Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm mesna dung dịch 100 mg ml

Đặc điểm về tác dụng dược lý Mesna tương tác hóa học với các chất chuyển hóa độc bao gồm cả acrolein của các thuốc chống ung thư ifosfamid hoặc CYP có trong nước tiểu, nên ngăn ngừa ho

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

1 ThS Đào Nguyệt Sương Huyền

2 TS Nguyễn Văn Hân

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Công nghiệp Dược- Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới ThS.Đào Nguyệt Sương Huyền và TS.Nguyễn Văn Hân – bộ môn Công nghiệp Dược, là người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Với lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn các cán bộ, thầy cô Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong cả quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, cùng các thầy cô, các cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè là những người đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong mọi mặt để tôi có kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017

Lữ Nguyễn Phúc Hưng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Mesna 2

1.1.1 Tổng quan về mesna 2

1.1.2 Nghiên cứu về phương pháp định lượng mesna nguyên liệu và chế phẩm dược dụng 5

1.1.3 Nghiên cứu về dạng bào chế mesna 8

1.2 Đại cương về thuốc tiêm 10

1.2.1 Khái niệm 10

1.2.2 Ưu điểm và hạn chế của thuốc tiêm 10

1.2.3 Một số biện pháp chống oxy hóa trong thuốc tiêm 11

1.2.4 Nghiên cứu về độ ổn định của thuốc tiêm mesna 13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.2 Chất chuẩn 16

2.1.3 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp bào chế 17

2.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của thuốc tiêm mesna 100 mg/ml 19

2.3.3 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của dung dịch mesna trong nước 22

2.3.4 Phương pháp đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm mesna 23

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 24

3.1 Thẩm định phương pháp định lượng 24

3.1.1.Độ đặc hiệu và tính tương thích của hệ thống 24

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính 25

3.1.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 26

3.1.4 Độ chính xác 26

3.1.5 Độ đúng 26

3.1.6 Ứng dụng phân tích mẫu chế phẩm Uromitexan 100 mg/ml 27

3.2 Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của dung dịch mesna trong nước 28

3.2.1 Ảnh hưởng của bước sục N2 và pH 28

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ EDTA 31

3.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện tiệt khuẩn 32

3.2.4 Ảnh hưởng của ánh sáng 32

3.3 Công thức dự kiến và quy trình bào chế 33

3.3.1 Công thức dự kiến 33

3.3.2 Quy trình bào chế 33

3.4 Theo dõi độ ổn định 34

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37

4.1 Về phương pháp định lượng mesna 37

4.2 Về xây dựng công thức thuốc tiêm mesna 100 mg/ml 39

4.3 Về xây dựng TCCS và bước đầu theo dõi độ ổn định 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BP Dược điển Anh (Bristish Pharmacopoeia)

CMQT 2-Chloro-1-methylquinolinium tetrafluoroborat

EDTA Dinatri edetat

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography)

ICH Hội nghị quốc tế về thống nhất các tiêu chuẩn kỹ thuật trong

đăng ký dược phẩm sử dụng trên người (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)

LOD Giới hạn phát hiện (limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (limit of quantitation)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopoeia)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1 Danh mục các biệt dược chứa mesna có mặt trên thị trường 4

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về phương pháp định lượng mesna trong nguyên liệu và chế phẩm dược dụng 6

Bảng 1.3 Nồng độ thường dùng của một số chất chống oxy hóa trong thuốc tiêm 12 Bảng 2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 15

Bảng 2.2 Chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 16

Bảng 2.3 Phương tiện, thiết bị dùng trong nghiên cứu 16

Bảng 3.1 Tính thích hợp của hệ thống 24

Bảng 3.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn 25

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chính xác 26

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ đúng 27

Bảng 3.5 Kết quả định lượng thuốc tiêm Uromitexan 100 mg/ml 27

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của bước sục N2 và pH đến độ ổn định của mesna trong dung dịch (khoảng pH 5-10) 28

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH (7-8) đến độ ổn định của mesna trong dung dịch 31

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ EDTA 31

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của điều kiện tiệt khuẩn 32

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của ánh sáng 33

Bảng 3.11 Công thức thuốc tiêm mesna 100 mg/ml dự kiến 33

Bảng 3.12 Kết quả theo dõi độ ổn định 34

Bảng 3.13 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của mesna 2 Hình 2.1 Sơ đồ bào chế thuốc tiêm mesna 18 Hình 3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn 25 Hình 3.2 Ảnh hưởng của bước sục N2 và pH đến độ ổn định của mesna trong dung dịch (sau hấp tiệt khuẩn ở 121°C/15 phút) 29

Hình 3.3 Ảnh hưởng của bước sục N2 và pH đến độ ổn định của mesna trong dung dịch (sau 15 ngày lão hóa cấp tốc ở 40°C) 29

Hình 3.4 Ảnh hưởng của bước sục N2 và pH đến độ ổn định của mesna trong dung dịch (sau 7 ngày bảo quản trong tủ sấy ở điều kiện 60°C) 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là bệnh phổ biến trong xã hội hiện nay với số lượng người phát hiện ngày càng tăng Trong số các biện pháp điều trị ung thư, điều trị bằng hóa chất là phương pháp phổ biến và thuận tiện cho người sử dụng Tuy nhiên, nhiều thuốc điều trị ung thư, đặc biệt là các thuốc thuộc nhóm oxazaphosphorin như CYP và ifosfamid, gây ra một trong những tác dụng không mong muốn nguy hiểm nhất là viêm bàng quang chảy máu [1] Trong những trường hợp này, cần thiết phải phối

hợp một thuốc giải độc CYP và ifosfamid như mesna

Đặc điểm cấu tạo chứa nhóm thiol trong phân tử giúp mesna kết hợp được với liên kết đôi trong phân tử acrolein do ifosfamid và cyclophosphamide chuyển hóa tạo thành, hạn chế tác dụng không mong muốn của chúng Tuy nhiên, đặc điểm này khiến mesna rất dễ bị oxy hóa, gây khó khăn trong công tác bào chế [1], [41] Trong

