Tổng hợp một số n hydroxypentanamid mang khung 1 (triazol 4 YL) methylindolin 2 on hướng tác dụng kháng ung thư

Hiện nay nhiều chất ức chế HDAC đã được chấp thuận trong đơn trị liệu hoặc kết hợp với các liệu pháp chống ung thư khác, ví dụ như: vorinostat SAHA, Zolinza®, romidepsin Istodax®, belino

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hải Nam và NCS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên

- Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Dược - trường Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị, các bạn và các em trong nhóm tổng hợp tại bộ môn Hoá Dược đã đồng hành, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn Dương Tiến Anh, bạn Nguyễn Minh Tuấn là những người đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất đến gia đình tôi, con cảm ơn bố mẹ đã luôn yêu thương, che chở, tha thứ cho con, anh cảm ơn em trai luôn bên cạnh anh suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Bùi Đức Tùng

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Histon deacetylase (HDAC) 2

1.1.1 Khái niệm và hoạt động của HDAC 2

1.1.2 Phân loại HDAC 2

1.1.3 Cấu trúc của HDAC 3

1.2 Các chất ức chế histon deacetylase (HDACi) 5

1.2.1 Cấu trúc HDACi 6

1.2.2 Tác dụng của HDACi 6

1.2.3 Ứng dụng của các HDACi 7

1.3 Một số hướng nghiên cứu tổng hợp các chất HDACi hiện nay 9

1.3.1 Hướng ức chế chọn lọc 9

1.3.2 Hướng ức chế kép (dual inhibitors) 11

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Hóa chất 16

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Tổng hợp hóa học 17

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Tổng hợp hóa học 17

2.3.2 Thử tác dụng sinh học 18

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Hóa học 20

3.1.1 Tổng hợp hóa học 20

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 29

3.1.3 Xác định cấu trúc 30

3.2 Thử hoạt tính sinh học 35

3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC 35

3.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 35

3.3 Bàn luận 36

3.3.1 Tổng hợp hóa học 36

3.3.2 Khẳng định cấu trúc 38

3.3.3 Thử hoạt tính sinh học 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon

(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton nuclear magnetic resonance)

AcOH : Acid acetic

ADN : Acid desoxyribonucleic

ADP : Adenosine diphosphate

ARN : Acid ribonucleic

AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người

d : Vạch đôi trong phổ NMR (Doublet)

DCM : Dicloromethan

dd : Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ NMR (Doublet of doublet)

DMF : Dimethylformamid

DMSO : Dimethylsulfoxid

DMSO-d 6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa

EGFR : Yếu tố tăng trưởng (Epidermal growth factor receptor)

ESI : Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)

FBS : Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

FDA : Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ

(U.S Food and Drug Administration)

FOXP3 : Gen forkhead box P3

H (%) : Hiệu suất

HAT : Histon acetyltransferase

HDAC : Histon deacetylase

HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors) HDLP : Protein giống HDAC (Histone deacetylase-like protein)

HeLa : Dòng tế bào được phân lập từ tế bào ung thư cổ tử cung

HER : Yếu tố tăng trưởng (Human epidermal growth factor receptor) HMGR : Enzym hydroxymethylglutaryl coenzym reductase

IC50 : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)

IR : Hồng ngoại (Infrared)

J : Hằng số ghép cặp trong phổ NMR

KRIBB : Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc

(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)

m : Đa vạch trong phổ NMR (Multiplet)

MeCN : Acetonitril

MeOH : Methanol

MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

NAD+ : Nicotinamid adenin dinucleotid

NCI-H23 : Dòng tế bào ung thư phổi người

NSCLC : Ung thư phổi không tế bào nhỏ (Non-Small Cell Lung Cancer) PC-3 : Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người

Rf : Hệ số lưu giữ trong TLC

RPMI : Môi trường nuôi cấy tế bào

s : Vạch đơn trong phổ NMR (Singlet)

SIRT : Sirtuin

SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic

SRG : Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group)

SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng người

VPA : Valproic acid

ZBG : Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group)

δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

ν : Dao động hóa trị trong phổ IR

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester 29 Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất VIa-d 30 Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d 31 Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-d 32 Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất VIa-d 33 Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIa-d 34 Bảng 3.7 Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất VIa-d 35 Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIa-d 36

Sơ đồ 3.6 Cơ chế phản ứng Click dùng xúc tác CuI theo Hein và cộng sự 37

ĐẶT VẤN ĐỀ Gần đây các chất ức chế HDAC nổi lên như một liệu pháp điều trị ung thư tiềm năng Lý do căn bản của việc phát triển các chất ức chế HDAC (và các tác nhân sửa đổi nhiễm sắc thể khác) như là phương pháp chống ung thư mới được xuất phát

từ việc hiểu rõ sự biến đổi gen, sự thay đổi ngoại gen của các enzym HDAC có thể làm thay đổi kiểu hình và biểu hiện gen, làm rối loạn cân bằng nội mô từ đó góp phần làm cho ung thư ngày càng phát triển Hiện nay nhiều chất ức chế HDAC đã được chấp thuận trong đơn trị liệu hoặc kết hợp với các liệu pháp chống ung thư khác, ví

dụ như: vorinostat (SAHA, Zolinza®), romidepsin (Istodax®), belinostat (Beleodaq®), panobinostat (Farydax®), nhiều thử nghiệm lâm sàng đánh giá ảnh hưởng của các chất ức chế HDAC trên huyết học và trên các khối u ác tính cũng đang được tiến hành rộng rãi

Theo hướng đi đó, nhóm nghiên cứu bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược

Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư có tiềm năng GS.TS Nguyễn Hải Nam cùng cộng sự sử dụng khung 2-oxoindolin và 1,2,3-triazol làm nhóm nhận diện bề mặt cho kết quả ức chế HDAC rất đáng mong đợi [1, 3, 25, 36, 42]

