NGHIÊN cứu xác ĐỊNH dư LƯỢNG HOÁ CHẤT bảo vệ THỰC vật TRONG dược LIỆU và sản PHẨM từ dược LIỆU BẰNG sắc ký KHỐI PHỔ

Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm dược liệu .... VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN CAO SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG

HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ

DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN CAO SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG

HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ

DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 62 72 04 10

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu

TS Lê Thị Hồng Hảo

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu và TS Lê Thị Hồng Hảo Các

số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập và nghiên cứu thực hiện luận án dưới sự hướng dẫn của

PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu và TS Lê Thị Hồng Hảo,

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu, Phó hiệu trưởng Trường Đại học Dược Hà

Nội, Trưởng bộ môn Hóa Phân tích - Độc chất và TS Lê Thị Hồng Hảo, Phó

Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, là hai

người thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ và cho tôi những kiến

thức quý báu để tôi hoàn thành luận án

Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia học tập và hoàn thành luận án đúng thời

gian quy định

Các thầy, cô Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất và Phòng Sau đại học, Trường

Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại

Trường

PGS Phạm Gia Huệ nguyên Trưởng Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất,

Trường Đại học Dược Hà Nội là người thầy đã đóng góp ý kiến, chỉ dẫn tôi

hoàn thành luận án

Các anh chị em tại Khoa Độc học dị nguyên và các đồng nghiệp ở Viện Kiểm

nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã động viên, giúp đỡ và chia sẽ với

những khó khăn trong công việc

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên

tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án

Trần Cao Sơn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i 

LỜI CẢM ƠN ii 

MỤC LỤC iii 

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi 

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU viii 

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ x 

ĐẶT VẤN ĐỀ 1 

Chương 1 TỔNG QUAN 3 

1.1 HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 3 

1.1.1 Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật 3 

1.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật 3 

1.1.3 Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật chính 5 

1.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 13 

1.2.1 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trên thế giới 13 

1.2.2 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật ở Việt Nam 14 

1.2.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật an toàn và hiệu quả 15 

1.3 DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 16 

1.3.1 Khái niệm về dư lượng và mức dư lượng tối đa 16 

1.3.2 Quy định về mức dư lượng tối đa 17 

1.3.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu 19  1.3.4 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm dược liệu 22 

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 23 

1.4.1 Các phương pháp xử lý mẫu 23 

1.4.2 Một số kỹ thuật dùng trong phân tích hóa chất bảo vệ thực vật 39 

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 49 

2.1.1 Hoá chất bảo vệ thực vật 49 

2.1.2 Đối tượng phân tích 53 

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 54 

2.2.1 Hoá chất, thuốc thử 54 

2.2.2 Chất chuẩn 54 

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 56 

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 57 

2.3.1 Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫu 57 

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 58 

2.3.3 Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ 58 

2.3.4 Phương pháp thẩm định 59 

2.3.5 Phân tích mẫu thực 62 

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 62 

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63 

3.1 KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG TRỒNG CÂY THUỐC 63 

3.1.1 Nguồn cung hóa chất bảo vệ thực vật 63 

3.1.2 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc tại Hà Nội và một số vùng lân cận 70 

3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU 75 

3.2.1 Xây dựng các điều kiện sắc ký khối phổ 75 

3.2.2 Xây dựng quy trình chiết hóa chất bảo vệ thực vật từ một số dược liệu và sản phẩm dược liệu 85 

3.2.3 Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm dược liệu 100 

3.3 DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 115 

3.3.1 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi 116 

3.3.2 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô 117 

3.3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược 118 

3.3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong trà xanh 120 

Chương 4 BÀN LUẬN 122 

4.1 VỀ VIỆC SỬ DỤNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG TRỒNG CÂY THUỐC VÀ CHẾ BIẾN DƯỢC LIỆU 122 

4.1.1 Về loại hoá chất bảo vệ thực vật được kinh doanh 122 

4.1.2 Về loại HCBVTV được sử dụng trong trồng cây thuốc 123 

4.2 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC

VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM DƯỢC LIỆU 124 

4.2.1 Lựa chọn đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu 124 

4.2.1.2 Lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu 126 

4.2.2 Về phương pháp xử lý mẫu 127 

4.2.3 Về phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ 132 

4.2.4 Về kết quả thẩm định phương pháp 138 

4.3 VỀ DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 141 

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 144 

KẾT LUẬN 144 

KIẾN NGHỊ 145 

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 146 

TÀI LIỆU THAM KHẢO  

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Giải thích

1 AOAC Hiệp hội các cộng đồng phân tích (Association of analytical communities)

2 APCI Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical

6 D-SPE Chiết phân tán pha rắn (Dispersive solid phase extraction)

7 ECD Detector bắt điện tử (Electron capture detector)

8 EI Va chạm điện tử (Electron impact)

9 EPA Cục Bảo vệ môi trường Mỹ (Environmental protection agency)

10 ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray ionization)

11 FAO Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực (Food and agriculture organization)

12 FDA Cục dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (Food and drug administration)

13 FL Huỳnh quang (Fluorescence)

14 GACP Thực hành tốt trồng và thu hái dược liệu (Good agriculture and collection practice)

15 GAP Thực hành tốt nông nghiệp (Good agriculture practice)

16 GC Sắc ký khí (Gas chromatography)

17 GCB Than đen hoạt tính (Graphite carbon black)

18 GC-MS Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography mass spectrometry)

19 GC-MS/MS Sắc ký khí khối phổ hai lần (Gas chromatography tandem mass

spectrometry)

20 GPC Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography)

21 HCBVTV Hóa chất bảo vệ thực vật

22 HLB Cân bằng thân nước, thân dầu (Hydrophilic lipophilic balance)

23 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

TT Chữ viết tắt Giải thích

24 IAC Sắc ký ái lực miễn dịch (Immunoaffinity chromatography)

25 IS Chất chuẩn nội (Internal standard)

26 LC Sắc ký lỏng (Liquid chromatography)

27 LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography mass spectrometry)

28 LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography tandem mass spectrometry)

29 LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

30 LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantification)

31 LD50 Liều chết trung bình (Median lethal dose)

32 LPME Vi chiết pha lỏng (Liquid phase microextraction)

33 MAE Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction)

34 MRL Giới hạn dư lượng tối đa (Maximum residue limit)

35 MMM Phương pháp đa dư lượng (Multiresidues multiclasses method)

36 MRM Kiểm soát đa phản ứng (Multi reaction mornitoring)

37 MS Khối phổ (Mass spectrometry)

38 MSPD Phân tán pha rắn mẫu thử (Matrix solid phase dispersion)

39 NCI Ion hóa hóa học âm (Negative chemical ionization)

40 NPD Detector nitơ phosphor (Nitrogen phosphorus detector)

41 PCI Ion hóa hóa học dương (Positive chemical ionization)

42 PDA Chuỗi diod quang (Photo-diod array)

43 PSA Các amin bậc 1 và bậc 2 (Primary secondary amines)

44 PS-DVB Polystyren divinylbenzen

45 SE Chiết dung môi (Solvent extraction)

46 SFE Chiết siêu tới hạn (Supercritical-fluid extraction)

47 SPE Chiết pha rắn (Solid phase extraction)

48 SPME Vi chiết pha rắn (Solid phase microextraction)

49 TPP Triphenyl phosphat

50 UV-VIS Tử ngoại khả kiến (Ultra violet – Visible)

51 WHO Tổ chức Y tế thế giới (World health organization)

52 WTO Tổ chức Thương mại thế giới (World trade organization)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1 Phân loại HCBVTV theo mối nguy 4 

Bảng 1.2 Số lượng hoạt chất HCBVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng và cấm sử dụng ở Việt Nam 14 

Bảng 1.3 Quy định của Dược điển Việt Nam IV về giới hạn HCBVTV 17 

Bảng 1.4 Giá trị MRL mặc định của một số nước 19 

Bảng 1.5 Một số ứng dụng của phương pháp QuEChERS để phân tích HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu 38 

Bảng 1.6 Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng GC-MS 44 

Bảng 1.7 Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng LC-MS 48 

Bảng 2.1 Một số HCBVTV được nghiên cứu trong khóa luận [17][124] 49 

Bảng 2.2 Thông tin về các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu 54 

Bảng 2.3 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion 60 

Bảng 3.1 Các HCBVTV được tiêu thụ phổ biến tại các địa phương khảo sát 65 

Bảng 3.2 Sự phổ biến của các HCBVTV theo nhóm phân loại 69 

Bảng 3.3 Danh mục cây thuốc và dược liệu ở các địa phương khảo sát 71 

Bảng 3.4 Danh mục HCBVTV sử dụng trong trồng cây thuốc 73 

Bảng 3.5 Các điều kiện MS trong LC-MS/MS để phân tích HCBVTV 76 

Bảng 3.6: Các thông số hoạt động đã tối ưu của nguồn ion hoá 77 

Bảng 3.7 Khảo sát gradient pha động (A = acid acetic 0,1%; B = methanol) 79 

Bảng 3.8 Điều kiện gradient để tách hỗn hợp HCBVTV 80 

Bảng 3.9 Độ lặp lại của hệ thống LC-MS/MS 81 

Bảng 3.10 Điều kiện MS trong GC-MS/MS được sử dụng trong nghiên cứu 83 

Bảng 3.11 Độ lặp lại của hệ thống GC-MS/MS 84 

Bảng 3.12 So sánh các phương pháp chiết và pH dịch chiết đo được 90 

Bảng 3.13 Tỷ lệ ion xác nhận và ion định lượng của các HCBVTV 103 

Bảng 3.14 Các nồng độ HCBVTV được sử dụng để khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn 104 