đó, oxy không khí là một tác nhân oxy hóa mesna rất mạnh Dạng thuốc tiêm là dạng bào chế phổ biến của mesna, có thể giúp phối hợp sử dụng với các thuốc hóa trị liệu ung thư, tuy nhiên cần nghiên cứu hạn chế tới mức thấp nhất sự phân hủy dược chất do các quá trình oxy hóa

Hiện nay, trên thị trường đã có một số chế phẩm thuốc tiêm mesna dạng dung dịch như Uromitexan, Mistabron, tuy nhiên Việt Nam hoàn toàn phải nhập khẩu mà chưa có cơ sở nào trong nước sản xuất Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi lựa chọn

đề tài: “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm mesna dung dịch 100 mg/ml” với các mục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Mesna

1.1.1 Tổng quan về mesna

1.1.1.1 Thông tin chung

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của mesna

Công thức phân tử: C2H5NaO3S2. Phân tử lượng: 164,17 đvC

Tên khoa học: natri 2-sulfanylethansulfonat [25], natri mercaptoethansulfonat [27]

2-Tên thường gọi: mesna[41]

- Tính acid: Hợp chất có chứa nhóm thiol thể hiện tính acid rất rõ rệt (đặc biệt

là trong môi trường có pH từ 10-11) vì thế trong môi trường bazơ sẽ tạo ra các anion thiolat:

RSH + OH-→ H2O +RS- Dung dịch mesna 10% trong nước có pH từ 4,5-6 [8], [41].

- Tính khử (dễ bị oxi hóa): Nhóm thiol (hoặc anion tương ứng của nó) rất dễ bị oxi hóa bởi các tác nhân peroxid, halogen, dimethylsulphoxid và các sulphoxid khác, ion kim loại hoặc oxyd kim loại, oxy không khí … trong huyết tương cũng như trong dung dịch thuốc tiêm tạo ra disulfur hữu cơ dạng R-S-S-R Ngoài ra, nó còn phản ứng với các chất oxi hóa mạnh như hypoclorid, kali permaganat tạo thành hợp chất sulfonic

- Tác dụng với kim loại nặng: Nhờ có gốc thiol tự do trong phân tử mà một số

chất có khả năng phản ứng với kim loại nặng, trong đó có đồng và chì để tạo thành liên kết giữa gốc thiol và kim loại nặng Mesna (M-SH) dễ dàng tạo thành dạng dimesna (M-S-S-M) song song với quá trình khử từ Cu2+ thành Cu+ [8]

1.1.1.4 Đặc điểm dược động học

Khi dùng một liều 800 mg mesna, thời gian bán thải của mesna và chất chuyển hóa mesna disulfur trong máu tương ứng là 0,36 giờ và 1,17 giờ Mesna có thể tích phân bố là 0,652 lít/kg và độ thanh thải huyết tương là 1,23 lít/kg/giờ Thuốc không thấm vào mô Với một liều mesna tiêm tĩnh mạch, sinh khả dụng trung bình của mesna có hoạt tính trong bàng quang là 50% Toàn bộ liều dùng có thể thải qua nước tiểu trong vòng 8 giờ sau khi tiêm[1] Tỷ lệ liên kết với protein huyết tương khoảng 70% [25].

1.1.1.5 Đặc điểm về tác dụng dược lý

Mesna tương tác hóa học với các chất chuyển hóa độc (bao gồm cả acrolein) của các thuốc chống ung thư ifosfamid hoặc CYP có trong nước tiểu, nên ngăn ngừa hoặc giảm được tỷ lệ và mức độ độc đối với bàng quang (ví dụ viêm bàng quang chảy máu, huyết niệu) do những thuốc này gây ra Ngoài ra, mesna còn làm tăng đào thải cystein, chất này có thể phản ứng hóa học với acrolein góp phần vào tác dụng bảo vệ đường tiết niệu của mesna [1]

Mesna cũng có tác dụng tiêu chất nhầy, vì vậy được dùng làm thuốc long đờm [1], [10] Cơ chế hoạt động tiêu nhầy của mesna được cho có liên quan đến sự

phá vỡ các cầu nối disulfua giữa các phân tử chất nhầy, làm giảm độ nhớt của chất nhầy, tăng khả năng tiêu đờm của thuốc [10].

Chống chỉ định: Người quá mẫn với mesna hoặc với những hợp chất thiol

khác

Thận trọng: Ðã có báo cáo về dị ứng với mesna, ở những người bệnh có rối loạn tự miễn, đa số đã sử dụng những liều mesna cao Các triệu chứng bao gồm từ quá mẫn nhẹ đến những phản ứng phản vệ toàn thân

Do chứa alcol benzylic, lọ thuốc đa liều không được dùng cho trẻ sơ sinh hoặc trẻ nhỏ, và phải được dùng một cách thận trọng cho những bệnh nhi lớn tuổi

Có thể gây dương tính giả trong xét nghiệm ceton niệu ở những người được điều trị với mesna [1].

1.1.1.7 Liều dùng, đường dùng

Nếu dùng ifosfamid hoặc CYP tiêm tĩnh mạch cả liều 1 lần, liều tiêm tĩnh mạch mesna bằng 20% liều thuốc chống ung thư (trọng lượng/trọng lượng) cho làm

3 lần cách nhau 4 giờ kể từ khi bắt đầu tiêm thuốc chống ung thư [10], [41].

Liều uống mesna bằng 40% liều thuốc chống ung thư đã dùng được cho làm 3 lần cách nhau 4 giờ bắt đầu 2 giờ trước khi tiêm thuốc chống ung thư Một cách khác, liều ban đầu mesna (20% liều thuốc chống ung thư) có thể tiêm tĩnh mạch tiếp theo là 2 liều uống (mỗi liều bằng 40% liều thuốc chống ung thư) cho vào lúc 2 và 6 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch

Nếu thuốc chống ung thư được tiêm truyền nhỏ giọt trong 24 giờ, tiêm tĩnh mạch liều mesna bằng 20% tổng liều thuốc chống ung thư, tiếp theo là truyền nhỏ giọt tĩnh mạch liều mesna bằng 100% tổng liều của thuốc chống ung thư trong 24 giờ, sau đó tiếp theo là truyền tĩnh mạch liều mesna bằng 60% tổng liều thuốc chống ung thư trong 12 giờ nữa [10], [41].

1.1.1.8 Một số chế phẩm trên thị trường hiện nay

Bảng 1.1 Danh mục các biệt dược chứa mesna có mặt trên thi trường

6 Mitexan 400mg/4ml Dung dịch

tiêm

Baxter

Một số biệt dược: Delinar, Mesnex, Mestian, Neper, Uromitexan, Mistabron,

Mitexan… Biệt dược đang được sử dụng ở Việt Nam là Uromitexan, Mistabron

1.1.2 Nghiên cứu về phương pháp định lượng mesna nguyên liệu và chế phẩm dược dụng

Đối với mesna nguyên liệu, dược điển Anh [9] , Mỹ [43] trình bày phương pháp định lượng mesna bằng phép đo iod Cách tiến hành được thực hiện như sau: Hòa tan 0,120g mesna vào trong nước, thêm 10 ml acid sulfuric 1M và 10 ml iod 0,1M Chuẩn độ với dung dịch natri thiosulfat 0,1M, thêm vào 1ml hồ tinh bột khi gần đến điểm kết thúc phản ứng 1 ml natri thiosulfat tương đương với 16,42mg

C2H5NaO2S2 Yêu cầu: hàm lượng mesna phải đạt từ 96,0%-102,0% tính theo chế

phẩm khan Các dược điển này không trình bày chuyên luận thuốc tiêm mesna Dưới đây là một số phương pháp định lượng mesna trong nguyên liệu và chế phẩm dược dụng được các tác giả xây dựng trước đây

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về phương pháp định lượng mesna trong nguyên

liệu và chế phẩm dược dụng

Phương pháp đo độ hấp thụ quang học

(DMPD) trong dung dịch acid với sự

có mặt của chất oxi hóa Fe3+ tạo thành

sản phẩm màu đỏ cam có đỉnh hấp thụ

cực đại 490 nm và ε=1,9.103

l/mol.cm

- Khoảng tuyến tính 8,2.10-3-9,0.10-2 g/L với hệ

số tương quan R2= 0,999

- Tác nhân phản ứng giữ trong tủ lạnh được vài tuần

Thực hiện phản ứng giữa mesna và

dung dịch Fe3+, tiếp đó tạo phức màu

với kali rhodanat Sản phẩm là phức

màu đỏ có độ hấp thụ cực đại ở bước

sóng 480 nm

- Khoảng tuyến tính 1-30 µg/ml với R2=0,9991

Phương pháp gián tiếp: Sử dụng natri

hypoclorid để oxi hóa mesna thành

dimesna, sau đó sử dụng hai chất chỉ

thị màu là cam methyl (phương pháp

A), đỏ công-gô (phương pháp B) tạo

phức với natri hypoclorit dư

- Phương pháp A: λmax=505

nm, khoảng tuyến tính 0,08-1,6 µg/ml với hệ số tương quan là 0,996; LOD

và LOQ lần lượt là 0,016 µg/ml và 0,048 µg/ml

- Phương pháp B:

λmax=605 nm, LOD=0,05 µg/ml, LOQ=0,15 µg/ml, khoảng tuyến tính 0,2-2 µg/ml với hệ số tương quan

là 0,998

- Đánh giá khả năng tìm lại

[30]

Thực hiện phản ứng oxy hóa mesna

bằng cerium(IV) ammoni sulphat Đo

cường độ huỳnh quang của sản phẩm

cerium(III) tạo thành với bước sóng

kích thích 259 nm, bước sóng phát xạ

359 nm

- Khoảng tuyến tính 4,0 ng/ml (R2=0,9994)

Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác 25,0 g

mesna hòa tan trong 25 ml nước cất

Tiến hành: hòa tan mẫu với 10 ml

dung dịch EDTA 3M và thêm nước

vừa đủ 100 ml 150 µl dung dịch

mesna được tiêm vào dòng chảy dung

dịch Ce(IV) 10-3M trong acid sulfuric

0,2M với tốc độ dòng 4ml/phút Sau

đó, dòng dung dịch này trộn lẫn với

- Khoảng nồng độ định lượng từ 0,29-2,21 ng (1,97–9,85mg.l-1),

- LOD: 0,21 ng với độ lệch chuẩn tương đối 4,1%

- Khả năng tìm lại dược chất nằm trong khoảng 94-

[27]

dòng quinnin 10-3 M trong acid

sulfuric 0,1M trước khi đi qua quang

phổ kế

105%

Như vậy, các phương pháp định lượng trong mesna nguyên liệu chế phẩm dược dụng chủ yếu là các phương pháp quang phổ hoặc đo cường độ huỳnh quang Đây là những phương pháp gián tiếp thuộc bản chất vật lý, hóa lý với ưu điểm giá

rẻ, đòi hỏi hóa chất phân tích và thiết bị phân tích tối thiểu [30], [35], [42], [44], tuy nhiên vì nguyên tắc phải tạo dẫn chất trung gian trước khi phân tích, do đó có nhược điểm là việc thực hiện trên một số lượng mẫu lớn gặp khó khăn, đi kèm với đó là độ lặp lại có RSD cao do phản ứng giữa các mẫu không đồng nhất, đồng thời không phát hiện được sự có mặt của tạp chất trong mẫu phân tích [34]

Một số tác giả cũng đã công bố phương pháp HPLC phân tích mesna trong các mẫu sinh học Tuy nhiên, đây đều là các phương pháp định lượng gián tiếp thông qua bước tạo dẫn chất trung gian với CMQT [15], ThioGLO3TM [23] Gần đây,

Mohamed Rizk và cộng sự (2014) đã công bố phép định lượng mesna trong nguyên liệu và chế phẩm dược dụng trên cơ sở phương pháp HPLC Đây cũng là phương pháp HPLC định lượng mesna trực tiếp đầu tiên Phương pháp này khắc phục được nhược điểm của những phương pháp định lượng gián tiếp trước đó, mặc dù yêu cầu trang thiết bị phức tạp, tuy nhiên có ưu điểm là thời gian phân tích nhanh, pha động đơn giản với nồng độ thấp, mẫu chuẩn bị đơn giản, cho độ nhạy và độ chính xác cao hơn Phương pháp này cho phép phân tích mesna với số lượng mẫu lớn, kể cả trong các mẫu có sự có mặt của các tạp phân hủy [34].

1.1.3 Nghiên cứu về dạng bào chế mesna

Hiện nay mesna được bào chế dưới các dạng bào chế: viên nén, thuốc tiêm dung dịch và đông khô Chính vì thế, nghiên cứu về bào chế mesna tập trung chính vào những dạng bào chế này

Năm 1992, Saul Bil và cộng sự đã xây dựng công thức viên nén sủi chứa hoạt chất mesna Theo công thức, với mỗi phần theo khối lượng của dược chất mesna

thêm: 0,01-1 phần tá dược dính; 0,03-0,4 phần tá dược rã; 0,01-0,2 phần tá dược trơn; 0,1 phần tá dược độn; đồng thời bổ sung 0,05-30 phần (theo khối lượng) hỗn hợp gây sủi [39] Đến năm 1993, Saubier D và cộng sự xây dựng công thức viên sủi có thành phần tương tự, tuy nhiên sử dụng alcol hoặc aceton hoặc hỗn hợp 2 dung môi này với nước [37].

Năm 2002, tác giả Rawert J và cộng sự đã bào chế viên nén bao phim, pellet hoặc bột cốm có chứa ít nhất 88% mesna; 5,6% nước Phương pháp bào chế dập thẳng hoặc trộn hạt ướt nhưng không sử dụng đến dung môi hữu cơ [33]

Dạng bào chế thuốc tiêm tương đối phổ biến hiện nay Engel J và cộng sự đã

sử dụng một số tá dược nhằm tăng độ ổn định của dung dịch mesna, bao gồm: chất bảo quản, chất chống oxy hóa và chất điều chỉnh pH [12] Tác giả đề xuất một số công thức sau:

Nước cất pha tiêm 50,0 ml Nước cất pha tiêm 50,000 ml Qua việc đánh giá ảnh hưởng của các tá dược đến thuốc tiêm tác giả đã đưa ra kết luận rằng: dung dịch thuốc tiêm cần được điều chỉnh pH khoảng 7,5-8,5 bằng natri hydroxyd để giảm thiểu tác dụng phụ khi sử dụng thuốc, tăng độ ổn định trong quá trình bảo quản [12]

Để giảm chi phí điều trị, mesna cũng được bào chế dưới dạng phối hợp với các thuốc điều trị ung thư như sau:

Dạng phối hợp của mesna với dẫn chất của oxazaphosphorin (bao gồm ifosfamid và CYP) dạng dung dịch nhằm giảm độc tố của thuốc Tác giả đã sử dụng 2-hydroxy propyl β-cyclodextrin để tăng độ ổn định của thuốc [14].

Trong một nghiên cứu khác, dạng thuốc tiêm đông khô chứa ifosfamid-mesna với tỷ lệ 1 phần khối lượng ifosfamid; 0,1-1,0 phần khối lượng của mesna và 0,1-17

phần khối lượng của hexitol Dung môi đông khô được sử dụng cũng là nước hoặc nước-methanol [38]

Ngoài ra, một công thức khác chứa ifosfamid phối hợp mesna cũng được nghiên cứu với tỷ lệ 1 phần (theo khối lượng) ure; 0,1-1 phần (theo khối lượng) của mesna ứng với mỗi phần (theo khối lượng) của ifosfamid Nước cất pha tiêm được

bổ sung vừa đủ đóng vai trò là dung môi đông khô [5]

1.2 Đại cương về thuốc tiêm

1.2.1 Khái niệm

Thuốc tiêm là những chế phẩm vô khuẩn, có thể là dung dịch, hỗn dịch, nhũ tương hoặc bột khô khi tiêm mới pha lại thành dung dịch hay hỗn dịch để tiêm vào

cơ thể theo những đường tiêm khác nhau [3].

