ỨNG DỤNG QUECHERS KHẢO sát dƣ LƢỢNG CHLORPYRIFOS TRONG nấm rơm TRÊN địa bàn THÀNH PHỐ cần THƠ BẰNG UPLC MS MS

TÓM TẮT ------ Dư lượng thuốc trừ sâu trong nấm rơm được phân tích bằng phương pháp Quechers.. Dư lượng thuốc trừ sâu trong nấm rơm được chiết với acetonitrile và MgSO4, làm sạch bằng

BỘ MÔN HÓA HỌC



PHẠM THANH TIỀN

ỨNG DỤNG QUECHERS KHẢO SÁT DƢ LƢỢNG CHLORPYRIFOS TRONG NẤM RƠM TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ CẦN THƠ BẰNG UPLC-MS-MS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC

Cần Thơ, 12/2014

LỜI CẢM ƠN

- -Để có được ngày hôm nay là nhờ công ơn của Cha, Mẹ đã vất vả nuôi dạy, lo

lắng, động viên cho con suốt hơn 3 năm tại giảng đường đại học Mỗi khi con gặp khó

khăn Cha, Mẹ luôn tin tưởng, an ủi, khuyến khích và động viên con vượt qua, công ơn

Cha, Mẹ rộng lớn như trời biển, con cám ơn Cha, Mẹ nhiều lắm

Nếu không có công ơn dạy dỗ, chỉ dẫn tận tình của Thầy, Cô thì em cũng không

có được ngày hôm nay Em rất cám ơn Thầy, Cô khoa Khoa Học Tự Nhiên và các

Thầy, Cô cũ đã luôn dìu dắt, dạy dỗ, truyền đạt những bài học quý giá về đạo đức, kỹ

năng sống, kiến thức chuyên môn để em bước vào đời

Luận văn hoàn thành hôm nay, là nhờ sự giúp đỡ của rất nhiều Thầy, Cô,

Anh, Chị và bạn bè Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

tận tình quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn, gởi gắm chỗ thực tập Cô đã trực tiếp góp ý,

chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cô Lê Thị Thanh Diệp, cô Phượng và các Anh, Chị phòng hóa lý trung tâm y tế

dự phòng thành phố Cần Thơ Cô đã gởi gắm em qua công ty thực tập, tận tình chỉ

dẫn, quan tâm chia sẽ, động viên trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cô Lê Thị Bạch (Cố vấn học tập), khoa Khoa học Tự nhiên, Cô đã hướng dẫn,

giúp đỡ, chỉ dẫn và giải đáp những thắc mắc của em trong quá trình thực tập

Ban giám đốc công ty TNHH Warrantek và tất cả Anh Chị trong công ty đã tạo

điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn Em cám ơn chân thành đến tất cả Anh,

Chị phòng sắc ký đã chỉ dẫn tận tình về kỹ năng thực hành, kỹ năng phòng thí nghiệm

trong quá trình thực tập Cuối cùng cám ơn tập thể lớp hóa học khóa 37, bạn bè đã

luôn bên cạnh, ủng hộ và chia sẽ những khó khăn, vất vả trong suốt thời gian qua

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA - -

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

trên điạ bàn thành phố Cần Thơ bằng UPLC-MS-MS ”

2. Nội dung nhận xét:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Cán bộ hướng dẫn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA - -

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

trên điạ bàn thành phố Cần Thơ bằng UPLC-MS-MS”

4. Nội dung nhận xét:

g Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

h Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Cán bộ chấm phản biện

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA - -

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

trên điạ bàn thành phố Cần Thơ bằng UPLC-MS-MS”

6. Nội dung nhận xét:

k Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

l Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Cán bộ chấm phản biện

TÓM TẮT

- -

Dư lượng thuốc trừ sâu trong nấm rơm được phân tích bằng phương pháp

Quechers Phương pháp Quechers cho thời gian phân tích nhanh, hiệu quả cao, dễ thực

hiện, giảm được chi phí sử dụng dung môi và an toàn cho nhân viên kiểm nghiệm Dư

lượng thuốc trừ sâu trong nấm rơm được chiết với acetonitrile và MgSO4, làm sạch

bằng phương pháp phân tán pha rắn dSPE, dịch chiết được phân tích bằng hệ thống

LC/MS/MS với kỹ thuật ion hóa ESI và kỹ thuật ghi phổ MRM Giới hạn phát hiện

của phương pháp là 0,744 ppb và giới hạn định lượng là 2,254 ppb Đường chuẩn có

sự tương quan tuyến tính rõ rệt giữa nồng độ chất phân tích và diện tích peak (R > 0,99) Phương pháp có độ lặp (RSD = 6,23%) và độ thu hồi (75% đến 114,6%)

đều đạt tiêu chuẩn AOAC 2007, và tiêu chuẩn châu Âu EC/657/2002 Phương pháp

Quechers được áp dụng rộng rãi ở các nước tiên tiến phân tích dư lượng thuốc trừ sâu

trong các nền mẫu khác nhau và ngày càng cải tiến mở rộng cho các nhóm kháng sinh,

độc tố, chất bảo quản trong thực phẩm, môi trường…

ABSTRACT

- -

The pesticide residues in straw mushrooms were analyzed by Quechers The method was known as the quick, easy, cheap, effective, rugged and safe method for pesticide residues in straw mushroom involves the extraction of the sample with acetonitrile (ACN) and simultaneous liquid–liquid partitioning formed by adding anhydrous magnesium sulfate (MgSO 4 ) followed by a simple clean-up step known as dispersive solid-phase extraction (dSPE) The extract was analyzed by Electrospray ionization

detection was 0,744 ppb in straw mushrooms The limit of quantification was 2,254 ppb The linear calibration curve with the correlation coefficient (r > 0,99) was

percentage recoveries from 75% to 114,6% were observed for chlorpyrifos from straw

chlorpyrifos in straw mushrooms, water, vegetables, fruits and other products.

