XÁC ĐỊNH dư LƯỢNG THUỐC bảo vệ THỰC vật TRONG bảo QUẢN củ HÀNH tím VĨNH CHÂU (sóc TRĂNG)

MỤC TIÊU CỤ THỂ Trong khuôn khổ một Luận văn tốt nghiệp đại học đề tài hướng đến mục tiêu:  Thử nghiệm quy trình chiết dư lượng của 2 loại thuốc bảo vệ thực vật Cypermethrin và Isoproca

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- - -    - - -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG BẢO QUẢN

CỦ HÀNH TÍM VĨNH CHÂU (SÓC TRĂNG)

MSSV: 2092072

Lớp: Hóa Học K35

Cần Thơ, 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Năm học 2012-2013

Đề tài:

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG BẢO QUẢN CỦ HÀNH TÍM VĨNH CHÂU (SÓC TRĂNG)

LỜI CAM ĐOAN

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2013 Luận văn tốt nghiệp đại học ngành: Hóa Học Mã số: TN338 Đã bảo vệ và được duyệt Hiệu trưởng………

Trưởng khoa………

Trưởng chuyên ngành Cán bộ hướng dẫn

Nguyễn Thị Diệp Chi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

- -NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Diệp Chi

2 Đề tài: Xác định dư lượng thuốc bảo về thực vật trong bảo quản củ hành tím Vĩnh Châu (Sóc Trăng).

3 Sinh viên thực hiện: Phạm Bình Minh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CẢM ƠN

- -

Trong suốt quá trình học tập ở bậc đại học, được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô trong bộ môn Hóa và bên cạnh việc thực hiện Luận văn tốt nghiệp đã giúp em tiếp thu được nhiều kiến thức bổ ích, tích lũy được nhiều kinh nghiệm quan trọng để

hỗ trợ cho công việc sau này Để đạt được kết quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Tất cả các thầy cô trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô của Bộ môn Hóa – Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho chúng em trong suốt quá trình học tập ở giảng đường Đại học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến và cô Nguyễn Thị Diệp Chi, cô Phạm Bé Nhị cán bộ Bộ môn Hóa – Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình hướng dẫn và luôn tạo điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến anh Trương Vĩnh Lễ và các anh chị trong phòng Quản lý chất lượng và Môi trường - Công ty Cổ phần Thuốc sát trùng Cần Thơ

đã quan tâm, tạo điều kiện và truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm thực tế

bổ ích

Cuối cùng em xin gửi lời ảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm giúp

đỡ em trong suốt khóa học

Em xin chân thành cảm ơn!

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Hành tím Vĩnh Châu 6

Hình 2.2: Người nông dân bị mù khi làm việc không có bảo hộ lao động 7

Hình 2.3: Hành được bảo quản theo công thức của người nông dân 7

Hình 2.4: Thuốc trừ rầy rệp VIMIPC 25WP 12

Hình 2.5: Thuốc trừ sâu VISHER 25EC 13

Hình 2.7: Đồ thị phương pháp ngoại chuẩn 18

Hình 2.8: Đồ thị phương pháp nội chuẩn 19

Hình 3.1: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao……… ……… 26

Hình 3.2: Hệ thống cô quay……….……… 26

Hình 3.3: Peak chuẩn Cypermethrin 33

Hình 3.4: Peak Cypermethrin trong mẫu 33

Hình 3.5: Đồ thị khảo sát tính tuyến tính Cypermethrin 34

Hình 3.6: Sắc ký đồ đồ trên mẫu chiết thực M90 35

Hình 3.7: Peak Isoprocarb trong chuẩn 37

Hình 3.8: Peak Isoprocarb trong mẫu 37

Hình 3.9: Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại Isoprocarb 37

Hình 3.10: Đồ thị khảo sát tính tuyến tính của Isoprocarb……….… 38

Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu thật M90 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) Cypermethrin 34

Bảng 3.2: Khảo sát tính tuyến tính của Cypermethrin 34

Bảng 3.3: Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của Cypermethrin 34

Bảng 3.4: Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) của Cypermethrin 35

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết Cypermethrin 35

Bảng 3.6: Kết quả nồng độ Cypermethrin trên mẫu thật (đơn vị: mg/kg)…….…… 36

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của Isoprocarb 38

Bảng 3.8: Khảo sát tính tuyến tính của Isoprocarb 38

Bảng 3.9: Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của Isoprocarb 38

Bảng 3.10: Kết quả tính giới hạn định lượng (LOQ) của Isoprocarb 39

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết Isoprocarb 39

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC HÌNH ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC BẢNG iii

MỤC LỤC iv

MỞ ĐẦU 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 2

MỤC TIÊU CỤ THỂ 4

TỔNG QUAN 5

CHƯƠNG I: THỊ XÃ VĨNH CHÂU VÀ CỦ HÀNH TÍM[1],[2][12] 6

CHƯƠNG II: THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT VÀ CÁC HOẠT CHẤT SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN HÀNH TÍM[3],[4],[8],[13] 8

I Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật 8

1.1 Định nghĩa 8

1.2 Phân loại 8

II Hoạt chất Cypermethrin và Isoprocarb 9

2.1 Cypermethrin 9

2.1.1 Tính chất 9

2.1.2 Công thức và danh pháp 9

2.1.3 Ứng dụng và ảnh hưởng của Cypermethrin trong nông nghiệp 10

2.2 Isoprocarb 11

2.2.1 Tính chất 11

2.2.2 Công thức và danh pháp 11

2.2.3 Ứng dụng trong nông nghiệp 12

2.3 Công thức bảo quản và các loại thuốc hóa học dùng trong công thức bảo quản 12

2.3.1 Công thức bảo quản 12

2.3.2 Các loại thuốc hóa học dùng trong công thức bảo quản: 12

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)[7],[11],[14],[15],[16] 14

I Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

1.1 Nguyên tắc, cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

1.2 Các yếu tố và thông số đặc trưng của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 16

1.2.1 Các yếu tố trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 16

1.2.2 Các thông số đặc trưng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 16

1.3 Định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 16 1.3.1 Định tính 16

1.3.2 Định lượng 16

* Nguyên tắc 17

* Phương pháp định lượng 17

1.4 Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 20

II Thẩm định quy trình phân tích: 20

2.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định 20

2.2 Nội dung thẩm định 20

2.2.1 Tính tuyến tính (Linearity) 21

2.2.2 Độ lặp lại (repeatability) 22

2.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of Detection) 22

2.2.4 Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of Quantition) 22

2.2.5 Hiệu suất thu hồi 23

THỰC NGHIỆM 24

CHƯƠNG I: CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM 25

1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 25

1.2 Phương pháp nghiên cứu và thí nghiệm 25

1.2.1 Phương pháp thí nghiệm 25

1.2.2 Điều kiện phân tích 25

1.2.3 Phương pháp chiết mẫu 25

1.2.4 Đánh giá kết quả phân tích 25

1.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 25

1.3.1 Dụng cụ, thiết bị 25

1.3.2 Hóa chất và dung môi 26

1.4 Hoạch định thí nghiệm 26

1.4.1 Xác định dư lượng Cypermethrin 26

1.4.2 Xác định dư lượng Isoprocarb 26

CHƯƠNG II: TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 27

I Xác định dư lượng Cypermethrin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 27

1.1 Phương pháp chiết mẫu phân tích 27

1.2 Điều kiện phân tích Cypermethrin 27

1.3 Thẩm định quy trình phân tích dư lượng Cypermethrin 27

1.3.1 Thí nghiệm 1: Định tính Cypermethrin 27

1.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của Cypermethrin 28

1.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của Cypermethrin 28

1.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của Cypermethrin 28

1.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) của Cypermethrin 28

1.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết 29

1.3.7 Thí nghiệm 7: Tiến hành trên mẫu thực 29

II Xác định dư lượng Isoprocarb bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 30

2.1 Phương pháp chiết mẫu phân tích 30

2.2 Điều kiện phân tích 30

2.3 Thẩm định quy trình phân tích dư lượng Isoprocarb 30

2.3.1 Thí nghiệm 1: Định tính Isoprocarb 30

2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của Isoprocarb 30

2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của Isoprocarb 31

2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của Isoprocarb 31

2.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) của Isoprocarb 31

2.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết 31

2.3.7 Thí nghiệm 7: Tiến hành trên mẫu thật 32

CHƯƠNG III: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 33

I Kết quả xác định dư lượng Cypermethrin 33

1.1 Định tính Cypermethrin 33

1.2 Khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của Cypermethrin 34

1.3 Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của Cypermethrin 34

1.4 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của Cypermethrin 34

1.5 Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) của Cypermethrin 35

1.6 Khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết 35

1.7 Tiến hành phân tích trên mẫu thật 35

II Kết quả xác định dư lượng Isoprocarb 37

II Kết quả xác định dư lượng Isoprocarb 37

2.1 Định tính Isoprocarb 37

2.2 Khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của Isoprocarb 37

2.3 Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của Isoprocarb 38

2.4 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của Isoprocarb 38

2.5 Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) của Isoprocarb 39

2.6 Khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết 39

2.7 Tiến hành phân tích trên mẫu thật 39

KẾT LUẬNVÀKIẾN NGHỊ 41

KẾT LUẬN 42

KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 47

MỞ ĐẦU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuốc bảo vệ thực vật được coi là một vũ khí có hiệu quả của con người trong việc phòng chống dịch hại, bảo vệ cây trồng Bên cạnh ưu điểm là bảo vệ năng suất cây trồng, thuốc bảo vệ thực vật còn gây ra nhiều tác hại khác như làm ô nhiễm môi trường, gây độc cho người và gia súc, tăng chi phi sản xuất, và nhất là để lại tồn dư trong nông sản gây ảnh hưởng đến chất lượng nông sản và sức khỏe người tiêu dùng

Tác động tiêu cực của thuốc bảo vệ thực vật càng trở nên nghiêm trọng khi con người

sử dụng không đúng cách và quá lạm dụng vào thuốc

Hóa chất bảo vệ thực vật có nhiều nhóm hóa chất khác nhau, trong đó có bốn nhóm chính là: lân hữu cơ, Clo hữu cơ, Carbamate và Pyrethroid Nhóm clo hữu cơ đã

bị cấm sử dụng, nhóm Pyrethroid vẫn đang được sử dụng nhưng độc tính thấp, ít có khả năng gây nhiễm độc cho người sử dụng Còn lại 2 nhóm: lân hữu cơ và Carbamate đang được dùng rộng rãi trong nông nghiệp, có độc tính cao và là nguyên nhân chính của phần lớn các vụ ngộ độc do ăn rau quả nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật ở nước ta hiện nay

Từ nhiều năm nay, hành tím Vĩnh Châu (Sóc Trăng) đã trở nên quen thuộc với người tiêu dùng trong và ngoài nước Thương hiệu hành tím Vĩnh Châu nổi tiếng khi được cấp chứng nhận đạt tiêu chuẩn Global GAP

Trước đây nông dân thường dùng chất DDT, 2,4D,… để bảo quản Nhưng hiện nay, các chất này đã nằm trong danh mục các hóa chất bị cấm sử dụng nên chuyển sang dùng các loại thuốc khác như: VIMIPC (Isoprocarb), VISHER (Cypermethrin),…

Để bảo quản củ hành người nông dân đã sử dụng VIMIPC (Isoprocarb), VISHER (Cypermethrin) và bột đất sét trong công thức bảo quản và được gọi là bột bảo quản Bột bảo quản được người nông dân sử dụng để ngăn chặn, chống lại các loại côn trùng sâu, rầy phá hoại trong lúc chờ để bán sản phẩm

Theo thống kê chưa đầy đủ của Hội Chữ thập đỏ thị xã Vĩnh Châu, trên địa bàn hiện có trên 800 người bị mù Nạn nhân là những nông dân chuyên trồng hành và một

số thanh niên, phụ nữ nông thôn tham gia bóc vỏ hành thời vụ vào mùa thu hoạch hành tím thương phẩm Ngoài ra còn những ảnh hưởng chưa được nghiên cứu hết trên những người trồng và người sử dụng, người tiêu dùng trên các loại hành này

Với những lí do trên, đề tài “Xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong

bảo quản củ hành tím ở Sóc Trăng” được thực hiện để thử nghiệm và đánh giá dư

lượng thuốc bảo vệ thực vật trong hành tím trong khi bảo quản để đưa ra các khuyến cáo cũng như đánh giá mức độ độc hại ảnh hưởng đến sức khỏe của người nông dân, người tiêu dùng

MỤC TIÊU CỤ THỂ

Trong khuôn khổ một Luận văn tốt nghiệp đại học đề tài hướng đến mục tiêu:

 Thử nghiệm quy trình chiết dư lượng của 2 loại thuốc bảo vệ thực vật (Cypermethrin và Isoprocarb) được sử dụng để bảo quản củ hành tím

 Thẩm định quy trình và xác định dư lượng 2 loại thuốc bảo vệ thực vật (Cypermethrin và Isoprocarb) bằng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

TỔNG QUAN

CHƯƠNG I: THỊ XÃ VĨNH CHÂU VÀ CỦ HÀNH TÍM

I Sơ lược về Thị xã Vĩnh Châu

Thị xã Vĩnh Châu thuộc Tỉnh Sóc Trăng Phía Đông và Nam giáp biển Đông, Phía Tây giáp tỉnh Bạc Liêu, Phía Bắc giáp huyện Mỹ Xuyên và Trần Đề; là một thị xã nằm ven biển có 43 km chiều dài bờ biển; tổng diện tích tự nhiên 47.339,48 ha, dân số

có 163.800 người (số liệu thống kê năm 2009) Lĩnh vực nông nghiệp là kinh tế mũi nhọn (chiếm tỷ trọng 72%), công nghiệp và tiểu thủ công nghiệp (chiếm 11%), thương mại và dịch vụ (chiếm 17%) Với vị trí đắc địa ở vùng cửa sông giáp biển nên Vĩnh Châu có lợi thế mạnh về nuôi trồng thuỷ sản, nổi bật là tôm sú, cá kèo kế đến là trồng hoa màu trên vùng đất cát pha, đất giồng ven biển với sản phẩm nổi tiếng là hành tím, củ cải, tỏi là nguồn hàng chủ lực tiêu thụ mạnh trong cả nước và xuất khẩu ra nhiều quốc gia trên thế giới

II Củ hành tím với người nông dân Vĩnh Châu

Thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng được ví như là “thủ phủ” hành tím của khu vực ĐBSCL, với diện tích gieo trồng giao động từ 5-7 ngàn ha hàng năm, tổng sản lượng cung ứng ra thị trường lên đến hơn 150 ngàn tấn/năm

Hình 2.1: Hành tím Vĩnh Châu

Theo Chi cục Bảo vệ thực vật và Sở Khoa học-Công nghệ Sóc Trăng, Hợp tác

xã hành tím Vĩnh Châu đã thực hiện mô hình sản xuất hành tím theo tiêu chuẩn Global GAP Sau hơn 1 năm thực hiện, Ngày 29/12/2009, Cục Sở hữu trí tuệ (Bộ Khoa học và Công nghệ) có quyết định chứng nhận đăng ký nhãn hiệu hành tím Vĩnh Châu cho Câu lạc bộ hành tím Vĩnh Châu (nay là Hợp tác xã hành tím Vĩnh Châu), thuộc ấp Cà Lăng

A Biển, xã Vĩnh Châu Người trồng hành tím ở Vĩnh Châu vui mừng vì sản phẩm chủ lực của địa phương này được cấp chứng nhận mô hình sản xuất hành tím theo tiêu chuẩn Global GAP Hành tím Vĩnh Châu được cấp vé “thông hành” để đến được một

số thị trường khó tính như: Indonesia, Thái Lan, Philippines, Ấn Độ…

Bên cạnh những thuận lợi người nông dân ở đây cũng gặp nhiều khó khăn và nguy hiểm trong việc bảo quản củ hành thành phẩm Theo thống kê chưa đầy đủ của Hội Chữ thập đỏ thị xã Vĩnh Châu (2012), trên địa bàn hiện có 828 người bị mù, trong

đó 267 người bị mù cả hai mắt và 561 người bị mù một mắt Nạn nhân phần lớn là những nhà nông Khmer cần cù, chuyên trồng hành và một số thanh niên, phụ nữ nông thôn tham gia bóc vỏ hành thời vụ vào mùa thu hoạch hành tím thương phẩm Có nhiều nguyên nhân gây mù cho người dân ban đầu được xác định là do môi trường làm việc, bóc vỏ tiếp xúc trực tiếp với hành và bột bảo quản, bụi hành có chứa hóa chất độc hại, hơi cay khi bóc củ hành xộc vào mắt, nhiều người thường lấy tay dụi gây viêm loét

Hình 2.2: Người nông dân bị mù khi làm việc không có bảo hộ lao động

Để bảo quản củ hành người nông dân đã sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong công thức với thành phần chính là bột đất sét và một số loại thuốc bảo vệ thực vật với tên thương phẩm như sau: MISUER (Isoprocarb), SHERPA (Cypermethrin), VIMIPC (Isoprocarb), VISHER (Cypermethrin),…

Hình 2.3: Hành được bảo quản theo công thức của người nông dân

CHƯƠNG II: THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT VÀ CÁC HOẠT CHẤT SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN HÀNH TÍM[3],[4],[8],[13]

I Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật 1.1 Định nghĩa

Hóa chất bảo vệ thực vật là những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học được dùng để phòng và trừ sinh vật gây hại cây trồng và nông sản Thuốc bảo vệ thực vật (thuốc trừ sâu) hay còn gọi là nông dược, là những chất độc có nguồn gốc từ tự nhiên hay hóa chất tổng hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản nhằm chống lại sự phá hoại của những sinh vật gây hại đến tài nguyên thực vật Những sinh vật gây hại chính bao gồm: sâu hại, bệnh hại, cỏ dại, chuột và các tác nhân khác

Hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều nhóm khác nhau, được gọi theo tên nhóm sinh vật gây hại, ví dụ như thuốc trừ sâu dùng để trừ sâu hại, thuốc trừ bệnh dùng để trừ bệnh cho cây…

1.2 Phân loại

Thuốc bảo vệ thực vật gồm 4 nhóm chính:

- Nhóm Clo hữu cơ (Organnochlorine) là các dẫn xuất clo của một số hợp chất hữu cơ như: Diphenyletane, Benzene, Nhóm này gồm những hợp chất rất bền trong

tự nhiên và thời gian bán phân huỷ dài Đại diện là Aldrin, Dieldrin, DDT,…

- Nhóm lân hữu cơ (Organophosphorus) đều là các Este, là các dẫn xuất hữu cơ của Acid Photphoric Nhóm này có thời gian bán phân huỷ ngắn và được sử dụng rộng rãi Nhóm này bao gồm một số hợp chất như: Parathion, Malathion, Diclovos, Clopyrifos…

- Nhóm Carbamate là các dẫn xuất hữu cơ của Acid Cacbamic, gồm những hoá chất ít bền vững hơn trong môi trường tự nhiên, song cũng có độc tính cao đối với người và động vật Đại diện cho nhóm này như: Carbofuran, Carbaryl, Isoprocarb,…

- Nhóm Pyrethroid là những thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên, là hỗn hợp của các Este khác nhau với cấu trúc phức tạp được tách ra từ hoa của những giống cúc nào đó Đại diện của nhóm này gồm Cypermethrin, Deltamethrin,…

Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như: các chất trừ sâu vô cơ, nhóm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus, nhóm các hợp chất vô cơ,…

II Hoạt chất Cypermethrin và Isoprocarb 2.1 Cypermethrin

 Khi bị thủy phân, thời gian bán hủy của Cypermethrin phụ thuộc vào dạng đồng phân và pH của môi trường Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, thời gian bán hủy của dạng đồng phân trans là 923 ngày, 136 ngày, 5 ngày và 23 phút tương ứng với điều kiện pH là 3, 7, 8 và 11 Dạng đồng phân cis bền hơn nên có thời gian bán hủy là 1302 ngày, 221 ngày, 21 ngày và 38 phút, tương ứng với điều kiện pH là 3, 7, 8 và 11

 Cơ chế tác động động chủ yếu của Cypermethrin là tác động lên hệ thống thần kinh, cơ chế tác động của Cypermethrin là gây ảnh hưởng đến sự vận chuyển của Na+ qua màng tế bào thần kinh Cypermethrin làm tăng độ thấm của của Na+

qua màng tế bào thần kinh, kết quả gây nên sự lặp đi lặp lại và kéo dài xung động thần kinh trong cơ quan cảm giác và làm đình trệ xung động trong sợi thần kinh Ngoài ra, Cypermethrin còn gây nên các hiện tượng xung huyết (Congestion), xuất huyết (Haemorrhage), hoại tử (Necrosis), teo nhân (Py knosis) trên một số cơ quan như não, gan, thận và mang của cá

2.1.2 Công thức và danh pháp

 Công thức phân tử (CTPT): C22H19Cl2NO3

 Công thức cấu tạo:

O O

Cl Cl

O N

(R, S)-alpha-cyano-3-phenoxybenzyl-2 ,2-dimethyl (1R, 1S)-cis, trans-3-(2,2 dichlorovinyl) cyclopropane-carboxylate

(Cypermethrin)

Danh pháp: (R, S)-alpha-cyano-3-phenoxybenzyl-2,2-dimethyl cis, trans-3-(2,2 dichlorovinyl) cyclopropane-carboxylate

Cymbush, Cymperator,…

2.1.3 Ứng dụng và ảnh hưởng của Cypermethrin trong nông nghiệp

Cypermethrin là hóa chất diệt côn trùng phổ rộng, nó giết cả côn trùng có lợi và động vật cũng như côn trùng gây hại Cypermethrin tác dụng gây độc nhanh với hệ thần kinh của côn trùng Sự kháng Cypermethrin đã phát triển nhanh chóng với những côn trùng tiếp xúc thường xuyên và có thể làm vô hiệu hóa hiệu lực hiệu lực của nó

Cypermethrin tác dụng tiếp xúc và vị độc, có phổ tác động rất rộng, trừ được nhiều loại côn trùng và nhện hại, đặc biệt là côn trùng thuộc bộ cánh vẩy (Bướm)

Trong nuôi trồng thủy sản, Cypermethrin được sử dụng để diệt giáp xác nguồn nước cấp cho các ao nuôi tôm Cypermethrin cực độc đối với thủy sinh vật, đặc biệt là nhóm giáp xác và côn trùng Độ độc cấp tính của Cypermethrin đối với giáp xác và côn trùng thường ở nồng độ nhỏ hơn 0,01 mg/L, đối với cá đối thì nhỏ hơn 1 mg/L

Cypermethrin cũng được sử dụng trong ao nuôi cá để diệt ngoại ký sinh như: rận cá, nấm thủy mi, trùng mỏ neo, trùng quả dưa, trùng bánh xe, sán lá… Thời gian xử lý là

15 ngày trước khi thả tôm, cá

Hoạt chất Cypermethrin rất độc đối với cá rô đồng, LC 50-96 giờ là 23 µg/L

Khi tiếp xúc với Cypermethin ở nồng độ 0,2 µg/L và 5,8 µg/L tần suất đớp khí trời của

cá rô tăng lần lượt 1,7 và 2,4 lần so với đối chứng nhưng có khuynh hướng giảm ở nồng độ 2,3 µg/L.Khi tiếp xúc với Cypermethin, hệ số chuyển hóa thức ăn trong M30-

30 ngày và 1-60 ngày thí nghiệm có khuynh hướng gia tăng (p>0,05) so với đối chứng

Tốc độ tăng trưởng tương đối của đối của cá có xu hướng giảm dần theo sự gia tăng

nồng độ Cypermethrin Ở nồng độ 5,8 µg/L, SGR giảm 11,4% trong 30 ngày thí nghiệm và 3,2% so với đối chứng trong 60 ngày thí nghiệm (Nghiên cứu của Nguyễn Văn Công, Trường Đại Học Cần Thơ)

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiền (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, thành phố Hồ Chí Minh) cho thấy Cypermethrin nồng độ 0,05 ppb gây chết 100% tôm sau 10 ngày Các nồng độ Cypermethrin còn lại là 0,01; 0,001 và 0,0001 ppb gây tỉ lệ chết sau 35 ngày lần lượt là 76,2; 45,2 và 30,6% Tôm chết có dấu hiệu hoại tử dạng 1

cơ quan gan tụy trên tổng số mẫu thu mô học và đọc được tiêu bản ở các nghiệm thức Cypermethrin 0,05; 0,01; 0,001 và 0,0001 ppb có tỉ lệ lần lượt là là 0; 13,8; 14,3 và 42,9% Trong khi đó, tỉ lệ mẫu tôm

 Khối lượng phân tử: 193,2 g/mol

 Áp suất hơi: 0,1333mPa (25°C)

CH

CH 3

CH 3 2-isopropylphenyl methylcarbamate

(Isoprocarb) H

 Danh pháp: o-cumenyl methyl Carbamate hoặc 2-isopropylphenyl methylCarbamate

 Tên thương mại: Etrofolan, Mipcine, Mipcin, Isoprocarbe, mipsin, Mipc,…

2.2.3 Ứng dụng trong nông nghiệp

Isoprocab được phối trộn với một số chất phụ gia khác dưới dạng bột hoặc nhũ dầu ở nồng độ khoảng 20-25%, với tên thương phẩm: APLAUD-MIPC 25BTN, VIMIPC 25 WP,…

Isoprocarb là hoạt chất thuốc trừ sâu tác động tiếp xúc và vị độc và tác động nội hấp, xông hơi, diệt trứng sâu non, trưởng thành của nhiều loại sâu miệng nhai, miệng chích hút Phổ tác dụng rộng trừ nhiều loại sâu thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng trên nhiều loại cây trộng khác nhau: sâu đục thân, sâu gai hại lúa, sâu cuốn lá, sâu tơ hại rau, sâu hại khoai tây,… Khi phun, xịt lên cây, thuốc được cây hấp thu nhanh Trên lúa thuốc diệt trừ được các loại bọ, rầy lúa rất mạnh chủ yếu thuốc được dùng để trị các loại rầy lúa (rầy nâu, rầy xanh đuôi đen, rầy lưng trắng), trừ bọ xít, bọ trĩ, bọ gai, sâu năng, các loại sâu ăn lá, nhưng lại ít hay không gây hại đến thiên địch, độc đối với cá

Trên cây ăn trái, rau, cây công nghiệp như: xoài, thuốc lá, ca cao, trà, bông vải

Thuốc trừ được một số loại rầy, bọ xít Dùng Mipcin 20 ND liều lượng 2-2,5 lít/ha, nồng độ 1:300 Cần phun kỹ những nơi côn trùng ẩn nấp ngay từ lúc sâu còn non

2.3 Công thức bảo quản và các loại thuốc hóa học dùng trong công thức bảo quản

2.3.1 Công thức bảo quản

Công thức được chọn theo quy ước bảo quản của người dân địa phương trong việc bảo quản củ hành tím như sau:

Bột đất + Vimipc (Isoprocarb) + Visher (Cypermethrin) Bột đất + Miseur (Isoprocarb) + Sharpa (Cypermethrin) Bột đất + Mipcin (Isoprocarb) + Visher (Cypermethrin)

2.3.2 Các loại thuốc hóa học dùng trong công thức bảo quản:

a VIMIPC 25WP:

Hình 2.4: Thuốc trừ rầy rệp VIMIPC 25WP

VIMIPC 25WP là một chế phẩm của Công ty cổ phần thuốc sát trùng Việt

Nam Thành phần chính là: Isoprcarb 25%, và thành phần phụ gia vừa đủ 100%

Sản phẩm được người nông dân sử dụng đặc trị: rầy nâu, bọ trĩ, sâu năng , sâu

ăn lá, rầy bọ xít, rệp,… trên lúa và các loại cây trồng khác như: rau, xoài, cacao, cà phê, thuốc lá,… Thuốc có tác động tiếp xúc, vị độc, hiệu lực lâu dài

b VISHER 25EC:

Hình 2.5: Thuốc trừ sâu VISHER 25EC

VISHER 25EC là một chế phẩm của Nhà máy nông dược Bình Dương Thành phần chính là: Cypermethrin 25%, và thành phần phụ gia vừa đủ 100%

VISHER 25EC là loại thuốc đặc trị: rầy xanh, bọ xít, sâu vẽ bùa, sâu keo, sâu đục quả,… Thuốc có tác động tiếp xúc, vị độc, hiệu lực lâu dài Thuốc được sử dụng trên lúa, bắp, cam, quýt, các loại rau màu, cây công nghiệp,…

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)[7],[11],[14],[15],[16]

I Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC: High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967–1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không trộn lẫn, một pha động và một pha tĩnh Trong đó pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đối bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

1.1 Nguyên tắc, cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC, chúng

ta phải có hệ thống trang bị về kỹ thuật này Hệ thống trang bị của HPLC đơn giản và

đủ để làm việc được theo kỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính sau:

* Bơm : có nhiệm vụ đẩy pha động vào trong cột sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký Bơm có hai loại: bơm một piston và bơm hai piston, bơm một piston

áp suất có xung, bơm hai piston áp suất không có xung

* Bộ phận tiêm mẫu : để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký Có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu tự động (Autosampler) Tiêm mẫu bằng tay thì độ lặp lại thường không tốt, phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật tiêm mẫu của người sử dụng, tiêm mẫu tự động độ lặp lại tốt hơn nhiều

* Cột sắc ký: là cột chứa pha tĩnh, nó là một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu Cột được làm bằng thép không rỉ, chiều dài thường

từ 10-30 cm, đường kính trong từ 4-10 mm, cỡ hạt pha tĩnh từ 3-10 µm Thường dùng cột dài 15cm, 25cm, đường kính trong 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm Hiện nay, có cột dài 5-10

cm, đường kính trong 1-4,6 mm, cỡ hạt 1,7 µm Trước các cột sắc ký thường kèm theo

bộ phận tiền cột có tác dụng giữ lại phần bẩn từ dung môi, bảo vệ cột phân tích

* Đầu dò (Detector): khi chất phân tích đi qua đầu dò tạo tín hiệu điện, tín hiệu này được đọc trên máy ghi, tín hiệu điện tỉ lệ với lượng chất phân tích đi qua đầu dò

Đầu dò phải đạt các yêu cầu về: phát hiện nhanh và lặp lại, độ nhạy cao, không làm thay đổi độ phân giải, không làm hỏng chất phân tích

Hiện nay, có nhiều loại đầu dò như: đầu dò UV-Vis, đầu dò huỳnh quang, đầu

dò chuỗi Diod (DAD), đầu dò khúc xạ kế vi sai (RI), đầu dò điện hóa (ECD), đầu dò

đo độ dẫn (CD), đầu dò ghép khối phổ (MS),

*Trang bị chỉ thị kết quả: Hiện nay, người ta sử dụng máy tính và máy in kèm theo ghi tín hiệu đo dưới dạng các peak của các chất để xử lý kết quả và in kết quả

1.2 Các yếu tố và thông số đặc trưng của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.2.1 Các yếu tố trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Pha tĩnh thường là silicagel gắn các nhóm phân cực (-diol, -amine, -cyano,…),

ít hay không phân cực (-C18, -C8, -phenyl,…)

- Pha động là dung môi hay hệ dung môi (trong HPLC), là khí mang như Nitrogen, heli, argon (trong GC)

- Trong HPLC chia làm 2 loại: pha thường hay pha thuận có pha tĩnh là phân cực, pha động không phân cực; pha đảo thì ngược lại, pha tĩnh ít hay không phân cực, pha động thì phân cực

- Dung môi:

+ Các dung môi dùng cho HPLC đều phải lọc qua màng lọc có kích thước lỗ là 0,45µm hay 0,22µm (trừ một số dung môi mà sản xuất đã lọc trước: Acetonitrile, Methanol,…)

+ Dung môi là nước hoặc hệ đệm trong nước thì dùng màng lọc Cellulose Acetat hay Nitrat, hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước thì dùng màng lọc Polyamid hay Nylon, dung môi hữu cơ lọc qua màng lọc Teflon

1.2.2 Các thông số đặc trưng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Thời gian chết (to): là thời gian cần thiết để pha động chạy qua hệ thống tách

- Thời gian lưu (tºR ): là thời gian cần thiết để từ khi chất được bơm vào cột cho đến khi đạt nồng độ cực đại trên detector

- Số đĩa lý thuyết (N): N = 16×(tR /W)2 với W là chiều rộng đáy peak N tốt nhất khi N gần bằng Nmax với Nmax = 4000 × (L/dr) với L là chiều dài cột max (cm), dr là đường kính hạt pha tĩnh (µm)

1.3 Định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.3.1 Định tính

Nguyên tắc của phân tích định tính là: so sánh thời gian lưu của các peak sắc ký trong mẫu phân tích với thời gian lưu của các peak sắc ký trong mẫu chuẩn Từ đó sẽ xác định trong mẫu phân tích có những chất nào, nếu chúng có thời gian lưu giữ đúng như thời gian lưu giữ của các peak trong mẫu chuẩn

1.3.2 Định lượng

* Nguyên tắc

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak của nó

a Phương pháp ngoại chuẩn

Phương pháp ngoại chuẩn là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả hai mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

So sánh diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm

a.1 Chuẩn hóa một điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ nồng độ của

mẫu thử

Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

s

x s

S

S C



xC

Cx : nồng độ mẫu thử

Cs: nồng độ chất chuẩn

Sx: diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử

Ss: diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu chuẩn

a.2 Chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần

rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao peak ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của peak với nồng độ của chất chuẩn (C)

Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định có thể thực hiện việc tính toán này theo hai cách:

Áp dữ kiện diện tích hoặc chiều cao peak của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy

ra được nồng độ của nó

Hình 2.7: Đồ thị phương pháp ngoại chuẩn

Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) peak với nồng độ của chất cần xác định

b a Y

C x  ^

Y = a + bCxY: diện tích peak a: giao điểm của đường chuẩn với trục tung b: độ dốc của đường chuẩn

Cx: nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử

Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) peak mẫu thử phải nằm trong đoạn

tuyến tính của đường chuẩn

b Phương pháp nội chuẩn

Đối với phương pháp này, người ta thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

Chất được thêm là chất nội chuẩn

Từ những dữ kiện về: diện tích (hoặc chiều cao) peak và hàm lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chất nội chuẩn và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử một cách chính xác

b.1 Chuẩn hóa một điểm: chất nội chuẩn được thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu

thử, rồi tiến hành sắc ký

Lượng hoặc nồng độ của thành phần trong mẫu thử được tính như sau:

x IS IS

b.2 Chuẩn hóa nhiều điểm:Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa những lượng (hoặc

nồng độ) chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng (hoặc nồng độ) chất nội chuẩn Sau khi sắc ký và thu được các dữ kiện diện tích, tiến hành vẽ đường chuẩn, biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) peak của chuẩn trên nội chuẩn (SS/SIS) với tỷ số của nồng độ ngoại chuẩn trên nội chuẩn (CS/CIS)

Hình 2.8: Đồ thị phương pháp nội chuẩn

Song song tiến hành sắc ký mẫu thử cũng được thêm nội chuẩn với lượng (hoặc nồng độ) như thang chuẩn

Tính tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) peak của chất thử trên diện tích (hoặc chiều cao) peak nội chuẩn (ST/SIS) rồi dựa vào đường chuẩn sẽ tìm được nồng độ của chất thử (CT)

c Phương pháp thêm chuẩn

Kỹ thuật này phối hợp phương pháp nội chuẩn và ngoại chuẩn

Kỹ thuật tiến hành như sau:

- Xử lý mẫu thử rồi tiến hành sắc ký

- Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết CX của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ

C (lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao) peak S theo công thức:

d Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành

phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích peak của nó so với tổng diện tích của tất

dụng nhiều trong sắc ký khí vì thường có đáp ứng như nhau ở Detector Ion hóa ngọn lửa (FID)

x Z Y X x

S

S S S S

S X

1

100100

%

1.4 Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Kỹ thuật phân tích HPLC đã đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách, phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau: hóa dược, sinh hóa, hóa dầu, các loại chất độc hại…

Ngoài ra, kỹ thuật này còn dùng để định tính và định lượng các sản phẩm thuốc, phân tích kiểm nghiệm các thành phần trong thực phẩm và môi trường…nhằm để đáp ứng đầy đủ các quy định quốc gia và quốc tế

II Thẩm định quy trình phân tích:

2.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định

Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập bảng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến Nói cách khác, việc thẩm định một quy trình phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh một cách khoa học rằng khi tiến hành thí nghiệm các sai

số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được

Trong các tiêu chuẩn chúng ta phải xây dựng phương pháp phân tích hay cũng gọi là quy trình thử nghiệm để giúp cho việc thực hiện kiểm tra chất lượng cũng như các tiêu chí đề ra cho các tiêu chuẩn đó

Mục tiêu của việc thẩm định các phương pháp phân tích là để chứng tỏ rằng quy trình đáp ứng với yêu cầu dự kiến

2.2 Nội dung thẩm định

Cơ sở cần thiết cho việc thẩm định phương pháp phân tích để định lượng những thành phần chủ yếu trong nguyên liệu làm thuốc, hoạt chất trong các chế phẩm cần dựa vào các tiêu chuẩn sau:

- Tính tuyến tính

- Độ lặp lại

Cách thực hiện:

Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước, các giá trị định lượng được y Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa là trong khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x là một đường thẳng (đoạn

thẳng) theo phương trình sau: Y = AX +B

Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ số tương quan R:

)()(

y y x

x

y y x x R

Nếu R = 1: có tương quan tuyến tính rõ rệt

R > 0: có tương quan đồng biến

R < 0: có tương quan nghịch biến

R < 5: không có tương quan nghịch biến

R > 5: có phụ thuộc tuyến tính

R = 0: hoàn toàn không có tương quan tuyến tính Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thể xây dựng phương trình hồi quy của khoảng này tức là xác định hệ số a và b của phương trình trên:

n y x xy R

/

/2

y : giá trị định lượng được

x : nồng độ định lượng

* Phương trình hồi qui : Y = AX + B

Yêu cầu: Tùy theo hoạch định mà chọn giá trị R Nói chung R phải ≥ 0,99

2.2.2 Độ lặp lại (repeatability)

Độ lặp lại (hay độ chính xác) là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng lẻ với

giá trị trung bình x thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử

đồng nhất trong cùng điều kiện xác định

Độ lặp lại bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên

Độ lặp lại thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của một loạt các lần thử ngiệm

Cách thực hiện:

Với cùng một mẫu được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phương pháp

đề xuất n lần (n = 6–10 hay nhiều hơn) Sau đó áp dụng công thức tính SD và RSD của phương pháp

SD i X: là giá trị trung bình

%100





X

SD RSD

n

x

X  i

Yêu cầu: RSD càng nhỏ, phương pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi

phòng thí nghiệm đưa ra Thông thường ta chọn RSD ≤ 10%

2.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of Detection)

Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất thử trong mẫu thử còn có thể phát hiện bằng phương pháp đề xuất, nó là một thông số của phương pháp thử giới hạn Giới hạn phát hiện thường được biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phần ngàn, phần tỷ của chất cần thử trong mẫu Việc xác định giới hạn phát hiện không cần thiết phải định lượng chính xác mà chỉ cần xác định chất thử có nồng độ thấp hơn hay cao hơn một giới hạn nào đó

Xác định: giới hạn phát hiện được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F-phân phối Fischer và trắc nghiệm t-phân phối Student)

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection: LOD) được tính theo công thức:

LOD=3,3độ lệch chuẩn/độ dốc

2.2.4 Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of Quantition)

Giới hạn định lượng là một thông số của phương pháp phân tích định lượng các hợp chất có trong một khung mẫu với lượng thấp như những tạp chất trong nguyên

liệu làm thuốc và sản phẩm phân hủy có trong chế phẩm Giới hạn định lượng là nồng

độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong một mẫu thí nghiệm còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác có thể chấp nhận được

Giới hạn định lượng có thể được biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phần ngàn, phần tỷ

có chất cần phân tích có trong mẫu

Xác định: giới hạn định lượng được xác định dựa vào phương trình hồi quy

tuyến tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F-phân phối Fischer và trắc nghiệm t-phân phối Student)

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation: LOQ) được tính theo công thức:

LOQ=10độ lệch chuẩn/độ dốc

2.2.5 Hiệu suất thu hồi

- Xác định hiệu suất thu hồi để đánh giá được sự phục hồi của chất cần định lượng khi qua quá trình chiết mẫu

- Với định lượng: đảm bảo rằng kết quả thu được của hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu là chính xác

Cách thực hiện:

- Pha dung dịch chuẩn trung gian: Cân một lượng chất cần phân tích và định mức tới vạch bằng dung môi phân tích (CH3OH) ta sẽ được dung dịch trung gian A với nồng độ a µg/ml

- Pha dung dịch chuẩn: hút 1 ml dung dịch trung gian A cho vào bình định mức

10 ml và định mức tới vạch bằng dung môi

- Dung dịch mẫu trắng + chuẩn: thêm 1 ml dung dịch trung gian vào mẫu trắng (giai đoạn cân mẫu chuẩn bị cho quá trình chiết mẫu) tiến hành chiết mẫu theo quy trình chiết mẫu

- Dung dịch mẫu trắng: được chiết theo quy trình

- Khi hệ thống ổn định thì tiến hành bơm mẫu

Kết quả hiệu suất thu hồi được tính như sau:

%100S

SS

%H

Chuan

Mau t rang Mau t rang

Chuan hoi

THỰC NGHIỆM

CHƯƠNG I: CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM

1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện: Từ ngày 03/01/2013 đến ngày 14/05/2013

Địa điểm thực hiện

- Phòng quản lý Chất lượng-Môi trường – Công ty cổ phần Thuốc sát trùng Cần Thơ Địa chỉ: Km 14, Quốc lộ 91, P Phước Thới, Q Ô Môn,

Cypermethrin và Isoprocarb trên hệ thống “Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” và

những điều kiện phân tích của hai hợp chất này trên hệ thống

1.2.2 Điều kiện phân tích

Qua quá trình khảo sát điều kiện phân tích được chọn theo tiêu chuẩn cơ sở năm

2010 của Công ty cổ phần Thuốc sát trùng Cần Thơ

1.2.3 Phương pháp chiết mẫu

Chúng tôi đã lựa chọn phương pháp chiết theo AOAC, Tiêu chuẩn Việt Nam

1.2.4 Đánh giá kết quả phân tích

Phương pháp đánh giá kết quả phân tích bằng phần mềm Excel

- Pipet, micropipet 1000µL, 10µL

- Kim bơm mẫu bằng tay 50µL

1.3.2 Hóa chất và dung môi

- Nước siêu sạch (nước HPLC)

- Chuẩn gốc Cypermethrin 92,7%

- Chuẩn gốc Isoprocarb 97,3%

- Methanol

- Chloroform

- Natri Sulfat (Na2SO4)

Hình 3.1: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hình 3.2: Hệ thống cô quay

1.4 Hoạch định thí nghiệm

1.4.1 Xác định dư lượng Cypermethrin

Thí nghiệm 1: Định tính Cypermethrin

Thí nghiệm 2: Khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của Cypermethrin

Thí nghiệm 3: Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của Cypermethrin

Thí nghiệm 4: Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của Cypermethrin

Thí nghiệm 5: Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) của Cypermethrin

Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết

Thí nghiệm 7: Tiến hành trên mẫu thực

1.4.2 Xác định dư lượng Isoprocarb

Thí nghiệm 1: Định tính Isoprocarb

Thí nghiệm 2: Khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của Isoprocarb

Thí nghiệm 3: Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của Isoprocarb

Thí nghiệm 4: Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của Isoprocarb

Thí nghiệm 5: Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) của Isoprocarb

Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết

Thí nghiệm 7: Tiến hành trên mẫu thực

CHƯƠNG II: TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

I Xác định dư lượng Cypermethrin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.1 Phương pháp chiết mẫu phân tích

Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đã lựa chọn được quy trình chiết dư lượng thuốc bảo vệ thực vật áp dụng cho hoạt chất Cypermethrin như sau:

Bước 1: Cân 100g mẫu hành tím đã cắt nhuyễn (chính xác 0,001g), cho vào

bình tam giác 500ml

Bước 2: Cho tiếp vào bình tam giác 100ml Chloroform, sau đó đặt vào bể siêu

âm 20 phút Lọc lấy dịch chiết và lặp lại thêm 2 lần

Bước 3: Đuổi bớt dung môi Cho vào dung dịch Na2SO4 để loại bớt nước trong dung dịch chiết

Bước 4: Lọc lấy dịch chiết Cô cạn dịch chiết và hòa lại bằng 10ml dung môi

Methanol được dung dịch phân tích

1.2 Điều kiện phân tích Cypermethrin

Điều kiện phân tích Cypermethrin được chọn theo tiêu chuẩn cơ sở của Công ty

Cổ phần Thuốc sát trùng Cần Thơ năm 2010

 Cột pha đảo C18, 1504,6mm (i.d), 5 μm

Mục đích: Xác định thời gian lưu của Cypermethrin trong mẫu thông qua thời

gian lưu của dung dịch chuẩn gốc khi phân tích trên hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Thực hiện: Pha dung dịch từ chuẩn gốc (Cypermethrin 92,7%), dung dịch chiết

từ mẫu hành Cho phân tích trên hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của Cypermethrin

Mục đích: Xác định giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của quá trình định

lượng RSD càng nhỏ phương pháp có độ chính xác càng cao (RSD ≤ 10%)

Thực hiện: Chuẩn bị mẫu: Lấy 1,0 ml dung dịch chuẩn 37,0 µg/ml cho vào

bình định mức 10ml có chứa nền mẫu, sau đó định mức tới vạch bằng CH3OH, thu được dung dịch 3,7 µg/ml Khi hệ thống ổn định thì tiến hành bơm mẫu.Tiến hành phân tích theo quy trình 6 lần

Cypermethrin

Mục đích: Khảo sát tính tuyến tính lập dãy chuẩn với các nồng độ: 4µg/ml,

5µg/ml, 10µg/ml, 20µg/ml, 30µg/ml

Xác định phương trình hồi quy Y = AX + B và hệ số tương quan tuyến tính (R)

giữa nồng độ và diện tích peak Cypermethrin

Thực hiện: Chuẩn bị mẫu: Cân 34,6 mg Cypermethrin 92,7% dùng làm chuẩn,

cho vào bình định mức 25 ml, định mức tới vạch bằng CH3OH, lắc kỹ và cho vào bể siêu âm khoảng 10 phút, ta được dung dịch chuẩn 1: 1283,5 µg/ml Lấy 10 ml dung dịch chuẩn 1 cho vào bình định mức 100 ml, sau đó định mức tới vạch, thu được dung dịch chuẩn 2: 128,35 µg/ml Lấy từng thể tích dung dịch chuẩn bằng Miropipet pha các dung dịch với nồng độ 4µg/ml; 5µg/ml; 10µg/ml; 20µg/ml; 30µg/ml trong bình định mức 10 ml Khi hệ thống ổn định thì tiến hành bơm mẫu

1.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của Cypermethrin

Mục đích: Xác định nồng độ thấp nhất của Cypermethrin trong mẫu thí nghiệm

mà phương pháp có thể phát hiện được

Thực hiện: Từ phương trình hồi quy tuyến tính Y = AX +B, tính được giới hạn

phát hiện của phương pháp

1.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) của Cypermethrin

Mục đích: Tìm nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thí

nghiệm còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác có thể chấp nhận