Bảng 3.15 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn của HCBVTV trên mẫu dây thìa canh 104 

Bảng 3.16 LOD, LOQ của các HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau phân tích bằng LC-MS/MS 107 

Bảng 3.17 LOD, LOQ của các HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau phân tích bằng GC-MS/MS 108 

Bảng 3.18 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu mã đề tươi (n=6) 110 

Bảng 3.19 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu trà thảo dược (n=6) 111 

Bảng 3.20 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dây thìa canh (n=6) 112 

Bảng 3.21 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu trà xanh (n=6) 113 

Bảng 3.22 Độ thu hồi của các HCBVTV trên một số nền mẫu thực 115 

Bảng 3.23 Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu tươi 116 

Bảng 3.24 Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu khô 117 

Bảng 3.25 Tần suất phát hiện HCBVTV trong các nhóm sản phẩm khác nhau 119 

Bảng 3.26 Đánh giá hàm lượng HCBVTV trong TPCN theo nguồn gốc mẫu 120 

Bảng 3.27 Kết quả phân tích HCBVTV trong trà xanh 120 

Bảng 4.1 Danh mục HCBVTV được lựa chọn cho nghiên cứu phân tích 125 

Bảng 4.2 Tóm tắt các bước chiết HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau bằng phương pháp QuEChERS 128 

Bảng 4.3 So sánh ảnh hưởng nền của phương pháp nghiên cứu với ảnh hưởng nền theo phương pháp của Raski 132 

Bảng 4.4 Thời gian lưu và điều kiện MS của một số HCBVTV rửa giải gần nhau 134 

Bảng 4.5 Đánh giá khả năng phân tích các HCBVTV bằng GC-MS/MS và LC-MS/MS 136 

Bảng 4.6 So sánh độ lặp lại và độ thu hồi với các nghiên cứu khác 140 

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Các trạng thái vật lý theo nhiệt độ vào áp suất 26 

Hình 1.2 Bộ dụng cụ chiết siêu tới hạn 26 

Hình 1.3 Dụng cụ chiết pha rắn thông thường (a) và tự động (b) 28 

Hình 1.4 Các loại nhóm silanol 29 

Hình 1.5 Nguyên tắc của vi chiết sợi rỗng 35 

Hình 1.6 Tóm tắt các bước chiết của ba phiên bản phương pháp QuEChERS 37 

Hình 2.1 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và sắc ký khí khối phổ sử dụng trong nghiên cứu 57 

Hình 3.1 Hiểu biết về HCBVTV của cán bộ kinh doanh 64 

Hình 3.2 Hiểu biết của nhân viên kinh doanh về danh mục HCBVTV 64 

Hình 3.3 Hình ảnh một số HCBVTV không có nguồn gốc 68 

Hình 3.4 Một số loại cây thuốc được trồng phổ biến ở các địa phương 73 

Hình 3.5 Một số vỏ HCBVTV sau sử dụng tại ruộng 73 

Hình 3.6 Sắc đồ tổng ion của hỗn hợp chuẩn HCBVTV 0,1 mg/mL và sắc đồ của 2 mảnh ion sản phẩm của carboxin, 2 mảnh ion sản phẩm của carbaryl 78 

Hình 3.7 Sắc ký đồ một số HCBVTV theo chế độ gradient 4 80 

Hình 3.8 Khảo sát quy trình chiết HCBVTV từ mẫu dược liệu tươi 85 

Hình 3.9 So sánh hiệu suất chiết HCBVTV trên mẫu mã đề tươi của 3 quy trình 86 

Hình 3.10 Dịch chiết bồ công anh xử lý theo quy trình có GCB (trái) và không có GCB 87 

Hình 3.11 Ảnh hưởng của GCB đến độ thu hồi HCBVTV trên nền mẫu mã đề 88 

Hình 3.12 Ảnh hưởng của GCB đến độ thu hồi HCBVTV trên nền mẫu bồ công anh 88  Hình 3.13 Quy trình chiết HCBVTV từ mẫu dược liệu tươi 89 

Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu đến hiệu suất chiết một số HCBVTV 90 

Hình 3.15: So sánh số lượng HCBVTV ở các khoảng độ thu hồi khác nhau (>80%; 70-80% và <70%) khi xử lý bằng 3 quy trình 91 

Hình 3.16 So sánh số lượng HCBVTV có độ thu hồi ở các khoảng khác nhau (>80%; 70-80% và <70%) khi sử dụng các lượng NaCl khác nhau 92 

Hình 3.17 Quy trình QuEChERS chiết HCBVTV trong mẫu dược liệu khô 92 

Hình 3.18 So sánh hiệu suất chiết HCBVTV trên mẫu TPCN xử lý theo 3 quy trình 93 

Hình 3.19 Ảnh hưởng của lượng PSA sử dụng đến độ thu hồi 94 

Hình 3.20 Ảnh hưởng của lượng GCB sử dụng đến độ thu hồi 95 

Hình 3.21 Quy trình chiết HCBVTV trên nền TPCN 95 

Hình 3.22 So sánh độ thu hồi của các HCBVTV khác nhau khi sử dụng các lượng muối chì acetat khác nhau 96 

Hình 3.23 Ảnh hưởng nền với mẫu dược liệu tươi (bồ công anh) 97 

Hình 3.24 Ảnh hưởng nền với mẫu TPCN (trà mướp đắng) 98 

Hình 3.25 So sánh ảnh hưởng nền của hai kỹ thuật định lượng: không sử dụng nội chuẩn và có sử dụng nội chuẩn (TPP) 98 

Hình 3.26 Ảnh hưởng nền với mẫu chè (có sử dụng nội chuẩn) 99 

Hình 3.27 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn của atrazin và dimethoat theo LC-MS/MS 101 

Hình 3.28 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của cypermethrin (4 đồng phân) và permethrin (2 đồng phân) theo GC-MS/MS 102 

Hình 3.29 Đường chuẩn phân tích HCBVTV trên một số nền mẫu 106 

Hình 3.30 Một số sắc đồ xác định LOD, LOQ thông qua xác định S/N 109 

Hình 4.1 Sự phân mảnh của carbendazim 133 

Hình 4.2 Sắc ký đồ của hai chất có thời gian lưu gần nhau (trichlorfon và dimethoat)135 

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và

chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm… Dược liệu là một

loại sản phẩm nông nghiệp đặc biệt, do đó cũng có nguy cơ mắc phải các dịch bệnh

nói trên Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đóng vai trò quan trọng để phòng và

loại trừ các loại dịch bệnh cho các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói

riêng Hiện nay, khi trồng hầu hết các loại dược liệu cần phải sử dụng HCBVTV nhằm

tăng năng suất và chất lượng dược liệu

Khi được sử dụng, HCBVTV có thể tồn dư trong sản phẩm Nếu HCBVTV

được dùng đúng theo quy định, mức tồn dư này là an toàn cho người sử dụng Theo

quy định, mỗi loại HCBVTV đều có giá trị giới hạn dư lượng tối đa (MRL) Tuy

nhiên, việc lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách các loại HCBVTV dẫn đến tồn

dư HCBVTV trong sản phẩm tăng lên vượt quá MRL Khi đó, HCBVTV sẽ gây ra các

tác dụng không mong muốn cho người sử dụng

Việc xác định mức dư lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm từ

dược liệu có ý nghĩa quan trọng để sàng lọc, loại bỏ các sản phẩm không đáp ứng được

sự an toàn cho người sử dụng Hiện nay, có hàng nghìn HCBVTV được cho phép sử

dụng trong nông nghiệp Để có thể phân tích hết các HCBVTV, cần phải áp dụng rất

nhiều kỹ thuật chiết và phân tích khác nhau, dẫn đến rất mất thời gian và tốn kém kinh

phí Do đó, việc xây dựng được các phương pháp có thể xác định đồng thời nhiều

HCBVTV thuộc nhiều nhóm khác nhau là nhu cầu cần thiết Trên thế giới, các phương

pháp xác định HCBVTV đã được phát triển từ rất lâu và đã trải qua nhiều thành tựu…

Hầu hết các phương pháp cố gắng hướng đến một phương pháp phân tích đồng thời

nhiều HCBVTV trong cùng một lần phân tích Các phương pháp này được gọi là

phương pháp đa dư lượng (MMM) Cục Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ đã ban hành

và thay đổi khá nhiều phương pháp đa dư lượng Trước đây, chiết lỏng lỏng kết hợp

với làm sạch bằng sắc ký cột là phương pháp kinh điển trong phân tích dư lượng

HCBVTV

Năm 2003, Anastassiades và cộng sự lần đầu tiên giới thiệu một phương pháp

chiết và làm sạch nhanh, dễ dàng mà sau này được gọi là QuEChERS (viết tắt của

Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged, Safe) kết hợp với sắc ký khí khối phổ và sắc

ký lỏng khối phổ để phân tích HCBVTV trên rau quả [32] Phương pháp QuEChERS

đã nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi và được nhiều nước chấp nhận làm phương

