Triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid đường uống và áp dụng đánh giá tác dụng của chế phẩm vượng gan

2.1 Thành phần trong mỗi viên nén Vượng Can 19 2.2 Thang điểm đánh giá mức độ xơ hóa gan trên tiêu bản mô bệnh 3.1 Ảnh hưởng của CCl4 với các mức liều khác nhau đến số lượng và tỉ lệ chu

VƯỢNG CAN

TÀO THỊ GIANG

MÃ SINH VIÊN: 1201137

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY XƠ GAN THỰC NGHIỆM BẰNG CARBON TETRACLORID ĐƯỜNG UỐNG VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CHẾ PHẨM

PGS.TS Đào Thị Vui, DS Phạm Đức Vịnh và Ths Trần Hồng Linh những người

thầy đã luôn tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn DS Đinh Đại Độ và DS Đinh Thị Kiều Giang là

những anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược lực đã trực tiếp tham gia và giúp đỡ

em trong thời gian nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng các bộ môn, phòng ban khác của Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu

Trong quá trình thực hiện đề tài, em còn nhận được sự giúp đỡ, ý kiến đóng góp

từ các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực Em xin chân thành cảm ơn

sự giúp đỡ quý báu đó

Em xin cảm ơn các anh chị, bạn bè đã và đang nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược lực đã luôn đồng hành, hỗ trợ, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng

hộ, chia sẻ khó khăn và động viên em thực hiện khóa luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Tào Thị Giang

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ ……… ….1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Xơ gan 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Dịch tễ 3

1.1.3 Nguyên nhân 4

1.1.4 Cơ chế bệnh sinh 4

1.1.5 Tiếp cận điều trị chống xơ hóa gan 7

1.2 Các mô hình gây xơ gan trên động vật thí nghiệm 11

1.2.1 Gây xơ gan bằng các tác nhân hóa học 11

1.2.2 Gây xơ gan bằng phương pháp thắt ống dẫn mật 15

1.2.3 Gây xơ gan bằng phương pháp miễn dịch 15

1.2.4 Mô hình động vật biến đổi gen 16

1.3 Chế phẩm Vượng Can 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 21

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid đường uống trên chuột cống trắng 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 29 3.1 Kết quả triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid đường uống trên chuột cống trắng 29

3.1.1 Độc tính và khả năng gây xơ gan của carbon tetraclorid ở các mức liều khác nhau trên chuột cống trắng 29 3.1.2 Kết quả triển khai mô hình gây xơ gan với các chế độ liều carbon tetraclorid

đã thiết lập 30

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống xơ hóa gan của chế phẩm Vượng Can 34

3.2.1 Ảnh hưởng của chế phẩm Vượng Can đến hình ảnh đại thể gan 34 3.2.2 Ảnh hưởng của chế phẩm Vượng Can đến hoạt độ AST, ALT và nồng độ bilirubin toàn phần 36 3.2.3 Ảnh hưởng của chế phẩm Vượng Can đến hàm lượng collagen trong gan 37 3.2.4 Ảnh hưởng của chế phẩm Vượng Can đến điểm xơ hóa trên tiêu bản mô bệnh học gan 38

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 41 4.1 Về kết quả triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid trên chuột cống trắng 41

4.1.1 Về độc tính và khả năng gây xơ gan của CCl4 ở các mức liều khác nhau… 41 4.1.2 Về kết quả triển khai mô hình gây xơ gan với các chế độ liều carbon tetraclorid đã thiết kế 42

4.2 Về tác dụng chống xơ hóa gan của chế phẩm Vượng Can 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

AST Aspartat transaminase

DEN Diethylnitrosamin

DMN Dimethylnitrosamin

ECM Extracellular matrix (Chất nền ngoại bào)

EMT Epithelial-mesenchymal transition (Chuyển dạng biểu mô-trung mô) HBV Virus viêm gan B

HCV Virus viêm gan C

HSC Hepatic stellate cell (Tế bào hình sao)

MFB Myofibroblast (Nguyên bào sợi cơ)

MMP Matrix metalloproteinase (Metalloproteinase gian bào)

NK Natural killer cell (Tế bào diệt tự nhiên)

PPARγ Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (Thụ thể được hoạt

hóa bởi yếu tố tăng sinh peroxisome gamma) PDGF Platelet-derived growth factor (Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu

cầu) ROS Gốc oxy hoạt động

TGF- β Transforming growth factor-β (Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta) TIMP Chất ức chế metalloproteinase

TRIAL Tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (Phối tử gây

chết tế bào theo chương trình liên quan đến TNF) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

2.1 Thành phần trong mỗi viên nén Vượng Can 19

2.2 Thang điểm đánh giá mức độ xơ hóa gan trên tiêu bản mô bệnh

3.1 Ảnh hưởng của CCl4 với các mức liều khác nhau đến số lượng

và tỉ lệ chuột có biểu hiện xơ hóa gan sau 10 tuần thí nghiệm 30

3.2 Ảnh hưởng của CCl4 đến tỷ lệ cá thể có hình thái gan bất thường

3.3 Ảnh hưởng của hai chế độ liều CCl4 đến hàm lượng collagen

3.4 Ảnh hưởng của chế phẩm Vượng Can đến tỷ lệ cá thể có hình

3.5 Ảnh hưởng của chế phẩm Vượng Can đến mức độ xơ gan trên

chuột thí nghiệm được gây xơ hóa bằng CCl4 38

1.1 Một số tác nhân chống xơ hóa hướng tới các đích tác dụng cụ thể 7

2.1 Chế phẩm thử do Công ty Cổ phần dược phẩm Thái Minh cung cấp 19

2.3

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu thăm dò độc tính và khả năng gây xơ gan

của carbon tetraclorid với các mức liều khác nhau trên chuột cống

trắng

23

2.4 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu triển khai mô hình gây xơ gan bằng

2.5 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm Vượng

Can trên mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid 25

3.1 Hình ảnh minh họa đại thể gan chuột của các lô động vật thí

3.2 Tỷ lệ phần trăm khối lượng gan so với khối lượng cơ thể của các

3.3 Ảnh hưởng của hai chế độ liều CCl4 đến hoạt độ ALT và AST huyết

3.4 Hình ảnh gan đặc trưng của các lô chuột thí nghiệm 35

3.5 Ảnh hưởng của chế phẩm Vượng Can đến hoạt độ AST, ALT trong

huyết thanh chuột được gây xơ gan bằng CCl4 36

3.6 Ảnh hưởng của chế phẩm Vượng Can đến nồng độ bilirubin toàn

phần trong huyết thanh chuột được gây xơ gan bằng CCl4 36

3.7 Ảnh hưởng của chế phẩm Vượng Can đến hàm lượng collagen ước

tính trong gan chuột thí nghiệm được gây xơ gan bằng CCl4 37

3.9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xơ gan là bệnh lý mạn tính gây tổn thương lan toả các tiểu thuỳ gan, đặc trưng bởi quá trình xơ hóa, đảo lộn cấu trúc các tiểu thùy và mạch máu trong gan [26] Với hơn 1 triệu ca tử vong, xơ gan được xếp vào nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ

11 trên thế giới [54] Mặc dù những nghiên cứu gần đây đã giúp làm sáng tỏ một phần

cơ chế bệnh sinh của bệnh lý này, hiện tại vẫn chưa có thuốc nào được phê duyệt cho mục đích dự phòng và điều trị xơ hóa tiến triển [56] Điều này đặt ra nhu cầu cấp thiết trong việc tìm kiếm và phát triển các tác nhân chống xơ hóa mới có tiềm năng áp dụng trên lâm sàng

Trong bối cảnh đó, nhiều mô hình gây xơ hóa gan trên động vật đã được xây dựng và trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu bệnh sinh cũng như phát hiện, đánh giá các thuốc tiềm năng trong điều trị xơ hóa Trong các mô hình đã được đề xuất, gây xơ hóa bằng carbon tetraclorid (CCl4) trên chuột thí nghiệm là một trong những mô hình được sử dụng phổ biến nhất [16] Tuy nhiên, mô hình này vẫn còn tồn tại nhiều khác biệt giữa các nghiên cứu khác nhau liên quan đến đường dùng, thời gian dùng và chế độ liều của tác nhân gây xơ hóa Ngoài ra, các chủng động vật thí nghiệm thường khác nhau về đặc tính miễn dịch, dẫn đến biến thiên về đáp ứng giữa các chủng khác nhau với cùng một chế độ liều của carbon tetraclorid [18] Mặt khác,

đa số các nghiên cứu hiện nay thường sử dụng carbon tetraclorid theo đường tiêm phúc mạc Đường dùng này có một số hạn chế như xâm lấn, có thể gây viêm phúc mạc mạn tính và ảnh hưởng đến thể trạng động vật thí nghiệm [40] Trong khi đó, các nghiên cứu sử dụng CCl4 theo đường uống hiện nay còn tương đối hạn chế và ít được áp dụng tại Việt Nam Hơn nữa, khi áp dụng mô hình gây xơ gan bằng CCl4, phần lớn các nghiên cứu trong nước mới chỉ tập trung vào các tiêu chí gợi ý mức độ tổn thương gan do xơ hóa như hoạt độ enzym gan và các chỉ số sinh hóa khác [2], [3], [7], [8], [9] Tuy nhiên, xơ gan là bệnh lý đặc trưng bởi sự biến đổi hình thái cấu trúc gan do sự lắng đọng của các tổ chức xơ trong nhu mô gan và những thay đổi này chỉ có thể đánh giá chính xác thông qua tiêu bản mô bệnh học gan [42] Do vậy,

nghiên cứu này được thực hiện nhằm triển khai mô hình gây xơ gan bằng carbon tetraclorid đường uống, sử dụng những thông số có thể phản ánh chính xác tình trạng

xơ hóa gan trên động vật thí nghiệm

Vượng Can là chế phẩm kết hợp giữa một số cao dược liệu và hợp chất thiên nhiên đã được biết đến với tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan như: cỏ nhọ nồi, bại tượng thảo, methionin … [1], [6] Mặc dù đã có mặt trên thị trường với công dụng hỗ trợ điều trị một số bệnh lý về gan trong đó có xơ gan, cơ sở khoa học chứng minh cho hiệu quả tiền lâm sàng của chế phẩm này còn rất hạn chế Do đó, ngoài mục tiêu triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid đường uống, nghiên cứu cũng hướng đến việc đánh giá tác dụng chống xơ hóa của chế phẩm Vượng Can

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetrachorid đường uống và áp dụng đánh giá tác dụng của chế phẩm Vượng Can” được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid đường uống trên chuột cống trắng

2 Đánh giá tác dụng chống xơ hóa gan của chế phẩm Vượng Can trên mô hình

đã triển khai

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Xơ gan

1.1.1 Định nghĩa

Xơ gan (cirrhosis) là bệnh lý mạn tính gây tổn thương lan toả ở các tiểu thuỳ gan, đặc trưng bởi quá trình xơ hóa (fibrosis), đảo lộn cấu trúc các tiểu thùy và mạch máu trong gan [26] Hình thái học của xơ gan là kết quả của 3 quá trình đồng thời hoặc nối tiếp: (1) viêm, hoại tử tế bào nhu mô gan; (2) sự tăng sinh xơ của tổ chức liên kết tạo sẹo xơ hóa; (3) sự hình thành các hạt tái tạo từ tế bào gan còn nguyên vẹn làm đảo lộn cấu trúc bình thường dẫn đến hình thành các u, cục trong nhu mô gan [5]

bố do bệnh nhân xơ gan ở giai đoạn còn bù thường không có triệu chứng và hầu hết các trường hợp chỉ được phát hiện khi đã xuất hiện các biến chứng [32] Tỉ lệ tử vong trong vòng 1 năm của bệnh nhân xơ gan dao động từ 1% đến 57%, tùy thuộc vào giai đoạn bệnh [17] Bên cạnh đó, gần 50% bệnh nhân xơ gan sẽ xuất hiện cổ trướng trong

10 năm và gần một nửa số ca xuất hiện cổ trướng sẽ tử vong trong vòng 2 năm [26]

1.1.3 Nguyên nhân

Xơ gan bắt nguồn từ nhiều nguyên nhân khác nhau Các nguyên nhân thường gặp là viêm gan B, C và do rượu Ở các nước phát triển, hầu hết các trường hợp xơ gan là do viêm gan nhiễm mỡ liên quan đến nghiện rượu hoặc viêm gan C [37] Ở khu vực Châu Á-Thái Bình Dương và Châu Phi, viêm gan B mạn tính là nguyên nhân gây xơ gan thường gặp nhất [37] Tổn thương ống mật cũng có thể gây xơ gan như tắc nghẽn ống mật cơ học, xơ hóa đường mật nguyên phát Bên cạnh đó, nhiều trường hợp xơ gan không rõ nguyên nhân, có thể do các bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu gây ra [52]

Ngoài ra, một số nguyên nhân khác có thể dẫn tới xơ gan như: viêm gan tự miễn; các bệnh di truyền (xơ hóa nang, thiếu alpha-1 antitrypsin …); phơi nhiễm với thuốc, chất độc và các hóa chất khác (như methotrexat, isoniazid …); nhiễm kí sinh trùng (sán máng, sán lá gan); rối loạn chuyển hóa (rối loạn chuyển hóa đồng, nhiễm sắc tố sắt …) [5]

Xơ hóa gan liên quan đến những thay đổi lớn cả về lượng và thành phần ECM

Ở giai đoạn tiến triển, lượng ECM trong gan tăng khoảng 6 lần so với bình thường,

bao gồm collagen (typ I, III và IV), fibronectin, undulin, elastin, laminin, hyaluronan

và proteoglycan [32] ECM có nguồn gốc từ rất nhiều loại tế bào, trong đó tế bào hình sao (HSC) là các tế bào sản xuất ECM chủ yếu trong mô gan tổn thương Ngoài ra, một số loại tế bào trung mô từ nhiều nguồn khác nhau cũng đóng góp vào quá trình hình thành và lắng đọng ECM, bao gồm các nguyên bào sợi cơ (MFB-myofibroblast)