1.2.2 Ưu điểm và hạn chế của thuốc tiêm

- Thích hợp dùng trong trường hợp bệnh nhân bất tỉnh, không tự kiểm soát bản thân, không muốn cộng tác với thầy thuốc hoặc không thể dùng theo đường uống

[29]

- Dùng thuốc theo đường tiêm giúp kiểm soát liều lượng chính xác hơn, dự đoán được mức độ và độ lặp lại của quá trình hấp thu dược chất tốt hơn so với dùng thuốc theo đường uống [3].

- Thuốc tiêm giúp thiết lập lại sự mất cân bằng về nước và chất điện giải của

cơ thể nhanh nhất, cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể trong trường hợp người bệnh không ăn được trong thời gian dài [29].

1.2.2.2 Hạn chế

- Chế phẩm thuốc tiêm yêu cầu bắt buộc phải vô khuẩn, tinh khiết, do đó khó nghiên cứu, bào chế và triển khai vào sản xuất hơn, giá thành thường cao hơn so với các dạng bào chế khác [3]

- Dùng thuốc theo đường tiêm rất khó đảo ngược tác dụng, nhất là trong trường hợp dùng thuốc quá liều [29].

- Yêu cầu người tiêm thuốc phải có trình độ chuyên môn y học cao và phải thực hiện nghiêm ngặt các yêu cầu vô khuẩn khi tiêm thuốc vì dùng thuốc theo đường tiêm luôn tồn tại nguy cơ lây nhiễm [29] Dùng thuốc theo đường tiêm tốn thời gian hơn và phải theo dõi sát tình trạng bệnh nhân trong suốt thời gian tiêm thuốc [3].

1.2.3 Một số biện pháp chống oxy hóa trong thuốc tiêm

Nhiều dược chất như morphin, vitamin C, các dược chất thuộc nhóm thiol,…, bản thân chúng là các chất khử do đó rất dễ bị oxy hóa, đặc biệt khi chúng được pha thành dung dịch dưới dạng thuốc tiêm Quá trình oxy hóa không chỉ làm giảm hàm lượng dược chất trong chế phẩm, làm giảm tác dụng điều trị mà nhiều khi còn gây

ra độc tính đối với cơ thể, nhất là đối với đường tiêm là đường đưa thuốc đã bỏ qua các hàng rào bảo vệ tự nhiên của cơ thể [3] Vì thế, đối với những dược chất dễ bị oxy hóa, cần thực hiện các biện pháp chống oxy hóa sau:

 Khi xây dựng công thức bào chế

- Dược chất và tá dược: Để đảm bảo dược chất ổn định trong các dạng bào chế, nguyên liệu sử dụng phải tinh khiết về mặt vật lý, hóa học và vi sinh vật

- Điều chỉnh pH của chế phẩm đến khoảng giá trị thích hợp mà ở đó tốc độ phản ứng oxy hóa dược chất diễn ra chậm nhất Ví dụ, dung dịch thuốc tiêm morphin bị oxy hóa chậm nhất ở pH 2-5 [29], dung dịch thuốc tiêm NAC 200 mg/ml trong nước ổn định nhất là ở khoảng pH 6,0-7,5 [4], [22].

- Sử dụng chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là những chất rất dễ bị oxy hóa và có thế oxy hóa thấp hơn so với dược chất, do đó chúng bị oxy hóa trước thay cho dược chất Các chất chống oxy hóa thường dùng là:

+ Các chất sinh SO2: các muối natri hay kali sulfit, bisulfit, metabisulfit và

dithionit là những chất chống oxy hóa thường dùng nhất trong các thuốc tiêm nước

[29].

+ Rongalit: có thể dùng để chống oxy hóa cho nhiều thuốc tiêm, tác dụng tốt ở

pH cao từ 9-11

+ Các chất khử, một số hợp chất có lưu huỳnh như cystein

Ví dụ, dung dịch thuốc tiêm cysteamin trong nước khi phối hợp thêm acid ascorbic 0,2%, hàm lượng dược chất còn lại sau 20 tuần bảo quản ở nhiệt độ phòng cao hơn 4,7% so với dung dịch không sử dụng chất chống oxy hóa [32].

- Sử dụng chất hiệp đồng chống oxy hóa: đây là những chất có tác dụng khóa vết các ion kim loại trong phản ứng oxi hóa dược chất [21] Thường dùng là muối dinatri của acid ethylen diamin tetra acetic (EDTA), một số acid như acid citric, acid tartric Ví dụ, độ ổn định của cysteamin tăng lên nếu phối hợp EDTA với nồng

độ 0,1% sau khi bảo quản 24 tuần ở cả 3 điều kiện -20oC, 4oC và 25oC [31].

Bảng 1.3 Nồng độ thường dùng của một số chất chống oxy hóa trong thuốc tiêm [29]

Chất chống oxy hóa Nồng độ (%) Chất chống oxy hóa Nồng độ (%)

Ester của acid ascobic 0,015 Natri metabisulfit 0,2

 Trong quá trình bào chế [3]

- Loại oxy hòa tan trong nước cất pha tiêm làm dung môi bằng cách đun sôi hoặc sục khí trơ như nitơ hay argon Đây là biện pháp chống oxy hóa có hiệu quả cao, giảm thiểu được nồng độ chất chống oxy hóa đưa vào [7], [13], [20].

- Pha chế đúng trình tự, pha chế trong những thiết bị kín, hạn chế tới mức thấp nhất thời gian tiếp xúc giữa dược chất và không khí Biện pháp thường thực hiện là pha chế tá dược trước khi pha chế dược chất [7], [13], [20].

- Đóng lọ, hàn ống trong dòng khí trơ nhằm thay thế không khí (có oxy) ở phần đầu lọ bằng khí trơ

- Bảo quản thuốc tránh ánh sáng bằng cách đóng thuốc vào bao bì thủy tinh có màu hoặc sử dụng bao bì thứ cấp cản ánh sáng

- Tiệt khuẩn đúng nhiệt độ và thời gian cần thiết để hạn chế tác động bất lợi của nhiệt Ví dụ, dung dịch cysteamin hydroclorid 90 mg/ml ổn định sau 1 lần hấp ở nhiệt độ 121oC/30 phút nhưng lại suy giảm nồng độ nhanh chóng sau 6 lần hấp như vậy [32]

1.2.4 Nghiên cứu về độ ổn định của thuốc tiêm mesna

Marshall P Goren và cộng sự (1991) đã pha chế dung dịch chứa mesna 100 mg/ml và EDTA 0,2 mg/ml với thể tích 10 ml được chuyển vào ống tiêm PP 20 ml

đã loại bỏ không khí, các ống tiêm được bảo quản tại 5, 24 và 35oC Ảnh hưởng của không khí (đồng thể tích) được đánh giá trong một ống tiêm khác, bảo quản ở nhiệt

độ phòng Nồng độ mesna và dimesna trong mỗi ống được xác định tại các thời điểm 0; 4; 6 và 24 h, lặp lại liên tục trong 9 ngày bằng cách thực hiện phản ứng với thuốc thử Ellman, phân tích bằng HPLC, so sánh với dung dịch chuẩn mesna 0,1 mg/ml và dung dịch chứa 0,09 mg/ml mesna và 0,01 mg/ml dimesna Nhằm đánh giá sự phân hủy của mesna, tác giả pha dung dịch mesna 0,1 mg/ml không có EDTA và xác định nồng độ mesna ở các thời điểm 0; 0,5; 4; 6; 9; 24; 48; 72h Kết quả cho thấy các mẫu chế phẩm mesna 100 mg/ml (trước pha loãng) ổn định ở mọi điều kiện bảo quản với nồng độ mesna định lượng được sau 9 ngày vẫn nằm trên mức 95%, trong khi đó mẫu với mẫu chế phẩm có không khí, chỉ sau 8 ngày, hàm lượng dược chất đã sụt giảm 10% Kết quả đối với mẫu dung dịch mesna không có mặt EDTA, dù được bảo quản ở điều kiện 5oC, nồng độ mesna giảm với tốc độ tuyến tính 18%/ngày [24].

Tiếp theo là nghiên cứu của Menard C và cộng sự (2003) về độ ổn định của mesna và cyclophosphamid (CYP) trong túi chứa dịch truyền bằng chất liệu PE Dung dịch trong dextrose 5% có nồng độ lần lượt 10,8 mg/ml CYP, mesna 3,2 mg/ml (dung dịch A) và CYP 1,8 mg/ml, mesna 0,54 mg/ml (dung dịch B) 6 túi

thuộc mỗi nồng độ được bảo quản ở 4oC và 6 túi còn lại bảo quản ở nhiệt độ thường Sử dụng phương pháp phân tích HPLC, với pha tĩnh là cột C18, pha động là hỗn hợp acetonitril và nước với tỷ lệ 30/70 về thể tích, điều chỉnh về pH 3 với HCl Chỉ tiêu đánh giá là pH và nồng độ dược chất còn lại Phép phân tích được thực hiện tại các thời điểm 1; 2; 4; 6; 12; 24; 48 và 96 giờ Kết quả thu được như sau: với dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng, pH giảm lần lượt 4,44 và 4,31 đơn vị ứng với dung dịch A và dung dịch B Với dung dịch bảo quản ở 4oC, dung dịch B

có sự sụt giảm pH đáng kể với 1,46 đơn vị Sự phân hủy CYP và mesna tuân theo

mô hình động học bậc nhất Các dung dịch bảo quản ở 4oC cho sự ổn định cao nhất với t90% đối với CYP và mesna lần lượt là 96 và 86 h với dung dịch A, 83 và 87 h đối với dung dịch B, và không có sự thay đổi về màu sắc, độ trong, cảm quan của tất cả các dung dịch [26].

Hassan Almoazen và cộng sự (2009) đã tiến hành nghiên cứu độ ổn định của mesna trong chế phẩm dịch truyền 100 mg/ml của Readymed Dung dịch mesna

100 mg/ml có chứa EDTA 0,25 mg/ml, được pha loãng với dextrose 5% đến nồng

độ 10 mg/ml Mẫu được lưu trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ kiểm soát 5oC và 25oC Các mẫu được lấy ở 0, 2, 7, 14 và 28 ngày, đưa vào trong các ống nghiệm để phản ứng với thuốc thử Ellman Mỗi mẫu phân tích gồm 50 ml dung dịch mesna, 800 ml nước, 100 ml đệm Tris 1,0M và 50 ml thuốc thử Ellman 10mM Sau thời gian phản ứng 45 phút, sản phẩm tạo thành được định lượng bằng phương pháp HPLC ở bước sóng 412 nm Kết quả chỉ ra rằng, với sự có mặt của EDTA, hàm lượng mesna duy trì trong khoảng giới hạn cho phép (90-110%) sau 28 ngày nếu bảo quản ở 5oC và

14 ngày nếu bảo quản ở 25oC Trong khi đó, nếu không phối hợp EDTA, sự phân hủy mesna tuân theo quá trình động học bậc nhất với hằng số tốc độ k= 0,023 h-1, tương ứng với thời hạn sử dụng (t90%) là 4,56 giờ [6].

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

2.1.2 Chất chuẩn

Bảng 2.2 Chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

2.1.3 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.3 Phương tiện, thiết bị dùng trong nghiên cứu

3 Máy đo pH Mettler Toledo Độ chính xác 0,01 Thụy Sĩ

4 Cân phân tích Sartorius TE214S Giới hạn đo: 22,20 g

Đức

6 Máy cất nước 2 lần Favorit

WCS8L

Công suất tối đa 4 lít/giờ Malaysia

7 Tủ vi khí hậu Contherm Global

5000

Kích thước 2435 x 1820 x

1120 mm Nhiệt độ kiểm soát -10°C

- 100°C

Australia

8 Tủ vi khí hậu Deayang TH-180S Dung tích: 18 lít

Nhiệt độ kiểm soát:

-40°C-150°C

Độ ẩm kiểm soát: 25-98%

Hàn Quốc

10 Tủ an toàn sinh học Topsafe 1.2 Kích thước trong: 1230 Italia

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng mesna trong dung dịch thuốc tiêm

2 Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của dung dịch mesna 100 mg/ml, bao gồm: pH, chất hiệp đồng chống oxy hóa, nhiệt độ, điều kiện bảo quản, sục nitơ , từ đó xây dựng công thức bào chế dung dịch mesna 100 mg/ml có thể sử dụng làm thuốc tiêm

3 Xây dựng TCCS và bước đầu theo dõi độ ổn định của dung dịch thuốc tiêm mesna 100 mg/ml

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

Các mẫu thuốc tiêm mesna 100 mg/ml được pha theo quy trình sau:

- Lọ thuốc tiêm được rửa siêu âm với hai lần với nước RO2 và hai lần với nước cất pha tiêm, sau đó sấy cho đến khô rồi sử dụng phương pháp tiệt khuẩn khô ở

240oC trong 2 giờ để đảm bảo độ vô khuẩn và loại hết chí nhiệt tố

- Pha chế dung dịch thuốc tiêm mesna (hình 2.1)

+ Mô tả

 Đun sôi nước cất, để nguội, sục khí nitơ trong 15 phút

 Cân tá dược, hòa tan trong khoảng 80% lượng nước

 Hòa tan mesna

 Điều chỉnh về pH thích hợp bằng dung dịch natri hydroxyd 1M

 Bổ sung nước cất vừa đủ thể tích

 Lọc tiệt khuẩn qua màng 0,2 µm

 Đóng dung dịch vào các lọ thủy tinh đã qua xử lý, sục khí N2 2 phút, đậy nắp cao su, xiết nắp nhôm

2.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của thuốc tiêm mesna 100 mg/ml

2.3.2.1 Phương pháp định lượng mesna trong dung dịch

Trên cơ sở tham khảo chỉ tiêu tạp chất liên quan của chuyên luận mesna nguyên liệu từ các dược điển Anh [9], Mỹ [43] và bài báo của Mohamed Rizk [34],

chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện như sau:

Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Phenomenex C18 250mm x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 10 µm

- Pha động: Cân 2,94 g KH2PO4; 2,94 g K2HPO4; 2,6 g tetrabutylamoni hidrosulfat hòa tan vào trong khoảng 600 ml nước cất 2 lần, điều chỉnh đến pH 2,3

bằng acid phosphoric Thêm 335 ml methanol, thêm nước cất 2 lần vừa đủ 1000 ml

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

- Detector UV, bước sóng phát hiện 215 nm

- Thời gian phân tích: 18 phút

Cách chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn

- Mẫu chuẩn: Cân chính xác 0,2000 gam mesna chuẩn vào bình định mức 20

ml, hòa tan trong nước cất 2 lần để thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Mẫu thử: Hút 1,00 ml dung dịch thuốc, pha loãng bằng nước cất 2 lần đến nồng độ khoảng 1 mg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký, thu được sắc ký đồ và diện tích pic tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn

Tỷ lệ hàm lượng mesna trong mẫu đem định lượng so với trên nhãn được xác định theo công thức:

Sthử, Schuẩn: diện tích pic của Mesna trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch thử tương ứng

k: hệ số pha loãng dung dịch thử HLTN: hàm lượng trên nhãn

Đây là phương pháp HPLC tương tự với phương pháp xác định giới hạn tạp chất trong mesna nguyên liệu được Dược điển Anh [8] , Mỹ [42] trình bày, tuy nhiên bước sóng phát hiện được đặt ở 215 nm thay vì 235 nm Vì đây là phương pháp định lượng mesna chưa được trình bày trong bất kỳ dược điển nào, vì thế chúng tôi tiến hành thẩm định theo hướng dẫn của ICH [17] với các chỉ tiêu như sau:

 Độ đặc hiệu:

Pha các dung dịch như sau:

- Dung dịch chuẩn mesna: Cân chính xác một lượng mesna chuẩn, hòa tan trong nước để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 1 mg/ml Lọc qua màng lọc

dịch placebo, pha loãng 100 lần Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Tiêm lần lượt các mẫu dung dịch chuẩn mesna, dung dịch thử, dung dịch chuẩn tạp chất D, dung dịch trắng vào hệ thống sắc ký với các điều kiện như trên, từ thời gian lưu và hình dạng pic trên sắc ký đồ để xác định độ đặc hiệu

 Tính thích hợp của hệ thống:

- Pha dung dịch đánh giá tính thích hợp hệ thống (dung dịch có chứa 0,18 mg/ml chất chuẩn mesna và 0,004 mg/ml chất chuẩn tạp chất C trong nước cất) Lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Tiêm dung dịch thích hợp hệ thống 6 lần qua hệ thống sắc ký, xác định thời gian lưu (tR), diện tích pic (Spic) của pic chính trong sắc ký đồ, yêu cầu RSD ≤ 2%,

độ phân giải giữa pic mesna và pic tạp chất C không dưới 3,0

 Xác định khoảng tuyến tính: Pha các mẫu mesna chuẩn trong nước với nồng

độ lần lượt từ 0,2 đến 1,8 mg/ml Phân tích theo quy trình đã được xây dựng Xác định sự tương quan giữa nồng độ mesna có trong mẫu và diện tích pic bằng phương pháp hồi quy tuyến tính

 Xác định LOD, LOQ:

- LOD được xác định bằng cách thêm chuẩn vào mẫu trắng đã được mô tả ở những phần trên tạo dung dịch dược chất với nồng độ giảm dần đến khi chiều cao pic phân tích lớn gấp khoảng 03 lần nhiễu đường nền

- LOQ được tính như sau: LOQ = 10/3.LOD

 Độ đúng: Tiến hành cân mesna chuẩn hòa tan vào dung dịch placebo nhằm đạt được các nồng độ 80, 100, 120 mg/ml, mỗi mẫu làm 3 lần Pha loãng 100 lần, tiêm mẫu vào hệ thống HPLC với các điều kiện mô tả như trên Từ kết quả diện tích pic tính nồng độ của mesna trong mỗi mẫu theo phương trình hồi quy tuyến tính được xây dựng, từ đó suy ra tỷ lệ phục hồi dược chất so với nồng độ thực thêm vào

 Ứng dụng phương pháp định lượng được xây dựng để phân tích mẫu chế phẩm thuốc tiêm Uromitexan 100 mg/ml (Nhà sản xuất: Baxter, USA, NSX: 07/2013, HSD: 07/2018) Tiêm mẫu 6 lần, xác định hàm lượng, tính RSD

2.3.2.2 Phương pháp xác định sự thay đổi pH

Sử dụng máy đo pH Mettler Toledo xác định giá trị pH của dung dịch thuốc tiêm ngay sau pha (pHo) và sau thời gian bảo quản (pH1) Sự thay đổi pH được xác

- Đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm dựa vào các tiêu chí: hình thức, hàm lượng dược chất mesna còn lại, sự thay đổi sau thời gian bảo quản

2.3.3.1 Ảnh hưởng của quá trình sục khí nitơ

So sánh độ ổn định của dung dịch mesna được bào chế theo quy trình không

có và có sục khí nitơ Từ đó xác định quy trình bào chế thích hợp

2.3.3.2 Ảnh hưởng của pH

Pha các mẫu thuốc tiêm mesna 100 mg/ml với các giá trị pH khác nhau từ

5-10 được điều chỉnh bằng dung dịch natri hydroxyd 1M Đánh giá độ ổn định của dung dịch sau thời gian bảo quản, từ đó xác định giá trị pH thích hợp

2.3.3.3 Ảnh hưởng của chất hiệp đồng chống oxy hóa

So sánh độ ổn định của dung dịch mesna có chất hiệp đồng chống oxy hóa EDTA ở các nồng độ khác nhau 0,0; 0,25; 0,5 mg/ml Từ đó xác định nồng độ chất hiệp đồng chống oxy hóa thích hợp

2.3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

So sánh độ ổn định của dung dịch thuốc tiêm mesna được bào chế theo quy trình tiệt khuẩn bằng nhiệt với thời gian khác nhau Từ đó xác định quy trình bào chế thích hợp

2.3.3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng

So sánh độ ổn định của dung dịch mesna được bảo quản ở điều kiện không và

có tránh ánh sáng khuếch tán trong phòng Từ đó xác định điều kiện bảo quản thích hợp

2.3.4 Phương pháp đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm mesna

Mẫu nghiên cứu: Thuốc tiêm được pha theo công thức đã lựa chọn sau khi khảo sát, đóng lọ thủy tinh không màu và theo dõi độ ổn định trong các điều kiện bảo quản khác nhau

Điều kiện bảo quản:

- Điều kiện thường: nhiệt độ 30±2oC, độ ẩm 75±5%

- Điều kiện lão hóa cấp tốc: nhiệt độ 40±2oC, độ ầm 75±5%

Phương pháp phân tích: đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm nghiên cứu dựa trên các tiêu chí sau:

- Hình thức: độ trong và màu sắc của dung dịch

- Hàm lượng dược chất: xác định hàm lượng dược chất trong dung dịch mới pha (coi hàm lượng ban đầu là 100%), tỷ lệ hàm lượng (%) dược chất còn lại trong mẫu nghiên cứu sau thời gian bảo quản được xác định theo công thức:

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1 Thẩm định phương pháp định lượng

3.1.1.Độ đặc hiệu và tính tương thích của hệ thống

3.1.1.1.Độ đặc hiệu

Phương pháp định lượng được tiến hành với các điều kiện được mô tả trong phần 2.3.2.1 Nhận thấy thời gian lưu pic mesna thu được từ dung dịch thử (phụ lục 2.5) và dung dịch chuẩn mesna (phụ lục 2.3) giống nhau (khoảng 5,4 phút) Sắc ký

đồ của dung dịch trắng (phụ lục 2.2) không xuất hiện pic ở thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mesna và tạp chất D (phụ lục 2.4)

Kết luận: Phương pháp định lượng được xây dựng có tính đặc hiệu với mesna