2

pháp chuẩn để áp dụng phân tích HCBVTV trong rau quả Sau đó, QuEChERS đã

được nhiều tác giả nghiên cứu và mở rộng áp dụng trên nhiều chỉ tiêu của nhiều đối

tượng khác nhau, trong đó phân tích HCBVTV trong dược liệu là một hướng rất mới

và có triển vọng

Hiện nay, theo quy định của Dược điển các nước, phương pháp chiết truyền

thống với kỹ thuật chiết bằng dung môi sau đó làm sạch bằng SPE hoặc GPC vẫn là

phương pháp được sử dụng để chiết HCBVTV trong dược liệu Phương pháp này có

một số hạn chế như khả năng ứng dụng hạn chế trên một nhóm HCBVTV nhất định,

sử dụng lượng dung môi hữu cơ rất lớn và trải qua rất nhiều bước nên chi phí rất tốn

kém

Với những thực tế như vậy, đề tài “Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo

vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ”

được thực hiện với các mục tiêu như sau:

1 Xác định các HCBVTV thường được dùng tại một số vùng trồng dược liệu ở

phía Bắc

2 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV trong

dược liệu và một số sản phẩm từ dược liệu

3 Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm từ

dược liệu

3

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

1.1.1 Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật

Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được chuyển nghĩa từ thuật ngữ tiếng Anh

“pesticide” có nghĩa là thuốc trừ côn trùng gây hại Tuy nhiên, hiện nay khái niệm này

được mở rộng cho nhiều loại hóa chất được sử dụng trong trồng trọt bao gồm cả thuốc

điều hòa sinh trưởng, thuốc làm rụng lá, thuốc trừ cỏ… [7][108]

Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO) đã đưa ra định

nghĩa về HCBVTV như sau: “HCBVTV là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với

mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ

trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn

của thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế

biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức

ăn chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện

hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng HCBVTV còn được dùng làm

tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân

làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm Cũng có thể dùng HCBVTV cho cây

trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá

trình bảo quản và vận chuyển” [50]

1.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật

Có nhiều cách phân loại HCBVTV khác nhau như phân loại theo mối nguy,

theo công dụng hay theo cấu tạo hóa học

1.1.2.1 Phân loại theo mối nguy

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) phân loại HCBVTV dựa vào các nghiên cứu về

nguy cơ độc hại, chủ yếu là độ độc cấp tính đường uống và đường ngoài da khi thử

nghiệm trên chuột

Giá trị LD50 trên chuột theo đường uống và đường dùng ngoài da được sử dụng

để phân loại LD50 (Median lethal dose – Liều chết trung bình) là liều lượng chất độc

gây chết cho một nửa (50%) số cá thể dùng trong nghiên cứu

Theo cách phân loại này, HCBVTV được chia thành 5 nhóm [133] (bảng 1.1)

4

Bảng 1.1 Phân loại HCBVTV theo mối nguy

Nhóm Mức độ độc LD 50 trên chuột (mg/kg cân nặng)

Đường uống Đường ngoài da

U Không có mối nguy độc cấp > 5000

1.1.2.2 Phân loại theo công dụng

Dựa vào công dụng của HCBVTV, người ta có thể phân loại như sau [7]:

 Hóa chất diệt trừ sinh vật gây hại: được gọi theo nhóm sinh vật gây hại như:

- Hóa chất trừ sâu (insecticides)

- Hóa chất trừ nấm (fungicides)

- Hóa chất trừ cỏ (herbicides)

- Hóa chất trừ chuột (rodenticides)

- Hóa chất trừ ốc sên (molluscicides)

- Hóa chất trừ nhện (acaricides)

- Hóa chất trừ vi khuẩn (bactericides)…

 Hóa chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR – plant growth regulators) là các hóa

chất sử dụng để kích thích, làm chậm hoặc ức chế sự phát triển của thực vật

 Hóa chất dùng trong bảo quản, xử lý hay chế biến sau thu hái

Trên cơ sở cách phân loại này, Alan Wood đã giới thiệu một trang điện tử trực

tuyến giới thiệu bộ sưu tập đầy đủ các loại HCBVTV được sử dụng [134]

1.1.2.3 Phân loại theo cấu tạo hóa học

Đây là cách phân loại được sử dụng phổ biến trong việc triển khai xây dựng các

phương pháp phân tích, vì các HCBVTV có cấu tạo tương tự thường có tính chất

giống nhau do đó phương pháp chiết và phân tích cũng giống nhau Hơn nữa, từng

nhóm HCBVTV tác động đến sinh vật và con người theo các nguyên lý tương tự nhau

Theo cách phân loại này một số nhóm HCBVTV chính như sau [7][108][130]:

- HCBVTV nhóm clor hữu cơ;

- HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ;

- HCBVTV nhóm pyrethroid;

1.1.3.1 Nhóm clor hữu cơ (organochlorines)

HCBVTV nhóm clor hữu cơ là các hợp chất hữu cơ được hình thành khi thay

thế các nguyên tử hydro của phân tử hydrocarbon và các dẫn xuất hydrocarbon bằng

các nguyên tử clor Trong phân tử các hợp chất này có thể tồn tại vòng benzen hoặc dị

vòng (chứa dị tố O, N, hay S) Các chất này thường là các dẫn xuất clor của một số

hợp chất hữu cơ như diphenyl ethan, cyclodien, benzen, hexan… [7][13][108]

Về mặt cấu tạo, HCBVTV nhóm clor hữu cơ được xếp vào 4 nhóm nhỏ [130]:

- Nhóm diphenyl aliphatic: DDT, dicofon, methoxychlor…

- Nhóm hợp chất benzen: lindan, hexaclorocyclohexan (HCH), pentaclorophenol…

- Nhóm hợp chất cyclodien: endrin, dieldrin, heptachlor, aldrin, endosulfan sulfat…

- Nhóm hợp chất polycloroterpen: toxaphen, polyclorocamphen…

Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm clor hữu cơ:

Aldrin Methoxychlor 4,4-DDT

Các HCBVTV nhóm clor hữu cơ nói chung có phổ tác dụng rộng, rất an toàn

với cây trồng ở liều thông dụng nhưng lại độc với các loài động vật máu nóng Các

chất này có thể tích lũy trong cơ thể sinh vật gây độc mạn tính, chúng cũng rất bền

trong môi trường, hiệu lực tồn dư lâu dài [23][68]

6

Cơ chế gây độc của HCBVTV nhóm clor hữu cơ phụ thuộc vào dạng cấu tạo

của chúng DDT và các HCBVTV có cấu trúc tương tự DDT là những chất rất độc trên

hệ thần kinh Chúng có tác dụng trên thần kinh ngoại biên thông qua ức chế các kênh

vận chuyển Na+ qua màng tế bào thần kinh dẫn đến tê liệt và có thể dẫn đến tử vong

Còn một số loại HCBVTV có cấu trúc dị vòng hoặc vòng chứa nhiều clor như aldrin,

dieldrin, heptachlor, endrin… tác động thông qua việc gắn với các vùng pícrotoxinin

của acid γ-aminobutyric dẫn đến ức chế ion Cl- vào trong tế bào thần kinh Hậu quả là

gây nên trạng thái kích thích thần kinh [27][44][60][71]

Mặc dù các HCBVTV clor hữu cơ có tác dụng diệt trừ mạnh đối với nhiều loại

sâu hại nhưng do vấn đề ô nhiễm môi trường và dư lượng HCBVTV trong nông sản,

sự tích lũy và tính độc cao đối con người và các loài động vật, mà ngày nay đa số các

HCBVTV clor hữu cơ đã bị cấm sử dụng

1.1.3.2 Nhóm phosphor hữu cơ (organophosphorus)

HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ chủ yếu là các hợp chất của phospho hóa trị

5, chúng là các ester hoặc amid của acid phosphoric hoặc dẫn xuất của acid

phosphoric Công thức cấu tạo chung của các hợp chất phosphor hữu cơ như sau [23]:

R1O P OR3

OR2

O

Trong đó R1, R2, R3 có thể là nhóm alkyl, aryl, amin hay các hợp chất thơm, dị

vòng Các nguyên tử O có thể được thay thế bằng S hay N để tạo ra các dẫn xuất

thiophosphat, amidat và cũng được xếp vào nhóm phosphor hữu cơ

Tùy theo sự thay thế các O bởi S, N và gốc ester hay amid mà có thể chia thành

một số nhóm nhỏ như: phosphat, phosphorothionat, phosphorothiolat, phosphorothionothiolat, phosphorodithiolat, phosphoroamidat, phosphoroamido-

thionat, phosphoroamidothiolat [23][130]

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphat [130]