Dựa trên cơ sở này, chúng tôi tiếp tục thiết kế các dẫn chất mang khung

1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on và tiến hành đề tài: “Tổng hợp một số N-hydroxypentanamid

mang khung 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư” với hai mục tiêu:

1 Tổng hợp 1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid cùng 3 dẫn chất

N-hydroxy-5-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và tác dụng ức chế HDAC của

các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Histon deacetylase (HDAC)

1.1.1 Khái niệm và hoạt động của HDAC

Hiện nay 377 enzym đã được tìm thấy trong cơ thể người nhờ vào việc biến đổi nhiễm sắc chromatin bằng cách thêm, loại bỏ hay đọc các dấu hiệu di truyền biểu hiện gen (epigenetic), những sự biến đổi thuận nghịch về mặt hóa học trên các histon

sẽ giúp xác định mã histon ADN được methyl hóa bởi ADN methyl transferase, demethyl hóa sau quá trình oxy hóa methyl bởi enzym Ten-Eleven Translocation và theo sau là các cơ chế sửa chữa Histon cũng có thể được methyl hóa bởi các enzym lysin hay arginin transferase Ngoài methyl hóa, các histon có thể bị biến đổi bởi nhiều nhóm chức khác như acetyl hóa, acyl hóa, sumoyl hóa, N-acetylglucosyl hóa Đặc biệt quá trình acetyl hóa được quy định bởi hoạt động của enzym histon acetyl transferase (HAT) và enzym có chức năng đối kháng là histon deacetylase (HDAC) [8, 39]

Sự acetyl hóa nhóm ɛ-amin của những lysin đặc trưng ở đầu N của các histon làm trung hòa điện tích dương trên lysin, điều này làm giảm ái lực của phức hợp histon với ADN, tăng cường sự tiếp cận của các yếu tố phiên mã ADN Mặt khác, sự deacetyl dẫn đến sự co rút sợi nhiễm sắc từ đó ngăn cản quá trình phiên mã [26] HAT

và HDAC là những enzym tham gia vào trong quá trình phát triển, biệt hóa, điều chỉnh chu kì tế bào, đặc biệt quan trọng là enzym HDAC, do đó việc không bình thường trong quá trình deacetyl hóa ở tế bào có liên kết chặt chẽ với ung thư [15, 26]

1.1.2 Phân loại HDAC

Đến nay, các nhà khoa học đã xác định được 18 HDAC khác nhau, được chia thành 4 nhóm nhờ vào sự tương đồng về cấu trúc, cơ chất đặc hiệu và cofactor phụ thuộc [39, 40]

Nhóm I, II, IV được gọi là các HDAC “kinh điển” phụ thuộc Zn2+; còn nhóm III được gọi là HDAC phụ thuộc NAD+

Hình 1.1 Phân nhóm HDAC [40]

1.1.3 Cấu trúc của HDAC

Các HDAC xúc tác cho quá trình deacetyl hóa lysin của các histon và các protein khác bằng cách liên kết nhóm acetyl ở đầu N-ɛ của lysin với nguyên tử kẽm

ở trung tâm hoạt động Sau khi kích hoạt, các nhóm N-acetyl bị tấn công bởi một phân tử nước, tạo ra một N-ɛ lysin tự do và acid acetic Nhìn chung cấu trúc của các HDAC gồm trung tâm hoạt động và kênh enzym, sự khác biệt lớn ở phần còn lại được tìm thấy ở cửa vào trung tâm hoạt động Các HDAC nhóm I có thêm một khoang nội (túi thứ cấp), được sử dụng cho việc loại bỏ nước và acid acetic Túi thứ cấp này có thể không tồn tại trong các HDAC nhóm II, nơi nước và acid acetic có thể sử dụng một con đường khác để thay thế Đối với các SIRT, nhóm acetyl được liên kết với ADP-ribose lúc kết thúc phản ứng xúc tác HDAC-6 thuộc nhóm IIb chủ yếu ở trong

tế bào chất, là HDAC duy nhất có chứa một nhân bản đầy đủ miền tương đồng chức năng deacetyl, tiếp theo là vùng liên kết với ubiquitin đặc trưng [39]

Các nguyên tử kẽm trong trung tâm hoạt động được thâm nhập thông qua một kênh enzym (kênh trung gian) chứa được 4 carbon của chuỗi lysin, trong khi bề mặt

bên ngoài tương tác với các chất còn lại của chất nền để acetyl hóa, góp phần vào sự

ổn định của cơ thể trong quá trình này [39]

Đột biến HDAC-1 ở khoang nội được nghiên cứu để hiểu rõ hơn về sự thoát ion acetat Thay thế những phần chính còn lại trong khoang này dẫn đến việc giảm mạnh hoạt động xúc tác và nhấn mạnh vai trò quan trọng của Tyr23, Tyr24, Arg34, Cis151 và đặc biệt Tyr303 (các HDLP) Thêm vào đó Val19, Met30, Ile35, Phe109

và Leu139 đóng vai trò quan trọng trong hình dạng của khoang để chứa các ion acetat Các chất ức chế mang tương đương với một ion acetat có thể xác định vị trí trong khoang nội và từ đó nâng cao tính chọn lọc [39]

Trung tâm hoạt động được đặc trưng bởi một kênh thân dầu rộng khoảng 11Å dẫn từ bề mặt protein tới vị trí hoạt động của của ion Zn2+ và được bao bọc bởi Gly154, Phe155, Phe210 và liên kết giữa Zn2+ và His183 Trung tâm hoạt động được đặc trưng bởi 1 hình khối liên kết phức tạp giữa nguyên tử kẽm và một số acid amin quan trọng bao gồm Asp181 và His183 Hơn nữa, từ vị trí gắn kẽm, có một khoang nội rộng khoảng14Å (cũng được gọi là khoang kị nước, chân túi) kéo dài về phía lõi của protein và được xác định bởi một số acid amin bổ sung bao gồm Met35, Phe114

và Leu144 [45]