LỜI CAM ĐOAN



Tôi xin cam kết luận văn này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất

cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày 27 tháng 11 năm 2014

Phạm Thanh Tiền

MỤC LỤC

- -Lời cảm ơn i

Trang xác nhận hội đồng ii

Tóm tắt v

Abstract vi

Lời cam đoan vii

Mục lục viii

Danh mục bảng xi

Danh mục hình xii

Danh mục từ viết tắt xiii

Chương 1: Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

Chương 2: Tổng quan 3

2.1 Tổng quan về nấm rơm 3

2.1.1 Giới thiệu chung về nấm rơm 3

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng nấm rơm 3

2.1.3 Quy trình sản xuất nấm rơm 3

2.1.4 Thu hoạch và chế biến nấm rơm 5

2.1.5 Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu nấm rơm 6

2.2 Khái niệm dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) một số quy định dư lượng HCBVTV trong nấm rơm 6

2.2.1 Khái niệm về dư lượng HCBVTV 6

2.2.2 Dư lượng tối đa cho phép – MRL (Maximum residue limit) 6

2.3 Chlorpyrifos, quy định MRL và phương pháp phân tích chlorpyrifos trong nông sản 7

2.3.1 Tổng quan về chlorpyrifos 7

2.3.2 Độc tính và cơ chế tác dụng 8

2.3.3 Tình hình sử dụng chlorpyrifos trên thế giới và Việt Nam 9

2.3.4 Quy định của một số tổ chức quốc tế và Việt Nam về dư lượng chlorpyrifos trong nông sản 10

2.3.5 Một số phương pháp phân tích dư lượng chlorpyrifos trong nông sản

11

2.4 Tổng quan phương pháp Quechers 12

2.4.1 Lịch sử hình thành và phát triển phương pháp Quechers 12

2.4.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp Quechers 13

2.4.3 Quy trình chung phân tích Quechers và các cải tiến của phương pháp

Quechers 14

2.5 Tổng quan về LC/MS/MS 17

2.5.1 Giới thiệu chung về HPLC 17

2.5.2 Đầu dò khối phổ - Đầu dò khối phổ MS/MS TQD 21

2.5.3 Đầu dò khối phổ ba tứ cực xevo TQD, kỹ thuật ghi phổ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring) 23

2.6 Thẩm định quy trình phân tích 25

2.6.1 Tầm quan trọng của thẩm định phương pháp 25

2.6.2 Nội dung thẩm định quy trình phân tích 25

Chương 3: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 31

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 31

3.1.1 Địa điểm thực hiện 31

3.1.2 Thời gian thực hiện 31

3.2 Phương tiện thực hiện 31

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ 31

3.2.2 Hóa chất, dung môi 32

3.3 Đối tượng nghiên cứu 32

3.4 Phương pháp nghiên cứu 33

3.5 Hoạch định thí nghiệm 33

3.5.1 Lựa chọn quy trình, cài đặt các thông số máy UPLC/MS/MS 33

3.5.2 Thẩm định quy trình định lượng chlorpyrifos 33

3.5.3 Áp dụng quy trình, phân tích một số mẫu nấm rơm trên địa bàn thành phố Cần Thơ 33

Chương 4: Thực nghiệm và kết quả 34

4.1 Lựa chọn quy trình, cài đặt thông số UPLC, TQD 34

4.1.1 Lựa chọn quy trình phân tích 34

4.1.2 Cài đặt thông số cho UPLC/MS/MS 36

4.1.3 Khảo sát cơ chế phân mảnh, chọn mảnh ion cho kỹ thuật ghi MRM 38 4.2 Thẩm định quy trình phân tích 41

4.2.1 Khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp 41

4.2.2 Khảo sát tính tuyến tính của đường chuẩn 42

4.2.3 Tìm giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 44

4.2.4 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 45

4.2.5 Khảo sát độ thu hồi của phương pháp 46

4.3 Kết quả phân tích mẫu nấm rơm trên địa bàn thành phố Cần Thơ 48

4.3.1 Mục đích 48

4.3.2 Tiến hành 48

4.3.3 Kết quả 49

Chương 5: Kết luận và kiến nghị 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Kiến nghị 50

DANH MỤC BẢNG

- -Bảng 2.1: Dư lượng tối đa MRL của một số loại thuốc BVTV trong nấm rơm theo tiêu chuẩn Codex Alimentarius Commission, 36 Th, tháng 7, 2013.[6] 7

Bảng 2.2: Dư lượng tối đa cho phép MRL của một số loại thuốc BVTV trong nấm rơm theo tiêu chuẩn Châu Âu EC 1107 / 2009 7

Bảng 2.3: Quy định dư lượng tối đa (MRL) của chlorpyrifos trong một số loại nông sản theo tiêu chuẩn Codex Alimentarius Commission, 36 Th, tháng 7, 2013.[6] 10