HC OH C

Cl Cl Cl

P

O CH3

O CH3O

Trichlorfon

8

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidothiolat

Các HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ có đặc điểm chung là phổ tác dụng rộng,

an toàn với cây trồng, diệt được nhiều sâu hại, tác dụng diệt côn trùng nhanh, có độc

tính cao với động vật máu nóng, nhưng không tích lũy lâu dài thường được thải trừ

nhanh qua nước tiểu và thời gian tồn dư trong môi trường không dài [23]

HCBVTV phosphor hữu cơ tác động vào thần kinh của côn trùng và người bằng

cách ngăn cản sự tạo thành men cholinestase (ChE) làm cho thần kinh hoạt động kém,

làm yếu cơ, gây choáng váng và chết Các chất nhóm phosphor hữu cơ gây phosphorin

hóa enzym acetylcholinesterase ChE có tác dụng phân giải acetylcholin trong cơ chế

dẫn truyền xung động thần kinh qua synap Khi ChE bị ức chế, làm ứ động

acetylcholin, gây rối loạn dẫn truyền cholinergic, làm ức chế dẫn truyền các xung thần

kinh tới các tế bào cơ, tuyến, não và hạch Nhiễm độc xảy ra cấp tính có thể gây nôn,

co thắt ruột, nhức đầu, mệt mỏi, chóng mặt, co giật, suy hô hấp hôn mê và tử vong

[54][60][68][71]

Các HCBVTV nhóm phospho hữu cơ được sử dụng phổ biến từ những năm

1980, nhưng ngày nay, do độc tính cao nên rất nhiều chất trong nhóm này đã bị cấm

hoặc hạn chế sử dụng ở Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới

1.1.3.3 Nhóm pyrethroid

HCBVTV nhóm pyrethroid là những chất hữu cơ có cấu trúc tương tự các

pyrethrin tự nhiên có mặt trong một số loại hoa cúc (Chrysanthemum

cinerariaefolium và Chrysanthemum coccineum) [23][108][130]

Có hai thế hệ HCBVTV nhóm pyrethroid đã được sử dụng [130]:

- Thế hệ thứ nhất được phát triển từ những năm 60 của thế kỷ XX (ví dụ như

tetramethrin, resmethrin, bioallethrin …) với mục tiêu thay thế các hợp chất nhóm clor

hữu cơ Tuy nhiên, do đặc tính rất kém ổn định trong môi trường dưới tác dụng của

ánh sáng nên các HCBVTV này hiện không còn được sử dụng rộng rãi

- Thế hệ thứ hai được phát triển từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX (ví dụ như

permethrin gồm 2 đồng phân, cypermethrin gồm 4 đồng phân, deltamethrin,

cyfluthrin, λ-cyhalothrin…) có độ ổn định trong môi trường tốt hơn thế hệ thứ nhất do

9

đó được sử dụng nhiều trong nông nghiệp Tuy nhiên, các chất thế hệ thứ hai có độc

tính cao với động vật có vú và con người

Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm pyrethroid

Ngày nay, các hợp chất nhóm pyrethroid thường được sử dụng phối hợp với

một số HCBVTV nhóm khác nhằm tăng tác dụng BVTV Ngoài việc được sử dụng

làm HCBVTV trong nông nghiệp, các chất nhóm pyrethroid còn được sử dụng nhiều

để làm các thuốc diệt côn trùng (ruồi, muỗi, gián…) trong nhà [108]

Các chất nhóm pyrethroid là các chất độc đối với dẫn truyền thần kinh do tác

dụng luôn giữ kênh Na+ mở trong màng tế bào thần kinh gây ảnh hưởng đến sự dẫn

truyền các xung thần kinh làm mất cảm giác, tê liệt, ở liều cao có thể gây tử vong Khi

tiếp xúc trong thời gian dài có thể gây ngộ độc gan Các chất này thường ít độc qua

đường tiếp xúc và qua hô hấp Liều độc của các chất nhóm pyrethroid cũng thấp hơn

nhiều loại HCBVTV khác [44][55][60][68][71]

1.1.3.4 Nhóm carbamat

HCBVTV nhóm carbamat là các ester của acid carbamic (H2N-COOH) và dẫn

xuất của acid carbamic Đại diện cho nhóm này như: aldicarb, carbofuran, carbaryl,

fenobucarb, isoprocarb… Ngày nay, các hợp chất carbamat được sử dụng rất phổ biến

và được phối hợp với các HCBVTV khác để tăng cường phổ tác dụng [23][108][130]

Các HCBVTV nhóm carbamat có đặc điểm chung là phổ tác dụng hẹp, hiệu lực

thuốc ngắn, ít tan trong nước, tan nhiều dung môi hữu cơ, bị kiềm phân hủy Không

tồn lưu lâu dài trong môi trường [23]

Các hợp chất carbamat cũng có khả năng tích lũy và đầu độc hệ thần kinh của

người và động vật nhưng độc tính kém các hợp chất phosphor hữu cơ Khi sử dụng,

10

chúng tác động trực tiếp vào men cholinesterase của hệ thần kinh và có cơ chế gây độc

giống như nhóm phosphor hữu cơ tuy nhiên mức độ độc hại không bằng các hợp chất

nhóm phosphor hữu cơ [53][60][71]

Một số HCBVTV nhóm carbamat có công thức cấu tạo như sau:

1.1.3.5 Nhóm neonicotinoid

Neonicotinoid là nhóm HCBVTV gây kích thích thần kinh có cấu trúc tương tự

nicotin được sử dụng từ những năm 80 của thế kỷ XX Đại diện cho nhóm này gồm

các chất như imidachloprid, acetamiprid, thiamethoxam, dinotefuran… [130][134]

Gần đây, một số nước hạn chế sử dụng những chất của nhóm này vì có nhiều

bằng chứng cho thấy nguy cơ gây hội chứng CDD (rối loạn sụt giảm bầy đàn) đối với

ong mật Nguyên nhân là do các chất này phá huỷ hệ thống miễn dịch tự nhiên của ong

mật nhạy cảm với nhiều trường hợp nhiễm trùng gây chết [52] Hiện nay, ở Việt Nam

các chất này vẫn được phép sử dụng làm HCBVTV trong nông nghiệp [2]

Một số HCBVTV nhóm neonicotinoid có công thức cấu tạo như sau:

11

Nhóm HCBVTV này có độc tính thấp hơn các nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu

cơ và carbamat Tuy nhiên, một số sản phẩm chuyển hoá của nhóm này lại cho thấy có

độc tính cao đối với chim và cá Cơ chế gây độc là do các sản phẩm này này gắn với

các receptor của acetylcholin, gây độc thần kinh trung ương Đường tiếp xúc qua da có

độc tính thấp, có thể gây đỏ và ngứa mắt nhẹ Chưa có các bằng chứng về gây ngộ độc

cấp tính trên người Các nghiên cứu cũng cho thấy các chất này phân hủy nhanh trong

đường tiêu hóa và loại trừ qua phân, nước tiểu trong vòng 48 giờ [52][60][71]

1.1.3.6 Nhóm macrocyclic lacton

Các hợp chất nhóm macrocyclic lacton là các sản phẩm được lên men tự nhiên

từ các loài vi khuẩn Streptomyces giống nấm Một số hợp chất đại diện của nhóm này

gồm abamectin, ivermectin, emamectin, spinosad…có công thức cấu tạo như sau

[108][130][134]:

Abamectin (B1a: B1b= 8:2) Emamectin

Spinosad

12

Trước đây, tác dụng chính của các chất thuộc nhóm này là tác dụng diệt giun

sán đối với gia súc Hiện nay, các chất thuộc nhóm này được sử dụng để làm

HCBVTV trong nông nghiệp Các HCBVTV nhóm macrocyclic lacton thường được

phối hợp với các HCBVTV nhóm khác để tăng khả năng diệt trừ sâu hại [2][130]

Các chất này ngăn cản sự dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh và tế bào cơ

bằng cách tăng cường sự giải phóng và gắn acid γ-aminobutyric vào đầu tế bào thần

kinh dẫn đến làm tăng ion Cl- vào trong tế bào làm tê liệt hệ thần kinh Các triệu chứng

ngộ độc cấp có thể gặp phải bao gồm hôn mê, giảm huyết áp, suy hô hấp và tử vong

[60][71]

1.1.3.7 Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật khác

Một số HCBVTV có cấu tạo khác biệt do đó không được xếp vào các nhóm

HCBVTV chính nêu trên Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV thuộc

các nhóm nhỏ nhưng đang được sử dụng phổ biến [134]

Ngoài ra, có thể kể đến một số HCBVTV thuộc các nhóm khác như nhóm thuốc

có nguồn gốc thực vật (allicin, nicotin, pyrethrin, rotenone…), diamid (chlorantraniliprole, cyantraniliprole) và nhiều HCBVTV không được phân loại vào

một nhóm cụ thể nào [134]

13

1.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

1.2.1 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trên thế giới

Trên thế giới, việc sử dụng HCBVTV trong lịch sử có thể được chia làm 4 giai

đoạn [7][23]:

 Giai đoạn 1 (trước năm 1940): Chủ yếu sử dụng các hợp chất vô cơ như đồng, lưu

huỳnh, arsen, thủy ngân… Phần lớn các chất này đều rất độc và tồn tại lâu trong môi

trường

 Giai đoạn 2 (từ 1940 đến 1960): Giai đoạn này bắt nguồn từ việc phát minh ra

thuốc trừ sâu DDT (Paul Muller, giải Nobel hóa học 1939) và sau đó là các HCBVTV

nhóm clor hữu cơ DDT từng được xem như là một loại thần dược cho nông nghiệp

Nhiều hóa chất được sử dụng trong giai đoạn này có chứa gốc clor đã để lại những hậu

quả nghiêm trọng cho nhân loại trong đó đỉnh điểm là việc sử dụng các hợp chất clor

hữu cơ (DDT; 2,4,5-T; 2,3,7,8-TCDD) làm chất độc hóa học trong chiến tranh Mặc

dù ở giai đoạn này, một số HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ và carbamat đã ra đời

nhưng vị trí của chúng còn kém xa các hợp chất nhóm clor hữu cơ

 Giai đoạn 3 (từ 1960 đến 1980): Năm 1962, tác phẩm Silent Spring của Rachel

Carson được xuất bản đã phát đi những cảnh báo về ảnh hưởng nghiêm trọng của các

hợp chất clor hữu cơ đối với sức khỏe con người và môi trường Từ 1973, US FDA

sau đó đã cấm sử dụng các hợp chất clor hữu cơ làm HCBVTV Thế giới đã phát minh

ra các hợp chất thay thế như các chất nhóm phosphor hữu cơ, nhóm pyrethroid là các

hợp chất ít bền trong môi trường hơn Các HCBVTV nhóm pyrethroid thế hệ II ra đời

vào đầu những năm 70 của thế kỷ XX mở ra khả năng áp dụng các loại HCBVTV có

độ chọn lọc cao và thân thiện với môi trường

 Giai đoạn 4 (từ 1980 đến nay): Đã phát minh ra nhiều loại HCBVTV mới và nguồn

gốc sinh học Ngoài hiệu quả phòng trừ dịch bệnh cho nông nghiệp, tính an toàn của

HCBVTV ngày càng được chú ý nhiều hơn Hầu như toàn bộ các HCBVTV nhóm clor

hữu cơ đã bị cấm sử dụng trên thế giới, các chất nhóm phosphor hữu cơ độc hại cũng

đã bị cấm hoặc hạn chế sử dụng Để đảm bảo hiệu quả trên mùa màng, người ta

thường phối hợp 2 hoặc nhiều HCBVTV có độc tính thấp hơn

Ngày nay nhiều HCBVTV mới đã được phát triển với ưu điểm là có tính chọn

lọc hơn và ít độc hại hơn Đặc biệt, các nhóm thuốc bảo vệ thực vật sinh học ngày

càng được nghiên cứu phát triển vì ít độc hại hơn Tuy nhiên vai trò của những thuốc

bảo vệ thực vật có bản chất hóa học vẫn chưa thể được thay thế Theo thống kê của

14

EPA, mỗi năm ở Mỹ sử dụng khoảng 1 tỷ tấn HCBVTV chiếm khoảng 22% lượng

HCBVTV được sử dụng trên toàn thế giới [108]

1.2.2 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật ở Việt Nam

Hàng năm, Bộ NN&PTNT ban hành Thông tư về Danh mục thuốc BVTV

Thông tư 21/2013/TT-BNNPTNT ngày 17 tháng 4 năm 2013 ban hành các danh mục

thuốc BVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng, cấm sử dụng ở Việt Nam [2] Bảng

1.2 tổng hợp số lượng các hoạt chất theo 3 danh mục được phân loại dựa vào công

dụng Theo đó, có đến trên 1500 hoạt chất HCBVTV được phép sử dụng ở Việt Nam

trong đó nhiều nhất dùng để diệt trừ sâu hại và trừ nấm bệnh Một số hoạt chất trừ sâu

hạn chế sử dụng bao gồm carbofuran và methomyl (nhóm carbamat) Có 21 hoạt chất

trừ sâu bị cấm sử dụng, bao gồm 14 chất nhóm clor hữu cơ (aldrin, BHC, lindan,

chlordan, DDT, dieldrin, endosulfan, endrin, heptachlor, isodrin, natri pentaclorophenat, pentaclorophenol, polyclorocamphen, chlordimeform), 5 chất nhóm

phosphor hữu cơ (phosphamidon, methamidophos, methyl parathion, monocrotophos,

ethyl parathion) và hai chất vô cơ (Cd, Pb)

Bảng 1.2 Số lượng hoạt chất HCBVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng và cấm

Hóa chất điều hòa sinh

trưởng thực vật 52 hoạt chất - -

Hóa chất dùng trong

bảo quản, xử lý hay

chế biến sau thu hái

10 hoạt chất 8 hoạt chất -

15

Hầu hết các thuốc BVTV sử dụng ở Việt Nam đều phải nhập khẩu từ nước

ngoài Hàng năm, Việt Nam nhập khẩu trên 70.000 tấn thành phẩm với trị giá 210 -

500 triệu USD Trên 90% thuốc BVTV được nhập khẩu từ Trung Quốc Tuy nhiên,

ngoài những thuốc BVTV nằm trong danh mục của Bộ Nông nghiệp và phát triển

nông thôn còn có nhiều loại thuốc BVTV được sử dụng trái phép trong nông nghiệp

thông qua việc mua bán trao tay Các sản phẩm này chủ yếu có nguồn gốc từ Trung

Quốc và được nhập vào Việt Nam thông qua các con đường tiểu ngạch [10]

Theo nghiên cứu của Lê Doãn Diên và cộng sự, sản lượng HCBVTV được sử

dụng ở Việt Nam năm 1998 là khoảng 38.000 tấn, trong tỷ trọng thuốc trừ sâu chiếm

55% Đến năm 2011, sản lượng HCBVTV được sử dụng khoảng 112.000 tấn và vẫn

tiếp tục xu hướng tăng [8][10]

Theo số liệu của Cục Bảo vệ thực vật, đến năm 2011, cả nước có 93 nhà máy,

cơ sở sản xuất, gia công, sang chai, đóng gói thuốc BVTV và 28.750 đại lý, cửa hàng

kinh doanh buôn bán thuốc BVTV Kết quả thanh tra, kiểm tra sản xuất, kinh doanh

thuốc BVTV (2007 - 2010) cho thấy: số cơ sở, cửa hàng, đại lý được thanh tra, kiểm

tra phát hiện có vi phạm chiếm khoảng 14 - 16 % (tổng số đơn vị thanh kiểm tra trung

bình 14.000/năm), trong đó: buôn bán thuốc cấm 0,19 - 0,013 %; buôn bán thuốc

ngoài danh mục 0,85 -0,72%; buôn bán thuốc giả 0,04 -0,2%; vi phạm về ghi nhãn

hàng hóa 3,12- 2,44 % và vi phạm vê điều kiện buôn bán 14,4-16,46% [10]

1.2.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật an toàn và hiệu quả

Để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong việc sử dụng HCBVTV cho cây trồng nói

chung và dược liệu nói riêng, cần phải thực hiện các biện pháp sau [23]:

1) Thực hiện biện pháp phòng trừ tổng hợp đối với mọi loại dịch hại và cây trồng,

chỉ dùng biện pháp hóa học khi những biện pháp khác không có hiệu quả

2) Đảm bảo sử dụng HCBVTV theo nguyên tắc 4 đúng

- Đúng thuốc: Mỗi loại HCBVTV được sử dụng để diệt trừ một tác nhân gây

hại cụ thể và không sử dụng cùng một loại thuốc trong nhiều vụ liên tiếp

- Đúng liều lượng: Cần sử dụng theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

- Đúng lúc: Cần phun thuốc vào thời điểm mà dịch hại trên đồng ruộng dễ bị

tiêu diệt nhất, đó là giai đoạn khi sâu còn non hay khi không có mưa lớn

Ngoài ra, cần ngừng sử dụng trước khi thu hoạch một thời gian nhất định tùy

theo từng loại thuốc

16

- Đúng cách: Cần pha thuốc đúng cách và phun thuốc làm sao cho HCBVTV

tiếp xúc được với dịch hại nhiều nhất Không tự ý trộn nhiều loại HCBVTV

với nhau để phun trên đồng ruộng

3) Đảm bảo thời gian cách ly (PHI – Pre harvest interval) của từng loại thuốc trên

mỗi loại cây trồng

4) Đảm bảo an toàn cất giữ những HCBVTV chưa sử dụng hết

- Những HCBVTV chưa sử dụng hết phải được cất giữ trong phòng riêng biệt,

không dột, có khoá cửa chắc chắn, xa nơi ở và chuồng trại gia súc

- Những dụng cụ đong thuốc, bình bơm thuốc, quần áo bảo hộ phải được giặt

giũ, rửa sạch sẽ sau mỗi đợt phun thuốc và phải cất giữ trong kho riêng

- Không đổ thuốc dư thừa, chưa dùng hết sang bất kỳ đồ đựng khác (vỏ chai

bia, chai nước mắm …) Sau khi đã dùng hết thuốc không được dùng bao bì

HCBVTV (chai, túi) vào bất kỳ mục đích nào khác Phải huỷ và chôn những

bao bì này

5) Đảm bảo an toàn trong lưu thông HCBVTV

1.3 DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ

SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU

1.3.1 Khái niệm về dư lượng và mức dư lượng tối đa

Dư lượng là phần còn lại của hoạt chất, các sản phẩm chuyển hóa và các thành

phần khác có trong thuốc, tồn tại trên cây trồng, nông sản, đất, nước sau một thời gian

dưới tác động của hệ sống và điều kiện ngoại cảnh [7]