ở khoảng cửa, các MFB tạo ra từ quá trình chuyển dạng biểu mô-trung mô, các tế bào

có nguồn gốc tủy xương … [56] Trong gan bình thường, tế bào hình sao cư trú ở khoang Disse và là nơi dự trữ vitamin A chủ yếu Sau tổn thương mạn tính, các tế bào hình sao được hoạt hóa và chuyển thành các nguyên bào sợi cơ Các tế bào này

sẽ di chuyển và tích tụ ở những vùng mô cần sửa chữa, tiết ra một lượng lớn collagen

và chất nền ngoại bào, cuối cùng dẫn tới xơ hóa gan [31] Ngoài tế bào hình sao, vai trò của các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương trong quá trình hình thành và lắng đọng ECM ngày càng được hiểu rõ Nghiên cứu của Kisseleva và cộng sự năm 2006 cho thấy các tế bào sợi từ tủy xương hiện diện trong gan và có thể biệt hóa thành MFB sản xuất collagen nhờ TGF-β [7] Bên cạnh đó, một số bằng chứng cho thấy tế bào trung mô ở khoảng cửa có liên quan đến quá trình xơ hóa [52] Sự hoạt hóa và tăng sinh của các tế bào này thành MFB khởi động quá trình tích tụ collagen gây lắng đọng ECM Ngoài ra, các nguyên bào sợi cơ có nguồn gốc từ quá trình chuyển dạng biểu mô-trung mô đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh xơ hóa liên quan đến các bệnh về ứ mật [46]

Hoạt hóa tế bào hình sao là sự kiện trung tâm trong xơ hóa gan [55] Quá trình này được khởi phát bởi nhiều yếu tố bao gồm các cytokin (đặc biệt là TGF-β, yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu, các gốc oxy hoạt động (ROS), các tế bào chết theo chương trình …) [19] Quá trình hoạt hóa tế bào hình sao trải qua 2 giai đoạn chính:

giai đoạn khởi đầu (còn gọi là giai đoạn tiền viêm) và giai đoạn duy trì Giai đoạn

khởi đầu có liên quan đến những thay đổi sớm về biểu hiện gen và kiểu hình đáp ứng với các cytokin và các kích thích khác, chủ yếu liên quan đến các kích thích cận tiết Trong khi đó, giai đoạn duy trì là kết quả của các kích thích này trong việc duy trì kiểu hình hoạt hóa và gây ra xơ hóa, liên quan đến vòng lặp tự tiết cũng như cận tiết

Trong giai đoạn khởi đầu, những thay đổi sớm nhất của các tế bào hình sao có thể là

do kích thích cận tiết bởi các tế bào lân cận, bao gồm: tế bào nội mô mao mạch hình sin, tế bào Kupffer, tế bào gan và tiểu cầu Các tế bào nội mô có thể tham gia vào sự chuyển đổi yếu tố tăng trưởng TGF-β sang dạng hoạt hóa, trở thành tác nhân gây xơ hóa Tiểu cầu cũng là nguồn kích thích cận tiết quan trọng, bao gồm các yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), TGF-β1, yếu tố tăng trưởng biểu bì Ngoài ra, các tế bào Kupffer có thể tham gia vào quá trình họat hóa tế bào hình sao, chúng kích thích tổng hợp chất nền, tăng sinh tế bào và giải phóng retinoid từ các tế bào hình sao thông qua hoạt động của các cytokin (đặc biệt là TGF-β) và các gốc oxy hoạt động Các tế bào gan bị phá hủy giải phóng các gốc oxy hoạt động và các chất trung gian gây xơ, kích thích hoạt hóa HSC và hoạt tính gây xơ hóa của các nguyên bào sợi cơ Giai đoạn duy trì kèm theo ít nhất 7 thay đổi quan trọng: (1) tăng sinh, (2) hóa ứng động, (3) gây xơ hóa, (4) co bóp, (5) thoái biến chất nền, (6) mất retinoid, (7) hóa hướng động bạch cầu và giải phóng cytokin Những thay đổi này đều làm tăng lắng đọng chất nền ngoại bào dẫn tới hình thành và tiến triển xơ gan [56]

Sự tích tụ ECM là hậu quả của sự tăng tổng hợp và giảm thoái biến chất nền [33] Do vậy, tăng cường thoái biến chất nền dần trở thành cơ chế chính của sự hồi phục xơ gan Yếu tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình này là các metalloproteinase (MMP) có tác dụng phân giải chất nền [55] Quá trình thoái biến chất nền diễn ra với sự tham gia của 4 enzym: MMP-2, MMP-9, stromelysin-1 và metalloproteinase màng typ 1 hoặc typ 2 Trong đó, MMP-2 (chủ yếu từ các tế bào hình sao), cùng với MMP-9 (tiết ra từ các tế bào Kupffer) có vai trò chính trong việc phân hủy collagen typ 4 Stromelysin-1 là enzym thoái hóa proteoglycan, glycoprotein và hoạt hóa collagenase Enzym metalloproteinase màng typ 1 hoặc typ

2 đóng vai trò hoạt hóa MMP-2 [55] Sự giảm hoạt động của các MMP phân giải chất nền chủ yếu là do sự biểu hiện quá mức của các tác nhân ức chế đặc hiệu metalloproteinase (TIMP) [33] Tiến triển xơ hóa gan có liên quan mật thiết với sự tăng TIMP-1 hoặc TIMP-2 làm giảm hoạt tính của các MMP phân giải protein, dẫn đến tích tụ ECM Tăng TIMP-1 được xem là tác nhân chính thúc đẩy xơ hóa tiến

triển, do vậy, giảm TIMP-1 là một trong những điều kiện tiên quyết cho phép đảo ngược xơ hóa [56]

1.1.5 Tiếp cận điều trị chống xơ hóa gan

Với sự phát triển của y học hiện đại, nhiều hướng tiếp cận khác nhau trong điều trị xơ hóa gan đã và đang được nghiên cứu Trong đó, một số hướng tiếp cận phổ biến bao gồm: (1) loại trừ nguyên nhân gây bệnh, (2) giảm viêm và đáp ứng miễn dịch nhằm tránh hoạt hóa tế bào hình sao, (3) ức chế hoạt hóa tế bào hình sao, (4) ức chế hoạt tính của tế bào hình sao đã hoạt hóa (trung hòa đáp ứng tăng sinh, gây xơ hóa,

co thắt và/hoặc đáp ứng viêm của tế bào hình sao), (5) hoạt hóa quá trình chết theo chương trình của tế bào hình sao, (6) tăng thoái biến chất nền [19], [20]

Một số tác nhân chống xơ hóa hướng đến các đích tác dụng cụ thể được minh họa tại Hình 1.1 [19]

Hình 1.1 Một số tác nhân chống xơ hóa hướng tới các đích tác dụng cụ thể

Chú thích: HSC: tế bào hình sao; HC: tế bào gan; BEC: tế bào biểu mô đường mật; M ϕ: đại thực bào; MFB: nguyên bào sợi cơ, MMP: metalloproteinase gian bào, TIMP: chất ức chế metalloproteinase, NK: tế bào diệt tự nhiên.

Loại bỏ nguyên nhân gây bệnh

Đây là phương pháp rất hiệu quả trong điều trị xơ hóa gan Một số nghiên cứu

đã chỉ ra rằng điều trị nguyên nhân có thể làm ngừng tiến triển, thậm chí đảo ngược

xơ gan [37] Việc loại bỏ HBV, HCV hoặc HDV bằng thuốc kháng virus có thể dẫn đến sự đảo ngược xơ hoá và cải thiện chức năng gan Tương tự, ngừng uống rượu, điều trị hội chứng thừa sắt hoặc thừa đồng (bệnh Wilson) … cũng có thể thúc đẩy quá trình phục hồi xơ hóa gan Đặc biệt, các thuốc kháng virus thường được sử dụng như IFN-α, ribavirin, lamivudin, adefovir, entecavir đã được chứng minh là có tác dụng chống xơ hóa gan Ở bệnh nhân viêm gan virus C có xơ gan giai đoạn còn bù, việc điều trị bằng interferon giúp làm giảm tải lượng virus, giảm tiến triển xơ gan mất bù

và ung thư biểu mô tế bào gan trên 40% bệnh nhân thuộc genotyp 1 và 70% thuộc bệnh nhân genotyp 2 hoặc 3 Việc điều trị lâu dài bằng các thuốc ức chế HBV dòng

L-Nucleosid không chỉ làm chậm tiến triển xơ gan, mà còn ngăn ngừa xuất hiện các

biến chứng xơ gan [37]

Giảm viêm và đáp ứng miễn dịch nhằm tránh hoạt hóa tế bào hình sao

Phản ứng viêm và đáp ứng miễn dịch là nguyên nhân trực tiếp phá hủy tế bào gan và hoạt hóa HSC Do đó, các liệu pháp chống viêm và ức chế miễn dịch là những biện pháp quan trọng trong việc ức chế sự phát triển xơ hóa, đặc biệt đối với xơ hóa

và xơ gan do viêm gan virus, viêm gan tự miễn, xơ hóa đường mật nguyên phát Các thuốc chống viêm như celecoxib, các chất chống oxy hoá như taurin và vitamin E đều cho thấy một phần tác dụng chống xơ hóa Tương tự, glucocorticoid, azathioprin, colchicin và rapamycin có tác dụng chống viêm, điều hòa miễn dịch, do vậy chúng

có thể hữu ích trong điều trị xơ hóa gan [52]

Quá trình chết theo chương trình của các tế bào gan là một sự kiện thường gặp trong tổn thương gan, góp phần hình thành xơ hóa và phát triển xơ gan Do đó, ngăn ngừa quá trình chết theo chương trình và thúc đẩy quá trình tái tạo tế bào gan có thể

là những phương pháp hữu ích trong điều trị xơ hóa gan và xơ gan Một nhóm các thuốc mới được gọi chung là “thuốc bảo vệ gan” đã thể hiện vai trò tiềm năng trong

việc ngăn ngừa phát sinh xơ hóa, bao gồm yếu tố tăng trưởng tế bào gan (HGF), các chấtức chế caspase, chất chống oxy hóa (silymarin) … [52]

Ức chế hoạt hóa tế bào hình sao

Quá trình hoạt hóa HSC không hoạt động thành MFB là sự kiện đóng vai trò trung tâm trong quá trình phát sinh xơ hóa và trở thành đích tác dụng tiềm năng của nhiều liệu pháp chống xơ hóa Các nghiên cứu tập trung vào quá trình hoạt hóa HSC

đã xác định được rất nhiều các tác nhân chống xơ hóa có giá trị trên lâm sàng, trong

đó có các thuốc đồng vận PPARγ (pioglitazon), α/γ interferon, chất đối kháng

TLR-4 Các phối tử PPARγ tổng hợp có khả năng gắn vào các thụ thể của nó và làm giảm hoạt hóa tế bào hình sao Do vậy, rất nhiều thuốc đồng vận PPARγ đang được thử nghiệm lâm sàng cho cả bệnh viêm gan nhiễm mỡ không do rượu và các bệnh gan xơ hóa khác Ngoài tác dụng kháng virus, IFN-α còn có thể điều hòa sự hoạt hóa tế bào hình sao IFN-γ đã được chứng minh có tác dụng làm giảm sự lắng đọng ECM trong

cơ thể bằng cách ức chế hoạt hóa HSC Chuột được sử dụng IFN-γ đã giảm sản xuất

và tích tụ collagen, laminin, fibronectin và pro-collagen typ I trong gan Tuy nhiên, tác dụng chống xơ hóa gan của IFN-α và IFN-γ chưa nhất quán Một nghiên cứu gần đây đã cho thấy IFN-α và IFN-γ có khả năng chống lại quá trình chết theo chương trình của các tế bào hình sao đã hoạt hóa [20]

Ức chế hoạt tính của tế bào hình sao đã hoạt hóa (trung hòa đáp ứng tăng sinh, gây

xơ hóa, co thắt và/hoặc đáp ứng viêm của tế bào hình sao)

Những bằng chứng mới về vai trò của các yếu tố tăng trưởng tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các tác nhân chống xơ hóa, đặc biệt là các thuốc đối kháng cytokin và thụ thể của nó Nhờ hiểu biết sâu hơn về con đường truyền tín hiệu nội bào thông qua các thụ thể tyrosin kinase như: PDGF, TGF-α; các chất đối kháng

cytokin đang được nghiên cứu sâu trên các mô hình in vivo hoặc in vitro (trên các tế

bào hình sao được phân lập), bao gồm các chất ức chế acid γ-linoleic, chất ức chế HMG CoA reductase, perfenidon Hiện nay, các thuốc đối kháng TGF-β cũng đang được thử nghiệm rộng rãi Nhờ tác dụng đối kháng cytokin, các thuốc đối kháng TGF-

β có tác động kép, vừa ức chế sản sinh ECM, vừa đẩy nhanh sự thoái biến của phức

hợp này Nhiều thử nghiệm in vivo và in vitro đã cung cấp bằng chứng cho hướng

điều trị này Ngoài ra, các chất ức chế protein kinase như rapamycin, cùng với khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào hình sao có thể làm chậm tiến triển xơ hóa trên những bệnh nhân nhiễm HCV tái phát [20]

Thúc đẩy quá trình chết theo chương trình của tế bào hình sao

Thúc đẩy quá trình chết theo chương trình của tế bào HSC cũng đang là đích tác dụng thu hút được rất nhiều sự quan tâm Một số tác nhân chống xơ hóa tác động theo cơ chế này như: các phối tử gây chết tế bào theo chương trình liên quan đến TNF (TRIAL), gliotoxin, sulfasalazin, cannabinosid Một nghiên cứu gần đây sử dụng gliotoxin gây chết tế bào hình sao theo chương trình đã thể hiện tác dụng chống xơ hóa trên chuột có tổn thương gan do CCl4, cung cấp thêm bằng chứng cho hướng tiếp cận điều trị này [20]

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã quan tâm đến vai trò của tế bào diệt tự nhiên trong việc phục hồi xơ hóa Sự kích hoạt tế bào diệt tự nhiên bởi acid polyinosinic-polycytidylic hoặc interferon-gamma đã được chứng minh là gây chết theo chương trình của các tế bào sao đã hoạt hóa và giảm mức độ hình thành các mô sẹo trong hai mô hình xơ gan thực nghệm Do đó, hoạt hóa các tế bào diệt tự nhiên

đã trở thành một hướng tiếp cận mới trong điều trị xơ hóa gan [31]

Tăng thoái biến chất nền

Bản chất của xơ hóa là đáp ứng làm lành vết thương quá mức, trong đó mô liên kết được tạo ra quá nhiều trong gan, sản xuất một lượng lớn chất nền ngoại bào hình thành các mô sẹo Do đó, giảm chất nền ngoại bào là hướng tiếp cận rất quan trọng trong việc tìm ra các tác nhân chống xơ hóa mới Một số liệu pháp chống xơ hóa hướng đến đích tác dụng này đã được đề xuất như: liệu pháp tế bào gốc, các chất ức chế TIMP, halofuginon … Các thuốc đối kháng TGF-β có nhiều ưu điểm bởi tác dụng kích thích sự thoái biến chất nền ngoại bào thông qua làm giảm số lượng các tác nhân

ức chế đặc hiệu metalloproteinase Halofuginon, một hợp chất kháng khuẩn có hoạt

tính chống xơ hóa thông qua khả năng ức chế sản xuất collagen đã và đang được nghiên cứu trong một số mô hình xơ gan thực nghiệm [20]

1.2 Các mô hình gây xơ gan trên động vật thí nghiệm

Các mô hình gây xơ gan trên động vật đã được sử dụng trong nhiều thập kỉ để nghiên cứu xơ hóa gan và tác dụng của các tác nhân chống xơ hóa Những mô hình này đóng vai trò quan trọng trong việc tìm hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh cũng như phát triển các liệu pháp điều trị xơ gan Cho đến nay, nhiều mô hình xơ gan trên động vật đã được xây dựng trên chuột nhắt, chuột cống, thỏ, lợn … nhằm mô phỏng quá trình xơ hóa và xơ gan trên người [51] Trong khuôn khổ cho phép, phần sau đây chỉ đề cập một số mô hình gây xơ hóa gan thường áp dụng trên động vật thực nghiệm

1.2.1 Gây xơ gan bằng các tác nhân hóa học

Các tác nhân hóa học thường được sử dụng là những chất gây tổn thương trực tiếp tế bào gan, dẫn tới hoại tử, kích hoạt phản ứng viêm và một loạt các quá trình phức tạp khác dẫn tới xơ hóa và xơ gan Các tác nhân thường được sử dụng bao gồm CCl4, thioacetamid, dimethylnitrosamin, diethylnitrosamin, dioxin, natri asenat, và ethanol [41]

Nhóm mô hình này được sử dụng rất phổ biến bởi độ lặp lại cao, dễ thực hiện

và có nhiều điểm tương đồng với cơ chế gây xơ hóa gan trên người [16] Tuy nhiên, rất khó kiểm soát nếu tác nhân gây xơ hóa được đưa vào một cách tự do (qua thức ăn hoặc nước uống) hoặc quá trình hấp thu, chuyển hóa các tác nhân gây xơ bị ảnh hưởng Việc sử dụng các tác nhân hóa học khác nhau cũng sẽ dẫn tới một số điểm khác nhau về thời gian gây xơ hóa, thời gian phát triển thành xơ gan, vị trí tổn thương điển hình của từng mô hình [40]

1.2.1.1 Gây xơ gan bằng carbon tetraclorid

Carbon tetrachlorid (CCl4) là chất gây xơ hóa được sử dụng rộng rãi nhất trong các nghiên cứu về xơ gan trên động vật gặm nhấm [16] Mô hình gây xơ gan sử dụng

carbon tetraclorid mang nhiều điểm tương đồng với với quá trình hình thành và phát triển xơ gan do tiếp xúc với các tác nhân độc hại trên người [18]

Trong cơ thể CCl4 được chuyển hóa thành •CCl3 bởi hệ thống enzym CYP450 (CYP2E1) Gốc •CCl3 tạo thành phản ứng với các acid nucleic, protein và lipid làm giảm tổng hợp protein, gây rối loạn chức năng màng tế bào và thúc đẩy quá trình peroxy hóa lipid Bên cạnh đó, gốc •CCl3 có thể phản ứng với các phân tử oxy tạo thành gốc •OOCCl3 Đây là gốc tự do có tính ái điện tử lớn hơn gốc •CCl3 và có khả năng tấn công các acid béo không no (quá trình peroxy hóa lipid) Sự tấn công của các gốc tự do lên các lipid màng cuối cùng có thể dẫn đến chuỗi phản ứng peroxy hóa lipid và gây hoại tử tế bào gan tại trung tâm tiểu thùy, từ đó kích hoạt hóa một loạt các phản ứng làm lành vết thương của cơ thể để phục hồi sự toàn vẹn của tế bào gan

Đó là quá trình rất phức tạp, trong đó có sự tăng sinh của các tế bào nhu mô và phi nhu mô thay thế các tế bào hoại tử, sự tham gia của các tế bào thực bào, tế bào miễn dịch để loại bỏ tổn thương, sự hoạt hóa tăng sinh sợi và chất nền ngoại bào Nếu tổn thương gan vẫn tiếp diễn, cuối cùng, sự tái sinh của gan không đủ để phục hồi, các tế bào gan sẽ bị thay thế bởi lượng lớn chất nền ngoại bào, bao gồm sợi collagen, dẫn tới tích tụ xơ hóa [36], [40]

Nhìn chung, khi sử dụng CCl4, xơ hóa thường phát triển rõ rệt sau 2-4 tuần phơi nhiễm, xơ hóa bắc cầu nghiêm trọng sau 5-7 tuần và xơ gan thường xuất hiện sau 8-

10 tuần phơi nhiễm Xơ gan nốt nhỏ, tăng áp lực tĩnh mạch cửa, cổ trướng thường xuất hiện sau 10-20 tuần Tuy nhiên, thời gian hình thành xơ hóa và tiến triển thành

xơ gan khác nhau tùy thuộc vào liều lượng, đường dùng và động vật thí nghiệm [40] Tiêm màng bụng là đường dùng phổ biến do khá thuận tiện, tính lặp lại cao và dung nạp tốt, tuy nhiên, đường dùng này có thể gây viêm phúc mạc mạn tính, làm ảnh hưởng đến thể trạng động vật thí nghiệm và kết quả của nghiên cứu [40] Có nhiều tranh luận xoay quanh vấn đề sử dụng CCl4 đường uống Một số tác giả cho rằng đường uống là đường dùng có tỉ lệ lặp lại kết quả xơ hóa cao nhất với tỉ lệ động vật sống sót chấp nhận được Trong khi một số tác giả khác không khuyến khích lựa

chọn đường uống do tỉ lệ tử vong cao ở giai đoạn đầu [16] Tiêm dưới da là đường dùng giúp làm giảm tỉ lệ tử vong ở động vật, tuy nhiên, đường dùng này có thể phát triển u hạt tại chỗ tiêm [16] Bên cạnh các đường dùng trên, CCl4 đường hít cũng đã được sử dụng để gây xơ hóa gan trên thực nghiệm Đường dùng này có nhiều ưu điểm như: không xâm lấn, không gây các phản ứng viêm tại chỗ tiêm như đối với đường tiêm dưới da và tiêm màng bụng Tuy nhiên, để tiến hành phương pháp này đòi hỏi cần có dụng cụ chuyên biệt và kinh nghiệm nhất định [40]

