Nghiên cứu tính đa dạng loài của chi aspergillus fr fr trên các vị thuốc mã tiền (semen strychni) và khiếm thực (semen euryales) đang lưu hành trên địa bàn hà nội

Tuy nhiên, cho đến nay ở trong nước vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào về mức độ nhiễm nấm mốc, đặc biệt là các loài của chi Aspergillus và mycotoxin trên các thảo dược này.. Đánh

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ HẠNH

MÃ SINH VIÊN: 1201165

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG LOÀI

CỦA CHI ASPERGILLUS FR.: FR

TRÊN CÁC VỊ THUỐC MÃ TIỀN

(SEMEN STRYCHNI) VÀ KHIẾM THỰC (SEMEN EURYALES) ĐANG LƯU HÀNH

TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ HẠNH

MÃ SINH VIÊN: 1201165

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG LOÀI

CỦA CHI ASPERGILLUS FR.: FR

TRÊN CÁC VỊ THUỐC MÃ TIỀN

(SEMEN STRYCHNI) VÀ KHIẾM THỰC (SEMEN EURYALES) ĐANG LƯU HÀNH

TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng chân thành và biết ơn sâu sắc

đến người thầy của tôi là TS Trần Trịnh Công – Giảng viên Bộ môn Vi sinh

và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã tận tình chỉ bảo, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các chị kĩ thuật viên của Bộ môn Vi sinh và Sinh học cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược

Hà Nội – là những người thầy đã chia sẻ và giúp tôi có được những kiến thức quý báu trong học tập và hành trang trong quá trình thực hiện khóa luận

Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn và các em sinh viên nghiên cứu khoa học trên Bộ môn Vi sinh và Sinh học là những người đã luôn động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều từ khi khóa luận mới bắt đầu được tiến hành cho đến khi hoàn thành

Cuối cùng, tôi muốn gửi đến gia đình của tôi, nơi đã sinh ra tôi, nuôi dưỡng tôi lớn lên và luôn bên cạnh động viên tôi suốt những năm tháng qua, lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Bùi Thị Hạnh

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

Một vài nét về chi Aspergillus Fr.: Fr 2

Tình hình nghiên cứu chi Aspergillus và độc tố trên thảo dược ở ngoài nước 4

Tình hình nghiên cứu chi Aspergillus và độc tố trên thảo dược ở trong nước 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 11

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.2 Môi trường phân lập và xác định nấm mốc 11

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 11

2.1.4 Hóa chất 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu 12

2.3.2 Phương pháp phân lập nấm mốc 13

2.3.3 Phương pháp phân loại nấm mốc 13

2.3.4 Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm 13

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15

3.1 Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu của vị thuốc mã tiền 15

3.1.1 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu 15

3.1.2 Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu vị thuốc mã

tiền nghiên cứu 15

3.1.3 Một số ý kiến bàn luận 23

3.2 Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu của vị thuốc khiếm thực 24

3.2.1 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc khiếm thực nghiên cứu 24

3.2.2 Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu vị thuốc khiếm thực nghiên cứu 24

3.2.3 Một số ý kiến bàn luận 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

1 Kết luận 34

1.1 Vị thuốc mã tiền 34

1.2 Vị thuốc khiếm thực 34

2 Đề xuất 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADM : Aspergillus Differentiation Medium Base

BGYF test : Bright greenish-yellow fluorescence test

DĐVN IV : Dược điển Việt Nam IV

DGM : Dichloran Glycerol Medium Base

HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography) HPLC-MS/MS : Sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp detector khối phổ 2 lần

(High performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry)

MEA : Malt Extra Agar

PDA : Potato Dextrose Agar

TLC : Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UPLC-MS/MS : Sắc kí siêu hiệu năng kết hợp detector khối phổ 2 lần

(Ultra performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Ba ̉ ng 3.1 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu 15

Bả ng 3.2 Các loài và số lượng chủng của chi Aspergillus phân lập được từ 10

mẫu mã tiền nghiên cứu 16

Bả ng 3.3 Một số đặc điểm khuẩn lạc của các loài thuộc chi Aspergillus phân

lập được từ các mẫu mã tiền nghiên cứu 17

Bả ng 3.4 Một số đặc điểm vi học của các loài thuộc chi Aspergillus phân lập

được từ các mẫu mã tiền nghiên cứu 18

Ba ̉ ng 3.5 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc khiếm thực nghiên cứu 24