Giới hạn dư lượng tối đa (MRL) HCBVTV (biểu thị bằng mg/kg), là nồng độ

cao nhất của dư lượng thuốc có trong một đơn vị sản phẩm nông sản hay thực phẩm

mà ở đó có thể được chấp nhận mà không gây hại cho người sử dụng Dư lượng

HCBVTV được tính bằng miligam thuốc có trong 1 kilogam nông sản Ủy ban Codex

(tổ chức tiêu chuẩn thuộc FAO và WHO) đã lập ra danh mục giới hạn tối đa của

HCBVTV trong thức ăn cho người và gia súc Mỗi nước đều có các quy định về MRL

của các HCBVTV trong các đối tượng khác nhau [50]

Việc xác định MRL dựa trên các nghiên cứu về độc tính của HCBVTV, các dữ

liệu về dư lượng trong sản phẩm được sản xuất theo quy trình thực hành nông nghiệp

tốt (GAP) và lượng sản phẩm mà con người sử dụng [50]

17

1.3.2 Quy định về mức dư lượng tối đa

Mỗi loại HCBVTV có một giá trị MRL khác nhau trên từng nền mẫu Hơn nữa,

MRL của mỗi nước lại khác nhau do sự khác nhau về số lượng sản phẩm và cách sử

dụng của từng nước WHO và FAO quy định MRL theo tiêu chuẩn Codex, trong đó

quy định cụ thể cho mỗi HCBVTV trong từng nền mẫu Các giá trị này được xem là

MRL quốc tế Tại Việt Nam, Quyết định số 46-2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm

2007 của Bộ Y Tế đã qui định MRL của HCBVTV trong các sản phẩm nông sản gồm

hoa quả, rau củ, thịt cá… [3] Các tiêu chuẩn này dựa trên tiêu chuẩn Codex do chưa

có các nghiên cứu ở Việt Nam về đánh giá nguy cơ ô nhiễm HCBVTV

Dược điển Việt Nam IV, có quy định về phương pháp phân tích HCBVTV (phụ

lục 17.12) [4] trong đó giá trị giới hạn (mg/kg) được lấy quy định của Dược điển Mỹ

[125] Theo quy định này, đối với các sản phẩm có nguồn gốc thực vật, giới hạn của

từng HCBVTV được đưa ra như ở Bảng 1.3 Còn các sản phẩm không có MRL thì

giới hạn phải thấp hơn giới hạn phát hiện của phương pháp quy định bởi EPA Cụ thể

hơn, đối với các sản phẩm cuối cùng, giá trị MRL được tính theo công thức sau:

trong đó: A: là ADI – lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được (mg/kg cân nặng)

M: Khối lượng cơ thể người (60 kg) B: Liều dùng dược liệu hàng ngày (kg)

Bảng 1.3 Quy định của Dược điển Việt Nam IV về giới hạn HCBVTV

19

Theo quy định này, mới chỉ có 32 HCBVTV có giới hạn cho phép Tuy nhiên,

hiện nay vẫn còn rất nhiều HCBVTV chưa có quy định về giới hạn này Hầu như các

sản phẩm dược liệu, chế phẩm từ dược liệu (như thuốc đông dược, trà thảo dược, thực

phẩm chức năng có thành phần thảo dược…) đều chưa có MRL Điều này gây ra

những khó khăn khi đánh giá chất lượng của sản phẩm

Để giải quyết vấn đề này, một số quốc gia phát triển và tổ chức trên thế giới như

Nhật Bản, Châu Âu… sử dụng giá trị MRL mặc định (default value) đối với các

HCBVTV chưa thiết lập được MRL Giá trị MRL mặc định này không dựa trên các

nghiên cứu về đánh giá nguy cơ mà dựa trên mức được coi là an toàn đối với người sử

dụng Hiện nay, tại Việt Nam chưa đưa ra giá trị MRL mặc định Bảng 1.4 giới thiệu

một số quy định về MRL mặc định của một số nước

Bảng 1.4 Giá trị MRL mặc định của một số nước

Quốc gia MRL mặc định (mg/kg) Tham khảo

Mặc dù giá trị MRL mặc định có sự khác nhau giữa các nước nhưng xu hướng

ngày càng có nhiều nước chấp nhận mức 0,01 mg/kg vì sự an toàn của sản phẩm đối

với sức khỏe người sử dụng

Cho đến nay, mức 0,01 mg/kg là giá trị MRL thấp nhất của tất cả các

HCBVTV.Giá trị MRL mặc định này được đa số các phòng thí nghiệm lựa chọn như

là mức mà phương pháp phân tích phải đạt được để phân tích HCBVTV

1.3.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu

Cũng như nhiều loại cây trồng khác, trong quá trình phát triển cây thuốc cũng

có nguy cơ mắc phải các bệnh dịch Do đó, việc sử dụng HCBVTV trong trồng cây

thuốc là rất cần thiết Tuy nhiên, việc lạm dụng hay sử dụng không đúng cách các

HCBVTV có thể tồn dư trong dược liệu và các sản phẩm chế biến từ dược liệu

20

Ngày 03 tháng 9 năm 2009, Bộ Y tế ban hành thông tư số 14/2009/TT-BYT về

việc hướng dẫn triển khai, áp dụng các nguyên tắc tiêu chuẩn “Thực hành tốt trồng

trọt và thu hái cây thuốc” theo khuyến cáo của tổ chức Y tế thế giới [5] Theo đó, đối

với việc sử dụng HCBVTV, tổ chức Y tế thế giới quy định:

1) Bất kỳ các hoá chất nông nghiệp nào dùng cho mục đích tăng trưởng hoặc diệt

trừ dịch hại chỉ được sử dụng khi không có các phương pháp khác Cần sử dụng

4) Chỉ có các nhân viên được đào tạo mới được phép sử dụng HCBVTV

5) Thời gian cách ly từ khi sử dụng HCBVTV đến khi thu hoạch cần phải tuân

theo đúng hướng dẫn của từng HCBVTV và được sự đồng ý của bên mua

6) Dư lượng HCBVTV trong các sản phẩm dược liệu phải đáp ứng được các yêu

cầu của quốc gia trồng và tiêu thụ sản phẩm

7) Không trồng và thu hoạch dược liệu từ những khu vực gần với nơi có hàm

lượng HCBVTV cao như gần các nhà máy sản xuất, nước thải có chứa nhiều

HCBVTV

8) Thiết bị sử dụng để phun HCBVTV cần được kiểm soát và hiệu chuẩn định kỳ

9) Trong quá trình bảo quản dược liệu, cần tránh xa các nguồn HCBVTV

Hiện nay ở Việt Nam, đã có một số đơn vị trồng cây thuốc đạt chuẩn

GACP-WHO Ở miền Bắc, một số đơn vị đạt chuẩn GACP-WHO đối với các sản phẩm dược

liệu như:

- Công ty trách nhiệm hữu hạn Nam Dược, Nam Định với dược liệu dây thìa

canh, bộ phận dùng là lá và cành mang lá được trồng tại Hải Hậu, Nam Định

- Công ty cổ phần Traphaco với 4 loại dược liệu đinh lăng (Hải Hậu và Nghĩa

Hưng, Nam Định), actiso (Sapa, Lào Cai), bìm bìm biếc (Lạc Thuỷ, Hoà Bình)

và rau đắng đất (Tây Hoà, Phú Yên)

Theo kết quả khảo sát tại hai đơn vị này, tất cả các loại HCBVTV đều nằm

trong danh mục cho phép và tuân thủ đúng các yêu cầu theo chuẩn GACP-WHO

“Thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc”

Các nghiên cứu về việc sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc và bảo quản

dược liệu ở Việt Nam còn rất hạn chế Tiêu biểu nhất là nghiên cứu của Trịnh Văn

21

Quỳ và Trần Việt Hùng, được công bố năm 2005 Theo kết quả này, trong quá trình

trồng cây thuốc tỷ lệ sử dụng thuốc BVTV chiếm 82,1%; 95,6% và 95,1% lần lượt ở

các vùng trồng cây thuốc ở Sapa – Lào Cai (2002), Thiết Trụ - Hưng Yên (2002) và

Nghĩa Trai – Hưng Yên (2004) Khoảng 67% số dược liệu được trồng cần phải được

sử dụng HCBVTV Tác giả đã thống kê được 99 loại thuốc BVTV trong đó có 64 chất

(27 hoạt chất) thuộc nhóm thuốc trừ sâu được sử dụng tại ba vùng trên Hầu hết các

hoạt chất nằm trong danh mục cho phép, chỉ có 1 chất đã bị cấm sử dụng

(methamidophos) và hai hoạt chất hạn chế sử dụng ở Việt Nam (endosulfan và kẽm

phosphid) [15][18]