Wagner và cộng sự đã tìm ra với những nhóm thế ưa nước hơn trong khoang 14Å đã làm giảm tác dụng đáng kể trên HDAC-1,2,3 (> 10 lần) phù hợp với bản chất thân dầu của vị trí này Ngoài ra các vòng phenyl không có nhóm thế dẫn đến giảm 5 lần hiệu lực đối với HDAC-2 [45]

Hình 1.2 Chất 1 liên kết với HDAC-2 [45]

HDAC-1 và HDAC-2 có sự tương đồng cao và cùng tồn tại trong cùng một phức hợp protein Mặc dù chúng liên kết chặt chẽ nhưng mỗi enzym đều sở hữu những chức năng riêng Sự tăng bài xuất của HDAC-2 trong ung thư đại trực tràng xuất hiện rất sớm ở giai đoạn polyp, xuất hiện nhiều và thường xuyên hơn HDAC-1 Tương tự như vậy, trong khi các biểu hiện của HDAC-1 và HDAC-2 tăng lên trong loạn sản cổ tử cung và ung thư xâm lấn, sự biểu hiện HDAC-2 cho thấy sự phân định

rõ về việc bao phủ rộng ở vùng chuyển tiếp của chứng loạn sản so với HDAC-1 Vào lúc HDAC-2 bị bất hoạt, các tế bào cho thấy số lượng gia tăng của sự mở rộng tế bào gợi nhớ sự biệt hóa tế bào Đó cũng chính là sự gia tăng quá trình tự hủy, kết hợp với gia tăng biểu hiện p21Cip1/WAF1, protein độc lập với p53 Kết quả cho thấy các HDAC, đặc biệt là HDAC-2 là enzym quan trọng tham gia vào những diễn biến đầu tiên của ung thư, điều đó làm cho chúng là những enzym được lưu tâm trong sự phát triển của khối u và trong mục tiêu điều trị ung thư [26, 35]

Sự chọn lọc ức chế dược lý của HDAC-2 là khả thi và ức chế hoạt tính xúc tác của enzym này có thể được ứng dụng như là một phương pháp điều trị theo hướng tăng cường các quá trình học tập và ghi nhớ trong nhiều rối loạn thần kinh và tâm thần [44]

1.2 Các chất ức chế histon deacetylase (HDACi)

Sự nỗ lực của các nhà khoa học trong hơn 20 năm qua đã đem lại sự chấp thuận của FDA cho 4 chất mới dựa trên sự ức chế HDAC, nhiều thử nghiệm lâm sàng

đã được hoàn thành hoặc đang được tiến hành với nhiều thuốc tác động lên sự biểu hiện gen (epigenetic), các HDACi được sử dụng một mình hoặc kết hợp để tăng hiệu lực của các thuốc hiện có Hợp chất đầu tiên được phê duyệt là vorinostat (SAHA, acid suberoyl anilid hydroxamic) để điều trị u lympho tế bào T ở da, tiếp theo là romidepsin trên các bệnh lý tương tự Belinostat được chấp thuận cho điều trị ung thư hạch bạch huyết tế bào T ngoại vi tái phát hay kéo dài Panobinostat là chất mới nhất được chấp thuận cho điều trị đa u tủy xương Các chất ức chế HDAC được chủ yếu

sử dụng trong bệnh bạch cầu và kém thành công trong các khối u rắn Chất thứ 5 được

sử dụng trong lâm sàng trong nhiều năm với mục đích chống động kinh là acid

valproic (VPA), một chất ức chế HDAC thường xuyên tham gia vào các thử nghiệm lâm sàng vì hồ sơ lâm sàng nổi tiếng của nó Những cải tiến lớn có thể đến ở một thế

hệ tiếp theo của các chất ức chế HDAC, miễn là chúng được nghiên cứu chuyển giao một cách tối ưu [39]

- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (zinc binding group - ZBG): tương tác với ion

Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC như acid hydroxamic, các thiol, nhóm

o-aminoanilin của benzamid

Hình 1.3 Cấu trúc một số chất ức chế HDAC

1.2.2 Tác dụng của HDACi

Các chất ức chế HDAC tạo ra con đường đối kháng lại khối u bằng các cách [29, 47]:

- Ngừng lại chu kì tế bào

- Kích hoạt sự chết theo chương trình

- Gây chết tế bào bằng tự thực

- Phá hủy sự phân chia tế bào

- Ức chế sự hình thành mạch

- Hoạt hóa protein phosphatase 1

- Phá vỡ chức năng của chaperoin HSP90

1.2.3 Ứng dụng của các HDACi

Ngoài ứng dụng đáng kể trong lĩnh vực điều trị ung thư, các nhà nghiên cứu ngày càng tìm ra nhiều lĩnh vực mà các chất ức chế HDAC thể hiện được những tiềm năng to lớn

1.2.3.1 Các chất ức chế HDAC trong mô hình tiền lâm sàng của bệnh thần kinh

Các chất HDACi có hiệu quả trong một số mô hình động vật của bệnh thoái hóa thần kinh, bao gồm các bệnh như Alzheimer, Huntington, Parkinson, đột quỵ do thiếu máu cục bộ, bệnh xơ cứng teo cơ một bên và teo cơ cột sống [14, 38] Trong hầu hết trường hợp, các HDACi phổ rộng đã được nghiên cứu, nhưng những HDACi phổ hẹp chứng minh chúng hiệu quả hơn và ít độc tính hơn Ví dụ sự ức chế mỗi HDAC-3 là đủ để ngăn chặn bệnh Huntington kèm theo thoái thần kinh mắt trong mô hình ruồi giấm thường (Drosophila melanogaster) và làm giảm sự biểu hiện gen liên quan trong bệnh Huntington Sự ức chế HDAC-1 cũng cho kết quả tương tự, như việc làm ức chế panHDAC với vorinostat và butyrat trong mô hình ruồi giấm ở bệnh Huntington [28]

1.2.3.2 Các chất HDACi để điều trị các bệnh thần kinh

Các chất HDACi đã được sử dụng trong chuyên khoa thần kinh trong nhiều năm qua đặc biệt trong lĩnh vực tâm thần học và thoái hóa thần kinh trước khi các mục tiêu phân tử của các loại thuốc này được xác định VPA đã được cấp phép sử dụng vào năm 1978 như một loại thuốc chống co giật để điều trị các cơn động kinh vắng ý thức (absence seizures) cũng như rối loạn co giật cục bộ và toàn bộ, được đưa vào thị trường Mỹ năm 1983 VPA vẫn được sử dụng rộng rãi như là một thuốc chống

co giật và an thần trong điều trị bệnh động kinh, rối loạn lưỡng cực, trầm cảm, tâm thần phân liệt và chứng đau nửa đầu [17]

Hiện nay một thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III đang được tiến hành để đánh giá sự kết hợp giữa VPA và levocarnitin ở trẻ em trong bệnh teo cơ cột sống Ngoài

ra chất ức chế HDAC-3 mang tên RG2833 đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng cho bệnh mất điều hòa Friedreich, là một bệnh di truyền gây nên tổn thương diễn tiến

ở hệ thần kinh [17]

1.2.3.3 Các chất ức chế HDAC trong mô hình tiền lâm sàng để điều trị bệnh viêm

Các HDACi đã cho thấy kết quả tích cực trong các bệnh viêm nhiễm ở mô hình động vật gặm nhấm bao gồm viêm khớp, viêm ruột, tăng huyết áp, sốc nhiễm trùng huyết, viêm đại tràng, bệnh ghép chống chủ do truyền máu (graft-versus-host-disease) [21] và trong nhiều trường hợp kết quả này là do làm tăng số lượng và chức năng của tế bào Treg [4] Các chất ức chế chọn lọc HDAC nhóm IIa có thể thích hợp nhất trong các bệnh viêm nhiễm Các HDACi phổ rộng (trichostatin A (TSA) và vorinostat) nhưng không phải HDACi chọn lọc nhóm I (entinostat) ngăn cản sự phát triển và thúc đẩy sự tiêu tan của viêm đại trực tràng trong các mô hình chuột và điều này phụ thuộc vào các tế bào FOXP3 Treg [4]

Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh hiệu quả của các HDACi trong mô hình tiền lâm sàng của bệnh viêm khớp, làm nổi bật tiềm năng cho sự phát triển lâm sàng của những chất này [24, 30]

1.2.3.4 Các chất ức chế HDAC trong điều trị kháng virus

Gần đây các chất ức chế HDAC còn là một hướng nghiên cứu tiềm năng trong điều trị kháng virus Một thách thức trong điều trị HIV là loại triệt để nguồn virus tiềm ẩn Nghiên cứu cho thấy các chất ức chế HDAC nhóm I làm tăng sản xuất HIV

trong in vitro [33] Sự tái kích hoạt virus tiềm ẩn của các HDACi đã được nhìn thấy

trong những dòng tế bào bị lây nhiễm và trong tế bào T CD4+ của bệnh nhân được điều trị bằng thuốc kháng virus [34] Gần đây những kết quả tiền lâm sàng đã được

mô phỏng lại trong một nghiên cứu lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm HIV tiềm ẩn [7] Điều trị bằng vorinostat dẫn đến sự gia tăng acetyl hóa tế bào và sản xuất ARN HIV

trong tế bào T CD4+ ở những bệnh nhân mà tình trạng virus huyết đã được ngăn chặn hoàn toàn bằng liệu pháp kháng virus Vorinostat, panobinostat và VPA đang được thử nghiệm kết hợp với các phương pháp điều trị kháng virus khác nhau [17]

Điều trị bệnh nhân nhiễm virus herpes simplex (HSV) cũng có thể là một ứng dụng khác của các HDACi qua việc trung gian loại bỏ nguồn virus tiềm ẩn nhờ vai trò của HDAC-1 và 2 trong việc duy trì giai đoạn tiềm ẩn của HSV [50]

1.3 Một số hướng nghiên cứu tổng hợp các chất HDACi hiện nay

Trong xu hướng tổng hợp những chất HDACi ở những năm gần đây, nhóm acid hydroxamic được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và tổng hợp nhiều nhất

do đặc tính dễ tổng hợp và dễ tạo phức với ion Zn2+ của enzym HDAC Với 116 bài báo tổng hợp HDACi tìm được từ năm 2011 đến nay, có đến 80 bài có đích là acid hydroxamic, được quan tâm thứ hai là các chất benzamid với 13 bài Vẫn tiếp nối việc dựa vào công thức các thuốc đưa ra thị trường để đưa ra định hướng tổng hợp tuy nhiên ngày càng có nhiều xu hướng mới trong tổng hợp các chất HDACi như việc

ức chế chọn lọc cũng được các nhà nghiên cứu chú tâm hơn, việc gắn thêm các khung thuốc (artermisinin, colchinin…) để đích đến hướng tới không chỉ ức chế HDAC mà còn ức chế đồng thời thêm một loại enzym khác

1.3.1 Hướng ức chế chọn lọc

Nhóm acid hydroxamic tiềm năng nhất cũng không ổn định trong cơ thể sống

và nhanh chóng bị chuyển hóa Ví dụ như SAHA có thời gian bán thải ngắn < 2h và

bị đào thải dưới dẫn chất liên hợp glucoronid Nghiên cứu mới nhất chỉ ra rằng thế

hệ thứ ba của các chất ức chế sẽ xuất hiện liên quan đến sự ổn định của nhóm gắn kẽm Tuy nhiên các chất ức chế HDAC thường nhắm tới nhiều HDAC và hệ quả sinh học thường không thể dự đoán trước từ đó bị đánh giá thấp cho các hoạt động hướng đến nhiều HDAC Do đó, các chất ức chế chọn lọc là cần thiết cho mỗi loại HDAC, một số đang được thử nghiệm trong pha tiền lâm sàng; giai đoạn I hoặc II trong thử nghiệm cho bệnh ung thư và các bệnh về thần kinh, các chất ức chế chọn lọc cũng

mở một lĩnh vực mới để chống lại các bệnh ký sinh trùng [5, 46]

Ví dụ bệnh sán máng là một trong những bệnh kí sinh nghiêm trọng bị con người bỏ quên do loài từ chi Shistosoma với Schistosoma mansoni là loài phân bố lớn nhất Trên toàn thế giới có hơn 265 triệu người bị nhiễm và 280 nghìn trường hợp

tử vong được báo cáo hàng năm Hiện nay không có thuốc phòng ngừa hiệu quả và lựa chọn duy nhất là praziquantel, tuy nhiên với việc hiệu quả ngày càng giảm và sự

đề kháng với praziquantel ngày càng tăng dẫn đến phải cần có một loại thuốc điều trị mới Nghiên cứu cho thấy HDAC-8 của loài Schistosoma mansoni (smHDAC-8) là HDAC phong phú nhất trong các HDAC nhóm I của loài kí sinh này, có một cấu trúc khác trong túi hoạt động so với HDAC-8 tương đồng ở người Dựa vào kiểm tra hóa học cấu trúc, một vài chất đã được xác định có tác dụng ức chế chọn lọc smHDAC8 hơn cả các HDAC quan trọng ở người và có khả năng gây chết sán [22, 39]

Các nhà khoa học đã tìm ra sự chọn lọc có thể là kết quả của việc túi kị nước tạo ra tương tác đặc trưng bên ngoài trung tâm hoạt động hoặc từ bất cứ tương tác đặc trưng có thể khác Chọn lọc HDAC-4 có thể được tạo ra từ halogen liên kết với Tyr814 cùng với tương tác π giữa nhóm -NH ở Phe812 và vòng phenyl mang nguyên

tử halogen [11] Một túi lớn được xác định bởi His842, Phe870-Phe871 và Leu943 có chứa các nhóm kỵ nước lớn có thể tạo ra liên kết với -NH của His842 Một túi nhỏ hơn được xác định bởi Met810-Cys813 có thể chứa nhóm khóa hoạt động của HDACi [11] Điều tương tự cũng áp dụng với HDAC-7, khi mà thiết kế của các chất ức chế có thể hướng tới các khoang kị nước được xác định bởi His531, His541-Glu543, Ile628 và Phe679 [31]

Pro942-Sự chọn lọc đối với HDAC-6 phụ thuộc vào nhóm khóa hoạt động nơi mà tương tác bên ngoài trung tâm hoạt động tồn tại, như đối với tubacin [16] Tubacin là chất ức chế chọn lọc HDAC-6 theo một cấu trúc mà sinh ra sự va chạm trong không gian nếu chồng lên vùng Phe870-Leu943 cho HDAC-4 và vùng Pro809-Leu810 cho HDAC-7, các chuỗi tương ứng với Pro260 trong HDAC-6 được đẩy vào khu vực cao hơn Ngược lại các chất ức chế HDAC-4,7 cho đụng độ không gian với HDAC-6 ở Tyr293 [39]

1.3.2 Hướng ức chế kép (dual inhibitors)

1.3.2.1 HDAC và topoisomerase

Chất ức chế topoisomerase là podophyllotoxin được ghép với SAHA, SAHA được cho là góp phần duỗi xoắn chromatin và cải thiện hoạt động ức chế topoisomerase Chất 2 cho kết quả tốt nhất với các nồng độ nM trên HDAC-1,3,6 [48] Geurrant và cộng sự đã kết hợp daunorubicin (DAU) và chất ức chế HDAC Một trong những giả thuyết là benzyl hóa nhóm -NH2 của đường làm cho DAU ít bị bơm tống ra ngoài, chất 3 mạnh hơn so với SAHA về hoạt động ức chế HDAC và cả topoisomerase II [20] Alkylhydroxamat camptothecin được tổng hợp như là chất ức chế cả HDAC và topoisomerase I Chức năng của nhóm phenol được sử dụng như một điểm giữ cho cấu trúc dài của SAHA, kết quả là hoạt tính topoisomerase thấp vì nhóm hydroxyl này rất quan trọng cho việc liên kết với topoisomerase Chất 4 cho hoạt tính tương tự SAHA với sự ức chế HDAC toàn bộ là 56,2 nM ở dòng tế bào được phân lập tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) và chọn lọc với HDAC-1 và HDAC-

6 hơn HDAC-8 [39]

Hình 1.4 Các chất ức chế HDAC và topoisomerase

1.3.2.2 HDAC và thụ thể androgen/oestrogen

Các chất tạo liên kết với thụ thể androgen (AR) và HDAC được đề xuất cho điều trị bệnh ung thư tuyến tiền liệt, AR tăng quá mức trong dòng tế bào ung thư trên Một loạt các chất ức chế AR-HDAC đã được tạo ra, dẫn đến chất tốt nhất là chất 5 mang hệ hống lutamid Ức chế HDAC trong tế bào với nồng độ 10 µM đưa đến đáp ứng IC50 trong ức chế HDAC và AR là 0,69 µM [18] Trong cùng phạm vi đó, thụ thể oestrogen (ER) cũng được sử dụng để thiết kế các chất ức chế kép Gryder và cộng sự đã báo cáo sự kết hợp của chất ức chế HDAC với estradiol hoặc tamoxifen Nhóm alkyl của estradiol được sử dụng cho phản ứng Click trong khi tamoxifen được sửa đổi để phản ứng với nhóm chức của SAHA Tất cả hợp chất đều thể hiện hoạt tính ở mức µM cho ERα Chất 6 thể hiện hoạt tính ở mức nM cho HDAC-1,6, gấp

103 lần HDAC-8 [19]

Hình 1.5 Các chất ức chế HDAC và thụ thể androgen/oestrogen

1.3.2.3 HDAC và tyrosin kinase

Các chất ức chế tyrosin kinase của các yếu tố tăng trưởng (EGFR, HER2) như erlotinib được gắn thêm nhóm alkyl hydroxamat ức chế HDAC Những chất này được thử nghiệm cho sự ức chế HDAC và EFGR/HER2 Chất 7 được chứng minh là chất

nổi bật in vitro với sự kết hợp của erlotinib và SAHA, trong khi những thử nghiệm in

vivo cho thấy sự giảm kích thước khối u trên một vài giống chuột, bao gồm giống

ghép dị lai đề kháng lại erlotinib là A549 NSCLC Chất này đã được đưa vào phát triển lâm sàng [12] Các dẫn chất của lapatinib được thử nghiệm trên các HDAC-1,3,6,8 cho kết quả khả quan, trong đó chất 8 cho kết quả tốt nhất trong việc ức chế

cả 2 enzym [32]

Hình 1.6 Các chất ức chế HDAC và tyrosin kinase

1.3.2.4 HDAC và nitric oxid

Nitric oxid (NO) được tạo ra tự nhiên từ L-arginin bởi tác động của NO synthase (NOS) Đó là tín hiệu quan trọng và tác động phân tử đóng vai trò then chốt trong nhiều quá trình sinh học đa dạng Nồng độ cao của NO gây ra khả năng gây độc mạnh chống lại các tế bào ung thư của con người và làm tăng sự chết theo chu trình của tế bào khối u, nồng độ NO cao cũng hạn chế sự di căn và làm tăng nhạy cảm của

tế bào khối u với hóa tri, xạ trị và liệu pháp miễn dịch [9] Thật vậy, kết hợp các nhóm giải phóng NO với các chất ức chế HDAC đã được nghiên cứu ra để đem lại tác động hiệp lực trong sự giảm kích thước khối u Đặc biệt, HDAC-2 có thể được xúc tác sửa đổi bởi tác nhân NO, dẫn đến sự nitrat hóa hoặc S-nitrosyl hóa Tyr Hơn nữa, NO đã được chứng minh cho phép bắt chéo giữa các HDAC nhóm I và III Vài nghiên cứu

đã chỉ ra rằng các sự ức chế HDAC và NO là hiệp đồng trong bệnh phì đại tim và chữa lành thương tích [27]

Entinostat được sửa đổi để thêm một nhóm cho NO với mục đích để hoạt hóa guanylat cyclase cho chất 9 đặc trưng cho khả năng ức chế HDAC Việc tạo ra NO làm S-nitrosyl hóa HDAC-2, đẩy mạnh định vị HDAC-4 ở trong nhân và điều chỉnh biểu hiện microRNA [10] Những chất cho NO khác được tổng hợp bởi Tu và cộng

sự, chất 10 được xem là một trong những chất hứa hẹn nhất, với hoạt tính so sánh với SAHA về tác động chống tăng sinh (IC50 trong khoảng 4,67-6,65 µM với các loại tế bào ung thư khác nhau, IC50 = 0,18 µM với tế bào HeLa) và sinh ra NO ở mức cao [43]

Hình 1.7 Các chất ức chế HDAC và tạo NO

1.3.2.5 HDAC và các đích khác

Tubulin là yếu tố quan trọng trong quá trình nguyên phân, nơi là mục tiêu của một số thuốc can thiệp vào sự trùng hợp của nó tới vi ống Với việc HDAC-6 chịu trách nhiệm deacetyl hóa tubulin trong chu trình này, các chất ức chế kép đã được

thiết kế Dẫn chất của Colchinin được báo cáo bởi Zhang và cộng sự, chất 11 có sự

ức chế HDAC mạnh nhất nhưng hiệu quả thấp hơn trong mô hình in vitro so với dẫn

chất 12, có thể là do tính thấm tế bào của chất 12 tốt hơn [49]

Kết hợp phần decalin của thuốc statin là lovastatin với nhóm gắn kẽm cho ra chất 13, được đánh giá cho điều trị ung thư với sự ức chế HMGR-HDAC được cân

bằng ở mức nM Nói chung, các hợp chất được thiết kế cho thấy tiềm năng gần gấp

10 lần cho HDAC-1 và HDAC-6 so với HDAC-2 [13] Các folat thường được tìm thấy trong một vài dòng tế bào ung thư mà có sự biểu hiện quá mức của thụ thể folat (FR), đặc biệt là ung thư vú Kết hợp các chất nền FR kinh điển và acid hydroxamic, Carrasco và cộng sự thu được chất 14, 15 ức chế HDAC-8 ở người ở mức độ µM, điều trị với tế bào HeLa cũng cho sự ức chế ở mức µM [37]

Hình 1.8 Các chất ức chế kép khác

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Hóa chất

Các dung môi, hóa chất được sử dụng trong quá trình làm thực nghiệm là loại dùng cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty Sigma-Aldrich hoặc Merck Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:

Và các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid

(DMF), acetonitril (MeCN), dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), acid acetic (AcOH), aceton, ethyl acetat, K2CO3, KI, NaCl, Na2SO4, NaOH, HCl, CuI, FeCl3…

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng

- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

- Máy cất quay chân không Buchi R-200

- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm

- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy

- Máy Cary 660 FTIR để xác định phổ IR

- Máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM để ghi phổ MS, đặt tại Khoa Hóa học - trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR, đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

5-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-+ triazol-1-yl)-N-hydroxypentanamid (VIc)

5-(4-((5-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-+ triazol-1-yl)-N-hydroxypentanamid (VId)

5-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3 Kiểm tra độ tinh khiết

- Xác định cấu trúc của các chất vừa tổng hợp được

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

- Thử tác dụng ức chế HDAC

- Thử độc tính trên một số tế bào ung thư: ung thư đại tràng (SW620), ung thư tuyến tụy (AsPC-1), ung thư biểu mô tuyền tiền liệt (PC-3), ung thư phổi (NCI-H23) 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

và xác định nhiệt độ nóng chảy

2.3.1.3 Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được

Các chất sau khi được tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Cary 660 FTIR tại Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-

400 cm-1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ

lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1

- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, chế độ ESI(-)-MS, dung môi MeOH

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-

HDAC có phát huỳnh quang (Fluoregenic HDAC Assay Kit - BPS Bioscience) Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ KIT thử nghiệm

Kết quả độ hấp thụ được đọc trên máy đo hấp thụ huỳnh quang VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) tại bước sóng kích thích 360 nm, bước sóng phát quang 450 nm

2.3.2.2 Thử độc tính tế bào

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro được

tiến hành tại Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Dòng tế bào thử nghiệm: PC-3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt), SW620 (tế bào ung thư đại trực tràng), AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tụy), NCI-H23 (tế bào ung thư phổi) Các dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Thử độc tính tế bào theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB) [41]

Tính kết quả: Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ để thêm môi trường nuôi cấy) Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với cường độ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probits

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Hóa học

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Quá trình tổng hợp 4 chất VIa-d trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ quy trình chung như sau:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung

Tác nhân và điều kiện: i) NaN 3 , MeOH, 12h; ii) Propargyl bromid, K 2 CO 3 , KI, DMF, 50 o C, 3-4h;

iii) CuI, MeCN, 50 o C, 3h; iv) NH 2 OH.HCl, NaOH, MeOH/H 2 O, -5 o C, 30 phút

3.1.1.1 Tổng hợp chất methyl 5-azidopentanoat (II)

Chất II được tổng hợp từ methyl 5-bromopentanoat (I) bằng phản ứng thế nucleophil với tác nhân NaN3 theo sơ đồ 3.2:

- Cất quay chân không ở 60oC loại dung môi

- Phân tán hỗn hợp thu được vào 50 ml dung môi DCM

- Lọc loại tủa NaBr và NaN3 không tan

- Cất quay chân không ở 40ºC loại dung môi

- Bảo quản sản phẩm trong ngăn mát tủ lạnh ở 0-5ºC, đậy nút kín

 Kết quả:

- Cảm quan: chất lỏng, màu vàng nhạt

- Hiệu suất: 82,8% (0,52 g)

3.1.1.2 Tổng hợp chất yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid (VIa)

N-hydroxy-5-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-a Tổng hợp chất IVa:

Tổng hợp chất 1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVa) từ nguyên liệu isatin (IIIa) qua phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất IVa

- Thêm vào 40 ml nước cất lạnh để tạo tủa

- Lọc thu tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60ºC

 Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn, màu cam

- Hiệu suất: 83,4% (0,31 g)

- tºnc = 148,1-149,0ºC

- Rf = 0,63 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 100:1)

b Tổng hợp chất Va:

Điều chế chất methyl

5-(4-((2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanoat (Va) từ chất IVa thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI Phản ứng theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất Va

 Tiến hành phản ứng:

- Hòa tan 0,19 g (1,0 mmol) chất IVa vào 4,0 ml MeCN trong bình cầu sạch dung tích 50 ml Thêm 0,19 g (1,2 mmol) chất II và 0,19 g (1,0 mmol) CuI

- Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 50ºC trong 3h

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 10:1

 Xử lý phản ứng:

- Cất quay chân không ở 60ºC loại dung môi MeCN

- Phân tán cắn vào 30 ml DCM, gia nhiệt đến 40ºC để hòa tan hết chất Va, còn CuI không tan lắng ở đáy bình, lọc loại CuI

- Cất quay loại dung môi thu được hỗn hợp gồm 2 chất Va và II

- Hòa tan hỗn hợp vào lượng MeCN tối thiểu, thêm từ từ nước cất đến khi thấy tủa, khi thấy tủa không tăng thì dừng Để lạnh để ổn định tủa

- Gạn, lọc thu tủa, rửa tủa bằng nhiều lần nước cất để loại chất II

- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60ºC

 Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn, màu da cam

N-hydroxy-5-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid (VIa) được tổng hợp thông qua phản ứng tạo

hydroxamic giữa chất Va và hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ:

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa

 Tiến hành phản ứng:

- Phân tán 0,18 g (0,5 mmol) chất Va và 0,35 g (5,0 mmol) NH2OH.HCl vào 4,0 ml MeOH trong bình cầu sạch dung tích 50 ml

- Làm lạnh bình phản ứng đến -5ºC bằng hỗn hợp đá muối

- Khuấy phân tán hỗn hợp trong bình phản ứng

- Chuẩn bị dung dịch NaOH bão hòa trong nước, đã được làm lạnh Chuyển

từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng đến pH = 12

- Tiếp tục cho phản ứng thêm 30 phút ở -5ºC

- Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử FeCl3 5% và TLC, tiến trình thực hiện như sau:

+ Lấy 0,05 ml dịch từ bình phản ứng lên khay sứ, acid hóa bằng dung dịch HCl 5% Nhỏ 1 giọt thuốc thử FeCl3 5% vào hỗn hợp trên, nếu thấy xuất hiện màu

đỏ vang chứng tỏ đã có sản phẩm acid hydroxamic

+ Acid hóa 0,05 ml dịch lấy từ bình phản ứng bằng dung dịch HCl loãng 5% trong vial, thêm ethyl acetat để chiết lấy sản phẩm Đưa pha dung môi hữu cơ lên bản mỏng Tiến hành TLC với pha động DCM:MeOH = 5:2 Phản ứng kết thúc khi thấy vết ester Va đã mất đi hoàn toàn

 Xử lý phản ứng:

- Trung tính hóa hỗn hợp trong bình phản ứng bằng HCl lạnh 5%

- Thêm vào 20 ml nước cất lạnh

- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

- Tinh chế sản phẩm:

+ Kết tinh lại bằng hệ MeOH-H2O: Hòa tan sản phẩm thu được trong lượng MeOH tối thiểu Nhỏ từ từ nước cất vào cho đến khi bắt đầu xuất hiện tủa mịn và ổn định Để lạnh ở 0-5ºC trong 48h

+ Lọc tủa, sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60ºC

 Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn, màu vàng

- Hiệu suất: 55,9% (0,10 g)

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả thu được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6

3.1.1.3 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxypentanamid (VIb)

5-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-Dẫn chất VIb được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ

đồ 3.1

a Tổng hợp chất IVb:

Tổng hợp chất 5-fluoro-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVb) từ nguyên liệu 5-bromoisatin (IIIb) bằng phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa, sử dụng 0,33

- tºnc = 138,1-139,2ºC

- Rf = 0,63 (với hệ dung môi DCM:MeOH = 100:1)

b Tổng hợp chất Vb:

Điều chế chất methyl

5-(4-((5-fluoro-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanoat (Vb) từ chất IVb thông qua phản ứng Click với chất II

5-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-hydroxamic giữa chất Vb và hydroxylamin hydroclorid

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,18

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6

3.1.1.4 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxypentanamid (VIc)

5-(4-((5-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-Dẫn chất VIc được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ

đồ 3.1

a Tổng hợp chất IVc:

Tổng hợp chất 5-cloro-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVc) từ nguyên liệu 5-cloroisatin (IIIc) bằng phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa, sử dụng 0,39

Điều chế chất methyl

5-(4-((5-cloro-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanoat (Vc) từ chất IVc thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va, sử dụng 0,22

c Tổng hợp chất VIc:

Dẫn chất 1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxypentanamid (VIc) được tổng hợp qua phản ứng tạo

5-(4-((5-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-hydroxamic giữa chất Vc và hydroxylamin hydroclorid

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,19

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxypentanamid (VId)

5-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-Dẫn chất VId được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ

đồ 3.1

a Tổng hợp chất IVd:

Tổng hợp chất 5-bromo-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVd) từ nguyên liệu 5-bromoisatin (IIId) bằng phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa, sử dụng 0,45

- Rf = 0,65 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 100:1)

b Tổng hợp chất Vd:

Điều chế chất methyl

5-(4-((5-bromo-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanoat (Vd) từ chất IVd thông qua phản ứng Click với chất II

5-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-hydroxamic giữa chất Vd và hydroxylamin hydroclorid

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,21

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6

Hiệu suất tổng hợp và chỉ số lý hóa của các dẫn chất VIa-d được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester

(%) VIa 5-H C16H18N6O4 358,1 Vàng 55,9 VIb 5-F C16H17FN6O4 376,1 Vàng 53,2 VIc 5-Cl C16H17ClN6O4 392,1 Vàng 56,1 VId 5-Br C16H17BrN6O4 436,0 Vàng 55,1

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các sản phẩm sau khi được tổng hợp, xử lý và tinh chế bao gồm các dẫn chất VIa-d và các sản phẩm trung gian IVa-d, Va-d đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy Các kết quả về Rf và tonc của các dẫn chất VIa-d được trình bày cụ thể ở bảng 3.2

 Sắc ký lớp mỏng:

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck

70-230 mesh, với 4 hệ dung môi khác nhau là DCM, DCM:MeOH (100:1 và 10:1), DCM:MeOH:AcOH (100:40:1), tiến hành quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng

254 nm Kết quả TLC cho thấy các sản phẩm đều có vết gọn, rõ, không có vết phụ

 Đo nhiệt độ nóng chảy:

Các dẫn chất VIa-d sau khi được kết tinh lại đều ở thể rắn, có thể tiến hành xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Kết quả được trình bày trong bảng 3.2, nhận thấy các dẫn chất VIa-d đều có nhiệt độ nóng chảy xác định (khoảng dao động nhiệt độ hẹp, từ 1-2oC)

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to

sơ bộ khẳng định được các dẫn chất VIa-d là tinh khiết và có thể sử dụng để thực hiện các bước xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR

3.1.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR):

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các dẫn chất VIa-d được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d

Ghi chú: ν là dao động hóa trị

Nhận xét: Dựa trên phổ đồ (phụ lục 1, 2, 3 và 4) có thể sơ bộ nhận ra sự hiện

diện của các nhóm chức thông qua vị trí, cường độ, hình dạng pic, ví dụ như O-H,

N-H và C=O của acid hydroxamic; C=O của nhóm carbonyl; N-O và O-N-H của oxim [2]

Tuy nhiên các phổ IR này chưa thể cung cấp đầy đủ dữ liệu để khẳng định cấu trúc của các dẫn chất VIa-d