng các yêu cầu chung, trừ yêu cầu về mô tả trong chuyên luâ ̣n tương ứng

4 Nếu dược liê ̣u đòi hỏi phải được làm thành bô ̣t trước khi đi ̣nh tính, đi ̣nh lượng thì phải tán dược liê ̣u đó thành bô ̣t, rây và trô ̣n đều như được mô tả trong Phu ̣ lu ̣c 3.5 và

13

trong chuyên luâ ̣n riêng

5 Chỉ tiêu “Mô tả” bao gồm những mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm của bề mă ̣t, vết bẻ hay mă ̣t cắt của dược liê ̣u, đă ̣c điểm thể chất của dược liê ̣u

6 Định tính là những phương pháp dùng để nhâ ̣n biết dược liê ̣u, bao gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa

7 Thử tinh khiết là cách kiểm tra đô ̣ tinh khiết của dược liê ̣u Tùy từng dược liệu mà thử tinh khiết có thể bao gồm mô ̣t số hay tất cả các chỉ tiêu dưới đây:

a Mất khối lượng do làm khô (Phu ̣ lục 9.6 hay 12.13)

b Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrocloric (Phu ̣ lục 9.7 và 9.8)

c Các tạp chất hữu cơ, các bộ phâ ̣n khác của dược liê ̣u, các dược liê ̣u bi ̣ biến

màu, hư thối (Phu ̣ lục 12.11)

d Tỉ lê ̣ vụn nát của dược liê ̣u (Phu ̣ lu ̣c 12.12)

e Hàm lượng kim loa ̣i nặng (Phu ̣ lu ̣c 9.4.11)

f Dư lượng các chất bảo vê ̣ thực vâ ̣t (Phu ̣ lu ̣c 12.17)

g Xác đi ̣nh chất chiết được là xác đi ̣nh hàm lượng các chất trong dược liê ̣u có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác) (Phu ̣

lục 12.10)

8 Định lượng là viê ̣c xác đi ̣nh hàm lượng mô ̣t hay mô ̣t số chất có trong dược liê ̣u

bằng phương pháp hóa học, lý học hoă ̣c sinh ho ̣c Đi ̣nh lượng bao gồm cả việc xác định hàm lượng chất béo (Phu ̣ lu ̣c 12.9), tinh dầu (Phu ̣ lu ̣c 12.7) và xác đi ̣nh hoa ̣t lực

bằng các phép thử sinh ho ̣c

1.7 Tiêu chuẩn hóa dược liệu cỏ sữa lá lớn

1.7.1 Dược điển Trung Quốc 2010

Chuyên luận dược liệu cỏ sữa lá lớn đã được đưa vào Dược điển Trung Quốc 2010

[28] gồm các chỉ tiêu kiểm nghiệm: mô tả, bột, định tính bằng SKLM, tạp chất, tro toàn phần, mất khối lượng do làm khô, chất chiết được trong ethanol Trong đó,

14

quercitrosid (quercitrin) và acid gallic được sử dụng làm chất đối chiếu để định tính dược liệu bằng SKLM

1.7.2 Dược điển thuốc cổ truyền Ấn Độ 1989

Chuyên luận dược liệu cỏ sữa lá lớn đã được đưa vào Dược điển thuốc cổ truyền

Ấn Độ 1989 [18] gồm các chỉ tiêu kiểm nghiệm: Mô tả, bột, định tính bằng SKLM (không sử dụng chất đối chiếu), tạp chất, tro toàn phần, tro không tan trong acid, chất chiết được trong ethanol, chất chiết được trong nước

Nghiêm Đức Trọng giám định tên khoa học là Euphorbia hirta L., họ Thầu dầu

(Euphorbiaceae) Mẫu thu hái ở Nghệ An chưa thực hiện lưu trữ tiêu bản do đang chờ thu hái mẫu tươi

Bảng 2.1 Số hiệu tiêu bản các mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu

STT Ký hiệu mẫu Số hiệu tiêu bản Địa điểm thu mẫu Thời gian

1 BD HNIP/18112/15 Thuận An, Bình Dương 11/2014

16

Hình 2.1 Ảnh chụp các mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ

Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có:

- Các dung môi hữu cơ: Ethanol, methanol, ether dầu hỏa, chloroform, ethyl acetat, toluen, acid formic, natri acetat, nhôm clorid (AlCl3.6H2O), cloramin B, nước Javel, son phèn, xanh methylen

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S9 (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,01 mg

- Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R-200 (Đức)

- Máy xác định độ ẩm Precisa XM60

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Kính hiển vi Leica (Đức)

- Máy siêu âm Sonic vibra cell

- Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U-1900

- Camera điện thoại 13MP

2.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu cỏ sữa lá lớn như sau:

1 Mô tả

2 Vi phẫu

3 Bột

4 Định tính: Định tính bằng phản ứng hóa học và định tính bằng SKLM

5 Định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu

6 Mất khối lượng do làm khô

2.3.4 Định tính

- Định tính nhóm hợp chất flavonoid bằng phản ứng hóa học: Tiến hành theo

phương pháp ghi trong tài liệu [2]

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng: Tiến hành theo phương pháp quy định tại Dược

điển Việt Nam IV (Phụ lục 5.4) [3], [8]

2.3.5 Định lượng

- Định lượng flavonoid toàn phần trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn bằng phương pháp

quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến quy định tại Dược điển Việt Nam IV (Phụ

lục 4.1) [3], các nghiên cứu [8], [60]:

 Tiến hành chiết xuất dịch chiết cỏ sữa lá lớn và loại tạp

 Làm phản ứng với dung dịch nhôm clorid 10% trong nước

2.3.6 Mất khối lượng do làm khô

Xác định mất khối lượng do làm khô của dược liệu theo phương pháp quy định

tại Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 9.6) [3]

20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát và xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu cỏ sữa lá lớn

Dược liệu là BPTMĐ hoặc BPTMĐ phơi hay sấy khô của cây cỏ sữa lá lớn

(Euphorbia hirta L.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

3.1.1 Mô tả dược liệu

Thân ít phân nhánh, gần như hình trụ, dài 15-50 cm, đường kính 1-3 mm Vỏ ngoài màu đỏ nhạt hoặc vàng, dễ gãy, có thể rỗng ở giữa hoặc không BPTMĐ bao phủ bởi lông dài và dày Lá đơn, mọc đối; phiến lá hình mác-thuôn, elip dài, hoặc hình trứng-mác, dài 1-4 cm, rộng 0,5-1,3 cm, màu xanh-nâu, ngọn lá nhọn, hoặc tù, mép lá răng cưa nhỏ, 3 gân lá riêng biệt Cụm hoa dày, mọc ở nách lá, dạng xim, nhiều lông, hình trứng-tam giác Quả nang 3 góc, có nhiều lông ngắn, mịn Mùi hương nhẹ, vị nhạt, hơi chát

3.1.2 Vi phẫu

3.1.2.1 Vi phẫu thân

Quan sát dưới kính hiển vi, vi phẫu thân của 5 mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu có mặt cắt hình gần tròn, theo thứ tự từ ngoài vào trong có các đặc điểm như sau: Lớp biểu bì gồm 1 lớp tế bào hình trứng xếp đều đặn (2), mang lông che chở đa bào (1)

Mô mềm vỏ gồm 5-6 lớp tế bào hình trứng, xếp tương đối đều đặn thành các vòng tròn đồng tâm (3) Các bó libe-gỗ xếp sát nhau tạo thành vòng hướng tâm, mỗi bó gồm libe (4) ở phía ngoài, gỗ (5) ở phía trong, ngăn cách với libe bởi tầng phát sinh libe-gỗ Mô mềm ruột (6) chiếm phần lớn tiết diện thân, gồm các tế bào thành mỏng, hình gần tròn, càng vào trong các tế bào có kích thước càng lớn

Ảnh chụp vi phẫu thân các mẫu nghiên cứu dưới kính hiển vi được trình bày ở Phụ lục 1

3.1.2.2 Vi phẫu lá

Quan sát dưới kính hiển vi, vi phẫu lá của 5 mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu theo thứ tự từ dưới lên trên có các đặc điểm như sau:

Phần gân lá: Mặt trên hơi lõm, mặt dưới lồi Biểu bì dưới (2) gồm 1 hàng tế bào

hình trứng xếp đều đặn, mang lông che chở đa bào (1) Mô mềm (3) gồm 4-5 hàng tế

Phần phiến lá: Biểu bì dưới (11) gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn và

mang lông che chở đa bào (10) Mô mềm (12) gồm 2-3 hàng tế bào hình gần tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn Mô giậu (13) gồm 2-3 hàng tế bào nằm sát biểu

bì trên Biểu bì trên (14) gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn

Ảnh chụp vi phẫu lá cỏ sữa lá lớn dưới kính hiển vi được trình bày ở Phụ lục 2

3.1.3 Bột dược liệu

Bột mầu xanh nhạt, không mùi, vị hơi đắng Quan sát dưới kính hiển vi có các đặc điểm sau: Lông che chở đơn bào hoặc đa bào gồm 4-5 tế bào (1), bó sợi (2), mảnh biểu bì (3), mảnh biểu bì mang lỗ khí (4), mô mềm (5), mảnh mô mềm chứa tinh bột (6), các mảnh mạch (7), (8), hạt phấn hoa hình bầu dục hoặc gần tròn, mầu vàng nhạt (9)