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thu năm 2009, có 102

HCBVTV được sử dụng tại các địa phương Duyên Hà – Thanh Trì (Hà Nội), Vạn

Phúc - Thanh Trì (Hà Nội); xã Tự Nhiên - Thường Tín (Hà Nội); xã Bình Minh -

Khoái Châu (Hưng Yên) và xã Hoà Bình - Hà Trung (Thanh Hoá), trong đó có 79

thuốc diệt côn trùng (chiếm 77,45%) Hai nhóm hoạt chất chính được sử dụng phổ

biến trong các HCBVTV là nhóm phosphor hữu cơ (chiếm 27,45%) và nhóm

pyrethroid (chiếm 22,55%) Qua điều tra tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây

thuốc tại một số địa phương phát hiện thấy trong số các hoá chất được sử dụng có

nhiều chế phẩm không nằm trong Danh mục hoá chất bảo vệ thực vật được phép sử

dụng ở Việt Nam năm 2009 (sơ bộ phát hiện có 26/102 thuốc, chiếm 25,49%) [22]

Theo Trần Việt Hùng, quy trình sử dụng thuốc BVTV khi phun cho cây ở một

số vùng trồng cây thuốc tự phát (như Thiết Trụ, Hưng Yên) nói chung được sử dụng

chưa đúng cách, cụ thể như sau [15]

1) Người sử dụng không trang bị bảo hộ lao động khi phun thuốc, thiếu áo mưa, khẩu

trang và găng tay

2) Dùng không đúng liều lượng: phần lớn người dân sử dụng lượng gấp 1,5 đến 4 lần

liều lượng ghi trên nhãn

3) Dùng theo kinh nghiệm, truyền miệng nhau dẫn đến có những cách sử dụng sai và

nguy hiểm như hiện tượng trộn thuốc trừ sâu với thuốc chuột để diệt sâu bọ, trộn

thuốc sâu với rượu…

4) Lạm dụng: Sử dụng nhiều loại thuốc BVTV khác nhau Nói chung người dân phát

hiện thấy sâu là phun thuốc Số lần sử dụng thuốc trên một vụ không cố định, dao

động từ 4-8 lần/vụ

5) Người dân không quan tâm khoảng thời gian từ khi phun thuốc đến khi thu hái

22

6) Một số thuốc BVTV được để gần nơi gia đình sinh hoạt, để ở góc vườn thuốc bị

chảy hoặc dính nước mưa

7) Sau khi sử dụng xong, bao bì đựng thuốc được vứt tại vườn trồng cây thuốc hoặc bờ

mương Như vậy, người dân không thực hiện xử lý bao bì đựng thuốc BVTV sau

khi sử dụng xong

8) Người dân còn sử dụng thuốc BVTV bị cấm như methamidophos (Monitor) hoặc

thuốc BVTV hạn chế sử dụng như endosulfan (Cyclodan, Endosol) và kẽm

phosphid (Fokeba) Đáng lưu ý là nhiều người đã biết đây là những hóa chất cấm và

hạn chế sử dụng nhưng vẫn cố tình sử dụng

1.3.4 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm dược liệu

Tổ chức Y tế thế giới đã ban hành hướng dẫn đánh giá chất lượng dược liệu

trong đó HCBVTV là một tiêu chí rất quan trọng [132] Mặc dù vậy, các nghiên cứu

về dư lượng HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu ở nước ta hiện nay

còn rất hạn chế Chất lượng các sản phẩm thuốc và TPCN từ thảo dược hiện nay vẫn

còn thiếu những qui định về giới hạn kim loại nặng, qui định về dư lượng thuốc bảo vệ

thực vật và hóa chất kích thích tăng trưởng

Qua khảo sát của Viện Dược liệu có 25/91 mẫu dược liệu khảo sát có dư lượng

HCBVTV, hay gặp nhất là các mẫu dược liệu có các bộ phận thường dùng là lá và hoa

như khổ sâm, ngải cứu, tía tô, húng quế, kinh giới, cúc hoa, mướp đắng, rau má… và

các mẫu dược liệu khô như đương qui, sâm, ngưu tất [21]

Một nghiên cứu năm 2009 của Nguyễn Thị Bích Thu và cộng sự, xác định một

số HCBVTV nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ và carbamat trong 24 loại dược liệu

tại 5 xã thuộc 4 tỉnh ở Việt Nam cho thấy có 23% số mẫu có dư lượng HCBVTV

nhóm phosphor hữu cơ, 21% số mẫu có dư lượng HCBVTV nhóm pyrethroid và chỉ

có 3% số mẫu có phát hiện thấy dư lượng HCBVTV nhóm clor hữu cơ Ngoài ra,

nhóm tác giả còn phát hiện thấy chất endosulfan là thuốc BVTV đã bị cấm sử dụng

[22]

Theo các nghiên cứu của Trịnh Văn Quỳ và Trần Việt Hùng được thực hiện từ

2002-2004, 33 mẫu dược liệu tại Sapa – Lào Cai, Thiết Trụ - Hưng Yên và Nghĩa Trai

– Hưng Yên đã được phân tích bằng sắc ký khí Nghiên cứu không phát hiện dư lượng

HCBVTV nhóm clor hữu cơ, tuy nhiên phát hiện có 4/16 mẫu cúc hoa có dư lượng

cypermethrin trong đó có 1 mẫu vượt MRL Ngoài ra, có 1 mẫu hoắc hương phát hiện

có trichlorfon [15][18]

23

Một số tác giả khác cũng nghiên cứu phương pháp để xác định HCBVTV trong

dược liệu, tuy nhiên mới chỉ dừng lại ở phương pháp mà chưa đi sâu vào xác định dư

lượng của các HCBVTVtrong dược liệu [26]

Hầu hết các nghiên cứu tại Việt Nam cho đến nay đều sử dụng phương pháp sắc

ký khí hoặc sắc ký khí khối phổ để xác định dư lượng HCBVTV Các phương pháp

này chỉ xác định được một số nhóm HCBVTV như clor hữu cơ, phosphor hữu cơ và

pyrethroid mà không thể xác định được một số nhóm HCBVTV mới đang được sử

dụng phổ biến như nhóm carbamat, nhóm neonicotinoid… Do đó, cần phải có những

phương pháp phân tích có thể ứng dụng để xác định các hợp chất này

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

Có nhiều phương pháp để xác định dư lượng HCBVTV trong nông sản và dược

liệu Về nguyên tắc chính, quá trình phân tích HCBVTV thường gồm hai giai đoạn:

giai đoạn xử lý mẫu và giai đoạn phân tích trên thiết bị Ở giai đoạn thứ nhất, các

HCBVTV được tách ra khỏi nền mẫu vào một dịch chiết thích hợp Nền mẫu dược liệu

rất đa dạng, do đó quá trình xử lý mẫu cần được tối ưu hóa để chiết xuất được tối đa

các HCBVTV trên nhiều loại dược liệu khác nhau Ở giai đoạn thứ hai một kỹ thuật

phân tích phù hợp được sử dụng để xác định hàm lượng HCBVTV trong dịch chiết từ

đó tính được hàm lượng trong mẫu ban đầu

1.4.1 Các phương pháp xử lý mẫu

Phân tích dư lượng HCBVTV trong các nền mẫu dược liệu và sản phẩm từ dược

liệu thường gặp phải khó khăn do sự khác nhau về thành phần của các loại dược liệu

Vì thế, mục tiêu của quá trình xử lý mẫu ngoài việc chiết được tối đa HCBVTV, còn

phải làm giảm được càng nhiều tạp chất càng tốt Có nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã được

sử dụng bao gồm chiết bằng dung môi, chiết siêu tới hạn, chiết pha lỏng dưới áp suất,

chiết vi sóng, chiết pha rắn, chiết phân tán pha rắn, vi chiết pha rắn và QuEChERS

1.4.1.1 Chiết bằng dung môi

 Giới thiệu chung

Chiết bằng dung môi (solvent extraction, SE) là kỹ thuật sử dụng dung môi hữu

cơ để chiết chất phân tích từ mẫu đã làm nhỏ Thông thường, các mẫu rắn có thể được

đồng nhất trước khi chiết bằng phương pháp nghiền, xay, trộn Một phần mẫu được

xay hoặc lắc với dung môi hữu cơ sau đó cho thêm natri sulfat khan để loại nước (có

24

trong mẫu) Tỷ lệ giữa mẫu và dung môi có thể thay đổi tùy theo từng loại nền mẫu

Thông thường, 50 mL dung môi có thể được sử dụng để chiết khoảng 5-10 g mẫu Có

thể sử dụng một số tác nhân vật lý hỗ trợ như lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc, sóng siêu

âm… Đối với các mẫu nhiều tạp chất có thể phối hợp thêm các quá trình làm sạch

khác [6][17][73]

Trong kỹ thuật chiết bằng dung môi, yếu tố cần quan tâm nhất là độ phân cực

của dung môi phải phù hợp với chất phân tích Khi cần thiết phải phối hợp các loại

dung môi khác nhau để thay đổi độ phân cực, độ nhớt, lực dung môi Trong các loại

dung môi, acetonitril là dung môi được dùng phổ biến Ngoài ra, nhiều loại dung môi

khác cũng đã được sử dụng để chiết HCBVTV từ dược liệu như n-hexan, ethyl acetat,

diethyl ether, dicloromethan và aceton [73]

Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction, MAE) là

phương pháp chiết bằng dung môi có sự hỗ trợ của vi sóng Năng lượng vi sóng giúp

hỗ trợ, đẩy nhanh quá trình hòa tan các chất phân tích từ mẫu vào dung môi chiết

[7][58] Trong quá trình chiết, thể tích dung môi cần phải ngập mẫu nhưng không

được quá lớn vì có thể ảnh hưởng đến tác động của vi sóng đến mẫu

Chiết soxhlet là một phương pháp chiết bằng dung môi đặc biệt Trong đó, dung

môi mới ở nhiệt độ cao sẽ liên tục đi qua mẫu và giúp chiết kiệt đối tượng phân tích

trong mẫu đã làm nhỏ Dung môi chiết có thể là hỗn hợp aceton với hexan hoặc với

ether dầu hỏa Aceton thường được sử dụng do đây là dung môi đồng tan với nước, có

điểm sôi thấp làm giảm nhiệt độ sôi và tăng khả năng thấm vào mẫu [36]

 Ứng dụng của SE

Các phương pháp được quy định trong Dược điển Việt Nam IV, Dược điển Mỹ

XXXVII [125] hay Dược điển Trung Quốc 2010 đều sử dụng kỹ thuật chiết dung môi

và phối hợp thêm các kỹ thuật làm sạch khác để phân tích HCBVTV [4][105] Theo

dược điển Việt Nam IV và Dược điển Mỹ XXXVII, mẫu dược liệu được làm khô và

chiết bằng aceton, sau đó được chuyển đổi về dung môi toluen trước khi cho qua các

cột làm sạch phù hợp với từng nhóm HCBVTV [4][125] Dược điển Trung Quốc sử

dụng phương pháp chiết HCBVTV clor hữu cơ bằng aceton và chiết lại bằng

dicloromethan, sau đó dicloromethan được cô, cặn được hòa trong ether dầu hỏa và

làm sạch với acid sulfuric rồi phân tích bằng sắc ký khí [105] Các phương pháp này

có thể chiết được một số HCBVTV thuộc 3 nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ và

pyrethroid, nhưng không chiết được các HCBVTV thuộc các nhóm khác

25

Một ứng dụng tiêu biểu về phương pháp chiết dung môi do Granby và cộng sự

công bố gần đây để phân tích HCBVTV nhóm carbamat và các HCBVTV phân cực

trên nền mẫu quả bằng cách chiết với hỗn hợp dung môi methanol và đệm acetat có sử

dụng siêu âm Độ thu hồi đạt được từ 70-120% trong khoảng nồng độ từ 0,02 đến 0,2

mg/kg [58]

Lino và cộng sự đã so sánh khả năng chiết của các loại dung môi và hỗn hợp

dung môi để chiết 15 HCBVTV nhóm clor hữu cơ trong dược liệu bao gồm hỗn hợp

acetonitril và hexan (1:1), hỗn hợp nước và acetonitril (1:1) hay n-hexan Kết quả cho

thấy sử dụng n-hexan cho hiệu suất chiết tốt nhất [84]

Trong các điều kiện chiết, pH là yếu tố khá quan trọng có thể ảnh hưởng đến

hiệu suất chiết Yoshioka và cộng sự đã sử dụng pH 10 để chiết nhiều hợp chất có tính

acid base khác nhau từ các loại quả họ cam [139] Trong một nghiên cứu khác, điều

chỉnh pH về 6 có thể làm tăng hiệu suất chiết của một số HCBVTV thế hệ mới như

benfuracarb và imidacloprid [112]

Phương pháp chiết Soxhlet cũng được một số tác giả nghiên cứu để chiết

HCBVTV trong dược liệu Tuy nhiên, các kết quả so sánh cho thấy hiệu quả của

phương pháp này không cao Theo Snyder, hiệu quả của Soxhlet không tốt bằng chiết

siêu tới hạn (SFE) [116] Hwang và cộng sự cũng đã so sánh phương pháp chiết

Soxhlet sử dụng hỗn hợp dung môi n-hexan:aceton (1:1) với phương pháp vi chiết pha

rắn (SPME) và thấy Soxhlet không phù hợp để chiết HCBVTV nhóm clor hữu cơ [66]

Chiết bằng dung môi là phương pháp đơn giản, hiệu quả và khá ổn định Tuy

nhiên, phương pháp này có nhiều nhược điểm như rất mất thời gian và tốn công sức;

sử dụng lượng lớn dung môi gây ảnh hưởng đến môi trường; một số dung môi độc hại

có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người làm Phương pháp này cũng chỉ có thể ứng dụng

để phân tích một vài nhóm HCBVTV như nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ và

pyrethroid

1.4.1.2 Chiết siêu tới hạn

 Giới thiệu chung

Chiết siêu tới hạn (Supercritical-fluid extraction, SFE) là phương pháp chiết

bằng dung môi đặc biệt là dung môi ở trạng thái siêu tới hạn [17][92] Một chất sẽ ở

trạng thái siêu tới hạn khi có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn Ở trạng thái

siêu tới hạn, chất này không còn ở thể lỏng nhưng vẫn chưa thành thể khí (Hình 1.1)

26

Hình 1.1 Các trạng thái vật lý theo nhiệt độ vào áp suất

Trong SFE, CO2 thường được sử dụng vì có thể dễ dàng đạt được nhiệt độ và áp

suất tới hạn Giá trị nhiệt độ và áp suất tới hạn tương ứng là 31oC và 73 atm Ngoài ra,

đây là hợp chất có giá thành rẻ, bền về mặt hóa học, không độc, không cháy, độ nhớt

thấp, độ tinh khiết cao, khả năng khuếch tán cao, dễ loại ra khỏi dịch chiết và có thể

pha vào các dung môi khác Tuy nhiên, CO2 là chất kém phân cực do đó không phù

hợp để chiết các chất phân cực [86]

Hình 1.2 Bộ dụng cụ chiết siêu tới hạn

Hình 1.2 mô tả cấu tạo của một bộ dụng cụ SFE Quá trình chiết gồm các bước:

- Mẫu được nạp vào bình chiết

- Dòng CO2 lỏng qua bình ngưng tụ rồi đến bơm nén và bộ gia nhiệt Khi đạt

nhiệt độ và áp suất CO2 trở thành siêu tới hạn

- Dòng CO2 siêu tới hạn vào bình chiết Các chất theo CO2 đến bình tách

27

- Điều chỉnh nhiệt độ và áp suất thích hợp, CO2 biến thành dạng khí, sản phẩm sẽ

lắng xuống, thu riêng

- CO2 dạng khí có thể được nén lạnh, hóa lỏng và đưa trở lại bình chứa cho các

lần phân tích sau

 Ứng dụng của SFE

Nhiều tác giả đã phát triển phương pháp SFE để xác định HCBVTV trong dược

liệu [65][75][106][120] Do CO2 kém phân cực nên khi chiết các HCBVTV có độ

phân cực trung bình đến cao, cần phải sử dụng thêm các chất hỗ trợ hoặc chất tạo phức

để thu được hiệu suất chiết cao hơn SFE có thể được phối hợp với các kỹ thuật làm

sạch khác khi phân tích mẫu dược liệu Ling và cộng sự sử dụng SFE để chiết 13

HCBVTV từ dược liệu Dịch chiết CO2 lỏng được hấp thụ vào bẫy silica hoạt tính ở

nhiệt độ –30oC Chất phân tích được rửa giải với n-hexan ở 30oC sau khi đã cho bay

hơi hết CO2 Hiệu suất thu hồi đạt được từ 78 đến 121% [83]

Năm 1997, Lehotay đã tổng quan về SFE ứng dụng trong phân tích các nền mẫu

tự nhiên cho thấy nếu dựa vào độ tan của các HCBVTV, phương pháp SFE rất phù

hợp để chiết hầu hết các HCBVTV mà không phải sử dụng dung môi độc hại [76]

Ưu điểm nổi bật nhất của SFE là tính chọn lọc Dịch chiết từ phương pháp này

thường không cần phải trải qua quá trình làm sạch trước khi phân tích do đó phương

pháp này rất phù hợp cho các nền mẫu phức tạp [65] Tuy nhiên, đến nay SFE không

phải là một phương pháp phổ biến vì các chi phí đầu tư thiết bị khá tốn kém và việc

mở rộng ứng dụng trên nền mẫu mới cần có những khảo sát riêng

1.4.1.3 Chiết pha rắn

 Giới thiệu chung

Chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) là một phương pháp chiết dựa vào

sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất được chiết

từ pha lỏng vào pha rắn Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được đóng vào các ống

nhỏ Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ được giữ lại

trên ống Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung môi khác phù hợp

Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so với thể tích dịch ban đầu

Vì thế qua SPE, ngoài tác dụng làm sạch có thể thực hiện thêm bước làm giàu mẫu

Ngoài ra, người ta có thể sử dụng luồng khí nóng để rửa giải các chất từ pha rắn, đây

là cách thuận tiện để chuyển các chất vào phân tích trên sắc ký khí [12][17][56][86]