Bả ng 3.6 Các loài và số lượng chủng của chi Aspergillus phân lập được từ 10

mẫu khiếm thực nghiên cứu 24

Bả ng 3.7 Một số đặc điểm khuẩn lạc của các loài thuộc chi Aspergillus phân

lập được từ các mẫu khiếm thực nghiên cứu 26

Bả ng 3.8 Một số đặc điểm vi học của các loài thuộc chi Aspergillus phân lập

được từ các mẫu khiếm thực nghiên cứu 27

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc sinh conidi của chi Aspergillus 3

Hình 3.1 Loài A niger nhiễm trên vị thuốc mã tiền 19

Hình 3.2 Loài A flavus nhiễm trên vị thuốc mã tiền 20

Hình 3.3 Loài A tamarii nhiễm trên vị thuốc mã tiền 21

Hình 3.4 Loài A ochraceus nhiễm trên vị thuốc mã tiền 22

Hình 3.5 Loài A flavus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực 28

Hình 3.6 Loài A niger nhiễm trên vị thuốc khiếm thực 29

Hình 3.7 Loài A fumigatus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực 30

Hình 3.8 Loài A terreus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực 31

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thảo dược đang được sử dụng chế biến các phương thuốc gia truyền cũng như làm nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp dược ngày một tăng Tuy nhiên, trên thực tế và theo đánh giá của các nhà khoa học, nguồn nguyên liệu này hiện chưa đáp ứng được các yêu cầu về chất lượng, độ an toàn

và tính hiệu quả [13], [17], [25] Trong quá trình thu hoạch, vận chuyển, bảo quản và phân phối, thảo dược là mục tiêu lây nhiễm của nhiều loại nấm mốc

khác nhau (đặc biệt là các loài của chi Aspergillus) và là nguyên nhân gây hư hỏng và tạo thành mycotoxin [14] Mã tiền (Semen Strychni) và khiếm thực (Semen Euryales) là các vị thuốc được dùng khá phổ biến trong đông y Mã

tiền, ngoài việc được dùng để chiết strychnin trong tây y, còn được dùng nhiều trong đông y để chữa tê thấp, bại liệt và bán thân bất toại [9] Khiếm thực cũng được dùng khá phổ biến trong đông y để làm thuốc bổ, điều trị các bệnh như đau nhức dây thần kinh, tê thấp, đau đầu gối, di tinh, tiểu tiện nhiều, phụ nữ khí

hư bạch đới [9] Tuy nhiên, cho đến nay ở trong nước vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào về mức độ nhiễm nấm mốc, đặc biệt là các loài của chi

Aspergillus và mycotoxin trên các thảo dược này Để góp phần nâng cao hiệu

quả sử dụng, độ an toàn của thảo dược nói chung, các vị thuốc mã tiền và khiếm

thực nói riêng, đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng loài của chi Aspergillus Fr.:

Fr trên các vị thuốc mã tiền (Semen Strychni) và khiếm thực (Semen Euryales) đang lưu hành trên địa bàn Hà Nội” đã được thực hiện với 2 mục

tiêu sau:

1 Phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu của hai vị thuốc nghiên cứu

2 Phân loại các chủng nấm thuộc chi Aspergillus phân lập được đến cấp loài

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Một vài nét về chi Aspergillus Fr.: Fr

Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu năm 1729, sau đó đến năm

1832 được Fries chấp nhận và theo luật quốc tế về danh pháp thực vật, chi

Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries Sau này Fries lại

xem xét bổ sung nên được mang tên Aspergillus Fries ex Fries

Chi Aspergillus đặc trưng bởi những đặc điểm sau: Hệ sợi nấm gồm các

sợi có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong một số trường hợp trở thành màu nâu hay màu sẫm, một số ngả màu xanh lá cây khác nhau ở các vùng nhất định của khuẩn lạc Cấu trúc mang bào tử trần phát triển từ một

tế bào có đường kính lớn hơn, thành tế bào dày hơn Giá bào tử trần (conidiophore) được cấu tạo bởi một cuống (stipe) không phân nhánh, với phần đỉnh phồng to gọi là bọng (vesicle) hình chùy, hình elip, hình cầu hoặc nửa cầu Bọng này mang các thể bình Các thể bình (phialide) được gọi là thể bình một tầng (uniseriate phialide), hoặc trên cuống thể bình (metula) là thể bình hai tầng (biseriate phialide) Conidi (conidium) được tạo thành nối tiếp nhau từ thể bình Conidi chỉ gồm một tế bào, bề mặt nhẵn hoặc xù xì, có gai, không màu hoặc có màu Bọng, thể bình, cuống thể bình (nếu có) và conidi hình thành một khối conidi (conidial head) (hình 1.1) Khối conidi có thể hình thành dạng cột (columnar), dạng phóng xạ (radiate) hoặc dạng cầu (globose) Một số loài có bào tử túi (ascosporum) trong các thể quả kín (cleitothecium), thể quả có thể nằm trong đệm nấm dạng hạch cứng (sclerotium) là các khối sợi thường có

dạng hình cầu, cứng Hình thức hữu tính: Eurotium, Emericella, Neosartorya

và một số chi khác

Nhiều loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ

chất tự nhiên, đặc biệt là lây nhiễm trên các loại hạt lương thực, các loại cơ chất chết có nguồn gốc thực vật [6], ở nhiều vùng địa lí khác nhau trên thế giới Ở

3

các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới sự xuất hiện của chi Aspergillus phổ biến hơn rất nhiều so với các loài của chi Penicillium

Hình 1.1 Cấu trúc sinh conidi của chi Aspergillus

Một số loài của chi nấm này được dùng trong công nghệ lên men, hoặc các ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid hữu cơ (acid citric, acid glucomic) hoặc các enzym (amylase, protease) [19] Mặt khác, một số loài có khả năng gây bệnh ở người và động vật [32] hoặc có khả năng sinh các chất chuyển hoá

thứ cấp độc (mycotoxin) [15], [17]

Hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper & Fennell (1965) [20] gồm

18 nhóm (Group) và có 132 loài với 18 thứ Samson (1979, 1992, 1994a & b)

đã công bố sưu tập dữ liệu của các loài, thứ đã được mô tả từ 1965 và chỉ ra sự bất hợp lý của một số taxon đã được công bố Đến nay, số lượng các loài của

4

chi đã được phát hiện lên tới trên 200 loài, trong đó có khoảng trên 70 loài là các trạng thái hữu tính [19]

Nhận diện nấm bằng nuôi cấy: các chủng đã phân lập được cấy đơn bào

tử tại 3 điểm trên môi trường Czapek và MEA 2% và ủ ở 250 C Đối với các

loài nấm ưa khô như A penicillioides, trạng thái hữu tính Eurotium và một số

loài khác có thể sử dụng các môi trường Czapek và MEA với 20-40% đường

kính Các chủng thuộc 2 loài A flavus và A parasiticus được nuôi cấy xác định

trên môi trường ADM Trong điều kiện nuôi cấy trên các môi trường, sử dụng các đĩa Petri thuỷ tinh tốt hơn là sử dụng các đĩa Petri bằng chất dẻo Hầu hết các loài hình thành bào tử trong vòng 7 ngày Quan sát bằng kính hiển vi các đặc điểm và cấu trúc của khối conidi sau nuôi cấy Cần có biện pháp phòng

tránh hít phải bào tử do một số loài của chi Aspergillus có thể gây bệnh ở người (đặc biệt là A fumigatus)

Tình hình nghiên cứu chi Aspergillus và độc tố trên thảo dược ở ngoài nước

Hiện nay, trên thế giới xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thực vật để làm thuốc ngày một tăng Tuy nhiên, việc sử dụng càng nhiều thực vật làm thuốc càng tạo ra mối nguy cơ về sức khỏe cho cộng đồng do thiếu các nghiên cứu cần thiết về cách sử dụng, tính hiệu quả, độc tính, và chất lượng của các sản phẩm tự nhiên này Khi nguồn dược thảo được sử dụng tăng cao có thể dẫn đến việc tăng lượng mycotoxin đưa vào cơ thể Bởi vậy, dược thảo nhiễm mycotoxin có thể gây ra các vấn đề bất lợi đối với sức khỏe con người, và có thể dẫn đến rủi ro nguy hiểm đến tính mạng Sự xuất hiện tự nhiên của nhiều mycotoxin trong các loại thực vật làm thuốc và các dược thảo truyền thống được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới như Tây Ban Nha, Trung Quốc, Đức,

Ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ, và các nước Trung Đông [13], [17], [25]

5

Mycotoxin là các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp độc được tạo bởi các chi

nấm quan trọng như Aspergillus, Penicillium, Fusarium và Alternaria

Mycotoxin cũng có thể được định nghĩa là các chất chuyển hóa của nấm, khi

ăn phải, hít phải hay được hấp thu qua da gây ra các bệnh khác nhau, được gọi chung là bệnh do độc tố nấm (mycotoxicosis), hoặc gây tử vong ở người và động vật Mycotoxin có thể gây ra nhiều tác động khác nhau như gây ung thư, độc với hệ thần kinh, gây quái thai, và làm tổn thương hệ miễn dịch Cho đến nay, có khoảng 400 mycotoxin đã được phát hiện Tuy nhiên, xét về tác hại đối với sức khỏe con người và động vật nuôi, các mycotoxin quan trọng là aflatoxin, ochratoxin A, fumonisin, zearalenone, và deoxynivalenol Các mycotoxin này thường được phát hiện trên các sản phẩm như ngũ cốc, các loại quả hạch, dược thảo, và các loại gia vị Các sản phẩm có nguồn gốc thực vật, khi được bảo quản qua nhiều ngày (trên 48 giờ) sẽ nhạy cảm với sự phát triển của nấm mốc và sự hình thành mycotoxin Sự lây nhiễm có thể xuất hiện trước thu hoạch, hoặc giai đoạn sau thu hoạch Khí hậu nhiệt đới ẩm hoặc điều kiện bảo quản kém là các yếu tố môi trường thuận lợi cho nấm mốc phát triển và tạo thành mycotoxin Sự hình thành độc tố nấm mốc có thể tăng lên khi gặp các điều kiện khác như khô hạn, tổn hại do côn trùng hoặc thu hoạch bằng máy móc trong quá trình trồng trọt và bảo quản [13]

Đánh giá mức độ nhiễm và khả năng sinh độc tố của các loài nấm mốc trên 152 mẫu nguyên liệu thô có nguồn gốc từ 56 loài thảo dược, được thu thập

từ 13 cơ sở sản xuất của Achentina [23], bằng các phương pháp phân lập, nhận diện chuẩn cho thấy: có 52% của 152 mẫu nghiên cứu bị nhiễm các loài của chi

Aspergillus Trong số này, có 27% thuộc nhóm loài A flavus và 25% thuộc

nhóm loài A niger Ngoài ra, 16% tổng số mẫu đã bị nhiễm các loài của chi

Fusarium Các loài A flavus và A parasiticus phân lập được nhiều nhất, với

50% trong số 40 chủng phân lập được có khả năng sinh độc tố, và nồng độ

6

aflatoxin xác định được dao động trong khoảng 10-2000 ng/g Trái lại, chỉ có

26% số chủng của nhóm loài A niger phân lập được có khả năng sinh độc tố

ochratoxin A ở nồng độ thấp, trong khoảng 0,12-9,0 ng/g Qua tỷ lệ nhiễm các loài nấm có khả năng sinh độc tố trên các mẫu dược thảo nghiên cứu, cho thấy

sự cần thiết phải điều tra mức độ nhiễm tự nhiên của các mycotoxin Trên cơ

sở đó mới có thể xác định được giới hạn hợp lý về các loại độc tố, giúp quản lý hiệu quả nguồn nguyên liệu dược thảo, tránh rủi ro cho sức khỏe cộng đồng

Điều tra mức độ nhiễm các loài nấm sinh độc tố và mycotoxin trên 40

mẫu dược liệu của 8 cây thuốc (mỗi cây 5 mẫu gồm: Saraca indica, Terminalia

arjuna, Withania somnifera, Bacopa monnieri, Evolvulus alsinoides, Zingiber officinale, Tribulus terrestris và Hemidesmus indicus), được thu thập từ các

chợ khác nhau của bang Agra và vùng lân cận (Ấn Độ), giai đoạn 2009-2010,

cho thấy: các loài gồm: Aspergillus niger, A flavus, Mucor spp., và Rhizopus spp nổi trội so với các loài khác phân lập được Trong số 10 mẫu bị nhiễm A

flavus, 4 mẫu phân lập được các chủng có khả năng sinh aflatoxin [22] Với

dược liệu bị nhiễm các chủng nấm sinh độc tố, không đồng nghĩa với sự có mặt của mycotoxin trên nguồn cơ chất Tuy nhiên, sự có mặt của các loài nấm là một rủi ro tiềm tàng về khả năng nhiễm độc tố Bởi vậy, các thảo dược phải được bảo quản cẩn thận mới có khả năng ngăn chặn được sự phát triển của nấm mốc sau thu hoạch Ngoài ra, các dược liệu có nguồn gốc thực vật này phải được kiểm tra sự có mặt của mycotoxin trước khi sử dụng

Điều tra mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên 50 mẫu dược liệu là

lá khô của 2 loài thực vật (Azadirachta indica và Justica adhatoda) được thu

thập từ các hiệu bán buôn và bán lẻ của 8 quận, bang Jammu và Kashmir (Ấn Độ) bằng kỹ thuật rửa bề mặt (surface washing technique), sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Kết quả cho thấy: có tổng số 50 loài nấm, thuộc 30 chi đã được phân lập Sự đa dạng của các loài nấm trên 2

7

mẫu lá tương đối giống nhau (có thể do nguồn dinh dưỡng phong phú và không khác nhau nhiều) Các loài nấm phân lập được có khả năng sinh mycotoxin quan trọng Kết quả phân tích độc tố cho thấy: các aflatoxin B1, B2, và patulin

đã được phát hiện trên các mẫu lá khô của Azadirachta indica, và aflatoxin B1, B2 và zearalenol cũng được phát hiện ở các mẫu lá cây Justica adhatoda Trong

các mycotoxin đã được phát hiện, aflatoxin có mặt trên cả 2 loại lá (do sự có

mặt của các chủng sinh độc tố thuộc loài A flavus) Tuy nhiên, các độc tố

ochratoxin, citrinin, zearalenone và deoxynivalenol đã không phát hiện thấy trong các mẫu lá nghiên cứu [28]

Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và mycotoxin trên 84 mẫu dược thảo và gia vị thực phẩm thường dùng (có nguồn gốc từ 14 loại thực vật khác nhau, được nhập khẩu từ Ấn Độ), được thu thập từ các hiệu bán lẻ của thủ đô Cairo,

Ai Cập Kết quả cho thấy: 10 chi nấm đã được nhận diện Trong đó, các loài

Aspergillus flavus, A parasiticus, A niger, Fusarium oxysporum, và Penicillium viricatum đã xuất hiện với tần suất cao nhất trên các mẫu dược thảo

và gia vị nghiên cứu Kết quả phân tích mycotoxin cho thấy: 17 mẫu đã bị nhiễm aflatoxin B1, với hàm lượng trung bình từ 10-160 µg/kg Độc tố ochratoxin đã bị nhiễm trong 3 mẫu, với lượng trung bình từ 20-80 µg/kg Không phát hiện thấy các độc tố khác như acid penicillic, zearalenone, và T-toxin [14]

Nghiên cứu mức độ nhiễm tự nhiên của nấm mốc và độc tố trên 5 loại rễ

(cả dạng tươi và khô sau thu hoạch) của 5 loài thực vật: Aegle marmelos,

Clerodendrum phlomoides, Desmodium gangeticum, Gmelina arborea và Oroxylum indicum bằng các phương pháp chuẩn cho thấy: đã có 43 và 37 chủng

nấm được phân lập từ các mẫu tươi (genuine) và khô ở các chợ, chủ yếu thuộc

2 chi Aspergillus và Fusarium Định tính và định lượng các aflatoxin B1, B2,

G1 và G2 bằng BGYF test (dựa vào màu huỳnh quang vàng xanh sáng dưới

8

bức xạ tử ngoại 365 nm) và HPLC cho thấy: Các mẫu rễ tươi và khô của 5 loại dược thảo trên đã bị nhiễm aflatoxin với lượng khác nhau, đặc biệt là aflatoxin B1 và B2 Tuy nhiên, các độc tố này có mặt với lượng thấp hơn so với qui định (20 µg/kg) của tổ chức Y tế Thế giới [21]

Một nghiên cứu khác khảo sát khả năng nhiễm các aflatoxin B1, B2, G1

và G2 trong các mẫu hạt của 2 loài cây Mucuna pruriens L., Portulaca

oleracceae L., và rễ của cây Delphinium denudatum Wall, được thu thập từ các

chợ của thủ đô New Delhi, Ấn Độ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với khối phổ 2 lần (HPLC-MS/MS) cho thấy: Các aflatoxin B1, B2 đã được phát

hiện ở dạng vết (thấp hơn giới hạn phát hiện) trong hạt của cây M pruriens, không phát hiện được trong rễ của cây D denudatum Hạt của cây P oleraceae

đã bị nhiễm aflatoxin B1 và B2 Các aflatoxin G1 và G2 đã không phát hiện

thấy ở M pruriens, P oleraceae, và thấp hơn giới hạn phát hiện ở D

denudatum [29]

Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và độc tố từ các mẫu dược thảo khô là

vỏ (từ các cây Betula utilis D Don., Symplocos paniculata Wall., Berberis

aristata DC.), rễ (Arnebia euchroma (Royle) Johnston Contr., Articum lappa

Linn., Plumbago zeylanica Linn., Cichorium intybus Linn.), thân rễ (Acorus

calamus Linn.), lá (Oroxylum indicum Vent.), thân và lá (Centella asiatica

Linn.) được thu thập từ các chợ ở Himachal Pradesh bằng các môi trường chuẩn

và sắc ký lớp mỏng cho thấy: Các loài nấm thuộc các chi Aspergillus, Rhizopus

và Penicillium đã có mặt trên tất các các mẫu nghiên cứu Trong đó, A niger

là loài phân lập được nhiều nhất Trong 10 loại dược thảo nghiên cứu, có 7/10 dương tính với aflatoxin [26]

Khảo sát các mẫu của 3 loại quả khô (của 3 loài thực vât Emblica

officinalis, Terminalia chebula và T bellerica) - các thành phần được dùng để

sản xuất chè thuốc cổ truyền Triphala nổi tiếng của Ấn Độ, được thu thập ngẫu

9

nghiên từ các chợ của bang Jummu và Kashmir, Ấn Độ Kết quả điều tra cho thấy: tất cả các mẫu phân tích đều bị nhiễm nấm Gần một nửa các loài nấm

hoại sinh thuộc 2 chi Aspergillus và Penicillium Kết quả phân tích độc tố cho

thấy: các mẫu nghiên cứu dương tính với nhiều loại độc tố khác nhau, bao gồm aflatoxin (B1, B2), ochratoxin A, patulin và citrinin [27] Với hàm lượng cao các độc tố này trong các mẫu quả của 3 loài thực vật trên, bên cạnh việc làm giảm hiệu quả của chè thuốc Triphala còn có thể gây ra mối nguy hiểm cho con người do các tác dụng độc với gan, thận, và tế bào Trên cơ sở nghiên cứu này, các tác giả cũng đã khuyến cáo rằng: Trước khi chế tạo chè thuốc Triphala, điều rất quan trọng là phải đánh giá cẩn thận chất lượng của 3 loại quả này về các chỉ tiêu nhiễm nấm và mycotoxin

Một nghiên cứu khác về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên 12 dược thảo dạng hạt gồm thảo quyết minh, hạt cây tơ hồng, hạt ý dĩ, sa uyển tử, hạt sen, hạt vải, đào nhân, hạt tiêu, hạt mã đề, bá tử nhân, hạt màn màn, và hạt quýt đã cho thấy: Với hệ vi nấm bề mặt, 34 loài thuộc 7 chi đã được phát hiện

Trong đó, Aspergillus niger và Penicillium polonicum là các loài phổ biến nhất

(lần lượt là 12% và 15%) Các mẫu hạt dược thảo đã được kiểm tra khả năng nhiễm 2 độc tố chính là ochratoxin và aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) bằng thiết

bị siêu hiệu năng kết nối với detector khối phổ 2 lần (UPLC-MS/MS) cho thấy: Các mẫu hạt trắc bách diệp (từ cây trắc bá) đã bị nhiễm độc tố aflatoxin B1 (52,0 µg/kg) và hạt quýt đã phát hiện thấy độc tố ochratoxin A (92,3 µg/kg), quá qui định cho phép của châu Âu (lần lượt với 2 độc tố aflatoxin, ochratoxin

A là 5 µg/kg và 20 µg/kg) [15]

Tosun và cộng sự [31] đã nghiên cứu mức độ nhiễm độc tố aflatoxin trên

12 mẫu chè thuốc (herbal tea) đang lưu hành ở các cửa hiệu ở Manisa (Thổ Nhĩ Kỳ) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy: Trong số 48 mẫu được phân tích, có 43 mẫu bị nhiễm aflatoxin Hàm lượng cao nhất của độc tố này

10

(34,18 µg/kg) đã phát hiện thấy trên một mẫu của chè thuốc “Cúc La Mã” (camomile tea) Tỷ lệ nhiễm các aflatoxin B1, B2, G1 và G2 được phát hiện trong các mẫu chè thuốc lần lượt là 54; 29; 71 và 46% Hàm lượng các độc tố này trong các mẫu được phát hiện lần lượt dao động trong các khoảng 0-14,2; 0-12,4; 0-13,5 và 0-28,7 µg/kg Độc tố aflatoxin đã không phát hiện thấy trong

5 mẫu của 3 loại chè thuốc khác

Tình hình nghiên cứu chi Aspergillus và độc tố trên dược liệu ở trong nước

Trong nước, cho đến nay các công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm

nấm mốc nói chung, chi Aspergillus nói riêng và mycotoxin trên thảo dược

không nhiều Một số công trình nghiên cứu về tính đa dạng loài của chi

Aspergillus [7], [8], [10], [11] Một số công trình khác nghiên cứu về mức độ

nhiễm loài A flavus, nấm mốc nói chung và aflatoxin [1], [3], [4], [5], [6], [10]

Điểm chung của các công trình này là đều áp dụng phương pháp đặt trực tiếp dược liệu trên môi trường PDA để phân lập các chủng nấm nhiễm Đồng thời cũng sử dụng môi trường Czapek Dox để nuôi cấy các chủng nấm trong khảo sát đặc điểm khuẩn lạc và vi học trong xác định các loài Kết luận của các công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc đều cho thấy các loài của chi

Aspergillus đều chiếm một tỷ lệ cao nhất trong các chủng nấm phân lập được

từ các dược thảo nghiên cứu [5], [6] Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy,

các loài A niger, A flavus và A fumigatus thường chiểm tỷ lệ cao trong các loài của chi Aspergillus phân lập được Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu cũng

cho thấy, một số dược thảo như hạt sen, ý dĩ đã bị nhiễm aflatoxin (một độc tố

có khả năng gây ung thư) quá mức cho phép của ngành y tế [4], [6], [10]

11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

10 mẫu mã tiền và 10 mẫu khiếm thực được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn Hà Nội (phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm), được chuyển

về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập và phân loại nấm

2.1.2 Môi trường phân lập và xác định nấm mốc

• Môi trường PDA (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Khoai tây gọt vỏ: 200; Glucose: 20; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC) 5,6 ±0,2

• Môi trường Dichloran Glycerol Medium Base - DGM (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Peptone: 5; Glucose: 10; KH2PO4: 1; MgSO4: 0,5; Dichloran: 0,002; Chloramphenicol: 0,1; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 5,6 ± 0,2

• Môi trường xác định 2 loài A flavus và A parasiticus: Aspergillus

Differentiation Medium Base - ADM (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Peptone: 10; Cao nấm men: 20; Ferric amonium citrate: 0,5; Dichloran: 0,002; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 6,3 ± 0,2

• Môi trường Czapek Dox Agar (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Đường kính: 30; NaNO3: 2,0; KCl: 0,5; K2HPO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,5; FeSO4.7H2O: 0,01; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 7,3 ± 0,2

12

• Nồi hấp tiệt trùng Hiclave HVE - 25, Hirayama (Nhật Bản)

2.1.4 Hóa chất

Dung dịch NaOCl 1%

2.2 Nội dung nghiên cứu

• Xác định hàm ẩm, xử lý các mẫu dược liệu của 2 vị thuốc nghiên cứu, đặt lên các đĩa Petri chứa môi trường phân lập (PDA hoặc DGM) đã được chuẩn

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu

Hàm ẩm các mẫu dược liệu được xác định bằng phương pháp "Mất khối lượng do làm khô" theo hướng dẫn của phụ lục 9.6, DĐVN IV [2]

Cách tiến hành: Dược liệu được nghiền thô, thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm Cân một lượng mẫu thử (m), tiến hành làm khô trong tủ sấy

ở nhiệt độ 105C trong vòng 4 giờ với khiếm thực, và đến khối lượng không đổi với mã tiền Sau khi sấy, làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm rồi cân ngay (m’)

Tính kết quả hàm ẩm theo công thức sau:

Hàm ẩm (%)=m-m'

13

2.3.2 Phương pháp phân lập nấm mốc

Phương pháp phân lập nấm mốc trên dược liệu được áp dụng trên cơ sở của phương pháp Samson và cộng sự (sử dụng phương pháp đặt trực tiếp trên môi trường PDA hoặc DGM) [24]: Các mẫu dược liệu (mỗi mẫu 40g) được khử trùng hệ vi nấm bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorid 1% mới pha trong

2 phút Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất đã khử trùng Để ráo nước và đặt nhanh các mẫu dược liệu vào các đĩa Petri đã có môi trường PDA (hoặc DGM) bằng kẹp vô trùng (thực hiện trong tủ cấy vô trùng) Ủ ở nhiệt độ 27°C, sau 5-7 ngày

tiến hành phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu dược liệu nghiên cứu

2.3.3 Phương pháp phân loại nấm mốc

• Phân loại các loài của chi Aspergillus dựa trên mô tả đặc điểm khuẩn lạc, vi

học các loài của Samson và cộng sự 1995 [24], Raper và Fennell 1965 [20], Pitt và Hocking 1985 [19] Nguyên lý chung của phương pháp là dựa trên

sự so sánh đặc điểm khuẩn lạc (đường kính khuẩn lạc, màu sắc mặt trước và sau của khuẩn lạc, các chất tiết trên khuẩn lạc …) và đặc điểm vi học (cấu trúc sinh conidi, kích thước, màu sắc của cấu trúc sinh conidi và conidi, sợi nấm …) của các chủng khi được cấy đơn bào tử tại 3 điểm trên các môi trường chuẩn (Czapek Dox), và nuôi trong cùng điều kiện (nhiệt độ, thời gian, nồng độ oxy…)

• Xác định 2 loài A flavus, A paraciticus theo phương pháp sinh hóa của Pitt

và Hocking [19] Nguyên lý của phương pháp là các chủng của 2 loài A

flavus, A parasiticus khi nuôi cấy trên môi trường ADM, ủ ở nhiệt độ 30°C

sau 42-48 giờ sẽ xuất hiện màu vàng cam sáng ở mặt trái khuẩn lạc

2.3.4 Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm

Mức độ nhiễm các loài được tính theo 2 chỉ số [18]:

• Chỉ số có mặt hay tần suất xuất hiện loài trên các mẫu nghiên cứu:

14

FQ (isolation frequency, %) = Số mẫu có mặt loài

Tổng số mẫu nghiên cứu x 100%

15

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu của vị thuốc

mã tiền

3.1.1 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu

Một trong các yếu tố sinh thái quan trọng, ảnh hưởng đến sự lây nhiễm

và phát triển của nấm trên các cơ chất nói chung và mã tiền nói riêng là hàm

ẩm của cơ chất Do vậy, các mẫu của vị thuốc này trước khi tiến hành phân lập nấm, đã được xác định hàm ẩm theo phương pháp của phụ lục 9.6, DĐVN IV

Kết quả xác định hàm ẩm của các mẫu mã tiền nghiên cứu được liệt kê trong bảng 3.1 dưới đây

Ba ̉ ng 3.1 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu

3.1.2 Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu

Các mẫu của vị thuốc mã tiền nghiên cứu, sau khi xác định hàm ẩm đã được xử lý các bào tử nấm bề mặt bằng natri hypoclorid 1%, đặt trực tiếp lên môi trường PDA (hoặc DGM), phân lập các chủng nấm nhiễm sau 5-7 ngày ủ

ở nhiệt độ 27oC Để phân loại các chủng nấm nhiễm thuộc chi Aspergillus phân

lập được đến cấp loài, tiến hành nuôi cấy trên môi trường Czapek Dox và môi trường ADM Khảo sát các đặc điểm khuẩn lạc, vi học và sinh hóa của các chủng nấm nuôi cấy, đối chiếu với đặc điểm của các loài đã được mô tả từ các tài liệu tham khảo

a) Kết quả phân lập và phân loại