Ảnh chụp bột dược liệu các mẫu cỏ sữa lá lớn được trình bày ở Phụ lục 3

3.1.4 Định tính

3.1.4.1 Định tính nhóm hợp chất flavonoid bằng các phản ứng hóa học

Cân chính xác khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm

50 ml ethanol 90%, đun sôi cách thuỷ sôi trong 10 phút, lọc nóng Dịch lọc thu được đem cô cách thủy cho bay hết dung môi Cắn thu được hòa trong 20 ml nước cất đun sôi, lọc nóng Dịch lọc thu được đem cô cách thủy cho bay hơi hết nước, cắn còn lại được hòa tan trong 15 ml ethanol 90% Dịch thu được đem làm các phản ứng định

tính flavonoid

- Phản ứng với kiềm

Kết quả: Phản ứng dương tính (+)

+ Phản ứng với dd FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc Thêm vào 2-3 giọt

dd FeCl3 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen

Kết quả: Phản ứng dương tính (+)

+ Phản ứng Cyanidin: Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi Nhỏ từ từ từng giọt acid hydrocloric đặc (3-5 giọt) Để yên một vài phút, dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ

Kết quả: Phản ứng dương tính (+)

Kết luận: Cả 5 mẫu cỏ sữa lá lớn đều cho phản ứng dương tính rõ với các phản

ứng định tính flavonoid Trong dược liệu cỏ sữa lá lớn có flavonoid

Đề nghị: Chọn các phản ứng định tính flavonoid làm chỉ tiêu định tính trong tiêu

chuẩn kiểm nghiệm cỏ sữa lá lớn

3.1.4.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

- Bản mỏng: Silica gel F254 đã hoạt hóa ở 110ºC trong 1h

- Hệ dung môi khai triển: Toluen-Ethyl acetat-Methanol-Acid formic (3:6:1:1)

- Dung dịch thử: Cân khoảng 5g bột dược liệu, cho vào bình nón 50ml, thêm

methanol vừa đủ, đun hồi lưu trong 30 phút, để nguội Lọc bỏ bã dược liệu, dịch lọc đem cô cách thủy cho đến khi còn khoảng 1ml thu được dung dịch thử để chấm sắc ký

23

- Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 0,1mg quercitrin chuẩn vào 1ml methanol, khuấy

đều thu được dung dịch có nồng độ 0,1mg/ml

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên cùng một bản mỏng khoảng khoảng 5 µl

dung dịch thử và 5 µl dung dịch đối chiếu Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng

ra để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm

và 365 nm Hiện vết bằng thuốc thử AlCl3 3% trong ethanol tuyệt đối

- Kết quả: Kết quả định tính dịch chiết cỏ sữa lá lớn bằng SKLM được trình bày ở

sắc kí đồ hình 3.1

Hình 3.1 Ảnh chụp sắc ký đồ dịch chiết methanol của 5 mẫu cỏ sữa lá lớn

24

Chú thích: Q: Quercitrin

Nhận xét: Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại và sau khi hiện vết bằng

thuốc thử cho thấy hệ dung môi sắc ký đã chọn tách tốt đối với dịch chiết methanol các mẫu nghiên cứu Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, 5 mẫu cỏ sữa lá lớn đều có vết tương ứng với vết quercitrin trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu với Rf là 0,435 Điều đó chứng tỏ dịch chiết cỏ sữa lá lớn có chứa quercitrin

Đề nghị: Trong chỉ tiêu kiểm nghiệm cỏ sữa lá lớn bằng SKLM:

- Chọn hệ dung môi Toluen-Ethyl acetat-Methanol-Acid formic (3:6:1:1) làm hệ dung môi sắc ký

- Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 0,1mg quercitrin chuẩn vào 1ml methanol, khuấy đều thu được dung dịch có nồng độ 0,1mg/ml

3.1.5 Định lượng flavonoid toàn phần trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn

Định lượng flavonoid toàn phần trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến

3.1.5.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc

Cân chính xác 1,0 mg quercitrin chuẩn, cho vào bình định mức 10 ml, thêm 6 ml methanol, lắc cho tan hoàn toàn Bổ sung methanol đến vạch thu được dung dịch chuẩn gốc S có nồng độ 100 μg/ml

3.1.5.2 Khảo sát cực đại hấp thụ

Lấy chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10 ml, thêm 0,3 ml dung dịch nhôm clorid 10% (TT), 0,3 ml dung dịch natri acetat 1M (TT), thêm nước cất đến vạch, lắc đều, sau đó để yên trong 30 phút Tiến hành quét phổ từ bước sóng 200-600 nm Kết quả quét phổ cho thấy dung dịch có 2 cực đại hấp thụ chính ở các bước sóng 280,5 nm và 412,0 nm Do đó, chọn bước sóng 412,0 nm làm bước sóng

đo quang

Hình ảnh phổ quercitrin chuẩn tạo phức với nhôm clorid được trình bày ở hình 3.2