Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel) (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

MỘT SỐ HỢP CHẤT CHÍNH TỪ CÂY CÀ

ĐỘC DƯỢC (DATURA METEL)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Thái Nguyên - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

MỘT SỐ HỢP CHẤT CHÍNH TỪ CÂY CÀ

ĐỘC DƯỢC (DATURA METEL)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60 44 01 18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ MAI

Thái Nguyên - 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Thị Mai đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ

em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn

Em xin cảm ơn các thầy cô khoa Hóa Học - Trường Đại Học Khoa Học Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên cứu khoa học, và các anh chị, các bạn học viên lớp K9B - lớp Cao học Hóa đã trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè và đồng nghiệp của tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Mai Hương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN a MỤC LỤC b DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT d DANH MỤC BẢNG e DANH MỤC HÌNH f DANH MỤC PHỔ g

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chi Datura 3

1.2 Nghiên cứu hóa học chi Datura 3

1.3 Giới thiệu cây cà độc dược (Datura metel) 9

1.3.1 Đặc điểm thực vật 9

1.3.2 Công dụng theo kinh nghiệm dân gian 9

1.4 Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật 10

1.4.1 Chọn dung môi chiết 10

1.4.2 Quá trình chiết 12

1.5 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ 13

1.5.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 13

1.5.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký 14

1.5.3 Phân loại phương pháp sắc ký 14

1.6 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 19

1.6.1 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) 19

1.6.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance 19

Spectroscopy NMR) 19

Chương 2: THỰC NGHIỆM 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu 22

2.2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các phân đoạn và phân lập các chất 22

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 23

2.3 Thực nghiệm 23

2.3.1 Xử lý mẫu dược liệu và chiết tách các hợp chất 23

2.3.2 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất 25

2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng của hợp chất trong mẫu dược liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 28

3.1.1 Hợp chất DM1: Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl (1 2)-β-D-galactopyranoside 7-O-β-D-glucopyranoside 28

3.1.2 Hợp chất DM2: Kaemp-ferol 3-O-β-glucopyranosyl (12)- β- glucopyranoside-7-O-α-rhamnopyranoside 33

3.1.3 Hợp chất DM3 (Scopolamine) 39

3.2 Dùng phương pháp HPLC xác định hàm lượng hợp chất DM1 (CDM9) 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CC Column Chromatography Sắc ký cột

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

1H-NMR Proton Magnenic Rosonance

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer Phổ DEPT

ESI-MS Electronspray Ionization Mas

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Dữ kiện phổ NMR của DM1 và chất tham khảo 32

Bảng 3.2 Dữ kiện phổ NMR của DM2 và chất tham khảo 38

Bảng 3.3 Dữ kiện phổ NMR của DM3 và chất tham khảo 42

Bảng 3.4 Kết quả đo phổ HPLC của mẫu DM1 47

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phương sai 48

Bảng 3.6 Tổng hợp mẫu phân tích 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây cà độc dược(Datura metel) 9

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các chất từ loài Datura metel 24

Hình 3.1 Phổ MS của hợp chất DM1 28

Hình 3.2 Phổ 1H –NMR của hợp chất DM1 29

Hình 3.3 Phổ 13C –NMR của hợp chất DM1 30

Hình 3.4 Phổ HMQC hợp chất của DM1 30

Hình 3.5 Phổ HMBC của hợp chất DM1 31

Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất DM1 33

Hình 3.7 Phổ MS của hợp chất DM2 34

Hình 3.8 Phổ 1H –NMR của hợp chất DM2 35

Hình 3.9 Phổ 13C –NMR của hợp chất DM2 36

Hình 3.10 Phổ DEP của hợp chất DM2 36

Hình 3.11 Phổ HMQC của hợp chất DM2 37

Hình 3.12 Phổ HMBC của hợp chất DM2 37

Hình 3.13 Cấu trúc hóa học của hợp chất DM2 39

Hình 3.14 Phổ MS của hợp chất DM3 39

Hình 3.15 Phổ 1H –NMR của hợp chất DM3 40

Hình 3.16 Phổ 13C –NMR của hợp chất DM3 41

Hình 3.17 Phổ HMBC của hợp chất DM3 43

Hình 3.18 Một số tương tác chính HMBC của hợp chất DM3 43

Hình 3.19 Cấu trúc hóa học của hợp chất DM3 (Scopolamine) 44

Hình 3.20 Phổ UV của hợp chất DM1 45

Hình 3.21 Sắc ký đồ của hợp chất DM1(CDM9) 45

Hình 3.22 Sắc ký đồ của hợp chất DM1 ở nồng độ 0,053125 mg/mL 46

Hình 3.23 Sắc ký đồ của hợp chất DM1 ở nồng độ 0,10625 mg/mL 46

Hình 3.24 Sắc ký đồ của hợp chất DM1 ở nồng độ 0,2125 mg/mL 47

Hình 3.25 Đường chuẩn của hợp chất DM1 48

Hình 3.26 Sắc ký đồ của hợp chất DM1 trong cặn chiết tổng 49

PHỤ LỤC PHỔ

PHỤ LỤC 1: CÁC HÌNH ẢNH PHỔ CỦA HỢP CHẤT DM1 1

Hình 3.1 Phổ MS của hợp chất DM1 1

Hình 3.2 Phổ 1H –NMR của hợp chất DM1 2

Hình 3.3 Phổ 13C –NMR của hợp chất DM1 3

Hình 3.4 Phổ HMQC của hợp chất DM1 4

Hình 3.5 Phổ HMBC của hợp chất DM1 5

PHỤ LỤC 2: CÁC HÌNH ẢNH PHỔ CỦA HỢP CHẤT DM2 6

Hình 3.7 Phổ MS của hợp chất DM2 6

Hình 3.8 Phổ 1H –NMR của hợp chất DM2 7

Hình 3.9 Phổ 13C –NMR của hợp chất DM2 8

Hình 3.10 Phổ DEP của hợp chất DM2 9

Hình 3.11 Phổ HMQC của hợp chất DM2 10

Hình 3.12 Phổ HMBC của hợp chất DM2 11

PHỤ LỤC 3: CÁC HÌNH ẢNH PHỔ CỦA HỢP CHẤT DM3 12

Hình 3.14 Phổ MS của hợp chất DM3 12

Hình 3.15 Phổ 1H –NMR của hợp chất DM3 13

Hình 3.16 Phổ 13C –NMR của hợp chất DM3 14

Hình 3.17 Phổ HMBC của hợp chất DM3 15

Hình 3.20 Phổ UV của hợp chất DM1 16

Hình 3.21 Sắc ký đồ của hợp chất DM1(CDM9) 17

Hình 3.22 Sắc ký đồ của hợp chất DM1 ở nồng độ 0,053125 mg/mL 18

Hình 3.23 Sắc ký đồ của hợp chất DM1 ở nồng độ 0,10625 mg/mL 19

Hình 3.24 Sắc ký đồ của hợp chất DM1 ở nồng độ 0,2125 mg/mL 20

Hình 3.25 Đường chuẩn của hợp chất DM1 21

Hình 3.26 Sắc ký đồ của hợp chất DM1 trong cặn chiết tổng 22

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước có vị trí địa lý và khí hậu nhiệt đới gió mùa rất thuận lợi cho hệ thực vật phát triển Điều này giải thích vì sao nước ta có thực vật rất đa dạng và phong phú, với khoảng 12000 loài thực, trong đó có khoảng

4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược Ngoài sự phong phú về chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong nhân dân để phòng và chữa nhiều bệnh khác nhau Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức một vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc dân gian, cổ truyền được tồn tại và lưu truyền đến ngày nay Đây là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá, từ xa xưa, nó đã được con người biết đến, khai thác và sử dụng vào phục vụ đời sống, sức khỏe của mình

Tuy nhiên các loài dược liệu này chủ yếu mới dừng lại ở việc dùng theo kinh nghiệm dân gian, chưa có các nghiên cứu đầy đủ về thành phần hóa học cũng như tác dụng của các chất trong dược liệu theo quan điểm y học hiện

đại Cây cà độc dược (Datura metel) được nhân dân ta khử phong thấp, chữa

hen xuyễn, tuy nhiên để làm rõ thành phần nào tác dụng như vậy thì vẫn là một vấn đề đã và đang được sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như của toàn xã hội

Chi Datura là chi trong họ Cà (Solananceae), là một chi khá lớn, được

phân bố ở nhiều quốc gia và có mặt ở hầu hết các tỉnh, thành trong cả nước

Các bộ phận lá, rễ, vỏ thân, cành, quả của các loài trong chi Datura là các vị

thuốc quí trong dân gian

Cây cà độc dược (Datura metel) được trồng làm cảnh và sử dụng làm

dược liệu Tuy nhiên, do có nhiều các hợp chất dạng tropane alkaloid nên cây

có độc tính hoặc gây dị ứng khi tiếp xúc hoặc sử dụng với liều lượng cao

Vì vậy chúng tôi lựa chọn loài cà độc dược (Datura metel) họ cà

(Solananceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu chiết tách,

xác định cấu trúc một số hợp chất chính từ cây cà độc dược (Datura metel)”

Nhiệm vụ của đề tài là:

1 Xử lý mẫu và tạo dịch chiết

2 Nghiên cứu phân lập thành phần hóa hoc

3 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được

4 Định lượng 01 chất bằng HPLC

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chi Datura

Chi Datura là chi trong họ Cà (Solananceae) Trên thế giới chi Datura

có khoảng năm loài là Datura inoxia, D metel, D stramonium, D wrightii

và D alba, ở Viê ̣t Nam, theo tác giả Võ Văn Chi mới tìm thấy bốn loài là D

inoxia, D metel, D stramonium, D suaveolens [1]; Theo tác giả Phạm Hoàng

Hộ, chi Datura có ba loài: D Inoxia, D metel và D suaveolens [2]

1.2 Nghiên cứu hóa học chi Datura

Trong cuốn sách “ Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, tác giả Đỗ

Tất Lợi chỉ mô tả một loài D metel (cà độc dược) trong chi Datura Loài này

có tác dụng khử phong thấp, chữa hen xuyễn, nước sắc dùng để rửa những nơi

da tê dại, chữa hàn thấp, chữa ho hen, say sóng hoặc nôn mửa khi đi máy bay

Có thể dùng bột lá hay bột hoa, hoặc dùng lá hay hoa phơi khô, thái nhỏ để hút như thuốc lá Trong lá, hoa, hạt và rễ loài này chứa các alcanoit tropan là: scopolamine (hyoscine) (1), atropine (2) và hyoscyamine (3) [3]

Các bộ phận lá, rễ, vỏ thân, cành, quả của các loài trong chi Datura là

các vị thuốc quí trong dân gian Lá cà độc dược (D metel L.) đã được sử dụng

ở Ấn Độ và châu Phi để điều trị các rối loạn hô hấp và bệnh hen suyễn [4]

Hoa của loài D metel L được dùng làm thuốc gây mê, điều trị các chứng ho,

hen suyễn và co giật [5] Ở Trung Quốc, hoa của loài này có tác dụng rõ ràng trong điều trị lâm sàng bệnh vẩy nến Bên cạnh đó, nhiều tác dụng dược lý bao gồm chống viêm, chống kích động của da và chống sốc phản vệ cũng được các nhà khoa học Trung Quốc thông báo [6] Từ dịch chiết 50% etanol

của hoa loài D metel L năm hợp chất dạng megastigmane sesquiterpene đã

được phân lập: yangjinhualine A (4), grasshopper ketone (5), citroside A (6), vomifoliol (7), (6S,9R)-6-hydroxy-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside (8) và (6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside (9) [7] và hai hợp chất khung steroidal lactone là baimantuoluoline G (10) và baimantuoluoside

H (11) Cấu trúc khung này được thông báo có hoạt tính gây độc tế bào, chống oxi hóa, kháng viêm và kháng u mạnh [8]

Cũng từ là loài D metel L tám hợp chất daturamalakoside A (12),

daturamalakoside B (13), daturamalakin A (14), daturamalakin B (15), phenowithanolide (16), daturametelin B (17), withametelin (18) và daturametelin A (19) được phân lập, kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy hợp chất 13 có hoạt tính độc tế bào với dòng tế bào ung thư phổi (A549)

và đại trực tràng (DLD-1) với giá trị IC50 lần lượt là 7 µM và 2,0 µM Các

hợp chất 17 và 18 có hoạt tính độc tế bào mạnh hơn với dòng tế bào ung thư đại trực tràng (DLD-1) với giá trị IC50 lần lượt là 0,6 µM và 0,7 µM [9]

Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học từ lá loài D metel L năm hợp

chất khung steroidal lactone được phân lập dmetelin A (20), dmetelin B (21), dmetelin C (22), dmetelin D (23) và 7α,27-dihydroxy-1-oxowitha-2,5,24-trienolide (24) Các hợp chất được thử nghiệm kháng viêm, kết quả cho thấy hợp chất 20, 23, 24 thể hiện hoạt tính kháng viêm với giá trị IC50 lần lượt là: 17,8 µM, 11,6 µM và 14,9 µM [10]

OGlc6Glc1

23 R1= β OH R2 = OH

24 R1= α OH R2 = OH

Bằng phương pháp sắc ký khí - phổ khối, 67 ancaloit đã được tìm thấy từ

lá, cành, rễ, hạt của loài D stramonium Chất hyoxyamin (3) được tìm thấy ở rễ, cành, lá, hoa và hạt với hàm lượng lớn nhất Trong đó có 9 ancaloit mới là: 3,7-dihydroxy-6-propionyloxytropane (25), 6,7-dehydro-3-tigloyloxytropane (26), 3-tigloyloxy-6,7-epoxytropane (27), 3,7-dihydroxy-6-(2′-methylbutyryloxy)tropane (28), 6,7-dehydroapoatropine (29),3-(3′-methoxytropoyloxy)tropane (30), 3-tigloyloxy-6-isobutyryloxy-7-hydroxytropane (31), 3-tropoyloxy-6-isobutyryloxytropane (32),

3β-tropoyloxy-6β-isovaleroyloxytropane (33) [11]

Trong một bài nghiên cứu về tác dụng dược lý và tính độc của loài D

stramonium nhóm tác giả Bhakta Prasad Gaire, Lalita Subedi đã thông báo có

13 hợp chất được phân lập từ loài này: scopolamine (hyoscine) (1), atropine

(2), hyoscyamine (3), scopolin (34), atropamin (35), sitosterol (36), sophorose (37), cuscohygrine (38), esculetin (39), chlorgenic acid (40), ferunic acid (41), menteloidin (42) và apoatropin (43) Những tác dụng dược lý đáng chú ý của loài D stramonium là điều trị bệnh hen suyễn, chống động kinh, kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư tế bào biểu mô [12]

Hoạt tính chống ung thư của hợp chất dinoxin B (44) và aglycon của

dinoxin B (45) phân lập từ lá loài D inoxia được Karl Vermillion và cộng sự

nghiên cứu Kết quả cho thấy hợp chất 44 có hoạt tính mạnh hơn hợp chất 45 trên 6 dòng tế bào ung thư vú, 4 dòng tế bào ung thư ruột kết, 2 dòng tế bào ung thư phổi, 2 dòng tế bào ung thư gan, 4 dòng tế bào ung thư da và 1 dòng

tế bào ung thư buồng trứng [13]

Từ loài D wrightii, Huaping Zhang và cộng sự đã phân lập được 5 hợp

chất có cấu trúc withanolide: withawrightolide (46), withametelin L (47), withametelin hay daturilin (48), withametelin O (49) và withametelin F (50) Tất cả năm withanolides (46-50) đã được thử hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư não (U251 và U87), ung thư biểu mô (MDA-1986), nguyên bào phổi thai nhi (MRC-5) Kết quả cho thấy, các hợp chất đều thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 0,56 - 5,6 µM [14]

1.3 Giới thiệu cây cà độc dược (Datura metel)

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Datura metel

Tên tiếng Việt: cà độc dược

5 răng, cánh hoa màu trắng, dính liền với nhau thành hình phễu

Hình 1.1 Cây cà độc dược

(Datura metel)

1.3.2 Công dụng theo kinh nghiệm dân gian

Trong y học cổ truyền Trung Hoa, nó là một trong 50 vị thuốc cơ bản, với tên gọi dương kim hoa

Theo Đông y, hoa cà độc dược có vị cay, tính ôn, có độc, có tác dụng ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấp đau nhức Lá là

vị thuốc ngừa cơn hen, giảm đau bao tử, chống say tàu xe Ngoài ra còn điều trị phong tê thấp, đau dây thần kinh toạ, đau răng Người ta thường dùng lá cuộn thành điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để hút (chữa ho, hen suyễn), dùng lá hơ nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi khô tán bột mịn

Vì cây có độc tính cao nên chỉ dùng theo sự hướng dẫn của thầy thuốc Khi bị ngộ độc, có hiện tượng giãn đồng tử, mờ mắt, tim đập nhanh, giãn phế quản, môi miệng khô, khô cổ đến mức không nuốt và không nói được Chất độc tác động vào hệ thần kinh trung ương, có thể gây tử vong do hôn mê

Trong nước, hầu như chưa có công trình nào công bố về thành phần hóa học cũng như giải thích được tác dụng của các chất có trong cây cà độc dược Vì vậy luận văn này đóng góp được phần nào nghiên cứu về thành phần hóa học cây cà độc dược

1.4 Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình,…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.4.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung

môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận

Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng

với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc

Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất

để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong

khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa

Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlrofrom, metylen

[di-(2-etylhexyl)-clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình

chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…

Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ

phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính

tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết Ví dụ trechlonolide A thu được từ trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense

được chiết trong methanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà

thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit

dễ nổ Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không

có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có

thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành

những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình

tạo thành chất không mong muốn

Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-40oC, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt

độ cao hơn

1.4.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể

dùng bình thuỷ tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết mới được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa

Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau

Ví dụ:

- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Đragendroff và tác nhân Maye

- Các flavonoid thường là những hợp chất màu Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết

- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra

và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết

- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde

có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

1.5 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến

và hữu hiệu nhất hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong việc

phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.5.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh

Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…)

Phương pháp sắc ký dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh Nguyên nhân của

sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ của các chất khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh

Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua

hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

1.5.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng

nhiệt Langmuir:

n =

n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n: Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b: Hằng số

C: Nồng độ của chất bị hấp phụ

1.5.3 Phân loại phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký:

- Pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng

- Pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn

 Theo bản chất của hai pha sử dụng

- Sắc ký phân chia (partition chromatography)

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)

+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn

- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography)

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí

+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin

- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học

là polymer nên gọi là hạt nhựa Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học

ở dạng ion Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation

- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography, gel filtration chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng

- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)

+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở

+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein

- Sắc ký lỏng cao áp

+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp

 Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)

- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin – layer chromatography) Trong sắc ký giấy:

+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos

+ Pha động: là chất lỏng

Trong sắc ký lớp mỏng:

+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực

+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng

- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)

+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa

+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh

+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột

 Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí

 Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia sắc ký thành các nhóm nhỏ: sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng

1.5.3.1 Sắc ký cột (CC)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ

là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể

Trong sắc ký, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau

Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp

Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5-1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô

Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.5.3.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột TLC được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, TLC còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản TLC điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ

bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

1.6 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người

ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp

sắc ký so sánh,…

1.6.1 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân

mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV

- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là phổ

phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

1.6.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một

chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon)

là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift) Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling)

Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm

1.6.2.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại carbon khác nhau Trên phổ DEPT, tín hiệu của các carbon bậc bốn biến mất Tín hiệu của CH và CH3

nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350 Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH

1.6.2.4 Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương

tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ,

một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ

biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định

về cấu trúc

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây cà độc dược có tên khoa học Datura metel Phần trên mặt đất của cây cà độc dược (Datura metel) thu hái tại Sa Pa

Mẫu thực vật được TS Bùi Văn Thanh Viện Sinh thái, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Phần trên mặt đất cây cà độc dược được phơi khô, nghiền thành bột (5,0 kg), và chiết với metanol (3 lần x 10 lít) trên thiết bị chiết siêu âm (ở

50oC, mỗi lần 1 giờ) Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 300 g cặn chiết metanol Phân bố cặn chiết metanol vào 2 lít nước cất sau đó chiết với dung môi diclometan (2 lần x

3 lít) và thu được cặn diclometan (30 g) và lớp nước

2.2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các phân đoạn và phân lập các chất

Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo

Sắc ký lớp mỏng (TLC): sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Dung môi triển khai sắc ký là hỗn hợp của một số trong số các dung môi thường dùng như hexan, chlororfom, etyl acetat, aceton, methanol và nước Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường, silica gel pha đảo Silica gel pha thường có kích cỡ hạt là 0,040-

0,063nm (240-430 mesh) Silica gel đảo YMC (30-50μm, Fujisilisa Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ion Dianion HP-20 (Misubishi Chem.Ind.Co.,Ltd)

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các chất là sự kết hợp xác định giữa các chỉ số hóa lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

• Phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng được ghi trên máy Agilent

1200 HPLC-MSD với nguồn ion hóa Electrospray ionization source-ESI hoặc Atmospheric pressure chemical ionization-APCI của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

• Phổ khối phân giải cao (HR TOF-MS) được đo trên máy Varian 910 FT-ICR mass spectrOMeter của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500MHz) và 13NMR (125MHz), HMQC, HMBC được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR SpectrOMeter của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn là TMS (Tetramethyl Silan)

C-• Phổ hồng ngoa ̣i (IR) đươ ̣c ghi bởi thiết bi ̣ Nicolet Impact 410 FT-IR

tại Viê ̣n Hóa ho ̣c, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

• Điểm nóng chảy (Mp): Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 Thực nghiệm

2.3.1 Xử lý mẫu dược liệu và chiết tách các hợp chất

Phần trên mặt đất cây cà độc dược được phơi khô, nghiền thành bột (5,0 kg) và chiết với metanol (3 lần x 10 lít) trên thiết bị chiết siêu âm (ở

50oC, mỗi lần 1 giờ) Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 400 g cặn chiết metanol Phân bố cặn chiết metanol vào 2 lít nước cất sau đó chiết với dung môi diclometan (2 lần x

3 lít) thu được cặn diclometan (50 g) và lớp nước

Phân tách sơ bộ lớp nước qua cột trao đổi ion (Diaion HP-20) và giải hấp phụ với hệ dung môi tăng dần nồng độ metanol trong nước (50, 75, và

100 %; v/v) thu được 3 phân đoạn W1 (22 g), W2 (30 g) và W3 (10 g) Phân đoạn W2 (30 g) sau khi phân tách trên cột sắc ký pha đảo RP-18 với hệ dung môi axeton/nước (1/3, v/v) và tinh chế lại bằng sắc ký cột silica gel sử dụng

hệ dung môi rửa giải etyl axetat/metanol/nước (3/1/0,1, v/v/v) thu được hợp

chất DM1 (30 mg) và DM2 (25 mg)

Từ cặn diclometan ký hiệu DMD, phân tách trên cột sắc ký pha đảo RP-18 với hệ dung môi axeton/nước (1;1) thu được DM3 (15 mg)

Chi tiết quá trình phân lập các hợp chất từ că ̣n chiết MeOH của loài D

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các chất từ loài Datura metel

Chiết với MeOH (3 lần) Cất loại dung môi bằng áp suất giảm

Bổ sung nước

Bố sung diclometan Lớp nước

Cột Dianion MeOH:H 2 O (50:50→ 100:0) Lớp diclometan

Phần trên mặt đất cây cà độc dược

W1 (22 g)

W2 (30 g)

MeOH:H 2 O(

(50:50)

MeOH:H 2 () (75:25)

MeOH:H 2 O (100:0)

DM3

(30 mg)

YMC Axeton:H 2 O (1:3→ 3:3)

2.3.2 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất

H-13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δC: 58,6 (C-1), 56,4 (C-2), 56,1 (C-4), 58,7 (C-5), 29,4 (C-6), 67,1 (C-7), 29,6 (C-8), 39,1 (C-10), 172,8 (C-1’), 55,9 (C-2’), 64,4 (C-3’), 137,5 (C-1’’’), 129,9 (C-2’’’, C-6’’’), 128,8 (C-4’’’), 129,2 (C-3’’’, C-5’’’)

2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng của hợp chất trong mẫu dược liệu

Thiết bị:

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1290 Infinity bao gồm:

- Bơm mẫu cao áp 4 kênh dung môi

- Tiêm mẫu tự động

- Cột sắc ký Hydrosphere C18, kích thước cột 150×4.6 mm, kích thước hạt 5 µm

- Detertor: phát hiện đa bước sóng DAD

- Máy tính và phần mềm điều khiển Openlab

- Sử dụng hệ thống HPLC Alliance 2695, của hãng Waters- Mỹ

- Cân phân tích Adam AAA 160L (d = 0,0001)

Chuẩn bị mẫu:

Xây dựng đường chuẩn:

Mẫu DM1 được cân chính xác 10,0 mg cho vào bình định mức (10 ml) sau đó định mức đến vạch bằng MeOH ta được dung dịch gốc (1mg/ml) Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 0,053125; 0,10625 và 0,2125 mg/ml, sau đó chạy lần lượt các dung dịch có nồng độ trên qua hệ thống HPLC với cột phân tích: Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm

Detector PDA : bước sóng 346 nm Thể tích mẫu bơm vào máy 10µl Các nồng độ DM1 chuẩn ở trên đã được đo lặp lại 3 lần, kết quả thu được có sự ổn định rất cao về giá trị tích phân (diê ̣n tích pic), và thời gian lưu (RT) Điều này chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp mà chúng tôi đã lựa chọn cho hệ thống HPLC là phù hợp cho việc phân tích định lượng DM1

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

2)-β-D-galactopyranoside 7-O-β-D-glucopyranoside

Hợp chất MD1 thu được là một bột màu vàng vô định hình Công thức phân tử của nó được thiết lập là C33H40O21 (M=772) bởi đỉnh ion [M+Na]+ tại m/z 795 trong ESI-MS

Hình 3.1 Phổ MS của hợp chất DM1

Phổ 1H –NMR, xuất hiện 4 tín hiệu doublet của 4 proton δH 8.11 (2H,

d, 8.5), 6.90 (2H, d, 8.5) đôi một ở vị trí octo với nhau bởi hằng số tương tác J

= 8.5 Điều này cho thấy sự tồn tại của hai vòng thơm đều thế para tạo nên một trục đối xứng Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu doublet tại δH 6.43 và 6.8

ppm với hằng số tương tác khá nhỏ (J = 2.0) chứng tỏ hai proton này nằm ở vị

trí meta với nhau Sự xuất hiện tín hiệu của 3 proton anomeric tại δH 5.68 (d, J

= 7.5 Hz, H-1), 4.58 (d, J = 8.0 Hz, H-1) và 5.07 (d, J = 7,0 Hz, H-1), cho thấy hợp chất MD1 là một triglycosid kaempferol

Phân tích phổ 13C –NMR và HSQC của DM1 chỉ ra sự có mặt của 33 carbon, bao gồm một cacbonyl cacbon ở δC 177,7 (C-4), tám nguyên tử thơm không proton hoá (trong đó có năm ôxy), và sáu carbon thơm, cho thấy rằng 1

có bộ xương flavonol (Bảng 3.1) 18 nguyên tử còn lại được giao cho ba đơn

vị đường, được xác định là hai glucopyranose và một galactopyranose bằng cách so sánh với các chất được báo cáo trong tài liệu [12] Các khớp nối spin tương đối lớn của ba proton anomeric (J ≥ 7.0 Hz) là những đặc trưng của với

các đơn vị glucose và galactose

Hình 3.3 Phổ 13 C –NMR của hợp chất DM1

Hình 3.4 Phổ HMQC hợp chất của DM1

Hình 3.5 Phổ HMBC của hợp chất DM1

Trong phổ HMBC, các tương quan HMBC từ δH 4.58 (H-1) tới δC

80.5 (C-2) và từ δH 5.68 (H-1) đến δC 98.4 (C-3) cho rằng chuỗi β-

glucopyranosyl- (12)] -D-galactopyranoside được đặt ở vị trí C-3

β-glucopyranose còn lại được gắn với C-7 bởi mối tương quan HMBC quan sát thấy từ δH 5,07 (H-1) đến δC 162,8 (C-7) Trên cơ sở phân tích ở trên, cùng với so sánh với các flavonol glycoside, cấu trúc của MD1 đã được thiết lập là kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl(12)-β-D- galactopyranoside 7-O-β-D-glucopyranoside [15]