Bảng 2.4: Quy định dư lượng tối đa (MRL) của chlorpyrifos trong nấm theo tiêu chuẩn EC/212/2013 10

Bảng 2.5: Quy định dư lượng tối đa (MRL) chlorpyrifos trong một số loại nông sản ở Việt Nam theo tiêu chuẩn TCVN 5624-2 : 2009 10

Bảng 2.6: Sự không tương thích của hệ thống HPLC và khối phổ MS 21

Bảng 2.7: Quy định điểm IP đối với kỹ thuật MS / MS 27

Bảng 3.1: Thống kê địa điểm, số lượng, thời gian lấy mẫu tại các chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ 32

Bảng 4.1: Chương trình gradient dung môi 37

Bảng 4.2: Tổng quát năng lượng phân mảnh ion của chlorpyrifos 40

Bảng 4.3: Số điểm IP của chuẩn chlorpyrifos 1ppb 42

Bảng 4.4: Dãy chuẩn chlorpyrifos để xây dựng đường chuẩn 43

Bảng 4.5: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chuẩn chlorpyrifos 43

Bảng 4.6: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 45

Bảng 4.7: Kết quả độ thu hồi tại 5 ppb 45

Bảng 4.8: Kết quả độ thu hồi tại 10 ppb 47

Bảng 4.9: Độ thu hồi tại nồng độ 20 ppb 48

Bảng 4.10: Kết quả phân tích các mẫu nấm rơm tại các chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ 49

Bảng 4.11: Tổng quát kết quả phân tích mẫu nấm 49

DANH MỤC HÌNH

- -Hình 2.1: Công thức của chlorpyrifos 8

Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa Chlorpyrifos trong cơ thể 9

Hình 2.3: Quy trình phân tích bằng phương pháp Quechers truyền thống 15

Hình 2.4: Cấu trúc cơ bản của PSA 16

Hình 2.5: Cấu trúc cơ bản của C18 16

Hình 2.6: Mẫu so sánh quá trình làm sạch của PSA, C18 16

Hình 2.7: Tác dụng làm sạch của PSA, GCB và C18 trên nền rau 17

Hình 2.8: Sơ đồ hệ thống HPLC 17

Hình 2.9: Sơ đồ tạo C18 từ silicagel 20

Hình 2.10: Sơ đồ cơ chế phân mảnh của khối phổ MS/MS 22

Hình 2.11: Cấu tạo đầu dò khối phổ TQD của hãng Waters 23

Hình 2.12: Sơ đồ kỹ thuật tạo ion ESI 24

Hình 3.1: Hệ thống UPLC xevo TQD của Waters 31

Hình 4.1: Phổ đồ chuẩn chlorpyrifos 10 ppb trong acetonitrile 36

Hình 4.2: Cơ chế phân mảnh (1) của chlorpyrifos 38

Hình 4.3: Cơ chế phân mảnh (2) chlorpyrifos 39

Hình 4.4: Cơ chế phân mảnh (3) chlorpyrifos 39

Hình 4.5: Cơ chế phân mảnh (4) chlorpyrifos 40

Hình 4.6: Phổ đồ mẫu Blank của nấm rơm 41

Hình 4.7: Biểu đồ phương trình hồi quy của chuẩn chlorpyrifos 43

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Quechers: Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and safe (nhanh chóng,

dễ dàng, rẻ, hiệu quả, ổn định và an toàn)

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long

AOAC: Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức)

BNNPTNT: Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn

HCBVTV: Hóa chất bảo vệ thực vật

MRL: Maximum residue limit (dư lượng tối đa cho phép)

Codex Alimentarius Commission: Ủy ban thực phẩm quốc tế

FDA: Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

thuần túy và hóa học ứng dụng)

OP: Nhóm thuốc trừ sâu lân hữu cơ

LD50: Letalisdosis (liều gây chết trung bình)

EPA: Environmental Protection Agency (Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ)

EFSA: European Food safety Authority (Cục an toàn thực phẩm Châu Âu)

ADI (mg/kg bodyweight/day): acceptable daily intake (lượng tiêu thụ hàng ngày mà cơ thể chấp nhận được)

ArfD (mg/kg bodyweight): acute reference dose (liều cấp tính tham chiếu)

dSPE: Dispersive Solid-phase extraction (chiết phân tán pha rắn)

PSA: Primary secondary amine

GCB: Graphite carbon black

LOD: limit of detection (giới hạn phát hiện)

LOQ: limit of quantification (Giới hạn định lượng)

S/N: signal to noise ratio (tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu)

USP: dược điển mỹ

GC-ECD: Sắc ký khí ghép đầu dò bắt điện tử

UPLC-MS-MS: Sắc ký lỏng siêu hiệu năng với đầu dò hai lần khối phổ

IR: Infrared spectroscopy (phổ hồng ngoại)

TQD: Triple Quadrupole detector

SRM: Selected Reaction Monitoring

MRM: Multiple reaction monitoring

ESI: Electrospray ionization

IP: indenfitication point

ISO 17025: international standard organization (Tiêu chuẩn quốc tế về phòng thí nghiệm)

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

ĐBSCL có diện tích trồng lúa đứng đầu cả nước vì vậy sản lượng phụ phẩm rơm rạ trong quá trình sản xuất nông nghiệp là rất lớn Người nông dân tận dụng rơm rạ để trồng nấm đem lại thu nhập đáng kể và nâng cao đời sống của người dân Nhờ tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nghề trồng nấm rơm phát triển mạnh không chỉ phục vụ cho thị trường trong nước mà còn hướng đến xuất khẩu

