NGHIÊN cứu bào CHẾ THUỐC TIÊM hỗn DỊCH CHỨA PHỨC hợp LIPID AMPHOTERICIN b

Đùn ép Hỗn dịch phức hợp lipid được đùn ép qua màng polycarbonat có kích thước lỗ màng xác định, thu được hỗn dịch có kích thước tiểu phân gần với kích thước của lỗ màng.. Nguyên lí của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc đến :

TS Trần Thị Hải Yến PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ

Là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Nhờ sự giúp đỡ quí báu đó mà tôi đã hoàn thành được các mục tiêu của đề tài đặt ra

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Bào chế-Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm khích lệ giúp tôi hoàn thành luận văn

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Amphotericin B 2

1.1.1.Công thức hóa học 2

1.1.2 Đặc tính lý hóa 2

1.1.3 Tác dụng dược lý 3

1.1.4 Dược động học 3

1.1.5 Chỉ định 3

1.1.6 Tác dụng không mong muốn (thường gặp) 4

1.1.7 Liều dùng 4

1.1.8 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 5

1.2 Phức hợp phospholipid chứa amphotericin B 5

1.2.1 Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid amphotericin B 5

1.2.2 Tá dược tạo phức 6

1.2.3 Độ ổn định 8

1.2.4 Ưu, nhược điểm 9

1.2.5 Bào chế phức hợp lipid chứa AMB 10

1.2.6 Phương pháp đánh giá cấu trúc của phức hợp lipid 12

1.3 Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB 18

1.4 Lợi ích của phương pháp bào chế tạo phức hợp với lipid 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1.Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB 23

2.2.2 Phương pháp chứng minh phức hợp lipid AMB 24

2.2.3 Phương pháp đánh giá hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 27 2.2.4 Phương pháp đánh giá thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

Chương 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 29

3.1 Thẩm định phương pháp định lượng AMB 29

3.1.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí 29

3.1.2 Độ đặc hiệu 29

3.1.3 Tính tuyến tính 30

3.1.4 Độ lặp lại 31

3.2 Nghiên cứu xây dựng công thức bào chế phức hợp lipid AMB 32

3.2.1 Khảo sát môi trường phân tán 32

3.2.2 Khảo sát dung môi hòa tan dược chất 35

3.2.3 Khảo sát tỉ lệ dược chất/lipid 36

3.2.4 Khảo sát biện pháp bốc hơi dung môi 37

3.2.5 Khảo sát phương pháp làm giảm KTTP 39

3.2.6 So sánh mẫu bào chế với chế phẩm thương mại Ampholip 44

3.3 Kết quả chứng minh phức hợp lipid AMB 46

3.3.1 Phân tích nhiệt vi sai 46

3.3.2 Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) 47

3.3.3 Hình thái của tiểu phân 48

3.3.4 Phổ nhiễu xạ tia X 50

3.4 Đề xuất qui trình bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml 53

3.5 Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml 56

Chương 4 BÀN LUẬN 58

4.1 Thẩm định phương pháp định lượng 58

4.2 Xây dựng công thức và qui trình bào chế phức hợp 58

4.2.1 Sử dụng tá dược HSPC và DSPG 58

4.2.2 Về môi trường phân tán 59

4.2.3 Về dung môi hòa tan dược chất 59

4.2.4 Về phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân 60

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

4.2.5 Về biện pháp bốc hơi dung môi 61

4.2.6 Về qui trình bào chế phức hợp lipid AMB 61

4.3 Phương pháp chứng minh phức hợp 62

4.3.1 Phương pháp quét nhiệt vi sai 62

4.3.2 Phương pháp chụp ảnh qua kính hiển vi điện tử 62

4.3.3 Phương pháp phổ IR 63

4.3.4 Phương pháp phổ nhiễu xạ tia X 63

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 So sánh ưu nhược điểm giữa liposome và phức hợp lipid AMB 9

Bảng 2.2 Nguyên liệu 22

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí 29

Bảng 3.4 Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak 30

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại 31

Bảng 3.6 Thành phần công thức khảo sát môi trường phân tán 32

Bảng 3.7 Phân bố KTTP của các mẫu sau 2 chu kỳ đồng nhất 34

Bảng 3.8 Thành phần công thức khảo sát dung môi hòa tan AMB 36

Bảng 3.9 Thành phần công thức khảo sát tỉ lệ dược chất/lipid 37

Bảng 3.10 KTTP và phân bố KTTP của hai biện pháp bốc hơi dung môi 38

Bảng 3.11 KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT6 và CT10 39

Bảng 3.12 Đặc tính của phức hợp sau khi làm giảm KTTP bằng phương pháp đồng nhất hóa tốc độ cao 41

Bảng 3.13 KTTP làm nhỏ bằng phương pháp siêu âm 42

Bảng 3.14 KTTP và phân bố KTTP sau khi đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng 43

Bảng 3.15 KTTP và phân bố KTTP của mẫu bào chế và chế phẩm Ampholip 45

Bảng 3.16 pH và hàm lượng của mẫu bào chế và chế phẩm Ampholip 46

Bảng 3.17 Số sóng của gốc (RO)2PO2- trong phân tử lipid của các mẫu 47

Bảng 3.18 Đỉnh nhiễu xạ của các mẫu đo 50

Bảng 3.19 Chất lượng thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB (n=3) 56

Bảng 3.20 Tiêu chuẩn cơ sở đề xuất cho thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml 57

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB 6

Hình 1.2 Phân tử HSPC và DSPG 7

Hình 1.3 Cấu trúc của màng phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha 14

Hình 1.4 Biểu đồ tượng trưng cho các pha phospholipid và phổ 31 P-NMR tương ứng a: pha phospholipid kép; b: pha phospholipid lục giác; c: pha xảy ra sự chuyển động đẳng hướng 15

Hình 1.5 Phổ hấp thụ hồng ngoại của tamoxifen (A), phospholipid (B), hỗn hợp vật lý (C) và phức hợp lipid tamoxifen (D) 16

Hình 1.6 Phổ nhiễu xạ tia X của vinorelbine (A), phospholipid (B), hỗn hợp vật lý (C) và mẫu phức hợp lipid vinorelbine (D) 17

Hình 1.7 Phổ nhiễu xạ của rifampicin (A), hỗn hợp vật lý (B), phospholipid (C), phức hợp lipid rifampicin (D) 17

Hình 1.8 Nồng độ AMB tìm thấy trong các mẫu xét nghiệm tử thi 19

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak 31

Hình 3.10 Hỗn dịch phức hợp lipid AMB ở nồng độ 50 mol % 34

Hình 3.11 Hỗn dịch phức hợp lipid AMB ở nồng độ 100 mol % 34

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của mẫu nhóm I và II 35

Hình 3.13 Mẫu CT10.1 và CT10.2 sau khi đồng nhất hóa lần 2 38

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn KTTP của mẫu CT6 và CT10 qua các lần đồng nhất 40

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT6 40

Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT10 40

Hình 3.17 Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP sau đồng nhất tốc độ 4.000vòng/phút 41

Hình 3.18 Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP sau siêu âm 50Hz/50W 42

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

Hình 3.19 Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP sau đồng nhất 2 chu kỳ kết hợp đùn 44 Hình 3.20 Mẫu bào chế và mẫu Ampholip 45 Hình 3.21 Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP của mẫu bào chế và Ampholip 45 Hình 3.22 Phổ đồ DSC của các mẫu HSPC, DSPG, AMB, mẫu liposome AMB

5 mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 25 mol% và 100 mol% 46 Hình 3.23 Phổ hồng ngoại của của các mẫu đo 48 Hình 3.24 Hình thái của các mẫu quan sát dưới KHV điện tử truyền qua 49 Hình 3.25 Phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu AMB (a), hỗn hợp vật lý (b), mẫu trắng (c), liposome AMB 5mol% (d), phức hợp lipid AMB100mol% (e) 52 Hình 3.26 Sơ đồ bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

5mg/ml 56

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

6 DSC Nhiệt quét vi sai (Differential Scanning Calorimetry)

7 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated

12 31P-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân phospho đồng vị 31

(Phosphorus –31 Nuclear magnetic Resonance )

13 TKHH Tinh khiết hóa học

14 TKPT Tinh khiết phân tích

15 TLTK Tài liệu tham khảo

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm nấm mà đặc biệt là nhiễm nấm hệ thống mà một trong những nguyên nhân gây ra tử vong ở những người suy giảm miễn dịch như bệnh nhân ung thư, bệnh nhân AIDS, bệnh nhân ghép tạng Amphotericin B (AMB) là một trong các kháng sinh polyen hiệu quả nhất cho việc điều trị nhiễm nấm hệ thống

ở người Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này là hầu như không tan trong nước nên sinh khả dụng thấp Do không tan trong nước nên muốn bào chế thuốc tiêm phải sử dụng biện pháp đặc biệt Vì vậy, nghiên cứu bào chế chế thuốc tiêm amphotericin B giúp giảm độc tính trên thận và tăng hiệu quả điều trị của thuốc

Các nghiên cứu trong nước về phức hợp lipid-AMB trước đây chưa đánh giá được cấu trúc của nó Vì vậy, để góp phần ứng dụng phức hợp lipid làm chất mang cho dược chất trị nấm có độc tính cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài :

”Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid

amphotericin B ” nhằm mục tiêu :

- Xây dựng được công thức và qui trình bào chế phức hợp lipid AMB

- Bào chế và đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng của thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [1],[7]

- Độ tan: thực tế không tan trong nước, hòa tan trong dimethyl sulphoxide và trong propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid, rất ít tan trong methanol, thực tế không tan trong cồn [6]

amin và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:

- Tính lưỡng tính và lưỡng thân [1]

- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrocloric hoặc các dung dịch kiềm [1]

- Dung dịch amphotericin B trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và

405 nm Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với 405 nm là 0,87-0,93 [1]

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

Trên mặt lâm sàng, amphotericin B có tác dụng kìm nấm đối với một số loại

nấm như Absidia spp , Aspergillus spp , Basidiobolus spp , Blastomyces

dermatitidis , Candida spp , Coccidioides immitis , Conidiobolus spp , Cryptococcus neoformans , Histoplasma capsulatum , Mucor spp , Paracoccidioides brasiliensis , Rhizopus spp , Rhodotorula spp , và Sporothrix schenckii [2]

1.1.4 Dƣợc động học

- Hấp thu: AMB hấp thu kém qua đường tiêu hóa, chủ yếu được tiêm truyền tĩnh mạch để điều trị nhiễm nấm hệ thống, chỉ dùng đường uống để điều trị nhiễm nấm đường tiêu hóa và niêm mạc miệng

- Phân bố: AMB liên kết với protein ở mức cao Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể nhưng chỉ một lượng nhỏ vào dịch não tủy Nửa đời của thuốc trong huyết tương khoảng 24h, khi dùng thời gian dài, nửa đời cuối cùng có thể tới 15 ngày

Chi tiết về sự phân bố trong các mô vẫn chưa được biết

- Chuyển hóa: chưa được làm rõ

- Thải trừ: AMB bài tiết rất chậm qua thận, với 2 – 5% liều đã dùng bài tiết dưới dạng hoạt tính sinh học Sau khi ngừng điều trị, vẫn có thể tìm thấy thuốc trong nước tiểu ít nhất sau 7 tuần Có thể do vậy mà amphotericin có nguy cơ gây độc

cao với thận Không loại được AMB ra khỏi cơ thể bằng thẩm tách máu [2]

1.1.5 Chỉ định

- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida

albicans ở miệng và đường tiêu hóa

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

- Thuốc tiêm tĩnh mạch amphotericin B thông thường dùng điều trị nhiễm khuẩn

nấm hệ thống nặng do nấm Aspergillus, Blastomyces, Candida,

Coccidioidesimmitis, Cryptococcus, Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum

- Dạng liposome hoặc phức hợp với lipid:được chỉ định cho những trường hợp

đã được điều trị bằng AMB thông thường mà bị thất bại hoặc những trường hợp

mà amphotericin B thông thường có thể gây độc cho thận hoặc suy thận [2]

1.1.6 Tác dụng không mong muốn (thường gặp)

- Phản ứng chung: Rét run và sốt, đau đầu, đau cơ hoặc khớp

- Máu: Thiếu máu đẳng sắc, kích thước hồng cầu bình thường và hồi phục được

- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, đau bụng, đi ngoài, buồn nôn, nôn, chán ăn

- Chuyển hóa: Rối loạn điện giải, giảm kali huyết, giảm magnesi huyết

- Tiết niệu: Giảm chức năng thận kèm theo tăng creatinin và urê huyết [2]

- Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1ml/lần ×4 lần/ngày, giữ thuốc trong miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày

- Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100 – 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [2]

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

1.1.8 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường

Theo tài liệu [16],[18], [24], hiện nay có các chế phẩm thương mại khác nhau của AMB trên thị trường có sử dụng chất mang lipid dưới đây Chúng khác nhau về hình thái, kích thước tiểu phân,chất mang và hàm lượng dược chất:

- AmBisome® (nghiên cứu sản xuất bởi công ty dược phẩm Nexstar) có cấu trúc dạng liposome một lớp Chất mang là HSPC, DSPG, cholesterol Kích thước tiểu phân 80nm Dạng bào chế: bột đông khô

- AmphocilTM (nghiên cứu và sản xuất bởi Zodiac Laboratory), Amphotec® (nghiên cứu và sản xuất bởi Liposome Technology Inc ) có cấu trúc phức hợp

có hình đĩa, chất mang lipid, cholesterol sulfat Kích thước tiểu phân 0,12-0,14

µm Dạng bào chế: bột đông khô

- Abelcet® (nghiên cứu và sản xuất bởi The Liposome Company Ltd) có cấu trúc là phức hợp dạng chuỗi, KTTP từ 1,6 µm đến 11µm và Ampholip (thuốc generic, sản suất bởi Bharat serums and vaccines Limited Ambernath, Ấn Độ)

có cùng chất mang là DMPC, DMPG với tỉ lệ DMPC:DMPG = 7:3, tỉ số mol AMB/phospholipid là 1:1 Dạng bào chế: hỗn dịch tiêm

1.2 Phức hợp phospholipid chứa amphotericin B

1.2.1 Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid amphotericin B

Phân tử Amphotericin B có tính lưỡng thân, một đầu chứa nhiều nhóm hydroxyl thân nước, một đầu là một chuỗi hydro carbon chứa nhiều nối đôi đơn luân phiên thân dầu Trong môi trường nước và ở điều kiện thích hợp, khi tỉ lệ

%mol AMB/phospholipid dưới 25%, AMB sẽ liên kết giới hạn ở dạng monomer với phospholipid tạo thành liposome Nhưng ở tỉ lệ %mol AMB/phospholipid từ 25% đến 100%, AMB sẽ liên kết với phospholipid để tạo thành cấu trúc dạng chuỗi

Bằng các phương pháp quan sát thích hợp, các nhà nghiên cứu đã suy đoán rằng, khi tỉ lệ %mol AMB/phospholipid tăng quá 25%, AMB đủ khả năng phá vỡ màng phospholipid kép và chen vào màng làm phá vỡ cấu trúc liposome Mặt khác, AMB làm cố định phospholipid bằng cách đan xen vào lớp phospholipid kiểu ngón tay đan vào nhau Phần polyen thân dầu của phân tử

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

AMB liên kết với chuỗi hydrocarbon của lipid, phần thân nước chứa các nhóm hydroxyl hướng về phía lõi, gốc phosphat của phân tử lipid hướng về nhóm amin của phân tử AMB, hình thành một hình trụ tròn Các hình trụ tròn xếp cạnh nhau hình thành phức hợp lipid AMB có hình dải ruy băng [12]

Hình 1.1 Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB [22]

1.2.2 Tá dƣợc tạo phức

Phospholipid sử dụng để chế tạo phức hợp lipid bao gồm: phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylinositol (PI), phosphatidic acid (PA), sphingomyelin (SPM), có thể sử dụng đơn độc hoặc phối hợp Các phospholipid

có thể là phospholipid tự nhiên hoặc chiết xuất từ tự nhiên như từ trứng, đậu nành Đại diện tốt nhất là phospholipid Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC)

hóa (HSPC)cũng được dùng phối hợp với Distearoyl Phosphatidyl Glycerol (DSPG) và tốt nhất ở tỉ lệ mol HSPC:DSPG=7:3 [4]

Hình 1.2 Phân tử HSPC và DSPG

HSPC có các ưu điểm sau: bền về hóa học hơn so với phosphatidylcholin đậu nành chưa hydrogen hóa do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chưa no, do đó giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ dược chất [3], [25]

DSPG đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành của phức hợp lipid AMB theo cơ chế sau: ở pH trung tính, DSPG có một nhóm phosphat bị ion hóa

do đó, phân tử tích điện âm Khi AMB đượcphân tán trong dung môi được acid hóa, các proton trong môi trường sẽ có xu hướng chuyển giao cho các nhóm amin của amphotericin B Kết quả là các phân tử AMB sẽ tích điện dương Do

đó sự tích điện trái dấu, các phân tử thu hút nhau, các nhóm tích điện trái dấu của chúng tạo thành một cặp ion Như vậy, sự hấp dẫn phân tử giữa AMB và phân tử DSPG được tăng lên rất nhiều Các chuỗi hydrocarbon béo của các phospholipid

bị thu hút bởi tương tác kỵ nước vào chuỗi dài của liên kết đôi không có nhóm thế của polyene [29]

Việc lựa chọn phospholipid cho thành phần của phức hợp lipid AMB là rất quan trọng, ảnh hưởng đến các đặc tính của phức hợp Vì vậy, việc lựa chọn phải căn cứ trên các đặc điểm sau:

-Mức độ bão hòa của lipid: phospholipid không bão hòa (như

phosphatidylcholin lòng đỏ trứng, phosphatydylglycerol,…) dễ bị peroxyd hóa dẫn đến hỏng màng, rò rỉ dược chất Vì vậy, phospholipid bão hòa (như

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

dipalmytoyl phosphatidylcholin, dipalmitidyl phosphatidic,…) được sử dụng nhiều hơn [3],[29]

-Nhiệt độ chuyển pha (T C ): liên quan đến hiện tượng chuyển pha của

phospholipid Ở dưới nhiệt độ chảy, phospholipid ở trạng thái gel có cấu trúc bền chặt, khó thấm, còn ở trên nhiệt độ chuyển pha, phospholipid chuyển sang trạng thái lỏng với cấu trúc sắp xếp lỏng lẻo [3]

- Độ tinh khiết: tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng mà yêu cầu nguyên

liệu có độ tinh khiết khác nhau

1.2.3 Độ ổn định

Tá dược tạo phức là phospholipid nên phức hợp lipid cũng có đặc tính về

độ ổn định như liposome là kém bền cả về mặt vật lý và hóa học trong quá trình bảo quản [3]

+ Về hóa học: phospholipid là hợp chất dễ bị oxy hóa và thủy phân Quá trình

oxy hóa tăng nhanh do sự tác động của các yếu tố như pH môi trường, nhiệt độ, nồng độ đệm, ion kim loại, sự tích điện của lớp phospholipid kép…Sự oxy hóa xảy ra mạnh nhất ở các phospholipid không no và cũng có thể xảy ra ở phospholipid no nếu ở nhiệt độ cao Bảo quản ở nhiệt độ thấp, bảo vệ tránh ánh sáng và oxy môi trường được cho là sẽ làm chậm quá trình oxy hóa Ngoài ra, có thể cho thêm các chất chống oxy hóa (α-tocoferol, BHA, BHT…), sử dụng EDTA tạo phức loại trừ ion kim loại, dùng khí trơ như nitơ trong quá trình bào chế cũng làm giảm đáng kể quá trình oxy hóa [3],[26]

+ Về vật lý: sự ổn định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số

PDI, sự tích điện bề mặt Trong quá trình bảo quản, có thể xảy ra sự kết tụ của các tiểu phân phức hợp lipid Nếu sử dụng phospholipid có nhiệt độ chảy thấp để bào chế phức hợp thì có thể xảy ra hiện tượng chuyển pha (từ pha gel có cấu trúc bền chặt sang pha lỏng có dạng liên kết lỏng lẻo) trong quá trình bảo quản Ngoài ra, tính thấm của phức hợp lipid cũng giống như liposome phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại phospholipid, hàm lượng và tính chất của dược chất cũng như

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

điều kiện bảo quản Bảo quản ở nhiệt độ thấp làm cho phospholipid ổn định hơn

do đó kéo dài được tuổi thọ của chế phẩm [3]

1.2.4 Ƣu, nhƣợc điểm

Bảng 1.1 So sánh ưu nhược điểm giữa liposome và phức hợp lipid AMB

ƢU ĐIỂM

Là hệ vận chuyển thuốc có tính tương

hợp sinh học cao do có tá dược là

phospholipid

Làm giảm độc tính của thuốc, tăng hiệu

quả điều trị do làm thay đổi phân bố sinh

học của dược chất có độc tính cao (giảm

phân bố ở cơ quan lành, tăng phân bố ở

cơ quan bệnh)

Dược chất được bảo vệ tránh tác động của

ngoại môi trong quá trình bảo quản, đặc

biệt là trong quá trình dẫn thuốc tới đích

sinh học của cơ thể

Tỉ lệ dược chất

(%mol dược chất/lipid)

Thấp (<9%)

Cao (25-100%)

[11], [22]

Hiệu quả điều trị

Tương đương liposome

Chỉ thích hợp với qui mô phòng thí

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

Sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid

gây tác động bất lợi đến sức khỏe người

sử dụng và môi trường

Độ ổn định thấp, kém ổn định về mặt vật

lý và hóa học Tá dược là phospholipid dễ

bị ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, vi sinh

của môi trường do đó tuổi thọ ngắn

(< 300nm)

To hơn liposome (< 11 µm)

[11]

1.2.5 Bào chế phức hợp lipid chứa AMB

1.2.5.1 Tạo phức hợp lipid chứa AMB thô

Phức hợp lipid chứa AMB được bào chế bằng các qui trình giống với các qui trình bào chế liposome Tùy thuộc vào tỉ lệ mol dược chất/lipid mà tạo ra liposome hay tạo ra phức hợp lipid chứa tỉ lệ AMB cao Phương pháp bào chế được đề cập đến là phương pháp hydrat hóa film, phương pháp thay đổi dung môi (tiêm polyol), phương pháp siêu âm, đông khô [11]

Với phương pháp hydrat hóa film, dược chất được hòa tan trong dung môi như là DMSO hoặc methanol Lipid (tốt nhất là DMPC:DMPG ở tỉ lệ 7:3) được hòa tan trong dung môi hữu cơ như là methylen chlorid, sau đó phối hợp dung dịch lipid vào dung dịch thuốc Cất quay dưới áp suất giảm để bốc hơi dung môi, kết quả tạo thành màng film dược chất-lipid Hydrat hóa film bằng dung dịch đệm phosphat (PBS) hoặc muối, đệm glycin để tạo phức hợp lipid AMB

1.2.5.2 Đồng nhất và giảm kích thước phức hợp

Mục đích của quá trình này là tạo ra phức hợp có kích thước nhỏ đồng đều

và phân bố kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lí, cải thiện hình thức cho chế phẩm

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

Có bốn phương pháp để đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân phức hợp lipid là đùn ép qua màng, siêu âm, đồng nhất hóa và đồng nhất hóa kết hợp đùn qua màng [11]

Đùn ép

Hỗn dịch phức hợp lipid được đùn ép qua màng polycarbonat có kích thước lỗ màng xác định, thu được hỗn dịch có kích thước tiểu phân gần với kích thước của lỗ màng Nguyên lí của phương pháp được mô tả như sau: hỗn dịch phức hợp lipid được đùn qua màng có các lỗ màng hình trụ, sắp xếp đồng trục, kích thước xác định, ở áp suất vừa phải và với số lần thích hợp Khi đó các tiểu phân có kích thước lớn hơn kích thích lỗ màng sẽ được làm nhỏ khi đi qua màng, còn các tiểu phân kích nhỏ thì hầu như không thay đổi kích thước khi qua màng,

do đó thu được hỗn dịch phức hợp có kích thước đồng nhất Ưu điểm của phương pháp này là có tính lặp lại cao giữa các lô mẻ [19],[27]

Siêu âm

Siêu âm là một trong những phương pháp phổ biến để làm giảm kích thước tiểu phân Các tiểu phân phức hợp lipid có đường kính nhỏ hơn 11µm có thể được tạo ra nhờ siêu âm Trong các thông số kỹ thuật thì tần số và năng lượng là hai trong số các thông số quan trọng của siêu âm Siêu âm tần số thấp

có thể làm giảm kích thước tiểu phân nhanh hơn trong khoảng kích thước mong muốn Thời gian ngắn sử dụng năng lượng siêu âm mạnh có hiệu quả hơn so với thời gian dài sử dụng năng lượng siêu âm yếu

Nhược điểm của phương pháp: có hiện tượng tăng nhiệt cục bộ trong quá trình siêu âm và giải phóng kim loại ở đầu que siêu âm (titan) vào sản phẩm, hiệu suất nạp thuốc giảm do rò rỉ được chất trong quá trình siêu âm So với phương pháp đùn ép, phương pháp siêu âm tiến hành trong thời gian ngắn hơn nhưng không có sự đồng nhất giữa các lô mẻ [19],[25],[27]

Đồng nhất hóa áp suất cao

Nguyên tắc của phương pháp là nén hỗn dịch qua một khe hẹp có kích thước xác định trong thiết bị đồng nhất hóa ở áp suất khoảng 200 bar Nén tuần

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

hoàn nhiều vòng cho đến khi thu được kích thước mong muốn, trung bình từ 6µm [3], [11]

4-Ưu điểm của phương pháp là dễ áp dụng nhưng nhược điểm là cấu trúc dễ

bị phá vỡ dưới áp suất cao [3]

Đồng nhất hóa bằng nghiền tốc độ cao

Tiểu phân được nghiền đến khi tạo được kích thước mong muốn, khi mà 90% tiểu phân có kích thước đường kính dưới 10µm, tốt nhất là từ 4-6 µm Các tiểu phân được nghiền một lần hoặc nhiều lần qua máy, tùy thuộc vào kích thước

và độ đồng nhất mong muốn Thiết bị nghiền tốt nhất là máy xay keo Grifford Wood Nếu cần thiết thì các tiểu phân bé hơn hoặc lớn hơn được loại bỏ bằng lọc tiếp tuyến [11]

Đồng nhất hóa bằng nghiền tốc độ cao kết hợp đùn qua màng

Để có tiểu phân với kích thước nhỏ hơn, sau khi đồng nhất hóa bằng phương pháp nghiền keo, các tiểu phân phức hợp lipid được lọc tiếp tuyến với màng lọc có kích cỡ lỗ lọc 5 µm Dịch lọc tiếp tục được đùn qua màng polycarbonat có kích cỡ lỗ lọc 3 µm hoặc 1,2 µm [11]

Ưu điểm của phương pháp kết hợp nghiền tốc độ cao và đùn qua màng là vừa tạo được kích thước tiểu phân có kích thước mong muốn vừa có độ đồng nhất cao [11]

1.2.6 Phương pháp đánh giá cấu trúc của phức hợp lipid

Các phương pháp để mô tả cấu trúc phức hợp lipid chứa AMB bao gồm chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử, phân tích nhiệt quét vi sai (DSC), đo phổ

P-NMR), nhiễu xạ tia X, đo thể tích bắt giữ, ly tâm gradient tỉ trọng[11], [13]

Trong các nghiên cứu về phức hợp lipid với dược chất khác, nhiều tác giả cũng đã sử dụng các phương pháp nhiễu xạ tia X, phương pháp phổ hồng ngoại

IR, phương pháp DSC, phương pháp chụp ảnh qua kính hiển vi điện tử để chứng minh sự tạo thành phức hợp [14], [21], [30], [31]

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

1.2.6.1 Phương pháp chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử

Mục đích của phương pháp này là để quan sát hình thái của phức hợp cũng như chứng minh phương pháp bào chế đã tạo ra phức hợp lipid AMB chứ không phải là liposome [11]

Có hai phương pháp chụp khác nhau: phương pháp khắc lạnh etching) và khắc nóng (heat-etching) Nhưng nguyên lí chung là: Mẫu được làm lạnh đột ngột trong ni-tơ lỏng hoặc propanol lỏng, sau đó bẻ gãy cấu trúc, lộ diện cấu trúc không gian của mặt cắt gãy Với phương pháp khắc lạnh: mặt cắt gãy được in hình lên platin carbon, hình sao chép lại rồi được quan sát dưới kính hiển vi điện tử Với phương pháp khắc nóng: mặt cắt gãy được gia nhiệt để nước

(Freeze-đá thăng hoa, lộ diện rõ hơn cấu trúc không gian của mẫu cần quan sát Soi mẫu dưới kính hiển vi điện tử [9]

Nghiên cứu về phức hợp lipid rifampicin, Singh C và cộng sự (2014) đã dùng phương pháp chụp kính hiển vi điện tử gia nhiệt (Hot stage microscopy) để quan sát cấu trúc của rifampicin trong phức hợp so sánh với rifampicin tự do Kết quả cho thấy rifampicin trong phức hợp ở dạng vô định hình khác với dạng tinh thể của dược chất ban đầu [30]

1.2.6.2 Phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai

Mục đích của phương pháp là để chứng minh không có lipid tiền chuyển pha và chuyển pha [11]

Nguyên lí của phương pháp:

Bình thường, màng phospholipid ở trạng thái gel với sự sắp xếp trật tự của các phân tử phospholipid Khi gia nhiệt, màng phospholipid kép chuyển từ trạng thái gel sang trạng thái tinh thể lỏng với sự sắp xếp lộn xộn của các phân tử lipid, làm ảnh hưởng tới lực tương tác Van der Waals giữa các chuỗi hydrocarbon, làm tăng sự linh động của màng lipid Khi dược chất liên kết chặt chẽ vào trong lớp phospholipid, cụ thể là phần thân dầu của phân tử AMB liên kết với chuỗi hydrocarbon của lipid, phần thân nước chứa các nhóm hydroxyl hướng về phía lõi, gốc phosphat của phân tử lipid hướng về nhóm amin của phân tử AMB, làm

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

tăng sự chặt chẽ của cấu trúc màng phospholipid kép do đó làm thay đổi lớn nhiệt chuyển pha [10]

Hình 1.3 Cấu trúc của màng phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha [10]

Trong nghiên cứu phức hợp lipid vinorelbine (VB) của Li Y và cộng sự (2013), để chứng minh sự tạo thành phức hợp, tác giả dùng phương pháp phân tích nhiệt vi sai cho các mẫu dược chất VB, phospholipid là lecithin chiết xuất từ lòng đỏ trứng (Lipoid E80®) , hỗn hợp vật lý và mẫu phức hợp lipid VB Kết quả cho thấy phổ nhiệt vi sai của phức hợp lipid VB không có peak nhiệt chuyển pha của phospholipid chứng tỏ phospholipid đã chuyển sang thể vô định hình [21]

Nguyên lí của phương pháp: Phospholipid khi ở dạng lipid kép thì có tính chất đối xứng trục, do đó phổ cộng hưởng từ hạt nhân 31

P-NMR doãng rộng bất đối xứng và có vai doãng về phía trường thấp Khi ở dạng phospholipid lục giác, trật tự hai chiều của cấu trúc lipid hình trụ cũng có đối xứng trục nhưng với sự thay đổi không đẳng hướng hóa học khác, sự thay đổi đó gây nên phổ hẹp hơn về phía trường thấp với vai ở trường cao Ở các dạng khác của phospholipid như là micell thì xuất hiện phổ đối xứng trung tâm do sự di chuyển đẳng hướng [23], [8]

Hình 1.4 Biểu đồ tượng trưng cho các pha phospholipid và phổ 31 P-NMR tương ứng a: pha phospholipid kép; b: pha phospholipid lục giác; c: pha xảy ra sự

chuyển động đẳng hướng [8]

1.2.6.4 Phương pháp phổ hồng ngoại IR

Mục đích của phương pháp là để chỉ ra sự tương tác của phân tử dược chất với phân tử phospholipid trong phức hợp

Nguyên lí của phương pháp: Dựa trên nguyên lí tạo thành phức hợp, khi tỉ

lệ mol AMB:lipid là 1:1, các gốc phosphat trong phân tử phospholipid hướng về nhóm amin của phân tử AMB tạo sự tương tác liên phân tử [12] làm mất các đỉnh hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức trong phân tử phospholipid hoặc dược chất

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

Khi nghiên cứu về phức hợp lipid tamoxifen, Jena S.K và cộng sự (2014)

đã dùng phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi (FTIR) để chứng minh sự tạo thành phức hợp Trong phổ đồ hấp thụ hồng ngoại (hình 1.5), mẫu phức hợp lipid tamoxifen không xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng của tamoxifen chứng

tỏ tamoxifen đã tương tác chặt chẽ với phospholipid để tạo thành phức hợp [14]

Hình 1.5 Phổ hấp thụ hồng ngoại của tamoxifen (A), phospholipid (B), hỗn hợp

vật lý (C) và phức hợp lipid tamoxifen (D)[14]

Tương tự, Singh D và cộng sự (2012) đã mô tả đặc tính của phức hợp lipid quercetin bằng phổ hấp thụ hồng ngoại và chỉ ra sự tương tác giữa nhóm hydroxyl và nhóm ceton của quercetin với nhóm phân cực của phospholipid là phosphatidylcholin chiết xuất từ đậu tương (Lipoid S-80) làm thay đổi peak hấp thụ của quercetin [31]

1.2.6.5 Phương pháp nhiễu xạ tia X

Mục đích của phương pháp là để chứng minh sự chuyển dạng thù hình của dược chất hoặc phospholipid hoặc để chỉ ra sự liên kết chặt chẽ giữa dược chất với phospholipid khi tạo thành phức hợp [21]

Li Y và cộng sự (2013) khi chụp phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu dược chất, phospholipid Lipoid E80®, hỗn hợp vật lý,phức hợp lipid vinorelbine cho

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

thấy rằng: ở phổ nhiễu xạ của phospholipid và hỗn hợp vật lý có đỉnh nhiễu xạ của phospholipid nhưng đỉnh nhiễu xạ đó biến mất ở phức hợp phospholipid vinorelbine Điều đó chứng tỏ rằng đã xảy ra sự liên kết chặt chẽ giữa dược chất vinorelbine và phospholipid làm mất đỉnh nhiễu xạ của phospholipid [21]

Hình 1.6 Phổ nhiễu xạ tia X của vinorelbine (A), phospholipid (B), hỗn hợp vật

lý (C) và mẫu phức hợp lipid vinorelbine (D)[21]

Singh C và cộng sự (2014) sau khi bào chế phức hợp lipid rifampicin từ Lipoid S-75 và rifampicin theo tỉ lệ mol 1:1 đã chứng minh sự tạo thành phức hợp bằng đo phổ nhiễu xạ tia X của mẫu rifampicin, hỗn hợp vật lý, phospholipid Lipoid S-75 và mẫu phức hợp lipid rifampicin Trên giản đồ nhiễu

xạ, mẫu phức hợp không thấy đỉnh nhiễu xạ của firampicin và phospholipid Điều đó chứng tỏ rifampicin đã liên kết chặt chẽ với phospholipid để tạo thành phức hợp (hình 1.7) [30]

Hình 1.7 Phổ nhiễu xạ của rifampicin (A), hỗn hợp vật lý (B), phospholipid

(C), phức hợp lipid rifampicin (D)[30]

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

1.3 Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB

Nghiên cứu ở nước ngoài

Janoff và cộng sự (2002) đã tiến hành bào chế phức hợp lipid AMB bằng phương pháp hydrat hóa film Dung môi hòa tan dược chất được sử dụng là DMSO hoặc methanol Lipid sử dụng là DMPC và DMPG với tỉ lệ mol cho kết quả tốt nhất là 7:3 Dung dịch hydrat hóa film là đệm phosphat, hoặc dung dịch muối hoặc dung dịch đệm glycine Bằng phương pháp này, tỉ lệ phần trăm mol dược chất/lipid để tạo phức hợp là từ 6-50%, tốt nhất là từ 30-50% Với tỉ lệ dược chất/lipid đó thì phức hợp lipid AMB tạo ra về căn bản là không có liposome Nghĩa là không có quá 10% khối lượng liposome mà tốt nhất là không

có quá 3% liposome [11] Để làm giảm kích thước tiểu phân, tác giả dùng máy nghiền keo để nghiền nhỏ tiểu phân trong khoảng 30 phút Để chọn lựa các tiểu phân trong khoảng tối ưu, tác giả dùng phương pháp lọc tiếp tuyến với hai cỡ lỗ lọc khác nhau, lần đầu lọc với màng tiếp tuyến có kích cỡ lỗ lọc 5 µm, dịch lọc lại tiếp tục lọc qua màng lọc tiếp tuyến có kích cỡ 2 µm

Larabi và cộng sự (2004) đã bào chế phức hợp lipid chứa AMB bằng phương pháp bốc hơi dung môi pha đảo AMB được hòa tan trong methanol sau

đó cho vào dung dịch lipid (DMPC:DMPG ở các tỉ lệ khác nhau) đã hòa tan trong dung môi hữu cơ Thêm nước tinh khiết và khuấy từ ở nhiệt độ phòng Cô

áp suất giảm loại dung môi thu được phức hợp lipid Tỉ lệ mol các thành phần AMB:DMPC:DMPG = 7:3:5 tương tự như thành phần của Abelcet Soi kính hiển vi điện tử cho thấy cấu trúc hình đĩa mỏng [20]

Janoff và cộng sự cũng đã nghiên cứu về cấu trúc của phức hợp lipid có tỉ lệ mol DMPC:DMPG = 7:3 cố định nhưng thay đổi tỉ lệ mol AMB trên tổng số lipid khác nhau Kết quả cho thấy với tỉ lệ mol AMB <5%, cấu trúc pha gel của phospholipid ở 20oC sẽ bị sang pha tinh thể lỏng ở nhiệt độ 25oC Nhưng với tỉ lệ mol AMB 25% và 50%, phức hợp lipid không có nhiệt chuyển pha ở 40oC [13]

Các nghiên cứu trong nước

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

Nguyễn Thị Mỹ (2014) đã nghiên cứu bào chế phức hợp lipid chứa AMB

có tỉ lệ mol HSPC và DSPG là 7:3, môi trường phân tán là đệm phosphat pH 7,4,

tỉ lệ dược chất/tổng số mol lipid là 25% cho hiệu suất nạp dược chất cao (87,06%), kích thước tiểu phân là 648,3nm; phân bố kích thước tiểu phân tương đối đồng đều (PDI=0,363) [4]

Tuy nhiên nghiên cứu trên chưa chỉ ra sự khác nhau về cấu trúc giữa liposome AMB và phức hợp lipid AMB

Chưa có nghiên cứu nào trong nước về dạng bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB được công bố

1.4 Lợi ích của phương pháp bào chế tạo phức hợp với lipid

- Giảm độc tính của dược chất

Phức hợp lipid AMB là dạng đầu tiên trong các công thức bào chế của AMB dựa trên lipid nhằm giảm độc tính mà không làm giảm hiệu quả điều trị Nhờ sự liên kết chặt chẽ giữa AMB và hệ lipid mang dược chất mà làm thay đổi đặc tính dược động học và sự phân bố tới mô của AMB Độc tính của AMB bị hạn chế bởi sự phân bố một cách đặc biệt tới đích tác dụng là vùng nhiễm nấm nội tạng sâu như gan, lách, phổi

Hình 1.8 Nồng độ AMB tìm thấy trong các mẫu xét nghiệm tử thi [22]

Nghiên cứu nồng độ AMB phân bố tới các mô trong cơ thể người bằng xét nghiệm tử thi của các bệnh nhân có nhiễm nấm cơ hội:

- Nhóm 1: gồm 3 bệnh nhân dùng phức hợp lipid AMB Trong đó 1 bệnh nhân dùng 3 liều ở mức 5,3mg/kg/ngày, 2 bệnh nhân dùng liều tích lũy AMB là 1200mg và 1500mg

- Nhóm 2: gồm 3 bệnh nhân dùng liposome AMB với liều tích lũy AMB

là 820-3428mg

- Nhóm 3: gồm 8 bệnh nhân dùng AMB qui ước với liều tích lũy là từ 206-2688mg

Kết quả cho thấy rằng: so với AMB qui ước, AMB trong phức hợp lipid

có nồng độ cao hơn ở phổi (trung bình là 17 lần), gan (2 lần) và lách (9 lần), đồng thời cao gấp 14 lần nồng độ AMB ở phổi của dạng bào chế dựa trên lipid khác (liposome) Khả năng làm giảm độc tính trên thận của phức hợp lipid AMB nhiều hơn so với dạng AMB qui ước đã mang lại sự an toàn cho bệnh nhân có chức năng thận suy yếu Điều này cho phép sử dụng phức hợp lipid AMB với liều cao hơn do đó tăng hiệu quả điều trị [22]

- Tăng sinh khả dụng

Tamoxifen thuộc nhóm II trong hệ thống phân loại BCS (Biopharmaceutics Classification System), khó tan, lại bị chuyển hóa bởi enzym đường ruột nên sinh khả dụng đường uống thấp Để cải thiện sinh khả dụng đường uống, Jena S.K và cộng sự (2014) đã bào chế dạng phức hợp lipid tamoxifen (phospholipid là Phospholipon®80H) nhằm tăng độ tan của dược chất trong dạ dày, vì vậy tăng sinh khả dụng đường uống Thử nghiệm độ tan trong môi trường acid pH 1,2, môi trường đệm phosphat pH 6,8 và môi trường nước cất Kết quả cho thấy phức hợp lipid tamoxifen tan tốt hơn tamoxifen tự do trong môi trường acid pH 1,2 nhưng không cao hơn trong môi trường pH 6,8 Trong môi trường nước cất, phức hợp lipid tamoxifen có độ tan cao gấp 3 lần so với tamoxifen tự do So sánh sinh khả dụng đường uống giữa tamoxifen và phức hợp lipid tamoxifen cho thấy dạng phức hợp có sinh khả dụng cao hơn thể hiện ở

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

diện tích dưới đường cong của phức hợp lipid tamoxifen (24,19µg.h/ml) trong 72 giờ cao hơn tamoxifen (8,31µg.h/ml), nồng độ đỉnh (Cmax) của phức hợp lipid tamoxifen cao gấp 2 lần so với tamoxifen Mặt khác thời gian bán thải (t1/2) của phức hợp (22,47 giờ) dài hơn so với của tamoxifen (13,93 giờ) [14]

Singh C và cộng sự (2014) nghiên cứu sinh khả dụng đường uống của phức hợp lipid-rifampicin so sánh với rifampicin tự do bằng cách xác định nồng

độ dược chất trong huyết tương chuột cống sau khi uống 48 giờ Kết quả cho thấy phức hợp lipid-rifampicin có nồng độ đỉnh (54,3µg/ml) cao hơn rifampicin (48,5µg/ml) Thời gian đạt nồng độ đỉnh của phức hợp là 6 giờ trong khi của rifampicin tự do là 4 giờ Sinh khả dụng tương đối của phức hợp lipid rifampicin so với rifampicin tự do là 319% Sinh khả dụng của phức hợp tăng có thể là do phospholipid làm tăng mức độ và tốc độ hấp thu dược chất qua niêm mạc ruột [30]

- Giảm kích ứng nơi tiêm thuốc

Li Y và cộng sự (2013) đã bào chế nhũ tương tiêm chứa phức hợp lipid vinorelbine Để đánh giá khả năng gây kích ứng nơi tiêm thuốc khi tiêm tĩnh mạch, tác giả đã tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ 3 mẫu khác nhau bao gồm nước muối sinh lý, Navelbine®

(vinorelbine tartrat trong nước cất) và nhũ tương tiêm chứa phức hợp lipid vinorelbine Kết quả là xuất hiện kích ứng mạnh khi tiêm Navelbine® bao gồm các dấu hiệu ứ máu, phù, chai cứng Ngược lại, nhũ tương tiêm chứa phức hợp lipid vinorelbine chỉ xuất hiện những kích ứng nhẹ Sau khi tiêm bắp, không thấy dấu hiệu hoại tử nơi tiêm thuốc hoặc quanh mô tiêm đối với nước muối sinh lí và thuốc tiêm nhũ tương chứa phức hợp lipid vinorelbine Tuy nhiên lại xuất hiện kích ứng nặng như sưng phồng, căng cứng, bạc màu da khi tiêm NavelbineGoogle.com/+D® [21]

ạyKèmQuyNh

ơn

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: phức hợp lipid AMB

- Nguyên liệu:

Bảng 2.2 Nguyên liệu

-Phương tiện nghiên cứu:

+ Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 1000 ml (Buchi – Đức)

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

+ Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Mastersizer 3000 (Malvern, Anh)

+ Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Chemstation 1260 (Agilent, Mỹ)

+ Thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex-c5 (Avestin – Canada)

+ Máy đồng nhất hóa tốc độ cao 1000X (UNI-DRIVE, Đức)

+ Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ)

+ Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone 50 kD, diện tích lọc 28 cm2

(Spectrumlab, Mỹ)

+ Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H

+ Máy siêu âm cầm tay UP200Ht (Hielsch, Đức)

+ Máy đo pH InoLab

+ Máy phân tích nhiệt vi sai DSC 60 (SHIMADZU, Nhật)

+ Máy nhiễu xạ tia X D8 Advance (Brucker, Đức)

+ Kính hiển vi điện tử JSM-5410LV (Jeol, Nhật)

+ Máy đo phổ hồng ngoại FTIR-1S (SHIMADZU, Nhật)

+ Cân phân tích Satorius BP121S

+ Tủ sấy, tủ lạnh

+ Các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính, nút cao su, nắp nhôm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB

2.2.1.1 Bào chế phức hợp lipid AMB

Phức hợp lipid AMB được bào chế bằng phương pháp thay đổi dung môi

Hòa tan AMB trong dung môi hữu cơ đã được acid hóa đến pH khoảng 0,5-1 bằng dung dịch HCl 2,5N trong cùng dung môi hữu cơ, siêu âm cho tan hoàn toàn, được dung dịch 1 Cân và hòa tan bằng siêu âm HSPC, DSPG với tỉ

lệ HSPC : DSPG = 7:3 trong hỗn hợp CHCl3:dung môi hòa tan dược chất (1:1), được dung dịch 2 Phối hợp dung dịch 2 vào dung dịch 1, siêu âm để thu được dung dịch đồng nhất 3 Bơm chậm dung dịch 3 vào dung dịch NaCl 0,9% đã gia nhiệt từ 60oC đến 70o

C, tốc độ bơm 0,8ml/phút Chọn kim tiêm có đường kính 0,4mm Quá trình tiêm mẫu có kết hợp khuấy từ tốc độ chậm và duy trì nhiệt độ

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

của hỗn hợp trong khoảng nhiệt độ trên cho đến khi phối hợp hết dung dịch 3 Bốc hơi dung môi cho đến khi loại hết dung môi

Hỗn dịch thu được tiếp tục đem làm giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp phương pháp mô tả ở mục 2.2.1.2

2.2.1.2 Phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân

Phức hợp lipid AMB sau khi bào chế được đồng nhất hóa để làm giảm kích thước tiểu phân bằng các phương pháp sau :

- Phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao trên máy EmulsiFlex-c5 : hỗn dịch được đồng nhất nhiều chu kỳ ở áp suất 5000 psi

- Phương pháp đồng nhất hóa tốc độ cao trên máy Uni-drive Hỗn dịch được đồng nhất hóa ở các mức 15.000 vòng/phút và 4.000 vòng/phút

- Phương pháp siêu âm trên máy siêu âm cầm tay UP200Ht : hỗn dịch được siêu

âm 30 giây rồi nghỉ 30 giây Tần số và công suất ở hai mức khác nhau là 80Hz/60W và 50Hz/50W

- Phương pháp kết hợp giữa đồng nhất hóa áp suất cao với đùn qua màng Hỗn dịch sau khi đồng nhất trên máy đồng nhất hóa áp suất cao ở áp suất 5000 psi một số chu kì thích hợp rồi tiếp tục đùn qua màng lọc PTFE kích cỡ lỗ lọc 5 µm

và màng lọc polycarbonat kích cỡ 0,8 µm với số lần thích hợp

2.2.2 Phương pháp chứng minh phức hợp lipid AMB

2.2.2.1 Phương pháp quét nhiệt vi sai (DSC)

- Mục đích: đánh giá cấu trúc gel của phức hợp lipid

- Thiết bị : máy phân tích nhiệt vi sai DSC 60 (SHIMADZU, Nhật)

- Mẫu phân tích :

+ Mẫu phân tích gồm mẫu nguyên liệu AMB, HSPC, DSPG, mẫu liposome AMB 5mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 25mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 100mol%

+ Các mẫu liposome AMB 5mol%, phức hợp lipid AMB 25mol% và phức hợp lipid AMB 100mol% được bào chế chế bằng phương pháp thay đổi dung môi theo mục 2.2.1.1 (chỉ khác về tỉ lệ mol dược chất/lipid lần lượt là 5mol%,

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

25mol% và 100mol%) rồi được làm khô theo qui trình sau: Hút khoảng 20ml hỗn dịch mỗi mẫu phân tích (mẫu liposome AMB 5mol%, phức hợp lipid AMB 25mol%, phức hợp lipid AMB 100mol%), cho vào các đĩa thủy tinh khác nhau Tiến hành bốc hơi đến khô trong tủ sấy chân không trong vòng 48 giờ, nhiệt độ

40oC, áp suất 0,05atm

- Tiến hành phân tích mẫu : Lấy khoảng 5-10mg mẫu phân tích cho vào đĩa

nhôm, hàn kín, đưa vào buồng máy Tiến hành quét nhiệt từ nhiệt độ phòng đến

250oC với tốc độ tăng nhiệt 5o

C/phút, lưu lượng nitơ 40µl/phút

2.2.2.2 Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử đông lạnh

- Mục đích : Quan sát hình thái cấu trúc phức hợp lipid AMB

- Thiết bị : kính hiển vi điện tử quét JSM-5410LV (Jeol, Nhật)

- Mẫu phân tích : Mẫu phân tích gồm mẫu phức hợp lipid AMB 25mol%, mẫu

phức hợp lipid AMB 50mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 100mol% Các mẫu được bào chế chế bằng phương pháp thay đổi dung môi theo mục 2.2.1.1, chỉ khác về tỉ lệ mol dược chất/lipid lần lượt là 25mol%, 50mol% và 100mol%

+ Tiến hành đưa mẫu vào khoang chứa mẫu, bẻ lạnh, gia nhiệt để nước đá thăng hoa, mạ phủ vàng và soi trên kính hiển vi điện tử quét

2.2.2.3 Phương pháp đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR)

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

- Mục đích: để đánh giá tương tác giữa các nhóm amin (NH2) của AMB với gốc phosphat của lipid

- Thiết bị: máy đo phổ hồng ngoại FTIR-1S (SHIMADZU, Nhật)

- Mẫu phân tích : Mẫu phân tích gồm mẫu HSPC, DSPG, hỗn hợp vật lý, mẫu

liposome AMB 5mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 100mol% Mẫu hỗn hợp vật

lý gồm dược chất AMB, HSPC, DSPG với khối lượng theo công thức bào chế phức hợp lipid AMB 100mol% Các mẫu liposome AMB 5mol%, phức hợp lipid AMB 100mol% được chuẩn bị giống mục 2.2.2.1

- Tiến hành phân tích mẫu : Lấy khoảng 5-10mg mẫu phân tích, trộn đều và

nghiền mịn với KBr, ép thành viên mỏng rồi đo trên máy đo phổ hồng ngoại FTIR-1S

2.2.2.4 Phương pháp đo phổ nhiễu xạ tia X

- Mục đích: để xem sự biến đổi cấu trúc khi tạo thành phức hợp do sự tương tác

giữa các phân tử AMB với các phân tử phospholipid

- Thiết bị: máy chiếu tia X D8 Advance (BRUCKER, Đức)

- Mẫu phân tích : Mẫu phân tích gồm mẫu AMB, hỗn hợp vật lý, mẫu trắng, mẫu

liposome AMB 5mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 100mol% Mẫu hỗn hợp vật

lý gồm dược chất AMB, HSPC, DSPG, natri clorid với khối lượng theo công thức bào chế phức hợp lipid AMB 100mol% Các mẫu trắng (mẫu giống công thức bào chế phức hợp lipid AMB 100mol% nhưng không có dược chất AMB), liposome AMB 5mol%, phức hợp lipid AMB 100mol% được chuẩn bị giống mục 2.2.2.1

- Tiến hành phân tích mẫu : Lấy khoảng 5-10mg mẫu đã làm khô, cho vào

đĩa đồng của thiết bị chiếu tia X Góc quét từ 5o

- 60o, tốc độ quét 2o

/phút, nhiệt độ phòng

Google.com/+D

ạyKèmQuyNh

ơn

2.2.3 Phương pháp đánh giá hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

2.2.3.1 Đánh giá hình thức

- Bằng cảm quan, hỗn dịch thuốc tiêm chứa phức hợp lipid AMB phải là hỗn dịch màu vàng sáng, không có tinh thể kết tủa, để lâu có thể sa lắng nhưng phân tán lại đồng nhất khi lắc nhẹ

2.2.3.2 Đánh giá kích thước tiểu phân bằng phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động

- Mục đích: Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP) qua các thông số về kích

thước trung bình theo thể tích (D[4;3]) và 90% tiểu phân có kích thước dưới kích thước yêu cầu (Dv(90)), đánh giá phân bố KTTP thông qua chỉ số “span”

- Thiết bị: Máy Mastersizer 3000

- Tiến hành: Cho khoảng 400ml nước siêu lọc vào cốc có mỏ 500ml Đặt cốc vào

máy đo Mastersizer 3000 Nhỏ hỗn dịch phức hợp lipid AMB vào cốc có mỏ cho đến khi độ đục đạt khoảng 20%

2.2.3.3 Định lượng AMB trong hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

Phương pháp: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Detector UV, bước sóng 405 nm

Pha mẫu chuẩn và mẫu thử

bổ sung methanol đến vạch, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 25µg/ml Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí

Mẫu thử:

Hút chính xác 1 ml mẫu thử, hòa tan bằng DMSO trong bình định mức 10

ml, bổ sung DMSO đến vạch Hút chính xác 1 ml dung dịch trên, pha loãng bằng methanol trong bình định mức 20 ml, bổ sung thể tích đến vạch Lọc mẫu qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí

Hàm lượng AMB trong chế phẩm được xác định bằng công thức:

Trong đó:

Ct: nồng độ AMB trong hỗn dịch phức hợp lipid (mg/ml)

St: diện tích peak mẫu thử (mAU.s)

Sc: diện tích peak mẫu chuẩn (mAU.s)

mc: khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg)

Vc: thể tích pha mẫu chuẩn (Vc=10ml)

Kt: hệ số pha loãng mẫu thử

Kc: hệ số pha loãng mẫu chuẩn

Hiệu suất qui trình được tính toán bằng công thức :

Q % =

2.2.4 Phương pháp đánh giá thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

Ngoài các phương pháp đánh giá phức hợp lipid AMB như hình thức, kích thước tiểu phân, hàm lượng AMB, thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB còn đánh giá các chỉ tiêu như pH, giới hạn thể tích

Chương 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1 Thẩm định phương pháp định lượng AMB

3.1.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí

- Chuẩn bị dung dịch AMB chuẩn có nồng độ khoảng 25µg/ml

- Tiêm mẫu 6 lần qua cột sắc kí với điều kiện sắc kí như mô tả ở mục 2.2.3.3, theo dõi thời gian lưu (tR) và diện tích peak Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí

- Mẫu dung môi là mẫu chỉ có dung môi pha dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử, không có phức lipid trắng và cũng không có dược chất AMB

- Tiêm mẫu dung môi, mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử qua cột sắc kí, đánh giá peak sắc kí xuất hiện trên sắc kí đồ

- Kết quả cho thấy: xuất hiện peak cân xứng, có thời gian lưu (tR) 7,5 phút trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử, không xuất hiện peak ở thời gian lưu này trên sắc kí đồ của mẫu trắng và mẫu dung môi (phụ lục 3, 4) Chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao, dược chất AMB có thời gian lưu 7,5 phút với điều kiện sắc kí trình bày ở mục 2.2.3.3

Bảng 3.4 Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak