Khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến một số tính chất của vi nang probiotic alginat tinh bột

Trong đó, phương pháp vi nang hóa tỏ ra có nhiều ưu điểm vượt trội giúp tăng độ ổn định và hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi về nhiệt độ, pH, các chất ức chế làm tế b

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN TOÀN

Mã sinh viên: 1201619

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA

CHITOSAN ĐẾN MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA VI NANG PROBIOTIC ALGINAT-

TINH BỘT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN TOÀN

Mã sinh viên: 1201619

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA

CHITOSAN ĐẾN MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA VI NANG PROBIOTIC ALGINAT-

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS

Đàm Thanh Xuân và DS Nguyễn Thị Ngọc những người thầy đã luôn tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn thành khóa luận này

Đồng thời tôi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong

bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia đã tạo mọi

điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, chỉ bảo tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 08 tháng 05 năm 2017 Sinh viên

Nguyễn Văn Toàn

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về vi nang 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Đặc điểm 2

1.1.3 Ưu điểm của vi nang 3

1.1.4 Nhược điểm của vi nang 3

1.2 Phương pháp bào chế vi nang 4

1.2.1 Phương pháp đông tụ 4

1.2.2 Phương pháp hóa rắn nhũ tương 5

1.3 Tổng quan một số thành phần sử dụng trong vi nang 6

1.3.1 Alginat 6

1.3.2 Chitosan 8

1.4 Một số phương pháp đánh giá sự có mặt của chitosan trong vi nang 9

1.4.1 Phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) 10

1.4.2 Phương pháp đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) 11

1.5 Một số nghiên cứu sử dụng vi nang alginat phối hợp với tinh bột và chitosan 12

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 14

2.1.1 Nguyên vật liệu sử dụng 14

2.1.2 Thiết bị 14

2.1.3 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành vi nang 15

2.2.2 Sơ bộ định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) 15

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác chitosan-alginat

trên vi nang 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp bào chế vi nang 15

2.3.2 Phương pháp đông khô 16

2.3.3 Phương pháp định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) 17

2.3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác chitosan-alginat trên vi nang 17

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành của vi nang calci alginat 18

3.2 Định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) 20 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác chitosan-alginat trên vi nang 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Cfu Số đơn vị khuẩn lạc (Colony – Forming Units)

L acidophilus Lactobacillus acidophilus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 14

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 14

Bảng 2.3 Bảng thiết kế công thức vi nang 15

Bảng 3.1 Đặc tính các mẫu tạo thành khi thay đổi nồng độ calci clorid 18

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh mô tả cấu trúc của alginat 6

Hình 1.2 Mô hình vỉ trứng, vị trí của ion Ca2+ trong gel và sự tạo gel calci alginat 7

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của chitosan 8

Hình 3.1 Hình ảnh vi nang M1 tạo thành theo thời gian 19

Hình 3.2 Hình ảnh vi nang M2 tạo thành theo thời gian 19

Hình 3.3 Phổ IR của chitosan chuẩn 22

Hình 3.4 Phổ IR của vi nang trắng 22

Hình 3.5 Phổ IR của vi nang M3 23

Hình 3.6 Phổ IR của vi nang M4 23

Hình 3.7 Phổ IR của vi nang M5 24

Hình 3.8 Phổ IR của vi nang M6 24

Hình 3.9 Hình ảnh so sánh phổ IR của chitosan, vi nang trắng và các vi nang M3, M4, M5 và M6 25

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn A - λ của dung dịch chitosan và môi trường pH 3 sau khi khảo sát hòa tan các vi nang M3, M4, M5 và M6 29

Hình 3.11 Phổ IR của vi nang M3 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3 29

Hình 3.12 Phổ IR của vi nang M4 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3 30

Hình 3.13 Phổ IR của vi nang M5 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3 30

Hình 3.14 Phổ IR của vi nang M6 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3 31

Hình 3.15 Hình ảnh so sánh phổ IR của chitosan, vi nang trắng và các vi nang M3, M4, M5 và M6 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotics được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người như ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch, hấp thụ ure, hỗ trợ điều trị cho người suy thận, giảm cholesterol máu, [24], [26], [33] Tuy nhiên, các vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như pH, nhiệt độ, ánh sáng, hàm ẩm,… Những yếu tố này làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tạo ra các chế phẩm có khả năng đảm bảo cung cấp đủ số lượng vi sinh vật đem lại tác dụng mong muốn Trong đó, phương pháp vi nang hóa tỏ ra có nhiều ưu điểm vượt trội giúp tăng độ ổn định và hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi về nhiệt độ, pH, các chất ức chế làm tế bào kéo dài khả năng tồn tại Các nghiên cứu gần đây tác giả sử dụng vi nang calci alginat bao chitosan để bao gói các vi sinh vật, phương pháp bao chitosan lên vi nang có nhiều lợi ích nổi bật Chitosan giúp bảo vệ, làm tăng khả năng sống sót của vi sinh vật, hạn chế tác động của acid dịch vị và muối mật khi vi sinh vật đi qua đường tiêu hóa [27], [29] Ngày nay phương pháp vi nang hóa bao chitosan được ứng dụng nhiều trong việc bao gói các vi sinh vật tạo ra sản phẩm probiotics mang nhiều lợi ích Từ

các lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến một số tính chất của vi nang probiotic alginat – tinh bột” với các mục tiêu sau:

1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành vi nang

2 Sơ bộ định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR)

3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác chitosan-alginat trên

vi nang

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vi nang

để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống [5], [19]

1.1.2 Đặc điểm

Vi nang có cấu tạo như một màng bán thấm hình cầu giúp tế bào được cách ly với môi trường xung quanh, bảo vệ và làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào vi sinh vật, bằng cách này chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như acid cao, pH thấp, muối mật, sốc nhiệt, và chỉ giải phóng tế bào tại nơi mong muốn [25] Ngoài ra vi nang hóa cũng giúp ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào trong quá trình lên men [30], [41]

Vi nang hóa cho phép cố định một lượng lớn tế bào vi sinh vật [41] Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và giải phóng vi sinh vật khi cần thiết Lớp màng phải có độ bền cơ học tương đối để có thể bảo vệ được các vi sinh vật sống bên trong, tuy nhiên lại không được quá vững chắc vì như thế sẽ ảnh hưởng đến sự giải phóng vi sinh vật khi cần thiết [5], [25]

Kích thước hạt vi nang cũng là một yếu tố quan trọng Giữa kích thước hạt, độ bền vững và khả năng giải phóng tế bào có mối quan hệ với nhau Kích thước hạt càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ vi sinh vật càng cao, nhưng giải phóng vi sinh vật khi cần thiết chậm và khó khăn Ngược lại, kích thước hạt nhỏ

thì độ bền cơ học của hạt thấp, khả năng chứa và bảo vệ vi sinh vật giảm nhưng khả năng giải phóng vi sinh vật thì nhanh và dễ dàng hơn

Vi sinh vật được giải phóng theo các cơ chế như: gãy vỡ màng, hòa tan màng hoặc khếch tán qua màng,… [25]

1.1.3 Ưu điểm của vi nang

Vi nang giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi các yếu tố bất lợi của môi trường như oxy và điều kiện acid ở dạ dày Ngoài ra, vi nang làm ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt của các chất ức chế có trong môi trường lên men do đó làm tăng độ ổn định và kéo dài khả năng tồn tại của vi khuẩn Trong vi nang khả năng tồn tại của vi khuẩn được tăng lên, tạo điều kiện để điều khiển tế bào và cho phép kiểm soát liều lượng Vi nang cũng cho phép điều chỉnh tốc

độ sinh trưởng của VSV, cho phép sử dụng TB ở một pha riêng biệt đối với MT lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [5], [25]

Vi nang có khả năng tạo ra mật độ VSV lớn do có thể cố định một lượng lớn TB sống Trong các ngành thực phẩm có các sản phẩm lên men như bia, rượu,… thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định TB VSV trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng VSV tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn [30], [37]

