Triển khai mô hình gây viêm loét đại tràng trên động vật thực nghiệm bằng acid acetic

Hình ảnh đại thể đại tràng và điểm tổn thương đại thể sau khi gây viêm trên chuột nhắt trắng .... gây viêm loét đại tràng chuột nhắt trắng 28 3.2 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ AA lên

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VĂN THỊ KIM CHI

MÃ SINH VIÊN: 1201058

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY VIÊM LOÉT ĐẠI TRÀNG TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHỆM BẰNG ACID ACETIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VĂN THỊ KIM CHI

MÃ SINH VIÊN: 1201058

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY VIÊM LOÉT ĐẠI TRÀNG TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHỆM BẰNG ACID ACETIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Thùy Dương

2 ThS Ngô Thanh Hoa

Nơi thực hiện:

Bộ môn Dược lực

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới

Ts Nguyễn Thùy Dương, Ths Ngô Thanh Hoa những người thầy đã luôn tận

tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn DS Đinh Đại Độ và DS Đinh Thị Kiều Giang là

những anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược lực đã trực tiếp tham gia và giúp đỡ

em trong thời gian nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng các bộ môn, phòng ban khác của Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu

Trong quá trình thực hiện đề tài, em còn nhận được sự giúp đỡ, ý kiến đóng góp từ các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Xin cảm ơn các anh chị, bạn bè đã và đang nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược lực đã luôn đồng hành, hỗ trợ, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng hộ và chia sẻ khó khăn, động viên em thực hiện khóa luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Văn Thị Kim Chi

MỤC LỤC MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Bệnh viêm loét đại tràng 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Dịch tễ 2

1.1.3 Nguyên nhân gây bệnh 2

1.1.4 Sinh lý bệnh 4

1.1.5 Chẩn đoán bệnh viêm loét đại tràng 6

1.1.6 Thuốc điều trị viêm loét đại tràng 7

1.2 Các mô hình gây viêm đại tràng bằng hóa chất 9

1.2.1 Mô hình gây viêm loét đại tràng bằng dextran sulphat natri (DSS) 10

1.2.2 Mô hình gây viêm loét đại tràng bằng acid trinitrobenzene sulfonic (TNBS) 13

1.2.3 Mô hình gây viêm loét đại tràng bằng oxazolon 14

1.2.4 Mô hình gây viêm loét đại tràng bằng acid acetic (AA) 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 18

2.1.1 Động vật nghiên cứu 18

2.1.2 Thuốc thử và hóa chất 18

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 18

2.2 Nội dung và thiết kế nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Triển khai mô hình viêm loét đại tràng bằng acid acetic trên chuột nhắt trắng 20

2.3.2 Triển khai mô hình viêm loét đại tràng bằng acid acetic trên chuột cống

trắng 22

2.3.3 Thẩm định mô hình với sulfasalazin 23

2.4 Phương pháp xử lí số liệu 27

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28

3.1 Kết quả triển khai mô hình viêm loét đại tràng bằng acid acetic trên chuột nhắt trắng 28

3.1.1 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ acid acetic đến tỷ lệ chết trên chuột nhắt trắng sau khi gây viêm loét đại tràng 28

3.1.2 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ acid acetic đến đại thể đại tràng chuột nhắt trắng 29

3.1.3 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ acid acetic đến điểm tổn thương đại thể chuột nhắt trắng 30

3.2 Kết quả triển khai mô hình mô hình viêm loét đại tràng bằng acid acetic trên chuột cống trắng 31

3.2.1 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ acid acetic đến tỷ lệ chết trên chuột cống trắng sau khi gây viêm loét đại tràng 31

3.2.2 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ acid acetic đến đại thể đại tràng chuột cống trắng 32

3.2.3 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ acid acetic đến điểm tổn thương đại thể chuột cống trắng 32

3.3 Kết quả thẩm định mô hình với sulfasalazin 34

3.3.1 Ảnh hưởng của sulfasalazin lên tỉ lệ khối lượng/chiều dài đại tràng 34

3.3.2 Ảnh hưởng của sulfasalazin lên hình ảnh đại thể đại tràng 35

3.3.3 Ảnh hưởng của sulfasalazin đến điểm tổn thương trên đại thể đại tràng 36 3.3.4 Ảnh hưởng của sulfasalazin đến điểm tổn thương lên cấu trúc vi thể đại tràng 37

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 41

4.1 Bàn luận về kết quả triển khai mô hình viêm loét đại tràng bằng acid acetic trên chuột nhắt trắng 41

4.1.1 Tỷ lệ chết sau khi gây viêm trên chuột nhắt trắng 42

4.1.2 Hình ảnh đại thể đại tràng và điểm tổn thương đại thể sau khi gây viêm trên chuột nhắt trắng 43

4.2 Bàn luận về kết quả triển khai mô hình viêm loét đại tràng bằng acid acetic trên chuột cống trắng 44

4.2.1 Tỷ lệ chuột chết sau khi gây viêm trên chuột cống trắng 45

4.2.2 Hình ảnh đại thể đại tràng và điểm tổn thương đại thể sau khi gây viêm trên chuột cống trắng 45

4.3 Về kết quả thẩm định mô hình với sulfasalazin 46

4.3.1 Tỷ lệ khối lượng/chiều dài đại tràng 47

4.3.2 Hình ảnh đại thể đại tràng và điểm tổn thương đại thể 47

4.3.3 Cấu trúc vi thể đại tràng 48

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

5- ASA 5 – Aminosalicylic

CRC Colorectal cancer (Ung thư đại trực tràng )

IBD Inflammatory Bowel Disease (Bệnh viêm ruột)

IECs Intestinal epithelial cell (Tế bào biểu mô ruột)

NKT Natural killer T (Tế bào diệt tự nhiên)

NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drug ( Thuốc chống viêm

không steroid) ROS Reactive Oxygen Species ( Gốc chứa oxy hoạt hóa)

TNBS Trinitrobenzene sulfonic acid

UC Ulcerative colitis (Bệnh viêm loét đại tràng)

gây viêm loét đại tràng chuột nhắt trắng

28

3.2 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ AA lên điểm tổn thương đại

thể đại tràng chuột nhắt trắng

30

3.3 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ AA lên tỷ lệ chết sau khi

gây viêm loét đại tràng chuột cống trắng

31

3.4 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ AA đến điểm tổn thương

trên đại thể đại tràng chuột cống trắng

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Tên hình Trang

2.2 Quy trình gây viêm loét đại tràng trên chuột nhắt trắng 21 2.3 Quy trình gây viêm loét đại tràng trên chuột cống trắng 23 2.4 Quy trình thẩm định mô hình với sulfasalazin 24 3.1 Ảnh hưởng của thể tích và nồng độ AA trên hình ảnh đại