Với mục đích tăng độc tính của CCl4, một số tác giả đã sử dụng CCl4 cùng một chất cảm ứng enzym CYP2E1 Bằng cách thêm phenobarbital vào nước uống, enzym CYP2E1 được cảm ứng giúp đẩy nhanh quá trình hình thành xơ hóa, từ đó có thể rút ngắn được thời gian gây mô hình Tuy nhiên, phương pháp này cũng làm tăng tỉ lệ tử vong trên động vật Mặc dù những tổn thương ngoài gan là tối thiểu (do CYP2E1 ít tồn tại ngoài gan), tình trạng viêm, hoại tử vẫn có thể xảy ra tại chỗ tiêm gây ảnh hưởng xấu đến thể trạng động vật thí nghiệm [40]

Khoảng thời gian sau liều CCl4 cuối cùng cho đến khi giết động vật thí nghiệm

để lấy mẫu nghiên cứu cũng là yếu tố quan trọng Sau liều CCl4 cuối cùng, nếu giết chuột quá sớm, viêm và hoại tử là quá trình nổi bật Tuy nhiên, nếu giết chuột quá muộn (sau 3 ngày), quá trình phục hồi tổn thương chiếm ưu thế Do vậy, thời điểm

48 đến 72 giờ sau liều CCl4 cuối cùng được cho là thời điểm tốt nhất để giết chuột và lấy mẫu xét nghiệm [40]

1.2.1.2 Gây xơ gan bằng thioacetamid

Ngoài carbon tetraclorid, thioacetamid (TAA) là một tác nhân sinh ung thư thường được sử dụng để gây xơ hóa gan trên động vật thực nghiệm [40] Trong cơ thể, TAA được chuyển hóa bởi CYP450 tạo thành chất chuyển hóa có độc tính (thioacetamid sulphur dioxyd) [16] Sử dụng TAA với liều thấp, kéo dài dẫn tới hình thành các khối u trong gan; tuy nhiên khi sử dụng liều cao, tế bào gan bị hoại tử và hình thành xơ hóa [41] Khác với các tác nhân khác, tổn thương điển hình gây ra bởi TAA là khu vực quanh tĩnh mạch cửa [40] Salguero Palacios R và cộng sự đã sử

dụng TAA thêm vào nước uống của chuột nhắt trắng với nồng độ 200 mg/l, kết quả cho thấy trong thời gian dưới 10 tuần, xơ hóa phát triển chưa rõ rệt, xơ hóa nặng bắc cầu được ghi nhận từ tuần thứ 16 trở đi [36] Gần đây, Wallace M.C và cộng sự đã

sử dụng TAA tiêm màng bụng với liều 150 mg/kg cân nặng, 3 lần/tuần và nhận thấy

xơ hóa gan phát triển rõ rệt trong khoảng 8-12 tuần [43] Hạn chế khi sử dụng mô hình TAA là cần một thời gian khá dài để phát triển xơ hóa Bên cạnh đó, ung thư đường mật và ung thư biểu mô tế bào gan cũng được mô tả trên chuột thí nghiệm sau một thời gian dài tiếp xúc với TAA [40]

1.2.1.3 Gây xơ gan bằng dimethylnitrosamin và diethylnitrosamin

Dimethylnitrosamin (DMN) và diethylnitrosamin (DEN) là những hợp chất gây ung thư thường được sử dụng để gây xơ hóa gan trên động vật thí nghiệm [41] Cơ chế gây xơ hóa gan của DMN và DEN tương tự như CCl4 Trong cơ thể, DMN và DEN được chuyển hóa thành chất chuyển hóa có độc tính bởi CYP2E1, sản sinh ra các gốc methyl hóa hoạt động Sản phẩm cộng hợp tạo thành bởi các gốc methyl hóa hoạt động và acid nucleic vừa gây độc tính trên gan vừa tạo ra các đột biến Hoại tử xuất hiện ở xung quanh các tĩnh mạch trung tâm cũng như ở khu vực xung quanh khoảng cửa với các vách ngăn nối giữa khoảng cửa và trung tâm tiểu thùy sau một vài tuần sử dụng DEN đường uống hoặc tiêm màng bụng [40] Jin N và cộng sự đã

sử dụng dung dịch DEN 1,5% với liều 5 ml/kg cân nặng trong vòng 3-11 tuần để gây

xơ hóa gan trên chuột cống trắng, kết quả cho thấy trong số 27 chuột được gây xơ hóa bằng DEN, 4 chuột chưa hình thành xơ hóa gan, 8 chuột hình thành xơ hóa gan

rõ rệt và 15 chuột phát triển xơ gan [24] Trên chuột nhắt trắng, DEN thường được

sử dụng với liều 100 μl/kg cân nặng trong vòng 12 tuần DMN cũng được sử dụng tiêm màng bụng trên chuột nhắt trắng với liều 10 μg/g, 3 lần/tuần trong 3 tuần [16]

Khác với các mô hình trên, xơ hóa gan gây ra bởi DEN và DMN vẫn được duy trì và thậm chí phát triển trong nhiều tuần hoặc nhiều tháng sau khi ngừng tác nhân gây xơ hóa Ung thư sẽ phát triển sau một thời gian tiếp xúc với DEN (dù tiếp tục dùng DEN hoặc đã ngừng sử dụng) Do đó, mô hình này không phải là lựa chọn hàng

đầu khi nghiên cứu xơ hóa đơn thuần, nhưng có thể được lựa chọn khi nghiên cứu mối quan hệ giữa xơ hóa gan và ung thư biểu mô tế bào gan [40]

1.2.2 Gây xơ gan bằng phương pháp thắt ống dẫn mật

Mô hình gây xơ hóa gan và xơ gan sử dụng phương pháp thắt ống dẫn mật lần đầu tiên được tiến hành trên chuột cống trắng bởi Rodríguez-Garay và cộng sự vào năm 1996, sau đó được áp dụng cho chuột nhắt trắng bởi Miyoshi H và cộng sự vào năm 1999 [16] Chuột cống trắng được đánh giá là đối tượng phù hợp với mô hình này do cơ thể chúng thiếu túi mật [40]

Khi thắt ống dẫn mật, một loạt các biến cố xuất hiện bao gồm: tắc nghẽn ống mật gây tăng áp lực đường mật, viêm, tăng tiết cytokin và ứ mật Các tế bào biểu mô đường mật tăng sinh, dẫn đến sự tăng sinh tiểu quản mật, kèm theo viêm và xơ hóa ở

khoảng cửa Ngoài tế bào hình sao, các nghiên cứu đã chứng minh rằng các nguyên

bào sợi ở khoảng cửa cũng là những tế bào góp phần quan trọng vào quá trình gây xơ hóa trên mô hình này [16], [40]

Với mô hình thắt ống dẫn mật, xơ hóa phát triển sau vài tuần, rối loạn huyết động, cổ trướng thường xuất hiện sau 6-8 tuần Nguyên nhân tử vong trong những tuần đầu tiên thường do rò rỉ mật, vỡ u nang ống mật hoặc túi mật (trên chuột nhắt trắng) Hạn chế lớn nhất khi sử dụng mô hình này trong nghiên cứu là tỉ lệ tử vong cao (>20% và thường xảy ra sau tuần thứ 4) Tuy nhiên mô hình này vẫn có thể sử dụng cho các nghiên cứu ngắn hạn về xơ gan do ứ mật [40]

1.2.3 Gây xơ gan bằng phương pháp miễn dịch

Gây xơ gan bằng huyết thanh dị chủng

Các kháng nguyên thường được sử dụng là huyết thanh lợn và ngựa, albumin lòng trắng trứng, gamma globulin người và globulin huyết thanh lợn Trong đó, tiêm phúc mạc huyết thanh lợn được đánh giá là phương pháp cho hiệu quả cao nhất [41]

Khi tiêm dưới da (thường 2 lần/tuần) huyết thanh dị chủng (thường sử dụng huyết thanh lợn với liều 0,5 ml/cá thể chuột cống hoặc 3,5 ml/kg cân nặng), xơ hóa

thường phát triển sau 5 tuần và tiến triển thành xơ gan sau khoảng 10 tuần [41] Mức

độ xơ hóa phụ thuộc vào chủng động vật thí nghiệm [40] Về mặt mô bệnh học, thay

đổi giải phẫu thường được đặc trưng bởi thâm nhiễm bạch cầu đơn nhân, tăng sinh

xơ ở khoảng cửa, hình thành các vách ngăn nối giữa khoảng cửa và các tĩnh mạch trung tâm [41] Với mô hình này, viêm là dạng tổn thương nổi bật do bạch cầu ái toan,

tế bào mast xâm nhập vào nhu mô gan [40] Do đó, mô hình này thường được sử dụng

để nghiên cứu vai trò của các đại thực bào, tế bào hình sao và các nguyên bào sợi trong xơ hóa gan [41]

Gây xơ gan bằng cách tiêm dưới da ấu trùng sán máng (Schistosomis mansoni)

Sau khi tiêm dưới da ấu trùng sán máng (Schistosomis mansoni), nhờ đáp ứng

viêm và đáp ứng miễn dịch với ấu trùng, u hạt phát triển trong gan trong sau 6- 8 tuần Collagen gan tăng gấp 20 lần bình thường kèm theo giảm tổng hợp albumin Cơ chế tăng sinh collagen và giảm tổng hợp albumin được đánh giá là có liên quan đến yếu tố tăng trưởng TGF-β [41]

1.2.4 Mô hình động vật biến đổi gen

Mô hình động vật biến đổi gen đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu

về xơ hóa gan trong nhiều thập kỉ qua Những mô hình này cho phép hiểu sâu hơn về vai trò của một số protein trong quá trình hình thành xơ gan, từ đó tạo điều kiện cho việc phát hiện các tác nhân chống xơ hóa mới Trong đó, chuột biến đổi gen mdr2 và alms1 là những mô hình phổ biến nhất [16]

Mdr2 là một gen mã hóa cho P-glycoprotein có liên quan đến bài tiết phospholipid mật Khi thiếu P-glycoprotein, quá trình bài tiết phospholipid vào mật

bị cản trở Do đó, chuột bị khiếm khuyết gen mdr2 sẽ phát triển kiểu hình giống xơ hóa đường mật nguyên phát ở người; bao gồm hoại tử tế bào gan, phản ứng viêm ở khoảng cửa và sự phá hủy các tiểu quản mật Chuột khiếm khuyết gen mdr2 sẽ xuất hiện xơ hóa đường mật ở 4-8 tuần tuổi Sau 4 tuần, TGF-β và các chất chỉ điểm hoạt hóa HSC bao gồm α-SMA, MMP-22 và PDGF-β tăng đáng kể Sự xuất hiện của một lượng lớn collagen được ghi nhận ở tuần thứ 8, dẫn đến sự hình thành cấu trúc sẹo xơ

hóa cùng với sự phá hủy ống mật Chuột thiếu mdr2 độ tuổi từ 4-6 tháng có thể phát triển ung thư biểu mô tế bào gan [16].

Alms1 là gen đóng vai trò quan trọng trong hội chứng hội chứng Alstrom ở

người Khi cho chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo, những động vật này xuất hiện chứng béo phì, kháng insulin, đái tháo đường, hạ natri máu, tăng ALT huyết thanh, tế bào gan sưng phồng, xơ hóa quanh các tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy Sau 24 tuần với chế độ ăn giàu chất béo, chuột đột biến alms1 giảm lượng mỡ, thúc đẩy quá trình chuyển mỡ vào gan, giảm nồng độ adiponectin huyết thanh, gây ra tổn thương tế bào gan, tăng kích thước gan và viêm gan Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh rằng sự hiện diện của cholesterol trong chế độ ăn có thể là cơ sở cho việc chuyển đổi

từ bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu sang viêm gan nhiễm mỡ không do rượu Mô hình này dựa vào sự tương tác giữa chế độ ăn và kiểu gen để thúc đẩy tổn thương gan Theo đó, đây là một mô hình hữu ích khi nghiên cứu quá trình chuyển từ bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu thành viêm gan nhiễm mỡ không do rượu bởi nhiều yếu tố khác nhau [16]

1.3 Chế phẩm Vượng Can

Vượng can là chế phẩm dạng viên nén, mỗi viên nén chứa các thành phần: cao

cỏ nhọ nồi, cao bại tượng thảo, cao hoàng bá, methionin, immune gama, vitamin K2 (MK7) Trong đó, một số thành phần đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan

Cỏ nhọ nồi

Cỏ nhọ nồi, còn gọi là cỏ mực hay hạn liên thảo, tên khoa học là Eclipta alba

Hassk, thuộc họ Cúc Asteraceae Theo các nghiên cứu trước đây, hoạt chất có tác

dụng bảo vệ gan trong cây nhọ nồi là wedelolacton (một dẫn chất coumestan), stigmasterol, sitosterol và demethyl wedelolacton [4] Một nghiên cứu gần đây đã cho thấy wedelolacton có tác dụng chống xơ hóa gan thông qua ức chế hoạt hóa thế bào hình sao [49] Ngoài ra, trong cỏ nhọ nồi còn chứa một lượng nhỏ tinh dầu, tanin, chất đắng, caroten và các alcaloid như ecliptin, nicotin [11]

Ở Ấn Độ, cỏ nhọ nồi được dùng làm thuốc bổ và chữa ứ tắc trong các bệnh phì đại về gan lách và chữa một số bệnh về da [4] Theo từ điển cây thuốc của Võ Văn Chi, cỏ nhọ nồi được dùng để điều trị viêm gan mạn tính, viêm ruột Ngoài tác dụng cầm máu đã được biết đến từ lâu, cao lỏng (cồn và nước) cỏ nhọ nồi còn có tác dụng bảo vệ gan thông qua việc hạn chế làm tăng hoạt độ AST, ALT và hạn chế tổn thương

vi thể gan [1] Bên cạnh đó, cao cỏ nhọ nồi cũng đã được chứng minh là có tác dụng chống nhiễm độc gan cấp bởi carbon tetraclorid ở chuột nhắt trắng [4]

Bại tượng thảo

Bại tượng thảo, còn gọi là bại tượng hoa trắng hoặc cỏ bồng, tên khoa học là

Patrinia villosa Juss, thuộc họ Nữ lang (Valerianaceae) Người ta đã phân lập được

được từ bại tượng thảo các hợp chất như: villosid, morronisid, loganin … Bộ phận dùng là toàn cây bại tượng hoa trắng, gọi là bại tượng thảo Bại tượng thảo có vị cay, tính ngọt quy vào 3 kinh can, vị, đại tràng Đây là vị thuốc có tác dụng thanh nhiệt, giải độc; thường được sử dụng để chữa viêm gan, viêm ruột, mụn nhọt, lở ngứa [6]

Hoàng bá

Hoàng bá, còn gọi là hoàng nghiệt hay quan hoàng bá, tên khoa học là

Phellodendron chinensis Rupr, thuộc họ cam (Rutaceae) Hoàng bá có chứa 1,6%

berberin, một lượng nhỏ palmatin, ngoài ra còn có chứa một số hợp chất không có nitơ như obakunon và obakulacton [11] Theo y học cổ truyền, hoàng bá thường được dùng để chữa hoàng đản, tiêu chảy, nhiệt lỵ … [4] Ngoài ra, hoàng bá có thể dùng kết hợp với một số vị thuốc khác như: mộc thông, chi tử, đại hoàng, nọc sởi chữa viêm gan cấp tính, bụng trướng, đau vùng gan [6]

Ngoài các thành phần trên, trong mỗi viên nén Vượng Can còn có chứa methionin là chất giúp tăng cường tổng hợp glutathion và có thể được sử dụng thay thế acetylcystein trong điều trị ngộ độc, immune gamma giúp tăng cường miễn dịch

và vitamin K2 (MK7) có thể có vai trò ngăn ngừa ung thư biểu mô tế bào gan ở phụ

nữ có mắc xơ gan do nhiễm virus viêm gan [21]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1.1 Chế phẩm thử

Chế phẩm thử Vượng Can do Công ty Cổ phần dược phẩm Thái Minh cung

cấp, lô sản xuất: 010915, ngày sản xuất: 08/9/2015, hạn sử dụng: 07/9/2018

Thành phần trong mỗi viên nén và hình ảnh chế phẩm thử được mô tả tại Bảng

2.1 và Hình 2.1

Bảng 2.1 Thành phần trong mỗi viên nén Vượng Can

Cao Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba Hassk)

Cao Bại tượng thảo (Patrinia villosa Juss)

Cao Hoàng bá (Phellodendron chinensis Rupr)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Động vật thí nghiệm

Chuột cống trắng giống cái, chủng Wistar trưởng thành, khỏe mạnh, cân nặng

khi bắt đầu tiến hành thí nghiệm 150 ± 20 g do Học viện quân Y cung cấp

Động vật được nuôi 1 tuần trước khi tiến hành nghiên cứu để thích nghi với môi trường và điều kiện nuôi dưỡng tại phòng thí nghiệm Trước và trong quá trình nghiên cứu, động vật được nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do

Dụng cụ, thiết bị:

- Máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động TC 3300 Plus (Teco diagnostics, Mĩ)

- Máy nghiền đồng thể Wisestir HS-30E

- Máy li tâm Gilson GmClab

- Cân phân tích AY 220 (Shimadzu)

- Cân kĩ thuật Presica-BJ610C, TE412 (Sartorius)

- Máy ELISA (Biotek, Mĩ)

- Máy cất nước 2 lần (Halminton, Mĩ)

- Tủ ấm điều nhiệt (Memmert)

- Nồi hấp (ALP, Nhật)

- Đĩa Costar 3596 (Corning, Mĩ)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Thăm dò độc tính

và khả năng gây

xơ hóa của CCl4

Triển khai mô hình gây xơ gan với các chế độ liều đã chọn

Triển khai mô hình gây xơ gan

bằng CCl4

Đánh giá tác dụng của chế phẩm Vượng Can

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Đánh

giá độc

tính

Định lượng collagen

Đánh giá vi thể gan

Đánh giá đại thể gan

Xét nghiệm sinh hóa máu

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế thành 3 đợt thí nghiệm Hai đợt thí nghiệm đầu được thực hiện để triển khai mô hình gây xơ gan trên chuột cống trắng và đợt thí nghiệm thứ ba để đánh giá tác dụng chống xơ hóa gan của chế phẩm Vượng Can trên mô hình

đã triển khai Nội dung chính của từng đợt thí nghiệm như sau:

Đợt 1: thăm dò độc tính và khả năng gây xơ gan của carbon tetraclorid ở các mức liều khác nhau trên chuột cống trắng

Đợt 2: triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid đường uống trên chuột cống trắng với chế độ liều thích hợp

Đợt 3: áp dụng mô hình đã triển khai để đánh giá tác dụng chống xơ hóa gan của chế phẩm Vượng Can

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid đường uống trên chuột cống trắng

2.3.1.1 Thăm dò độc tính và khả năng gây xơ gan của carbon tetraclorid ở các mức liều khác nhau trên chuột cống trắng

❖ Thiết kế nghiên cứu

Thử nghiệm thăm dò được tiến hành với 3 lô trên một số lượng hạn chế động vật (5 cá thể/lô), sử dụng 3 mức liều CCl4 bao gồm: 0,25 ml/kg, 0,5 ml/kg và 1,0 ml/kg cân nặng (tính theo thể tích CCl4),

Vào ngày thứ hai và thứ năm hàng tuần, chuột thuộc các lô được uống dung dịch CCl4 trong dầu olive với các mức liều như trên Trong suốt thử nghiệm, theo dõi cân nặng (hàng tuần), sự tiêu thụ thức ăn, nước uống và các biểu hiện bất thường của chuột (hàng ngày) Sau 10 tuần cho uống CCl4, giết chuột bằng cách kéo giãn đốt

sống cổ, lấy mẫu gan làm tiêu bản mô bệnh học để xác định mức độ xơ hóa

❖ Thông số đánh giá

- Tỉ lệ chuột chết tại mỗi mức liều CCl4

- Điểm xơ hóa trên tiêu bản mô bệnh học gan của các chuột còn sống tại thời điểm kết thúc thí nghiệm

Dựa trên thử nghiệm thăm dò, thiết kế chế độ liều thích hợp để triển khai mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid trên chuột cống trắng Chế độ liều được áp dụng phải đáp ứng 2 tiêu chí: (1) gây xơ hóa gan rõ rệt; (2) không gây chết chuột thí nghiệm Nếu không có chế độ liều nào thỏa mãn đồng thời 2 tiêu chí trên, cân nhắc điều chỉnh liều dùng và/hoặc thời gian sử dụng carbon tetraclorid trên động vật thí nghiệm

2.3.1.2 Triển khai mô hình gây xơ gan bằng carbon tetraclorid với các chế độ liều

đã thiết lập

❖ Thiết kế nghiên cứu

Chuột cống trắng giống cái sau khi nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 1 tuần được chia ngẫu nhiên vào lô chứng sinh lý và các lô bệnh lý (6-8 con/lô) Các lô bệnh lý được uống dung dịch CCl4 trong dầu olive 2 lần mỗi tuần với các chế độ liều đã chọn Với lô chứng sinh lý, chuột được uống dầu olive với thể tích tương đương (0,05 ml/kg cân nặng)

Uống dung dịch CCl4/dầu olive 2 lần/tuần Thích nghi

0

Theo dõi thể trạng chuột: cân nặng, tiêu thụ thức

ăn, nước uống, biểu hiện bất thường …

10

Lấy mẫu gan làm tiêu bản

mô bệnh học

Tuần -1

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu thăm dò độc tính và khả năng gây xơ gan của

carbon tetraclorid với các mức liều khác nhau trên chuột cống trắng