1.1.4 Nhược điểm của vi nang

Tế bào vi sinh vật sản sinh ra nhiều enzym trong quá trình trao đổi chất của nó, có

những enzym có thể cho xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp bao gói và cả chính tế bào Để giải quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật thích hợp (có thể biến đổi hoặc xử lý giống) để hạn chế tế bào không tạo ra các enzym không mong muốn và tăng hoạt tính của các enzym mong muốn [5], [41]

Đa số các vật liệu vi nang như thạch, gelatin… đều là những nguồn dinh dưỡng

mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được Điều này dẫn đến nhược điểm đó là vi sinh vật được bao gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm

cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm đáng kể

1.2 Phương pháp bào chế vi nang

Việc lựa chọn phương pháp bào chế phụ thuộc vào đặc điểm, tính chất của nguyên vật liệu như độ tan, tính tương đồng, kích thước vi nang… Vi nang có thể được bào chế bằng nhiều phương pháp khác nhau nhưng có thể tổng quát thành các phương pháp sau

1.2.1 Phương pháp đông tụ

Phương pháp này thường được áp dụng đối với các dung dịch polyme thân nước, polyme được dùng phải có khả năng tạo thành màng phim Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp đông tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp đông tụ phức tạp

a Đông tụ đơn giản

Nguyên tắc: Là quá trình loại nước của các keo thân nước dùng trong hệ do đó làm giảm độ tan của các chất keo, các chất keo sẽ tủa lại trên bề mặt tiểu phân phân tán (dung dịch tế bào tự do) [1]

Trong phương pháp này thường chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose) Làm giảm độ tan của chất keo bằng cách thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol,…) hoặc thêm vào một muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [1]

b Đông tụ phức tạp

Nguyên tắc: Là quá trình tương tác giữa các phân tử tích điện âm và tích điện dương của 2 hay nhiều hợp chất cao phân tử, thường do sự thay đổi nồng độ các chất tan cao phân tử hay pH Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng

dễ dàng tạo thành hạt đông tụ [4], [9]

Kĩ thuật đông tụ hóa muối còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel, ion hóa tạo gel để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel) Trong phương pháp này các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy VSV hoặc có thể kết hợp tạo phức với các

polycation khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn và ngăn thấm tốt hơn

Kỹ thuật đông tụ hóa muối sử dụng alginat và calci clorid làm chất bao gói có những ưu điểm như đơn giản, dễ làm, chi phí thấp, không cần sử dụng nhiệt độ cao hoặc các dung môi hữu cơ Đông tụ cho phép kết hợp một số lượng lớn VSV với chất bao gói, tuy nhiên nhược điểm là gây thất thoát VSV trong quá trình bào chế [18]

Kỹ thuật nhỏ giọt thường cho các vi nang có kích thước lớn nằm trong khoảng 2 - 5

mm [29] Đối với kỹ thuật phun đông tụ, sử dụng hệ thống phun dung dịch alginat dưới áp suất không khí tạo các giọt nhỏ và trở thành đông tụ khi gặp môi trường có tác nhân liên kết chéo Kỹ thuật này cho vi nang có kích thước bé (5 – 15µm) nhưng yêu cầu bắt buộc là phải có thiết bị thích hợp, tốn kém, khả năng tắc nghẽn cao [34] Nồng độ alginat thường được sử dụng để tạo thành gel khoảng 0,6 - 2% và nồng

độ dung dịch calci clorid là 0,05 - 2 M Kích thước và hình dạng của vi nang khác nhau tùy thuộc vào các thiết bị sử dụng [29]

Kỹ thuật phun đông tụ: Sử dụng hệ thống phun dung dịch alginat dưới áp suất

không khí tạo các giọt nhỏ và đông tụ khi gặp môi trường có tác nhân liên kết chéo

Kỹ thuật này cho vi nang có kích thước bé (5-15µm) nhưng yêu cầu bắt buộc phải có thiết bị thích hợp, tốn kém và khả năng tắc nghẽn cao [34]

Kỹ thuật nhỏ giọt: Phương pháp nhỏ giọt ứng dụng nguyên lý căn bản là khi một

chất lỏng được để rơi tự do thì sẽ tạo thành giọt hình cầu do sức căng bề mặt của chất lỏng Phương pháp nhỏ giọt được thực hiện theo nguyên tắc tạo giọt đồng thời và lồng vào nhau của hỗn dịch tế bào và dung dịch tạo vỏ gói Sự tạo giọt được thực hiện bằng cách ép các chất lỏng qua các ống đồng tâm, ở quy mô nhỏ có thể dùng bơm tiêm để ép chất lỏng qua bộ phận tạo giọt

1.2.2 Phương pháp hóa rắn nhũ tương

Vi nang có thể được tạo ra từ nhũ tương gồm hai hay nhiều chất lỏng không đồng tan với nhau Nhũ tương tạo thành có thể là loại dầu/nước (D/N) hoặc nước/dầu (N/D) phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong nước và polyme sử dụng Dựa vào

phương pháp hóa rắn nhũ tương mà có thể chia thành 3 kỹ thuật: bốc hơi dung môi, thay đổi dung môi và tạo liên kết chéo

Phương pháp hóa rắn nhũ tương là một phương pháp thích hợp để vi nang hóa probiotic trong các vi nang có kích thước nhỏ hơn 1 mm [35], [40] Loại và lượng chất diện hoạt cũng như lượng dầu và dung dịch calci clorid có thể ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình tạo vi nang Các nghiên cứu gợi ý sử dụng tỷ lệ pha dầu/alginat

là 2:1 trong bao gói probiotic, Tween 80 được sử dụng như là một chất diện hoạt trong quá trình tạo vi nang probiotic [35], [40] Phương pháp đông tụ từ nhũ tương

có hiệu quả trong việc giữ số lượng của L acidophilus LA – 5 và B bifidum BB - 12 cao hơn mức tối thiểu điều trị (> 107 cfu/g)

1.3 Tổng quan một số thành phần sử dụng trong vi nang

1.3.1 Alginat

a Cấu tạo

Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic Acid alginic là một acid hữu cơ có trong họ tảo nâu (thuộc họ Rhaephyceae) Alginat là một polyme có các monome là hai acid manunuronic (viết tắt là M) và acid guluronic (viết tắt là G) gắn với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid [19] Alginat có tỷ lệ khối G cao (tỷ số M/G thấp) tạo gel cứng hơn Ngược lại, alginat chủ yếu là khối M thì gel hình thành mềm hơn và đàn hồi hơn [32]

Hình 1.1 Hình ảnh mô tả cấu trúc của alginat

b Đặc điểm, tính chất liên quan đến bào chế vi nang

Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel [19]

Độ nhớt dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử alginat Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại [12], [23]

Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị

II, III, sự tạo gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị (Ca2+ , Ba2+ , Sr2+ ,…) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng [21] Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian 3 chiều Với cấu trúc gel này khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như 1 tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng kiểm soát được [19]

Hình 1.2 Mô hình vỉ trứng, vị trí của ion Ca 2+ trong gel và sự tạo gel calci alginat

c Ưu nhược điểm của alginat sử dụng làm vật liệu trong vi nang probiotic Alginat là nguyên liệu an toàn, không độc, dễ sử dụng và giá thành rẻ Alginat gel

hóa nhanh chóng ở pH trung tính và nhiệt độ thường, thích hợp cho các tế bào sống

và phân tử sinh học nhạy cảm như protein và acid nucleic [40] Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn định cao Quá trình vi nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt

độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo thành có tính thuận nghịch giúp giải phóng tế bào bên trong Hạt vi nang hình thành đẹp và tương đối đồng đều

[12]

Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số nhược điểm Độ bền gel phụ thuộc một số ion hóa trị I và các chất tạo phức với ion Ca2+ Gel alginat rã khi các cation hóa trị II phối hợp được thay thế bằng các cation hóa trị

I hoặc các chất tạo phức với Ca2+ Sự tương tác giữa alginat và các cation hóa trị I dẫn đến hiện tượng hòa tan của gel [16]

1.3.2 Chitosan

a Nguồn gốc

Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng deacetyl hóa của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của N-acetylglucosamine và dẫn xuất đường glucose Chitin là thành phần chính của thành tế bào nấm, xương ngoài động vật chân đốt như tôm, cua, côn trùng [38]

b Công thức hóa học

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của chitosan

c Tính chất của chitosan

Phân tử lượng từ 3.800 đến 2.000.000 dalton, mức độ acetyl hóa từ 66% đến 95% Kích thước tiểu phân, phân tử lượng, tỷ trọng, độ nhớt, mức độ acetyl hóa là những đặc tính quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng làm tá dược trong kỹ thuật bào chế [38]

Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng nồng độ chitosan, giảm nhiệt độ

và phụ thuộc mức độ deacetyl hóa của chitosan

Nhóm amino của chitosan có pka xấp xỉ 6.5 Chitosan mang điện tích dương, có tính base yếu, thấm nước, tan trong hầu hết các dung dịch acid hữu cơ ở pH nhỏ hơn 6.5 như acid formic, acid acetic, acid tartaric và acid citric, nhưng không tan trong acid sulfuric và acid phosphoric Các muối glutamat, clorid của chitosan tan trong nước Chitosan không tan trong môi trường kiềm, môi trường trung tính Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang chitosan [38]

Tính chất tích điện dương giúp cho chitosan hoạt động như một chất bám dính sinh học, có khả năng bám vào các bề mặt tích điện âm như màng nhầy Chitosan có rất nhiều loại có khối lượng phân tử và mức độ deacetyl hóa khác nhau, đây là những yếu tố ảnh hưởng đến kích thước phân tử, sự hình thành, kết tập phân tử và ứng dụng của chitosan

1.4 Một số phương pháp đánh giá sự có mặt của chitosan trong vi nang

Sự có mặt của chitosan trên vi nang giúp vi sinh vật được bảo vệ tốt nhất trong môi trường pH dạ dày và muối mật gây nên bởi các phản ứng trao đổi ion [31] Một phức hợp không hòa tan giữa chitosan và muối mật được tạo thành, giúp hạn chế việc khuếch tán của muối mật vào bên trong, điều này sẽ bảo vệ vi sinh vật khỏi sự ảnh

hưởng của muối mật [42] Koo S và cộng sự cũng báo cáo rằng Bifidobacteria và L

casei được bao gói trong hạt alginat - chitosan có khả năng sống sót cao hơn so với

alginat mà không có chitosan [28] Các tác giả đã sử dụng nhiều phương pháp khác

nhau để đánh giá sự có mặt của chitosan trên vi nang alginat – chitosan Zanjani K

và cộng sự đã thấy rằng vi nang sau khi bao chitosan có đường kính tăng lên so với trước khi bao chitosan [27] Shu và Zhu đã đo được mật độ của chitosan trên bề mặt

vi nang [36] Một số tác giả lại sử dụng phương pháp đo phổ hồng ngoại để xác định

sự có mặt của chitosan như của Donghong Li và cộng sự,… [15] Tuy nhiên, do hạn

chế về trang thiết bị cũng như thời gian thực hiện nên nghiên cứu chỉ sử dụng 2 phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) và phương pháp đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) để xác định sự xuất hiện của chitosan trên vi nang

1.4.1 Phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)

Phổ tử ngoại và khả kiến của các chất hữu cơ gắn liền với bước chuyển electron giữa mức năng lượng electron trong phân tử khi các electron chuyển từ các obitan liên kết hoặc không liên kết lên các obitan phản liên kết có mức năng lượng cao hơn, đòi hỏi phải hấp thụ năng lượng từ bên ngoài

a Nguyên tắc

Chiếu một chùm tia sáng có bước sóng λ và cường độ I0 qua dung dịch đồng nhất

có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại I đi qua dung dịch

Nguyên tắc của phương pháp phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa

mật độ quang và nồng độ dung dịch theo định luật Lambert – Beer Ưu điểm của phương pháp quang phổ tử ngoại và khả kiến trong phân tích định lượng là có độ nhạy cao, có thể phát hiện được một lượng nhỏ chất hữu cơ hoặc ion vô cơ trong dung dịch, sai số tương đối nhỏ (chỉ 1 đến 3%)

1.4.2 Phương pháp đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR)

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹ thuật phân tích rất hiệu quả Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ điện tử…) là cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các công thức tính toán phức tạp

a Nguyên tắc

Khi các phân tử hấp thụ năng lượng từ bên ngoài có thể dẫn đến quá trình quay, dao động xung quanh vị trí cân bằng của nó Tùy theo năng lượng kích thích lớn hay nhỏ có thể xảy ra quá trình quay, dao động hay cả quay và dao động đồng thời

Để có thể hấp thụ bức xạ hồng ngoại, phân tử đó phải đáp ứng các yêu cầu sau:

 Độ dài sóng chính xác của bức xạ: một phân tử hấp thụ bức xạ hồng ngoại chỉ khi nào tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử hay các nhóm nguyên tử của phân tử) cũng là tần số của bức xạ tới

 Một phân tử chỉ hấp thụ bức xạ hồng ngoại khi sự hấp thụ đó gây nên sự biến thiên momen lưỡng cực của chúng

Mặc dù phương pháp phổ dao động là một trong những phương pháp hữu hiệu nhất để xác định các chất về định tính cũng như định lượng, được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu khoa học cũng như trong kiểm tra công nghiệp, phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định:

 Phổ hồng ngoại không cung cấp thông tin về các vị trí tương đối của các nhóm chức khác nhau trên một phân tử

 Chỉ riêng phổ hồng ngoại thì đôi khi chưa thể kết luận là chất nguyên chất hay chất hỗn hợp vì có trường hợp 2 chất có phổ hồng ngoại giống nhau

b Ứng dụng

1 Phân tích định tính

Trước khi ghi phổ hồng ngoại, nói chung ta đã có thể có nhiều thông tin về hợp chất hoặc hỗn hợp cần nghiên cứu, như trạng thái vật lý, độ tan, điểm nóng chảy

Nếu có thể thì cần biết mẫu là chất nguyên chất hay hỗn hợp Sau khi ghi phổ hồng ngoại, nếu chất nghiên cứu là hợp chất hữu cơ thì nghiên cứu vùng dao động co giãn của H trước để xác định mẫu thuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hoặc cả hai Sau đó nghiên cứu các vùng tần số nhóm để xác định có hay không có các nhóm chức

Trong nhiều trường hợp việc đọc phổ (giải phổ) và tìm các tần số đặc trưng không

đủ để nhận biết một cách toàn diện về chất nghiên cứu, nhưng có thể suy đoán được kiểu hoặc loại hợp chất

2 Phân tích định lượng

Phương pháp phổ hồng ngoại có thể được ứng dụng trong phân tích định lượng một chất trong dung dịch hay trong hỗn hợp Cơ sở của phương pháp này dựa trên phương trình định luật Lambert – Beer biểu hiện mối quan hệ giữa sự hấp thụ ánh sáng và nồng độ chất Phương pháp phân tích định lượng nhờ phổ hồng ngoại cũng

có thể thực hiện theo cách lập đường chuẩn

1.5 Một số nghiên cứu sử dụng vi nang alginat phối hợp với tinh bột và

chitosan

Vi nang calci alginat đã được biết đến, nghiên cứu và ứng dụng trong khoảng thời

gian rất dài Từ những năm đầu thập niên chín mươi của thế kỷ XX Sheu và Marshall

(1993) đã sử dụng calci alginat để cố định và bảo quản lactobacilli [35] Sang thế kỷ

XXI Chandramouli V và cộng sự (2003) đã sử dụng vi nang calci alginat để bảo vệ

và làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus khi đi qua dạ dày [13] Khosravi Zanjania và cộng sự (2014) đã nghiên cứu và đánh giá ảnh hưởng

của vi nang alginat - tinh bột - chitosan đến sự cải thiện khả năng sống sót trong môi

trường dạ dày của Lactobacillus casei và Bifidobacterium bifidum [27] Theo nghiên cứu của Maria Chavarri và cộng sự số lượng vi sinh vật Lactobacillus gasseri và

Bifidobacterium bifidum được bao gói trong vi nang alginat – chitosan có khả năng

tồn tại cao hơn việc chỉ bao gói bằng alginat [14]

Theo nghiên cứu của Đàm Thanh Xuân và cộng sự, tác giả đã sử dụng vi nang alginat-tinh bột bao chitosan để làm tăng khả năng bảo vệ của L acidophilus ATCC

4356 [8] Tác giả Đàm Thanh Xuân và cộng sự đã đánh giá vai trò của tinh bột và sữa gầy đến quá trình tạo vi nang probiotic chứa vi khuẩn L acidophilus ATCC 4356 [7] Theo nghiên cứu của Phạm Thị Phương thì khả năng bao gói vi sinh vật trong vi nang

alginat – chitosan cao gấp 50 lần so với vi nang không có chitosan và hiệu quả bảo

vệ vi sinh vật trong môi trường pH 1,2 cũng tăng lên [6] Chitosan cũng được ứng

dụng rộng rãi trong công nghệ nano Theo tác giả Đặng Thị Lệ Hằng và cộng sự, tác

giả đã sử dụng chitosan để bào chế nano chitosan-curcumin ứng dụng trong tái tạo

mô [3]

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu sử dụng

 Nguyên liệu

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Calci clorid Trung Quốc Acid acetic Trung Quốc

2.1.2 Thiết bị

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Đĩa petri, bình nón, cốc có mỏ…

2.1.3 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

 Dung dịch acid acetic 0,5%

 Dung dịch NaCl 0,9% pH 3

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành vi nang

 Ảnh hưởng của nồng độ calci clorid 1%

 Ảnh hưởng của nồng độ calci clorid 2%

2.2.2 Sơ bộ định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ hồng

ngoại (IR)

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác chitosan-alginat trên vi nang

 Khảo sát khả năng hòa tan của vi nang trong môi trường pH 3

 Khảo sát ảnh hưởng của MT pH 3 đến tương tác chitosan-alginat trên vi nang

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế vi nang

Bảng 2.3 Bảng thiết kế công thức vi nang

 Chuẩn bị dung dịch alginat 2%: Cân chính xác 2,00 gam natri alginat, phân tán đều trong 100ml nước cất Để yên 30 phút cho alginat trương nở, đem hấp tiệt trùng ở 1150C trong 20 phút cho alginat đồng nhất

 Chuẩn bị hỗn dịch alginat - tinh bột: Cân 5,00 gam tinh bột, phân tán vào 50ml dung dịch alginat 2%, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 20 phút thu được hỗn dịch alginat-tinh bột

 Chuẩn bị dung dịch calci clorid 1%, 2%: Cân chính xác 1.00 gam, 2.00 gam calci clorid vào bình nón chứa 80ml nước cất, hòa tan rồi bổ sung nước cất vừa đủ 100ml đậy nút bông

 Chuẩn bị dung dịch chitosan 0,5% trong acid acetic [27]: Cân 0,5 gam chitosan, hòa tan trong dung dịch có chứa 90ml nước cất và 0,5 ml acid acetic băng, khuấy đều cho chitosan hòa tan hoàn toàn Điều chỉnh pH trong khoảng 5,5 – 6,0 bằng dung dịch NaOH 1N Bổ sung nước đủ 100ml Cho vào bình nón đậy nút bông Hấp tiệt khuẩn ở 1150C trong 20 phút, để nguội đến nhiệt

độ phòng

 Chuẩn bị dung dịch chitosan – calci clorid [36]: Cân calci clorid, cân chitosan rồi hòa tan cả hai trong dung dịch có chứa 90ml nước cất và 0,5ml acid acetic băng sau đó tiến hành tương tự như chuẩn bị dung dịch chitosan

Tạo vi nang [22]: dùng pipet hút 5ml hỗn dịch alginat – tinh bột đã đồng nhất nhỏ

từ từ xuống dung dịch calci clorid (hoặc dung dịch hỗn hợp chitosan – calci clorid tùy từng thí nghiệm), ngâm hạt trong thời gian thích hợp

2.3.2 Phương pháp đông khô

Vi nang sau khi vớt ra được rửa sạch bằng nước cất 2 lần rồi tiến hành tiền đông

24 giờ trong tủ lạnh sâu - 700C cho tới khi vi nang đông rắn hoàn toàn

Sau khi tiền đông mẫu được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô ở nhiệt

độ - 480C, áp suất 0,200 mbar trong 24 giờ Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị Mẫu được đựng trong lọ thủy tinh kín, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt

độ 2 – 80C