Hiện nay, có nhiều mô hình viêm loét đại tràng được triển khai trên thế giới để đánh giá tác dụng của thuốc điều trị UC [47] Trong đó, mô hình gây viêm loét đại tràng bằng hóa chất thường được sử dụng rộng rãi vì tính đơn giản, dễ thực hiện, dễ dàng kiểm soát liều hoá chất ảnh hưởng đến mức độ tổn thương đại tràng Mô hình này có thể gây ra bởi nhiều tác nhân như: dextran sulphat natri, acid trinitrobenzen sulfonic, oxazolon, acid acetic Các tác nhân này đều mô phỏng bệnh cảnh viêm loét đại tràng [60] Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu chưa tìm thấy mô hình gây viêm loét đại tràng đã được triển khai Trong các tác nhân gây viêm loét đại tràng, acid acetic thường được sử dụng vì mô phỏng được đặc điểm đặc trưng bệnh cảnh

UC ở người, tính sẵn có, chi phí thấp, dễ sử dụng [30]

Nhằm cung cấp một mô hình viêm loét đại tràng để áp dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc mới từ nguồn nguyên liệu sinh học trong điều trị viêm loét đại tràng

ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài “Triển khai mô hình gây viêm loét đại

tràng trên động vật thực nghiệm bằng acid acetic” với mục tiêu:

Triển khai được mô hình gây viêm loét đại tràng bằng acid acetic trên động vật thực nghiệm phù hợp với điều kiện thực nghiệm tại Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh viêm loét đại tràng

1.1.1 Định nghĩa

Viêm loét đại tràng (Ulcerative colitis –UC) còn gọi là viêm loét đại trực tràng chảy máu, là bệnh viêm mạn tính, có tính chất tự miễn, gây loét và chảy máu đại trực tràng, gây tổn thương lan tỏa lớp niêm mạc và dưới niêm mạc, vị trí chủ yếu ở trực tràng và giảm dần cho đến đại tràng phải [1]

UC và bệnh Crohn (Cronh disease- CD) là hai rối loạn viêm đường ruột của bệnh viêm ruột (Inflammatory Bowel Disease- IBD) [37] Hai bệnh này có một số đặc điểm lâm sàng, X-quang và giải phẫu bệnh khác nhau nhưng vẫn tương đối giống nhau về nguyên nhân gây bệnh, cơ chế bệnh sinh và hướng điều trị [4] Do

đó, các nghiên cứu trên thế giới vẫn chưa phân biệt hoàn toàn hai bệnh UC và CD

mà thường được thực hiện chung

1.1.2 Dịch tễ

Hiện tại, tỷ lệ mắc UC cao nhất ở Châu Âu và Bắc Mỹ, tương ứng 24,3 và 19,2 trên 100.000 dân Ở Châu Á và Trung Đông tỷ lệ này là 6,3 trên 100.000 dân [37] Các nghiên cứu gần đây chỉ ra tỷ lệ này ngày càng tăng ở những khu vực mà trước đây có tỷ lệ mắc bệnh UC thấp như: Tây-Nam Châu Á Bệnh này hay gặp ở lứa tuổi từ 15-40 tuổi, có tính chất gia đình Tỉ lệ mắc bệnh UC giữa nam và nữ là tương đương nhau [37], [43]

Ở Việt Nam đã có công bố về bệnh UC, song tỷ lệ mắc bệnh chưa có nghiên cứu đầy đủ để đưa ra số liệu chính xác Trong những năm gần đây nhờ có nội soi, bệnh đã được phát hiện nhiều hơn, song kết quả điều trị còn hạn chế vì tính chất dễ tái phát của bệnh [6]

1.1.3 Nguyên nhân gây bệnh

Nguyên nhân gây bệnh hiện nay vẫn chưa được xác định rõ ràng Một số yếu

tố được coi là nguy cơ gây bệnh như:

 Yếu tố di truyền:

Tiền sử gia đình là yếu tố nguy cơ độc lập dẫn đến sự phát triển IBD Khoảng 5-10% bệnh nhân IBD có tiền sử gia đình mắc bệnh IBD Đặc biệt, gia đình có bố

và mẹ mắc IBD thì nguy cơ mỗi đứa trẻ sinh ra mắc bệnh khoảng 36 % Tỷ lệ mắc IBD cũng tăng lên trong trường hợp bà mẹ mang song thai cùng trứng hoặc khác trứng [37]

Các nghiên cứu phân tử cũng đưa ra mối liên quan giữa di truyền gen và UC Trong đó, nghiên cứu tương quan toàn bộ nhiễm sắc thể (Genome-Wide Association Studies) đã xác định 47 allen có nguy cơ mắc UC [43], [47] Một số bệnh miễn dịch và gen di truyền liên quan đến bệnh như viêm khớp dạng thấp (TNFAIP3), bệnh vẩy nến (IL23R, IL12B), viêm cột sống dính khớp (IL23R), đái tháo đường typ 1 (IL10, PTPN2), hen (ORMDL3), lupus ban đỏ hệ thống (TNFAIP3, IL10) [37]…

 Yếu tố môi trường và một số yếu tố khác

Một số yếu tố môi trường và một số yếu tố khác như [37], [41]:

- Hút thuốc: Những người hút thuốc có nguy cơ mắc UC thấp hơn những người không hút thuốc 40%, do nicotin có tác dụng ức chế hoạt động của Th2 dẫn tới giảm nồng độ của IL-1 và IL-8 Thậm chí, hút thuốc lá còn được coi là một yếu tố làm thuyên giảm triệu chứng trong những đợt tiến triển của bệnh

- NSAID: Những bệnh nhân được chẩn đoán xác định IBD thì việc sử dụng NSAID có liên quan đến quá trình khởi phát và bùng phát bệnh

- Vệ sinh: Tỷ lệ UC thường có xu hướng cao hơn ở các nước phát triển, liên quan đến điều kiện môi trường sống

- Stress tinh thần: Yếu tố tinh thần rất quan trọng Stress có thể làm khởi phát bệnh, dễ tái phát bệnh và làm bệnh tiến triển nặng hơn

- Vi khuẩn: Các bệnh lý viêm dạ dày- đại tràng do một số tác nhân gây bệnh

như Salmonella, Shigella, Campylobacter spp, Clostridium difficile làm tăng nguy

cơ IBD gấp 2-3 lần

- Tình trạng sử dụng kháng sinh: Tần suất sử dụng kháng sinh cao có liên quan đến tăng nguy cơ phát triển IBD