Nấm rơm phát triển trong điều kiện ẩm ướt, thường xuyên bị sâu rầy và côn trùng tấn công Để bảo vệ năng suất nấm, người dân đã sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật phòng trừ sâu hại, trong đó nhóm lân hữu cơ được sử dụng phổ biến Theo danh sách hóa chất bảo vệ thực vật được phép đăng ký sử dụng của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (BNNPTNT) năm 2009, các sản phẩm thuốc trừ sâu thương mại chứa hoạt chất chlorpyrifos chiếm số lượng nhiều nhất trong nhóm thuốc trừ sâu lân hữu cơ

Dư lượng chlorpyrifos tồn đọng trong nấm rơm gây hại rất lớn đến sức khỏe của người sử dụng, ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương, giảm nội tiết

tố sinh sản, gây vô sinh, bạch tạng Ngoài ra, một số nghiên cứu dịch tễ học gần đây cho thấy chlorpyrifos có khả năng gây ung thư phổi và ung thư tiền liệt tuyến [1] Vì vậy kiểm soát dư lượng chlorpyrifos trong nấm rơm và các sản phẩm nông nghiệp là điều rất cần thiết Dược điển nhiều nước (Mỹ, Anh, Nhật Bản ), AOAC, tiêu chuẩn Châu Âu đã quy định mức dư lượng cho phép của chlorpyrifos trong thực phẩm và dược liệu

Để kiểm soát dư lượng thuốc trừ sâu đề tài “Ứng dụng Quechers khảo

sát dư lượng chlorpyrifos trong nấm rơm trên địa bàn thành phố Cần Thơ bằng UPLC/MS/MS” nhằm mục đích nâng cao chất lượng nấm rơm, hướng

đến xuất khẩu và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Tiến hành xây dựng và khảo sát phương pháp xác định dư lượng chlorpyrifos trong nấm rơm bằng kỹ thuật Quechers với hệ thống UPLC/ MS/

MS

Xác định dư lượng chlorpyrifos trong một số mẫu nấm rơm trên địa bàn thành phố Cần Thơ

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM RƠM [2,3]

2.1.1 Giới thiệu chung về nấm rơm

nhau có màu trắng xám, xám, đen kích thước đường kính cây nấm lớn, nhỏ tùy thuộc từng loại Ở các quốc gia vùng nhiệt đới rất thích hợp về nhiệt độ để nấm rơm sinh trưởng và phát triển Nhiệt độ thích hợp để nấm phát triển từ 30-32oC; độ ẩm nguyên liệu (cơ chất) 65-70%; độ ẩm không khí 80%; pH = 7, thoáng khí Nấm rơm sử dụng dinh dưỡng cellulose trực tiếp từ nguyên liệu trồng

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng nấm rơm

Nấm rơm giàu dinh dưỡng, 100 g nấm rơm khô chứa 21 g – 37 g đạm (thành phần đạm chứa hàm lượng cao, đầy đủ các acid amin cần thiết mà cơ thể không tự tổng hợp được) chất béo 2,1 g - 4,6 g, bột đường chiếm 9,9 g, chất xơ 21 g, các yếu tố vi lượng là Ca, Fe, P và các vitamine A, B1, B2, C, D, PP Nhờ giàu thành phần dinh dưỡng, nên nó là nguồn sử dụng để chế biến thành thực phẩm chức năng, làm món ăn, làm thuốc trong việc hỗ trợ trị liệu nhiều bệnh tật như các chứng rối loạn chuyển hóa, béo phì, rối loạn lipid máu, xơ vữa động mạch, tăng huyết áp và đái tháo đường

2.1.3 Quy trình sản xuất nấm rơm

2.1.3.1 Xử lý nguyên liệu

Rơm rạ được làm ướt bằng nước vôi (3,5 kg vôi hòa tan với 1000 lít nước), vun đống ủ khoảng 4 đến 6 ngày Nếu nguyên liệu quá ướt (khi vắt vài cọng rơm có nước chảy thành dòng) cần trải rộng ra mới đem trồng Rơm, rạ

đủ ướt (khi vắt vài cọng rơm nước chảy thành giọt) là tốt nhất Nếu rơm quá khô thì phải thêm nước vào đống ủ

2.1.3.2 Đóng mô cấy giống

Đặt khuôn (có thể vun thành luống không dùng khuôn) theo diện tích khu đất trồng Chiều ngang mặt mô từ 0,3 - 0,4 m, chiều cao từ 0,35 – 0,4 m

Trải một lớp rơm rạ vào khuôn dày 10 – 12 cm Cấy một lớp giống viền xung quanh cách mép khuôn 4 - 5 cm

Lượng giống cấy cho 1,2 m mô khoảng 200 - 250 g Mỗi lớp giống cấy xong dùng tay ấn chặt, nhất là xung quanh thành mô Trung bình một tấn rơm

rạ khô trồng được khoảng 90 m đến 100 m mô nấm

2.1.3.3 Chăm sóc mô nấm đã cấy giống

Tùy theo trồng nấm trong nhà hay ngoài trời mà có kỹ thuật chăm sóc khác nhau

Trồng trong nhà sau 3 đến 5 ngày không cần tưới nước, những ngày tiếp theo thấy rơm khô thì tưới nước xung quanh Nếu mật độ dày cần tưới hai đến

ba lượt nước trong một ngày Lượng nước tưới rất ít 0,1 lít cho 1,2 mét mô, nếu tưới nhiều nấm sẽ bị thối chân và chết ngay còn nhỏ Đến ngày thứ 7, 8 bắt đầu xuất hiện nấm con, 3 đến 4 ngày sau nấm phát triển nhanh chóng to bằng quả táo và bắt đầu nở dù

Đóng mô nấm ngoài trời thường bị các đợt mưa lớn, nắng nóng làm hư hỏng, vì thế cần che phủ thêm một lớp rơm rạ khô trên bề mặt mô nấm Lớp rơm rạ xếp theo một chiều, phủ theo kiểu lợp mái nhà Chiều dày 4 - 5 cm Tất

cả bề mặt của những mô ở mép ngoài khu vực trồng cũng cần che phủ bằng lớp rơm phủ áo, kiểm tra nếu thấy mô nấm bị khô có thể tưới trực tiếp lên lớp

áo phủ nhiều lần trong ngày, sao cho lớp rơm phía ngoài của mô nấm không bị mất nước

Các loại nấm mốc (mốc xanh, vàng, đen,…) loại này nguy hiểm, nguyên nhân có thể do nguyên liệu bị nhiễm bệnh từ trước Nhà xưởng vệ sinh không sạch sẽ, khu vực nuôi trồng ẩm thấp, đã trồng nấm nhiều lần,… Cần loại bỏ những mô nấm đã bị bệnh ra xa khu vực nuôi trồng thậm chí chôn sâu hoặc đốt để hạn chế nguồn bệnh lây lan Cách hiệu quả nhất là dùng hóa chất phun trực tiếp lên mô nấm trước giai đoạn gieo meo

Côn trùng phá hoại, gặm nhấm, chuột, gián, dế, sâu bọ… tấn công nấm rơm trong giai đoạn thu hoạch hoặc ăn meo nấm khi vừa mới gieo Tốt nhất là dùng thuốc để diệt côn trùng, bẫy diệt chuột, hoặc trộn hóa chất vào meo nấm khi gieo lên mô

2.1.4 Thu hoạch và chế biến nấm rơm

2.1.4.1 Thời gian và cách thu hoạch

Kể từ lúc trồng đến lúc thu hoạch đợt đầu là 15 đến 17 ngày Nấm ra rộ

từ ngày thứ 12 đến ngày thứ 15 Sau 7 đến 8 ngày tiếp theo thu hái nấm đợt 2

và kết thúc đợt nuôi trồng Thời gian từ lúc trồng đến khi thu hoạch khoảng 25 đến 30 ngày Hái nấm trong giai đoạn nấm hình trứng là tốt nhất để đảm bảo năng suất cao Vào những ngày nắng nóng, nấm phát triển rất nhanh vì vậy người trồng nấm cần phải thu hoạch nhanh để tránh hiện tượng nấm bung dù Năng suất nấm giao động từ 12 đến 20% so với nguyên liệu khô Năng suất nấm cao hay thấp tùy thuộc vào chất lượng meo giống, kỹ thuật nuôi trồng và yếu tố khí hậu

2.1.4.2 Cách chế biến nấm rơm

Nấm rơm có thể bảo quản, chế biến bằng nhiều cách khác nhau để phục

vụ cho nhu cầu của thị trường trong nước và xuất khẩu

 Chế biến nấm muối

Đun nước sôi, thả nấm tươi vào chần, dùng vỉ tre nén cho nấm chìm trong nước, đun to lửa cho sôi lại càng nhanh càng tốt Để sôi 5 - 7 phút, vớt nấm ra thả vào chậu nước lạnh, thay nước nhiều lần tới khi mát tay là được (có thể để vòi nước chảy liên tục) đảm bảo nấm rắn chắc, đổ nấm ra rổ để ráo nước Cho nấm đã chần vào túi nilon không thủng, chum vại hoặc can nhựa, một lớp nấm, một lớp muối theo tỷ lệ 1kg nấm, 0,3 kg muối khô, 0,2 lít dung dịch muối bão hòa Thời gian muối khoảng 15 ngày, nấm sẽ ổn định về chất lượng, khi đó chúng ta có thể đóng hộp và xuất khẩu

Chế biến nấm muối phục vụ cho xuất khẩu các thị trường châu Á, châu

Âu như Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ý,

 Chế biến nấm khô

Quy trình chế biến nấm khô đơn giản hơn nấm muối, nấm được phơi khô

có độ ẩm khoảng 13% mới đảm bảo chất lượng và bảo quản được lâu.Trung bình 10 kg nấm tươi cho 1,1 kg nấm khô Nấm khô có màu vàng rất đẹp, được tiêu thụ trong nước hoặc xuất khẩu sang các thị trường khó tính như Nhật, Châu Âu, Hoa Kỳ…

2.1.5 Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu nấm rơm[3]

Nước ta đứng thứ 3 thế giới về xuất khẩu nấm, theo số liệu thống kê của tổng cục hải quan, kim ngạch xuất khẩu nấm năm 2009 đạt 17 triệu USD, tăng 26,7% so với cùng kỳ 2008, riêng với nấm rơm đạt 8,4 triệu USD tăng 86,7%

so với năm 2008 Sản lượng nấm cả nước năm 2011 ước đạt khoảng 270 nghìn tấn tập trung ở khu vực trọng điểm là phía Bắc và phía Nam với 16 chủng loại nấm khác nhau (Cục Trồng trọt, 2011)

2.2 KHÁI NIỆM DƢ LƢỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT (HCBVTV), MỘT SỐ QUY ĐỊNH DƢ LƢỢNG HCBVTV TRONG NẤM RƠM

2.2.1 Khái niệm về dƣ lƣợng HCBVTV [4]

Dư lượng HCBVTV là lượng HCBVTV sử dụng còn tồn đọng trên nông sản sau khi thu hoạch, chế biến Dư lượng HCBVTV thường được tính bằng đơn vị miligam HCBVTV trên 1 kilogam (mg/kg) nông sản hoặc dược liệu

2.2.2 Dƣ lƣợng tối đa cho phép – MRL (Maximum residue limit) [5]

Dư lượng HCBVTV tối đa cho phép là lượng HCBVTV lớn nhất được phép tồn dư trong nông sản hay dược liệu mà không gây ảnh hưởng đến cơ thể người và vật nuôi khi sử dụng Dư lượng tối đa được viết tắt là MRL Tùy thuộc từng loại HCBVTV và nông sản khác nhau mà MRL cho phép khác nhau Để đảm bảo sự an toàn đối với sức khỏe người tiêu dùng các tiêu chuẩn quốc tế như CODEX, AOAC, FDA, tiêu chuẩn Châu Âu, Nhật… quy định MRL của HCBVTV trong nông sản nhập khẩu

Bảng 2.1: Dư lượng tối đa MRL của một số loại thuốc BVTV trong nấm rơm

Chlorpyrifos có tên theo IUPAC là

hóa chất Dow Agro Sciences (Hoa kỳ) với nhiều tên thương mại khác nhau như Brodan, Dowco 179, Dursban, Empire, Eradex, Lorsban, Piridane, Stipend

Hình 2.1: Công thức của chlorpyrifos

Chlorpyrifos là tinh thể màu trắng, mùi hôi, nhiệt độ nóng chảy trong

acid yếu Bị phân hủy trong môi trường kiềm Độ bền của hợp chất giảm theo

pH Chlorpyrifos không tan trong nước, tan tốt trong dung môi hữu cơ như (Acetone, acetonitrile, methylene chloride ) Chlorpyrifos được tổng hợp từ

3-Methylpyridine qua nhiều giai đoạn phức tạp để tạo ra pyridinol sau đó cho phản ứng với Diethylthiophosphoryl Chloride

3,5,6-Trichloro-2-2.3.2 Độc tính và cơ chế tác dụng [9,19]

Chlorpyrifos có khả năng gây ngộ độc cấp tính với liều lượng cao và gây

ra ngộ độc mãn tính nếu tiếp xúc trong một khoảng thời gian dài Chlorpyrifos rất độc hại với sự phát triển của thai nhi và trẻ em dù ở liều lượng rất nhỏ[9,19]

Trong 50 loại thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ (OP) được nghiên cứu thì chlorpyrifos có nguy cơ gây ung thư cao nhất

Theo tổ chức y tế thế giới chlorpyrifos được xếp vào nhóm độc II với

LD50 là 32 mg/kg đến 1000 mg/kg

Chlorpyrifos tác động chủ yếu lên hệ thần kinh trung ương, ức chế quá trình dẫn truyền xung thần kinh và gây rối loạn quá trình chuyển hóa của cơ thể Theo EPA Chlorpyrifos bị oxi hóa thành chlorpyrifos oxon sau đó bị thủy

phân thành 3,5,6 trichloro-2-pyridiol (TCP) liên kết vĩnh viễn với enzyme

acetylcholinesterase làm enzyme bị bất hoạt không gắn được với các thụ thể,

xung thần kinh truyền liên tục dẫn đến hiện tượng co giật ở người bị nhiễm độc Khoảng 70% các tế bào thần kinh bị ức chế theo cơ chế này

Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa Chlorpyrifos trong cơ thể

2.3.3 Tình hình sử dụng chlorpyrifos trên thế giới và Việt Nam[7]

Theo EPA 1987 - 1998 có khoảng 21 đến 24 triệu pound được sử dụng tại Hoa Kỳ mỗi năm Trong đó có khoảng 11 triệu pound được áp dụng cho các lĩnh vực phi nông nghiệp Công ty Dow đã đăng ký cung cấp chlorpyrifos thương mại cho gần 100 quốc gia và phục vụ hơn 8,5 triệu hecta cây trồng mỗi năm

Ở Hoa Kỳ hầu hết các sản phẩm diệt trừ mối có chứa chlorpyrifos đều bị cấm sử dụng từ 31/12/2005 Năm 2009, Singapore ban hành luật hạn chế sử dụng chlorpyrifos trong thuốc diệt mối Hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có quy định về việc hạn chế sử dụng chlorpyrifos trong HCBVTV và thuốc diệt côn trùng

Năm 2006, EPA đã quy định dư lượng chlorpyrifos trong một số loại nông sản dưới 0,01 ppm và trong nước là nhỏ hơn 2 ppb

Năm 2012, EFSA đã đưa ra các chỉ số ADI là 0,01 mg/kg thể trọng/ngày

và ARfD là 0,1 mg/kg thể trọng

Ở Việt Nam theo danh sách HCBVTB được đăng ký sử dụng của bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn năm 2009 cho thấy chlorpyrifos có số

lượng sản phẩm nhiều nhất trong nhóm lân hữu cơ và nó được sử dụng phổ biến ở nước ta hiện nay

2.3.4 Quy định của một số tổ chức quốc tế và Việt Nam về dƣ lƣợng chlorpyrifos trong nông sản[6,7,10]

Bảng 2.3: Quy định dư lượng tối đa (MRL) của chlorpyrifos trong một số loại nông sản theo tiêu chuẩn Codex Alimentarius Commission, 36 Th, tháng 7,

Quả lê, Hạt tiêu, cà chua, cà rốt 0,5

Củ hành, bắp cải, súp lơ, khoai tây 0,05

2.3.5 Một số phương pháp phân tích dư lượng chlorpyrifos trong nông sản

MoO PO

NH H

MoO NH

4

3 4

3

Sắc đồ màu khi so sánh với các dung dịch màu tham chiếu cho phép xác định được hàm lượng phosphate trong mẫu

 Hạn chế của phương pháp trắc quang

Trong giai đoạn phá mẫu toàn bộ phosphorous trong mẫu được chuyển thành orthophosphate nên không thể xác định chính xác từng hoạt chất, mà chỉ

có thể phân tích toàn bộ phosphorous có trong mẫu

Các yếu tố phức tạp của nền mẫu ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang và khả năng tạo phức màu

Không thể phân tích dư lượng dưới dạng vết nồng độ ppb, hoặc nhỏ hơn

2.3.5.2 Phương pháp chiết lỏng − lỏng với CH 2 Cl 2 (AOAC 990.06)

loại bỏ phần nước lấy CH2Cl2 làm khô bằng Na2SO4, chiết chuyển pha với 5ml

Methyl-tert-butyl ether Đem phân tích bằng GC-ECD, hoặc GC/MS

2.3.5.3 Phương pháp chiết lỏng-lỏng với n-Hexane [12]

3 (g) ml mẫu

↓ Thủy phân trong 175µl acid acetic 2,5 N bão hòa trong NaCl

(vortex 10 phút)

↓

↓ Lắc 1h, ly tâm 20 phút

↓

↓ Định mức 50 µl toluene , phân tích GC/MS

2.3.5.4 Ưu, nhược điểm của phương pháp chiết lỏng - lỏng

Chiết được chất phân tích có hàm lượng thấp (ppb) hoặc nhỏ hơn, dịch chiết sạch, ít tạp, phân tích bằng các thiết bị có đầu dò nhạy như ECD, MS, MS/MS… cho kết quả rất tốt

Hạn chế là tốn nhiều thời gian cho quá trình chuẩn bị mẫu, sử dụng một lượng lớn dung môi chứa chlor, hoặc hexane gây độc hại cho nhân viên phân tích

Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp chiết lỏng - lỏng về thời gian phân tích, bảo vệ sức khỏe của nhân viên, bảo vệ môi trường, phương pháp Quechers được sử dụng và cải tiến quá trình làm sạch bằng vi chiết trên nền pha rắn dSPE ngày càng phổ biến ở các phòng thí nghiệm được trang bị các dụng cụ phân tích có độ nhạy cao như GC/MS/MS, LC/MS/MS,…

2.4 TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUECHERS

2.4.1 Lịch sử hình thành và phát triển phương pháp Quechers[13,14 ]

Ban đầu, phương pháp Quechers được tìm ra bởi Michelangelo Anastassiades, Steven Lehotay và các cộng sự để phân tích một số loại thuốc

thú y Phương pháp Quechers được trình bày lần đầu tiên vào tháng 2 năm

2002 tại hội thảo dư lượng thuốc trừ sâu Châu Âu, xuất bản lần đầu vào 2003 Năm 2007 Lehotay đã cải tiến phương pháp sử dụng đệm acetate để điều chỉnh pH = 6 và Quechers được chính thức đưa vào tiêu chuẩn AOAC 2007.01

citrate để chiết một dãy rộng các loại thuốc trừ sâu khác nhau, và các loại thuốc trừ sâu phân cực Bên cạnh đó việc cải tiến phương pháp sử dụng dSPE, C18 và GCB giúp quá trình làm sạch mẫu tốt hơn mà không ảnh hưởng đến chất phân tích Phương pháp Quechers được đưa vào tiêu chuẩn châu Âu EN 15.662

Hiện nay phương pháp Quechers được sử dụng rộng rãi trên thế giới, phân tích dư lượng hơn 400 loại thuốc bảo vệ thực vật đang mở rộng phân tích

dư lượng các loại thuốc kháng sinh

2.4.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp Quechers [15]

2.4.2.2 Hạn chế của Quechers

Sử dụng Quechers đòi hỏi detector phải có độ nhạy cao như MS/MS, huỳnh quang, ECD,

Dung môi sử dụng là acetonitrile nên không phù hợp với GC Phải có quá trình chiết với dung môi dễ bay hơi như n-hexane, toluene trước khi đưa vào phân tích GC

Hiệu suất thu hồi chịu ảnh hưởng nhiều bởi pH vì vậy cần điều chỉnh pH phù hợp cho quá trình chiết

2.4.3 Quy trình chung phân tích Quechers và các cải tiến của phương pháp Quechers

Phương pháp Quechers gồm có 2 giai đoạn chính là quá trình chiết và quá trình làm sạch

Quá trình chiết sử dụng dung môi acetonitrile hoặc hỗn hợp acetonitrile với formic acid, acetic acid, đệm acetate, đệm citrate với các tỉ lệ khác nhau tùy theo pH của chất cần phân tích và nền mẫu Bên cạnh đó còn sử dụng thêm

nền mẫu và chất cần phân tích

2.4.3.1 Phương pháp Quechers truyền thống [ 14 ]

Cân 10 gam mẫu cho vào ống 50ml

Spike nội chuẩn hoặc hỗn hợp nội

Hình 2.3: Quy trình phân tích bằng phương pháp Quechers truyền thống

NaCl

Lấy 1ml cho vào vial

Phân tích HPLC/GC-MS/MS

2.4.3.2 Cải tiến của phương pháp Quechers

Cải tiến quá trình chiết: Sử dụng đệm acetate và đệm citrate để ổn định

pH trong quá trình chiết

để tăng hiệu quả làm sạch, kit Quechers được thêm vào GCB và C18

Hình 2.4: Cấu trúc cơ bản của PSA

Vial 0: Mẫu xử lý chưa qua làm sạch

Vial 1: Mẫu xử lý được làm sạch PSA và C18

Vial 2,3: Mẫu chỉ làm sạch bằng PSA

100 mg PSA 12.5

mg GCB

100 mg PSA

100 mg

C18

12.5 mg GCB

100 mg PSA

100 mg

C18 25 mg GCB

100 mg PSA

100 mg

C18

50 mg GCB

2.5 TỔNG QUAN VỀ LC/MS/MS

2.5.1 Giới thiệu chung về HPLC [ 16,18 ]

 Nguyên tắc hoạt động của máy HPLC

Mẫu sau khi được tiêm vào cột sẽ được pha động kéo qua cột Dựa vào khả năng tương tác giữa các chất có trong nền mẫu với pha tĩnh và pha động

mà chúng được tách khỏi nhau Sau khi ra khỏi cột, dung dịch mẫu phân tích

sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò

 Cấu tạo của hệ thống HPLC

Bình dung môi, bộ phận đuổi khí, hệ thống bơm , bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký, detector, bộ phận ghi nhân tín hiệu

Hình 2.8: Sơ đồ hệ thống HPLC

2.5.1.1 Hệ thống bình chứa dung môi

Bình làm bằng thủy tinh, có hệ thống ống dẫn dung môi, ở đầu các ống

có gắn nút bằng kim loại để lọc dung môi, nút được đặt trong một giếng ở đáy bình để đảm bảo hút đến giọt dung môi cuối cùng

Hệ thống pha động thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100 %

Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm), dung môi phải được đánh siêu âm khoảng 45 đến 60 phút hoặc cho dòng khí He sục qua với vận tốc 300 ml/ phút để loại hết bọt khí lẫn trong dung môi vì bọt khí sẽ làm giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền

 Có hai cách dùng pha động rửa giải

Đẳng dòng (isocratic): thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại được đựng trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi)

Pha động có thể là nước, các loại dung dịch đệm (pha trong nước), methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp các loại trên Pha động sẽ vận chuyển và tương tác với chất cần phân tích, do đó chúng giữ vai trò quan trọng trong việc tách các chất phân tích

2.5.1.3 Hệ thống bơm

xevo của waters bơm hoạt động với áp suất lên đến 14000 psi Tốc độ dòng 0,5 đến 4 ml/phút Có hai kiểu bơm là bơm trực tiếp và bơm màng nén ép tự động UPLC với hệ thống bơm gradient đa kênh cho phép tự động hóa trong việc lựa chọn kênh dung môi để giải ly theo chế độ tăng dần tuyến tính

2.5.1.4 Hệ thống tiêm mẫu vào máy

Có 2 cách đưa mẫu vào trong cột: tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay )

và tiêm mẫu tự động (Autosample)

Tiêm mẫu tự động: mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay đầu cột (không cần phải dừng dòng) bằng một van tiêm

có vòng chứa mẫu Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,5-20 µl Khi dùng van tiêm sẽ dễ dàng tự động hóa, phần mềm máy tính dễ dàng điều khiển và kiểm soát hệ thống bơm mẫu tự động Sai số tiêm mẫu dùng van khoảng 0,5%

Tiêm mẫu thủ công: mẫu được bơm bằng tiêm qua tấm đệm ở đầu cột Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao Cách tiêm này

có độ lặp lại thấp, sai số lớn hơn nhiều so với khi dùng van tiêm

2.5.1.5 Cột sắc ký

Cột HPLC được làm bằng thép không gỉ, thường dài 10-15 cm và có đường kính bên trong 2,1- 4,6 mm có trên 10.000 mâm lý thuyết Chất phân tích được cho đi qua cột bảo vệ để loại bỏ tạp bẩn trước khi vào cột sắc ký Cột HPLC được nhồi với rất nhiều loại pha tĩnh khác nhau: pha thường, pha đảo, pha tạo nối, cột trao đổi ion, cột sắc ký lọc gel với UPLC các hạt silicagel làm pha tĩnh có kích thướt rất nhỏ, UPLC xevo TQD với kích thướt hạt của pha tĩnh là 1,7µm

nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH

gắn vào