1.1.4 Sinh lý bệnh

Cho đến nay, các nhà nghiên cứu chưa đưa ra một cơ chế chính xác giải thích cho bệnh IBD Các mô hình nghiên cứu đã được đưa ra như đột biến tích hợp, biến đổi gen…chỉ ra rằng sinh lý bệnh IBD rất phức tạp [47], [60] Từ những mô hình nghiên cứu đó, các nhà nghiên cứu nhận thấy sinh lý bệnh IBD liên quan đến hệ vi sinh vật cộng sinh đường ruột, tế bào biểu mô ruột và tế bào miễn dịch

Trong điều kiện sinh lý bình thường, tồn tại một thế cân bằng trong tế bào giữa 3 thành phần bao gồm hệ vi sinh vật cộng sinh, tế bào biểu mô ruột (intestinal epithelial cells – IECs) và các tế bào miễn dịch trong mô

Trong bệnh IBD, dưới tác động của yếu tố môi trường và các yếu tố di truyền,

3 thành phần trên thay đổi và tương tác với nhau dẫn đến phá vỡ cân bằng trong tế bào Hệ sinh vật cộng sinh trong ruột có sự tăng lên của các vi sinh vật gây bệnh (ví

dụ, Proteobacteria như Escherichia coli) hoặc giảm đi của vi sinh vật có tác dụng chống viêm (Firmicutes như Faecalibacterium prausnitzii) Các vi khuẩn này có thể

xâm nhập vào tế bào biểu mô niêm mạc bị rò rỉ Từ đó tạo ra tương tác với hệ thống miễn dịch niêm mạc tự nhiên và đáp ứng thông qua thụ thể Toll-like biểu hiện trên

cả tế bào biểu mô và tế bào trình diện kháng nguyên Quá trình này kích hoạt CD4+

và CD8+ bên trong biểu mô và màng mô liên kết, tiết ra số lượng quá mức các cytokin viêm so với các cytokin chống viêm Một số cytokin kích hoạt các tế bào viêm khác (đại thực bào và tế bào B), một số cytokin khác gián tiếp chiêu mộ tế bào lympho, bạch cầu viêm và các tế bào đơn nhân từ dòng máu chảy vào tuyến ruột qua các tương tác giữa các receptor nội bào với bạch cầu (ví dụ α4β7 integrin) và nội mạch (ví dụ, MadCAM1) Tế bào CD4 + T helper (Th) thúc đẩy quá trình viêm của 3 loại tế bào chính Th1, Th2 và Th17, có thể có liên quan đến viêm đại tràng trong mô hình động vật và IBD ở con người Trong đó, Th1 liên quan đến CD; tế bào Th2 và các tế bào T diệt tự nhiên có liên quan tiết ra IL-13, gây ra viêm niêm mạc bề mặt giống UC ở người trong mô hình động vật và tế bào Th17 gây ra hóa ứng động bạch cầu Tế bào Th1 (tiết ra IFN-γ) được khởi phát bởi IL-12, một cytokin chính trong quá trình sinh lý bệnh của viêm niêm mạc Tế bào Th2 (tiết ra

IL-4 , IL-5, IL-13) được gây cảm ứng bởi IL-4, IL-23 và tế bào Th17 (tiết ra IL-17, IL-21) được hoạt hóa bởi IL-6, TGF-β Ngoài ra, IL-23 ức chế chức năng của tế bào

T điều tiết Các đại thực bào kích hoạt tiết ra TNF và IL-6 Sự giải phóng các tế bào viêm này được điều chỉnh bởi các con đường khác nhau liên quan đến viêm như con đường NF-κB và MAPK và con đường JAK / STAT [30], [37], [64]

Từ quá trình kích hoạt tế bào T dẫn đến các tác động của các chất trung gian gây viêm Các cytokin viêm như IL-1, IL-6, và TNF có tác động đa dạng lên mô Chúng thúc đẩy sự hình thành sợi, sản sinh collagen, kích hoạt các protein mô và tạo ra các chất trung gian gây viêm khác Mặt khác, chúng cũng kích hoạt các yếu tố đông máu trong quá trình đông máu cục bộ (ví dụ, tăng sản xuất yếu tố von Willebrand) Quá trình này không được điều hòa dẫn đến mất cân bằng giữa các chất trung gian gây viêm và chống viêm [37]

Hình 1.1 Sinh lý bệnh học của IBD

Từ những đặc điểm sinh lý bệnh trên dẫn đến những những tổn thương trực tràng với những hình ảnh đại thể và vi thể đặc trưng như [6]:

đại- Đại thể

- Hình ảnh tổn thương thường gặp ở trực tràng chiếm tỷ lệ hơn 90%, có thể gặp ở đại tràng Sigma, đại tràng xuống, các vùng khác ít gặp hơn, tuy nhiên cũng có trường hợp tổn thương lan tỏa khắp đại tràng

- Hình ảnh nổi bật: xung huyết, loét nông hoặc sâu, chảy máu ở niêm mạc và dưới niêm mạc

- Sau nhiều đợt tái phát, tổ chức xơ phát triển làm mất các nếp gấp đại tràng , làm hẹp lòng đại tràng hoặc phình giãn đại tràng, xuất hiện giả polyp

 Vi thể

Tổn thương từ lớp niêm mạc đến lớp dưới niêm mạc

- Thâm nhiễm bạch cầu hạt ở lớp biểu mô, hủy hoại tế bào biểu mô tạo nên các ổ loét

- Thâm nhiễm bạch cầu hạt vào các hốc tạo nên ổ apxe nhỏ

- Hình dạng mạch máu bất thường: xung huyết xuất hiện ở niêm mạc, dưới niêm mạc

1.1.5 Chẩn đoán bệnh viêm loét đại tràng

Chẩn đoán xác định dựa vào các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng Trong

đó, cận lâm sàng đóng vai trò quan trọng và quyết định đến chẩn đoán bệnh [1], [6]

Hình ảnh nội soi được phân loại giai đoạn bệnh theo Baron

+ Giai đoạn 0: niêm mạc nhạt màu, các mạch máu dưới niêm mạc mỏng, thưa thớt, thậm chí hình ảnh nội soi bình thường

+ Giai đoạn 1: niêm mạc lần sần, sung huyết đỏ, các mạch máu chỉ nhìn thấy một phần

+ Giai đoạn 2: niêm mạc mất nếp ngang, có những ổ loét đặc trưng, không nhìn thấy mạch máu dưới niêm mạc, dễ chảy máu khi đèn chạm phải

+ Giai đoạn 3: niêm mạc phù nề, sưng huyết, có những ổ loét lớn, chảy máu niêm mạc tự phát là đặc điểm quan trọng của giai đoạn này

+ Xuất huyết niêm mạc, dưới niêm mạc, các mạch máu có sung huyết

+ Nhiều ổ loét có giả mạc, mủ bao phủ

1.1.6 Thuốc điều trị viêm loét đại tràng

Điều trị UC bao gồm điều trị triệu chứng, điều trị đặc hiệu và chế độ nghỉ ngơi, ăn uống Trong giai đoạn bệnh tiến triển, bệnh nhân cần nghỉ ngơi tuyệt đối, hạn chế ăn các thức ăn nhiều xơ và nhiều bã và cần bổ trợ chế độ dinh dưỡng bằng đường tĩnh mạch thể nặng Điều trị triệu chứng bao gồm điều trị thiếu máu, bù nước

và điện giải trong ỉa chảy, bù kali nếu kali máu giảm do phân lỏng và nhiều chất nhầy [6] Các thuốc điều trị đặc hiệu bao gồm dẫn xuất của acid -5 aminosalicy (5- ASA), glucocorticoid, thuốc ức chế miễn dịch

 Dẫn xuất của acid 5 – Aminosalicylic (5- ASA)

- Các thuốc trong nhóm: sulfasalazin, balsalazid, olsalazin, mesalazin

- Cơ chế và tác dụng: Cơ chế tác dụng của 5-ASA chưa được xác định rõ ràng, một số cơ chế đã được đưa ra như ức chế sản xuất IL-1 và TNF, ức chế con đường lipoxygenase, loại các gốc tự do hoặc chất oxy hóa, và ức chế NF- kB một yếu tố phiên mã quan trọng để sản xuất các chất trung gian gây viêm [13]

- Chỉ định: là thuốc đầu tay để điều trị UC mức độ nhẹ và trung bình [12], [13], [41]

- Đường dùng: đường uống hoặc dùng tại chỗ qua đường hậu môn vào trực tràng, đại tràng [12], [45]

- Tác dụng không mong muốn: buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy Sufasalazin có nhiều tác dụng phụ hơn do liên quan đến thành phần sulfapyridin gây ra rối loạn về huyết học bao gồm tăng bạch cầu [45]

- Chỉ định: dùng trong trường hợp bệnh UC tiến triển mức độ trung bình và nặng, hoặc kết hợp với 5-ASA [12]

- Đường dùng: đường uống, dùng tại chỗ qua đường hậu môn vào trực tràng, đại tràng và đường tiêm tĩnh mạch [12], [13]

- Tác dụng không mong muốn: nguy cơ nhiễm trùng, giữ nước, mất cân bằng điện giải (hạ kali máu), tăng huyết áp, tăng nồng độ glucose máu, tăng cảm giác hưng phấn [45]

 Thuốc ức chế miễn dịch

- Thuốc sử dụng: Azathioprin, Cyclosporin, mercaptopurin

- Cơ chế và tác dụng: làm thay đổi đáp ứng miễn dịch của cơ thể

Azathioprin và mercaptopurin có thể làm giảm triệu chứng và duy trì tình trạng này lâu dài

Cyclosporin cũng có thể giảm triệu chứng trong trường hợp viêm loét đại tràng trầm trọng liên quan đến đề kháng với corticosteroid [45]

- Chỉ định: dùng trong trường hợp UC mức độ trung bình và nặng, hoặc

trong trường hợp bệnh nhân không đáp ứng với corticoid liều cao đường tĩnh mạch [12]

- Đường dùng: đường uống, tiêm tĩnh mạch [1]

- Tác dụng không mong muốn: buồn nôn, run, nhức đầu, tiêu chảy, phản ứng mẫn cảm và rồi loạn chức năng gan, thận, tiêu hóa…[45]

1.2 Các mô hình gây viêm đại tràng bằng hóa chất

Các mô hình gây IBD trên động vật đã được sử dụng trong nhiều thập kỉ để nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh, cơ chế bệnh sinh [38] Mặc dù không có mô hình nào đại diện hoàn chỉnh cho bệnh IBD ở người, nhưng những mô hình này đóng vai trò quan trọng trong việc tìm hiểu sâu hơn về sinh bệnh học, cũng như phát triển các liệu pháp điều trị [43], [60]

Mô hình IBD được phân thành 4 nhóm chính: Mô hình gây bởi hóa chất, mô hình gây bởi đột biến gen, mô hình gây bởi vi khuẩn và mô hình miễn dịch học Hiệp hội bệnh Crohn và viêm đại tràng ở Mỹ (Crohn’s and Colitis Foundation of America) đã đưa ra danh sách mô hình ưu tiên cho chương trình nghiên cứu IBD như trong hình 1.2 Như vậy, có 2 loại mô hình chính được sử dụng để nghiên cứu

UC trên chuột bao gồm mô hình gây bởi hóa chất và mô hình gây bởi đột biến gen [43]

Hình 1.2 Tóm tắt các mô hình của CD và/ hoặc UC

Các mô hình gây bởi đột biến gen bao gồm mô hình chuyển hóa tế bào, mô

hình tự phát, mô hình tự nhiên (tự gen đột biến) và mô hình đột biến gen Ngoài ra,

những tiến bộ về công nghệ di truyền học đã phân loại nhỏ hơn mô hình đột biến

gen thành sáu phân nhóm [43], [47], [60] Một số mô hình đột biến gen như chuyển

đổi gen đã chứng minh các tế bào T có liên quan đến quá trình khởi phát viêm ruột,

mô hình chuột nhắt knockout IL2 và IL 10 Như vậy, mô hình đột biến gen đã đưa

ra những giả thuyết nghiên cứu sâu về nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh IBD [64]

Nhiều mô hình gây viêm đại tràng bằng hóa chất được sử dụng rộng rãi trên

thế giới Các mô hình này có các đặc điểm bệnh lý, mô bệnh học và triệu chứng gần

giống với UC ở người [60] Mô hình có tính lặp lại và đơn giản về mặt kỹ thuật và

các triệu chứng viêm khởi phát nhanh Các tác nhân hóa học hay được dùng trong

mô hình này là Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), dextran natri sulfat (DSS),

oxazolon, acid acetic AA), thuốc gây viêm không steroid (NSAID)… [38], [43],

[47], [60]

Trong khuôn khổ cho phép, phần sau đây chúng tôi chỉ đề cập một số mô hình

gây UC bằng hóa chất thường áp dụng trên động vật thực nghiệm

1.2.1 Mô hình gây viêm loét đại tràng bằng dextran sulphat natri (DSS)

Mô hình DSS của viêm đại tràng thực nghiệm là một trong những mô hình

phổ biến nhất và được sử dụng rộng rãi do có những đặc điểm, triệu chứng giống

với UC [60], [64] Mức độ của viêm đại tràng do DSS gây ra phụ thuộc vào nhiều yếu tố như liều lượng, thời gian, nhà sản xuất / lô sản xuất DSS, chủng, giới tính và môi trường vi sinh vật của động vật [30], [43]

 Cơ chế gây viêm:

DSS gây độc trực tiếp lên các tế bào biểu mô, làm mất chức năng của hàng rào biểu mô, từ đó làm tăng thấm niêm mạc đại tràng Các chất có trọng lượng phân tử lớn và vi sinh vật cùng sản phẩm chuyển hóa của chúng có thể thấm vào lớp màng

mô liên kết [20], [40], [53]

Sử dụng DSS thời gian dài dẫn đến gia tăng hủy hoại biểu mô, thay đổi hình thái hang và kích hoạt các chất trung gian của hệ miễn dịch đặc hiệu cytokin Th1 /Th2 và TCM (tế bào T nhớ trung tâm) [21] Ngoài ra, DSS còn gây ra rối loạn chuyển hóa phospholipid thông qua giảm nồng độ glycerophosphocholin và phosphocholin ở đại tràng chuột nhắt dẫn đến biến dạng màng sinh học và xáo trộn quá trình trao đổi chất [22] Đồng thời làm mất liên kết ZO-1 protein tạo điều kiện thuận lợi tăng tính thấm ở ruột [58]

Các quá trình trên làm giảm chất nhày mucin, tăng sung huyết, phù nề, loét, thoái hóa biểu mô và hoại tử dẫn đến mất tế bào biểu mô, hình thành viêm hốc (cryptitis), áp xe thể hang (crypt) và sự xâm nhập của bạch cầu trung tính [20], [30]

 Cách tiến hành :

Mô hình viêm cấp

Trên chuột cống: sử dụng hỗn dịch 2-5% DSS (trọng lượng phân tử 50 kDa) trong nước, uống 5-9 ngày liên tiếp để gây viêm đại tràng ở chuột chủng Sprague-

Dawley hoặc Wistar [18], [48]

Trên chuột nhắt: Chủng chuột nhắt C57BL /6NTac, C57BL /6 và BALB /C sử dụng hỗn dich 3-5% DSS trong nước, uống trong 5-8 ngày [10] Đối với chủng ddY, C57BL /6J có thể sử dụng hỗn dịch 2-2,5% DSS trong 4-10 ngày [57]

Mô hình viêm mạn

Trên chuột cống: Một số nhà nghiên cứu đưa ra mô hình sử dụng 4% DSS trong 6 ngày, tiếp theo là uống nước trong 6 ngày, lặp lại trong ba chu kỳ ở chuột cống Sprague-Dawley [26]

Trên chuột nhắt: Cooper và cộng sự đưa ra mô hình trên chuột chủng BALB/C, mỗi chu kì sử dung DSS 5% trong 1 tuần, uống nước trong 10 đến 14 ngày và lặp lại chu kì trên trong 4-5 chu kì [17]

- Phân tích hóa sinh: mức độ cytokin mô như: TNF-α, 1β, 6, 10,

IL-17, MPO, MDA, SOD, CAT…

Ngoài ra, trong quá trình triển khai mô hình có thể theo dõi đặc điểm lâm sàng của chuột như tình trạng giảm cân, chảy máu trực tràng, tính chất của phân để đánh giá chỉ số hoạt động của bệnh (DAI)

 Ưu điểm:

Sử dụng đơn giản do DSS thường được phân tán trong nước cất, dễ kiểm soát liều lượng tạo điều kiện thuận lợi xác định mức độ tổn thương và khoảng thời gian dùng DSS để nghiên cứu quá trình viêm [43]

 Nhược điểm:

Sự khác biệt về chủng chuột, các khu vực nuôi, liều, thời gian điều trị, yếu tố

di truyền có thể dẫn đến mức độ của viêm khác nhau khi sử dụng DSS Điều này gây khó khăn đánh giá các thông số nghiên cứu so với các mô hình khác [24] Mặt khác, DSS không ổn định trong môi trường acid do đó tác nhân này không thích hợp khi triển khai mô hình có sử dụng acid [11]

1.2.2 Mô hình gây viêm loét đại tràng bằng acid trinitrobenzene sulfonic (TNBS)

TNBS là tác nhân gây ra tình trạng viêm ruột có các đặc điểm hình thái và mô bệnh học tương tự như IBD người [9] Đặc biệt, mô hình này có nhiều đặc điểm liên quan đến bệnh CD hơn bệnh UC Do đó, nhiều nghiên cứu sử dụng mô hình này để phân tích cơ chế bệnh và đánh giá tiềm năng điều trị CD của các chất ngoại sinh Trong một số trường hợp, acid dinitrosulfonic (DNS) được sử dụng như là một chất tương tự của TNBS, nhưng viêm do DNS có thể tạo ra những đáp ứng gần giống với hội chứng ruột kích thích hoặc dị ứng thực phẩm hơn là CD [47]

 Cơ chế gây viêm :

TNBS là một hapten gây ra phản ứng quá mẫn, tạo kháng nguyên từ đó kích thích các chất trung gian gây viêm trong hệ thống miễn dịch Đặc biêt, TNBS làm tăng sản xuất Th1 cùng với các chất trung gian gây viêm chủ yếu IL -12, các chất chuyển hóa arachidonat như leukotriene B4 (LTB4) và các acid béo monhydroxyl 5-HETE, 12-HETE và 15-HETE [30]

Ngoài ra, trong thực nghiệm TNBS thường được hòa tan trong ethanol và đưa vào đường trực tràng chuột để gây ra tình trạng viêm Ethanol không chỉ là một dung môi mà còn là chất hỗ trợ gây viêm bằng cách phá vỡ rào cản niêm mạc[33], [52]

 Cách tiến hành:

Trên chuột cống dùng 10 mg TNBS hoà tan trong 0,25 ml ethanol 50%

Trên chuột nhắt dùng 200 mg / kg TNBS hoà tan trong ethanol 30% [60]

 Thông số đánh giá: tương tự như mục 1.2.1

 Ưu điểm:

Sử dụng đơn giản, khoảng thời gian thí nghiệm ngắn, tổn thương kéo dài với

sự thâm nhiễm và loét tế bào viêm [73] Hơn nữa, mô hình này có thể cả giai đoạn cấp tính và mạn tính của viêm vì tác nhân này hoạt hóa 2 chất trung gian gây viêm đại tràng là cytokin Th1 và Th2 [30]

 Nhược điểm:

Mô hình UC gây bởi TNBS có nhiều đặc điểm liên quan đến CD hơn UC, mô hình không đưa ra tình trạng tự tái phát (spontaneous relapse) đây là điểm đặc trưng của IBD [49] Sử dụng TNBS gây UC phụ thuộc vào chủng do đó đòi hỏi tối ưu hóa

cá thể [67] Mặt khác, chính ethanol - dung môi hòa tan TNBS cũng gây viêm nặng

ở niêm mạc ruột dẫn đến khó phân biệt giữa chứng viêm do ethanol gây ra và chứng viêm do hapten TNBS gây ra [64]

1.2.3 Mô hình gây viêm loét đại tràng bằng oxazolon

Oxazolon là một chất hapten giống như TNBS nhưng gây ra tình trạng viêm đại tràng rõ rệt giống đặc tính bệnh UC ở người [43], [67]

 Cơ chế gây viêm:

Trong mô hình, Oxazolon có cơ chế gây viêm khác so với mô hình gây viêm đại tràng bằng tác nhân TNBS Dưới tác động của Oxazolon, đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào được hình thành với sự sản xuất rất nhiều lymphokin từ tế bào lympho T mẫn cảm trong đó có IL-13 được sản xuất từ tế bào T CD4+ tiết ra tế bào diệt tự nhiên (NKT) Cả 2 tế bào IL-13 và NKT đều có liên quan đến viêm đại tràng oxazolon Trong trường hợp, những con chuột nhắt không có tế bào NKT thì IL-13

bị phong bế bởi một protein IL-13Ra2-Fc, ngăn ngừa quá trình viêm đại tràng, dẫn đến không gây được mô hình viêm đại tràng bởi oxazolon Tế bào NKT gây độc tính đối với các tế bào biểu mô, mức độ độc tế bào tăng lên bởi IL-13 Mặt khác, IL-13 làm giảm chức năng của biểu mô bằng cách tăng apoptosis và tính thấm tế bào biểu mô Những ảnh hưởng bất lợi đối với chức năng hàng rào biểu mô của IL 3 được kích thích bởi IL-9, một cytokin tương tự Th2 được tạo ra trong thời gian viêm đại tràng oxazolon [40]

 Cách tiến hành:

Trên chuột cống: Test da vùng bụng với 300 μl oxazolon 5% trong ethanol tuyệt đối, sau đó đưa vào đường trực tràng 450 μl oxazolon 5% trong dung dịch ethanol 50% vào đại tràng ở ngày thứ 5 và ngày thứ 7 [72]

Trên chuột nhắt: Test da vùng bụng với 50-150 μl 3% oxazolon trong ethanol 100%, sau 5-8 ngày đưa vào đường đại tràng 70-150 μl oxazolon 0,75% -1% trong dung dịch ethanol 45% -50% [42]

 Thông số đánh giá: tương tự như mục 1.2.1

 Ưu điểm:

Oxazolon gây ra tình trạng viêm đại tràng giống với đặc tính bệnh UC ở người nên nhiều nghiên cứu đã sử dụng tác nhân này để nghiên cứu về bệnh UC [30] Tương tự mô hình TNBS, oxazolon có thể hoạt hóa 2 chất trung gian gây viêm đại tràng cytokin Th1 và Th2 nên mô hình có thể bắt chước giai đoạn cấp tính và mãn tính của quá trình viêm [25], [67]

 Nhược điểm:

Đa số các chủng chuột thông thường có khả năng đề kháng với viêm đại tràng

do oxazolon gây ra Dó đó, một số chủng chuột cần tiến hành test lẩy da để gây ra phản ứng dị ứng trước khi gây viêm bằng đường đại tràng với oxazolon như chủng chuột nhắt C57BL/6 [47] Mặt khác, ethanol được sử dụng làm dung môi trong mô hình nên khó phân biệt giữa chứng viêm do ethanol hay tác nhân oxazolon gây ra

1.2.4 Mô hình gây viêm loét đại tràng bằng acid acetic (AA)

AA là một tác nhân gây viêm cấp tính ở vùng đại tràng và mô phỏng đặc điểm đặc trưng của UC ở người Vì vậy, tác nhân này thường được sử dụng trong

mô hình gây viêm đại tràng bằng tác nhân hóa học [30], [60]

Mô hình này được triển khai đầu tiên bởi MacPherson và Pfeiffer gây viêm đại tràng bằng 0,5 ml AA 10-50%, qua đường trực tràng vào đại tràng tiếp xúc trong 10 giây, sau đó rửa sạch đại tràng với 3 lần nước muối [44] Các nghiên cứu tiếp theo tập trung vào việc thay đổi nồng độ AA và thời gian tiếp xúc để tối ưu hóa mô hình [43]

 Cơ chế gây viêm:

AA giải phóng proton vào nội bào gây ra quá trình acid hóa, từ đó dẫn đến tổn thương biểu mô diện rộng đồng thời kích hoạt bạch cầu đơn nhân và đại thực bào đến vị trí viêm, giải phóng IL-1, IL-6, và TNF-α Các cytokin này kích thích giải

phóng chemokin làm hóa ứng động các bạch cầu trung tính Tiếp theo, bạch cầu trung tính kích thích miễn dịch (IL-17, IL-10) và giải phóng các chất oxy hoá độc tế bào Quá trình trên gây hoạt hóa các gốc chứa oxy hoạt động (ROS) làm mất cân bằng giữa chất oxy hóa và các chất chống oxy hoá Từ đó, dẫn đến sự hình thành các gốc hydroxyl và peroxid dẫn đến hoại tử mô và rối loạn chức năng niêm mạc [16], [31] Hơn nữa, bạch cầu trung tính cũng giải phóng các proteases vàchất trung gian trong quá trình tổng hợp lipid làm tăng tình trạng tổn thương đường ruột [60] Tổn thương ban đầu gây bởi tác nhân AA là hoại tử biểu mô và phù nề, có thể

ở các lớp niêm mạc, dưới niêm mạc, hoặc các lớp cơ tùy thuộc vào nồng độ và thời gian tiếp xúc của AA Các tổn thương biểu mô này là một phản ứng tương đối đặc hiệu của acid hữu cơ vì HCl ở pH tương tự không gây ra tổn thương [70] Sau những tổn thương ban đầu là tình trạng viêm niêm mạc, dưới niêm mạc, liên quan đến việc kích hoạt con đường acid arachidonic [24]

AA dẫn đến hủy hoại biểu mô đại tràng không có viêm trong vòng 4 giờ, sau

đó một đợt các tế bào viêm cấp tính, đạt đến cường độ tối đa ở 12 giờ Tổn thương hóa học được hồi phục trong vài ngày ở chuột nhắt và 2-3 tuần ở chuột cống [38]

 Cách tiến hành:

- Trên chuột cống:

Tiến hành gây mê, đưa 1-2 ml AA (3-6%) vào đại tràng qua một ống polyethylen được đưa sâu 6-8cm trong đại tràng tính từ đầu hậu môn Sau đó, rút ống ra khỏi đại tràng và giữ chuột ở tư thế thẳng đứng trong vòng 15- 45 giây để đảm bảo AA tiếp xúc đều lên bề mặt niêm mạc đại tràng và không bị chảy ra ngoài [19], [46]

Các nghiên cứu đã đưa ra một số thay đổi về quy trình để gây được tình trạng viêm như hạn chế AA vào đại tràng, tiêm không khí (2 ml) sau khi đưa AA để phân

bố hoàn toàn tác nhân này vào trong đại tràng, duy trì chuột ở tư thế nằm ngang ít nhất 2 phút tránh rò rỉ AA ra ngoài, rửa sạch đại tràng bằng 5ml NaCl trong 20 giây sau khi đưa AA vào đại tràng [50], [68]

- Trên chuột nhắt:

Đưa 150 l- 1ml AA (4-6%) trong 0,9 % NaCl vào đại tràng qua đường hậu môn [54], [55]

 Ưu điểm:

AA là tác nhân thường sẵn có, chi phí thấp và dễ sử dụng [30] Các hợp chất

có tác dụng cải thiện tình trạng viêm đại tràng do AA nhằm mục tiêu hướng tới các loại phản ứng oxy hóa (ROS) như N-acetyl cysteine, trimetazidine, vitamin E và melatonin…Điều này cho thấy mô hình sử dụng AA gây viêm đại tràng có thể là một mô hình tốt để nghiên cứu hiệu quả của thuốc có cơ chế tác động vào các loại phản ứng oxy hóa [43]

 Nhược điểm:

Tổn thương biểu mô quan sát thấy trong vòng 24 giờ đầu tiên của cảm ứng

AA không phải là miễn dịch tự nhiên Do đó, việc thiết kế các loại thuốc nhằm đáp ứng miễn dịch nên được kiểm tra tại thời điểm sau 24 giờ sau khi kích thích [30]

 Thông số đánh giá: tương tự như mục 1.2.1

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Động vật nghiên cứu

Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, cân nặng từ 20-25g, khỏe mạnh do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

Chuột cống trắng, chủng Wistar trưởng thành khỏe mạnh, khối lượng 180- 220

g, Viện Quân Y cung cấp

Chuột được nuôi ổn định 5 ngày trong điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội, được nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.1.2 Thuốc thử và hóa chất

- Thuốc viên sulfasalazin 500mg (Pfizer), số lô 980470, hạn dùng 07/2018

- Acid acetic (Merck- Đức), tiêu chuẩn HPLC

- Thiopental natri (Rotexmedica- Đức)

- Dịch truyền tĩnh mạch NaCl 0,9% ( B Braun Melsungen AG)

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

 Thiết bị

- Cân phân tích AY 220 (Shimadzu)

- Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius)

- Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ 745T

 Dụng cụ

- Đồng hồ bấm giờ Q & Q HS45J003Y (Citizen Nhật Bản)

- Catheter đường kính trong 0,4 mm; đường kính ngoài 0,9 mm (AD instrusment)

- Dây truyền dịch đường kính trong 1,5 mm (B Braun Melsungen AG)

- Dụng cụ cố định đại tràng, các móc ghim nhỏ, bơm, kim tiêm nhựa, dụng

cụ mổ chuột

- Một số dụng cụ dùng trong chăn nuôi và pha chế của bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.2 Nội dung và thiết kế nghiên cứu

Để đạt mục tiêu triển khai được mô hình gây viêm loét đại tràng trên động vật

thực nghiệm, đề tài được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:

- Triển khai mô hình gây viêm loét đại tràng bằng AA trên chuột nhắt trắng

- Triển khai mô hình gây viêm loét đại tràng bằng AA trên chuột cống trắng

- Thẩm định mô hình đã triển khai bằng sulfasalazin

Các nội dung nghiên cứu được thiết kế như sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Triển khai mô hình viêm loét đại tràng bằng acid acetic trên chuột nhắt trắng

Sử dụng các dung dịch AA với thể tích và nồng độ khác nhau để gây viêm loét đại tràng trên chuột nhắt trắng [27], [54], [55], [56], [60] Sau đó, lựa chọn mức liều gây ra tình trạng viêm loét đại tràng ở mức độ tổn thương không quá nặng

 Bố trí thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày, được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 động vật

- Lô1: không gây viêm đại tràng, đưa vào đại tràng 0,5 ml NaCl 0,9%

- Lô 2: gây viêm đại tràng bằng 0,1 ml AA 6%

- Lô 3: gây viêm đại tràng bằng 0,2 ml AA 6 %

- Lô 4: gây viêm đại tràng bằng 0,5 ml AA 5%

- Lô 5: gây viêm đại tràng bằng 1ml AA 5%

Chuột thí nghiệm được nhịn đói 24 giờ, uống nước tự do Chuột được gây mê bằng cách tiêm tĩnh mạch natri thiopental liều 30 mg/kg Dùng một catheter có đường kính trong 0,4 mm luồn sâu 4cm vào đại tràng tính từ hậu môn Bơm dung dịch NaCl 0,9% ở lô 1 hoặc dung dịch AA ở lô 2, 3, 4, 5 vào đại tràng qua catheter này Rút ống ra khỏi đại tràng và giữ chuột ở tư thế nghiêng dốc trên giá đỡ trong

45 giây để đảm bảo AA tiếp xúc đều lên bề mặt niêm mạc đại tràng và không bị chảy ra ngoài Sau khi gây viêm đại tràng, chuột được cho ăn bình thường và uống nước tự do

Sau 24 giờ gây viêm hoặc đưa dung dịch NaCl 0,9% tiến hành mổ và bóc tách đại tràng của động vật Quan sát đại thể, mổ dọc theo chiều dài đại tràng, loại bỏ hết phân, rửa sạch đại tràng, tiến hành soi và đánh giá điểm tổn thương đại thể

Quy trình nghiên cứu thể hiện trong hình 2.2

Hình 2.2 Quy trình gây viêm loét đại tràng trên chuột nhắt trắng

 Thông số đánh giá:

- Tỷ lệ chuột chết sau gây viêm đại tràng

- Quan sát đại thể: Mức độ sưng phồng, màu sắc, bề dày thành, đường kính đại tràng, hình dạng và tính chất phân, mức độ dính của đại tràng với cơ quan khác

- Điểm tổn thương trên quan sát đại thể: Mức độ tổn thương của đại tràng được đánh giá bởi 3 nghiên cứu viên quan sát độc lập, làm mù các lô Điểm đại thể được đánh giá dựa trên thang điểm Wallace như ở bảng 2.1 [66]

Bảng 2.1 Thang điểm đánh giá mức độ tổn thương đại thể đại tràng theo

Wallace

0 Bình thường

1 Sung huyết cục bộ mà không có loét

2 Sung huyết và dày thành, gần loét (biểu mô bong trợt)

3 Loét 1 điểm và viêm*cục bộ

4 2 hoặc nhiều vị trí viêm và loét =< 1 cm

5 2 hoặc nhiều vị trí viêm và loét > 1 cm

6 Khu vực tổn thương >= 2 cm dọc theo chiều dài

7 Khu vực tổn thương >= 3 cm dọc theo chiều dài

8 Khu vực tổn thương >= 4 cm dọc theo chiều dài

9 Khu vực tổn thương >= 5 cm dọc theo chiều dài

10 Khu vực tổn thương >= 6cm dọc theo chiều dài

*Viêm "được định nghĩa là sung huyết và dày thành

2.3.2 Triển khai mô hình viêm loét đại tràng bằng acid acetic trên chuột cống trắng

Sử dụng các dung dịch AA với thể tích và nồng độ khác nhau gây viêm loét đại tràng chuột cống trắng [35], [36], [39] Sau đó, lựa chọn mức liều gây ra tình trạng viêm loét đại tràng ở mức độ tổn thương không quá nặng

 Bố trí thí nghiệm:

Chuột cống trắng được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày, được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 10 động vật

- Lô 1: không gây viêm đại tràng, đưa vào đại tràng 2 ml NaCl 0,9%

- Lô 2: gây viêm loét đại tràng bằng 1 ml AA 5%

- Lô 3 : gây viêm loét đại tràng bằng 2 ml AA 3%

Chuột thí nghiệm được nhịn đói 48 giờ, uống nước tự do Chuột được gây

mê bằng cách tiêm phúc mạc natri thiopental liều 30 mg/kg Dùng một ống polyethylen (dây truyền dịch) có đường kính 1,5 mm luồn sâu 6cm vào đại tràng

tính từ hậu môn Bơm dung dịch NaCl 0,9% ở lô 1 hoặc dung dịch AA ở các lô 2, 3 vào đại tràng qua dây truyền này Rút dây chuyền ra khỏi đại tràng và giữ chuột ở tư thế nghiêng dốc trên một giá đỡ trong 45 giây để đảm bảo AA tiếp xúc đều lên bề mặt niêm mạc đại tràng và không bị chảy ra ngoài Sau khi gây viêm đại tràng, chuột cho ăn bình thường và uống nước tự do

Sau 24 giờ gây viêm hoặc đưa dung dịch NaCl 0,9 % vào đại tràng, tiến hành giết chuột, mổ bóc tách đại tràng Quan sát đại thể, mổ dọc theo chiều dài đại tràng, loại bỏ hết phân, rửa sạch đại tràng, tiến hành soi và đánh giá điểm tổn thương đại thể

Quy trình nghiên cứu thể hiện trong hình 2.3

Hình 2.3 Quy trình gây viêm loét đại tràng trên chuột cống trắng

Thông số đánh giá: tương tự như mục 2.3.1

2.3.3 Thẩm định mô hình với sulfasalazin

Sau khi đã triển khai mô hình trên chuột nhắt trắng và chuột cống trắng, lựa chọn mô hình gây viêm trên chuột cống trắng bằng 2 ml AA 3% để thẩm định với chứng dương là sulfasalazin liều 100mg/kg [61], [62]

 Bố trí thí nghiệm:

Động vật nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày, được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 10 động vật:

- Lô 1 (chứng trắng) uống NaCMC 0,5%, đưa vào đại tràng 2 ml NaCl 0,9%

- Lô 2 (chứng bệnh) uống NaCMC 0,5%, gây viêm đại tràng bằng 2ml AA 3%

- Lô 3 (chứng dương) uống sulfasalazin liều 100mg/kg pha trong NaCMC

0,5% và gây viêm đại tràng bằng 2 ml AA 3%

Chuột thí nghiệm được cho uống NaCMC 0,5% hoặc chứng dương hàng ngày

vào 9 giờ sáng, liên tục trong 07 ngày Trước khi gây viêm đại tràng 48 giờ, động

vật bị cho nhịn đói, uống nước bình thường Ngày thứ tám, sau khi uống NaCMC

0,5% hoặc uống chứng dương 1 giờ, lô 1 được đưa vào đại tràng dung dịch NaCl

0,9%; lô 2, 3 được gây viêm đại tràng bằng AA như mục 2.3.2

Sau 24 giờ gây viêm hoặc đưa dung dịch NaCl 0,9 % vào đại tràng, tiến hành

giết chuột, mổ bóc tách vào đại tràng Quan sát đại thể, đo chiều dài đại tràng, mổ

dọc theo chiều dài đại tràng, loại bỏ hết phân, rửa sạch đại tràng, cân khối lượng

tươi đại tràng, tiến hành soi và đánh giá điểm tổn thương đại thể

Mỗi lô lấy 6 mẫu đại tràng dài 4cm được cắt đều hai phía tính từ vị trí đưa AA

(6cm tính từ hậu môn) và cố định trong dung dịch formol 10% Sau đó, mẫu được

gửi đến Bộ Môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội để làm tiêu bản vi thể

và đọc kết quả

Quy trình nghiên cứu thể hiện trong hình 2.4

Hình 2.4 Quy trình thẩm định mô hình với sulfasalazin

- Đánh giá tổn thương trên mô bệnh học: Mức độ tổn thương được đánh giá đồng thời theo các thang Neurath (điểm 0-4) [52], [54], thang Vilaseca (điểm 0-8) [56], [74] và mức độ hoại tử

+ Thang điểm Neurath đánh giá chủ yếu tình trạng viêm và mức độ thâm nhiễm bạch cầu

+ Thang điểm Vilaseca đánh giá mức độ loét, viêm và độ sâu của tổn thương + Mức độ hoại tử được đánh giá theo 4 cấp độ: không hoại tử, hoại tử rải rác, tập trung ổ nhỏ, diện rộng

Thang điểm đánh giá mức độ tổn thương theo Neurath và Vilaseca thể hiện trong bảng 2.2 và 2.3 Kết quả được đọc bởi PGS TS Lê Trung Thọ, Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội