Tổng hợp một số acid hydroxamic mang hợp phần 1 (triazol 4 YL) methylindolin 2 on hướng tác dụng kháng ung thư

Trên cơ sở cấu trúc của một số chất ức chế HDAC đã được công bố trên thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hoá Dược – trường Đại Học Dược Hà Nội đã tiến hành thiết kế và tổng hợp, cũng nh

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

NCS Đỗ Thị Mai Dung PGS.TS Phan Thị Phương Dung

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khoá luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy

cô, bạn bè và một số tổ chức trong suốt quá thực hiện đề tài Cho đến nay khi khoá luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ

Đầu tiên từ tận đáy lòng mình, tôi xin phép được được gửi lời cảm ơn chân thành

và sâu sắc nhất tới GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Phan Thị Phương Dung

và NCS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội,

những người thầy đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt chặng đường khó khăn khi thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc, phòng nghiên cứu cấu trúc - Đại học Quốc gia Seoul - Hàn Quốc đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin được cảm ơn các anh chị, các bạn và các em cùng nghiên cứu tại bộ môn Hoá Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, cũng như cảm ơn tập thể lớp M1K67 đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn

đến anh Lê Văn Cường, em Nguyễn Văn Huân, em Mai Quang Hưng và bạn Nguyễn Gia Anh Tuấn là những người bạn ở bên tôi lúc vui buồn đã giúp đỡ tôi rất

nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những tình cảm và sự giúp đỡ mà người thân và bạn bè đã dành tặng cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Minh Tuấn

1.2 Tác dụng kháng tế bào ung thư của khung triazol 9 1.2.1 Các hợp chất kháng tế bào ung thư mang khung triazol đã công bố 10 1.2.2 Vai trò của vòng triazol trong thiết kế công thức các chất ức chế HDAC 131.3 Các phương pháp tổng hợp khung 1,2,3-triazol bằng phản ứng Click 14 1.3.1 Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Kolarovič 14 1.3.2 Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Steven Lal 15 1.3.3 Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Yan 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các chất vừa tổng hợp được 20

2.3.3 Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được 20

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance)

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon Nuclear Magnetic

Resonance) AsPC-1 Dòng tế bào ung thư tuyến tuỵ

CTCL U lympho T ở da

DCM Dicloromethan

DMSO Dimethyl sulfoxid

FBS Huyết thanh bào thai bò (Fetal Bovine Serum)

FDA Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug

Administration)

H Hiệu suất phản ứng

HAT Histon acetyltransferase

HDACi Histon deacetylase inhibitors

HDAC Histon deacetylase

HRMS Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectrometry)

MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MeCN Acetonitril

MeOH Methanol

PC-3 Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

SAHA Acid sulberoylanillid hydroxamic

SW620 Dòng tế bào ung thư đại tràng

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TCTH Tiêu chuẩn tổng hợp

t-BuOH tert-Butanol

THF Tetrahydrofuran

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 So sánh IC50 của các chất có vòng 1,2,3-triazol so với SAHA 13

Bảng 1.2 Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol đi từ

azid và alkyl bằng phản ứng Click, xúc tác [CuBr(PPh3)3] với một số dung môi thông dụng

15

Bảng 1.3 Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol đi từ

azid và alkyl bằng phản ứng Click, xúc tác muối đồng với một số dung môi thông dụng

Bảng 3.3 Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic 33

Bảng 3.4 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to

nc) của các chất VIa-f 34 Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-f 35 Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-f 36 Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất VIa-f 37 Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIa-f 39 Bảng 3.9 Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất VIa-f 41 Bảng 3.10 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư 42 Bảng 3.11 So sánh sự tương quan giữa năng lượng tương tác dự đoán với

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Vai trò của HAT và HDAC trong điều hoà biểu hiện của gen 2

Hình 1.8 Mô hình mô tả cấu trúc chung của hợp chất ức chế HDAC tương

ứng với cấu trúc của SAHA

6

Hình 1.11 Một số chất ức chế sốc nhiệt protein mang khung triazol 10

Hình 1.12 Cấu trúc của combretastatin A-4 và chất 1 11 Hình 1.13 Cấu trúc của một số thuốc ức chế aromatase mang khung triazol 11

Hình 3.6 Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất

VIa-f trên các dòng tế bào SW620, PC-3 và AsPC-1

53

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1 Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Kolarovič 14

Sơ đồ 1.2 Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Steven Lal 15

Sơ đồ 1.3 Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Yan 16

Sơ đồ 3.7 Cơ chế phản ứng Click tạo thành Va-f 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong 20 năm trở lại đây, các thuốc làm chết tế bào ung thư “nhắm tới phân tử đích” là một trong những hướng điều trị mà nhiều nhà khoa học hướng tới Các mục tiêu phân tử điển hình đang được nghiên cứu như: protein kinase (khóa thụ thể HER1, HER2, Bcr-Abl…), histon deaceylase (HDAC), telomerase… Trong đó enzym HDAC

là một trong những mục tiêu phân tử rất được quan tâm hiện nay Một số chất ức chế enzym HDAC rất hữu hiệu đã được sử dụng trong việc điều trị ung thư như: SAHA (Zolinza®) (tác nhân ức chế HDAC đầu tiên được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da) Không lâu sau romidepsin (Istodax®), belinostat (Beleodaq®) và panobinostat (Farydax®) cũng đã được FDA lần lượt cấp phép sử dụng trong điều trị ung thư

Trên cơ sở cấu trúc của một số chất ức chế HDAC đã được công bố trên thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hoá Dược – trường Đại Học Dược Hà Nội đã tiến hành thiết kế và tổng hợp, cũng như công bố các dãy chất với đích tác dụng là HDAC Các dẫn chất thu được cho thấy hoạt tính kháng tế bào ung thư rất tốt [2, 8, 28] Đặc biệt phải kể đến các acid hydroxamic được GS.TS Nguyễn Hải Nam và nhóm nghiên cứu thiết kế và tổng hợp mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol Chúng có tác dụng ức chế HDAC tốt hơn gấp nhiều lần so với SAHA [28] Từ các nghiên này có thể thấy rằng các hợp chất của acid hydroxamic hướng ức chế HDAC mang nhóm nhận diện bề mặt

là dị vòng thơm, sẽ cho hoạt tính in vitro rất khả quan Tiếp tục hướng nghiên cứu này

chúng tôi tiếp tục thiết kế và tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần

1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on và tiến hành đề tài “Tổng hợp một số acid hydroxamic mang hợp phần 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư” với 2 mục tiêu:

1 Tổng hợp

N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid và 5 dẫn chất

2 Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất đã tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Các hợp chất ức chế HDAC

1.1.1 Giới thiệu sơ lược về enzym HDAC

Sự điều hoà biểu hiện của gen phụ thuộc vào các enzym: kinase, methyltransferase, histon actyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) do sự tác động của chúng lên phần đuôi histon của nhiễm sắc thể (NST) [16]

Hình 1.1 Vai trò của HAT và HDAC trong điều hoà biểu hiện của gen

Histon acetyltransferase (HAT) là nhóm các enzym acetyl hoá ε-NH2 của lysin (đầu N) gây trung hoà điện tích dương trên lysin, làm giảm đi khả năng tương tác với ADN (mang điện tích âm), tạo ra cấu trúc mở chromatin Đây là enzym khởi đầu cho quá trình phiên mã và dịch mã [25] (xem hình 1.1)

Histon deacetylase (HDAC) là các enzym có chức năng đối lập với HAT Chúng gây deacetyl hoá nhóm acetyl ở đầu N của lysin trên histon, làm cho nhiễm sắc thể đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã [12] (xem hình 1.1)

Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng HDAC không chỉ liên quan đến cấu trúc của chromatin và sự biểu hiện của gen mà sự biểu hiện quá mức của HDAC còn tác động đến tiến trình ung thư, bao gồm sự hình thành của các khối u ác tính [41] Chính vì vậy

ức chế HDAC trong điều trị một số bệnh ung thư như: ung thư biểu mô thận, ung thư biểu mô vảy ở đầu và cổ, u trung biểu mô, u lympho tế bào B và T… đã đạt được hiệu quả rất tốt

Cấu trúc của HDAC

Việc xác định cấu trúc của phân tử HDAC là vô cùng quan trọng trong việc tìm hiểu

về cơ chế tác dụng và dựa trên cơ sở đó để thiết kế công thức cho các chất ức chế HDAC

Sử dụng phương pháp kết tinh và chụp tia X đã giúp tìm ra cấu trúc tinh thể của các

HDAC khác nhau, từ đó chỉ ra rằng các HDAC đều có trung tâm hoạt đồng gồm 2 phần

chính: ion Zn2+ và kênh enzym dạng túi hình ống [4]

 Ion Zn2+ là một coenzym của HDAC, được tìm thấy ở đáy của túi enzym Trong

phân tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 5 liên kết phối trí: 1 liên kết với với nguyên tử oxy

của nhóm acetyl-lysin ở đầu N của histon, có vai trò xúc tác tách loại acetyl và 4 liên

kết với các nguyên tử oxy, nitơ của các acid amin Cơ chế ức chế HDAC của các acid

hydroxamic là tạo 2 liên kết phối trí với ion Zn2+, ngăn cản ion Zn2+ hình thành liên kết

phối trí với oxy của nhóm acetyl-lysin ở đầu N của histon để thực hiện vai trò xúc tác [4]

 Kênh enzym có dạng túi hẹp hình ống, tạo ra nhiều liên kết Van der Waals với

cơ chất Túi được tạo thành từ các acid amin thân lipid: phenylalanin, tyrosin, prolin,

histidin Đáy túi có một vài phân tử nước làm nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong

phản ứng deacetyl hoá, ngoài ra còn có vai trò tham gia tạo liên kết hydro khi không có

mặt nhóm -OH của tyrosin Cấu trúc của túi vô cùng linh động có thể biến đổi sao cho

phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau Chiều rộng của túi được giới hạn bởi

2 vòng thơm được tìm thấy ở cùng một vị trí ở nhiều HDAC khác nhau Trên miệng túi

có một vài vòng xoắn protein tạo thành một cái vành nhỏ Vành nhỏ trên miệng túi sẽ

tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của chất ức chế HDAC [4]

Phân loại các HDAC

 Có 18 loại HDAC đã được xác định và được chia thành 4 nhóm [12, 13]:

Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8

Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10

Nhóm III: Sirtuin (SIRT) 1-7

Nhóm IV: HDAC11

Trong đó nhóm III là các HDAC phụ thuộc NAD+(nicotinamid adenin) còn nhóm

I, II, IV là các HDAC phụ thuộc Zn2+

1.1.2 Phân loại các chất ức chế HDAC

Từ năm 1990, khi Yoshida lần đầu tiên tìm ra tác dụng ức chế HDAC của

trichostatin A (TSA) [34], đến nay trên thế giới các nhà khoa học đã tìm ra khoảng 6

nhóm hợp chất được phân loại dựa trên cấu trúc hoá học gồm [32, 39]:

(1) Các acid hydroxamic: Trichostatin A (TSA) là acid hydroxamic đầu tiên được

tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC [9], cho đến nay TSA vẫn là một trong số rất ít chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh, nhưng do chi phí sản xuất TSA quá cao và hiệu suất tổng hợp thấp, nên các nhà khoa học lại tiếp tục tìm kiếm thay thế Hiện tại thì FDA đã phê duyệt cho 3 dẫn chất hydroxamic có tác dụng ức chế trong điều trị ung thư: SAHA (2006), belinostat (2014) và panobinostat (2015)

Hình 1.2 Một số acid hydroxamic ức chế HDAC

(2) Các aminobenzamid: Năm 1999, các dẫn chất benzamid có tác dụng ức chế HDAC in vitro và in vivo được công bố bởi Suzuki và cộng sự Trong đó có MS-275

có tác dụng ức chế HDAC1, HDAC2 và HDAC3 ở nồng độ μM MGCD0103 là benzamid thể hiện tác dụng ức chế chọn lọc trên HDAC nhóm I và IV, không có tác dụng trên HDAC nhóm II [26]

Hình 1.3 Một số aminobenzamid ức chế HDAC

(3) Các muối carboxylat mạch ngắn: các muối butyrat, phenylbutyrat, acid valproat,

là các chất ức chế HDAC tương đối yếu (có tác dụng ở nồng độ mM) [20]

Hình 1.4 Một số muối carboxylat ức chế HDAC

(4) Các peptid vòng: depsipeptid, apicidin, và peptid chứa nhóm hydroxamic

Trong đó depsipeptid đã được FDA cấp phép cho điều trị u lympho T ở da (CTCL) tháng 11 năm 2009 Depsipeptid ở dạng tiền thuốc, khi vào tế bào được chuyển hoá thành dạng chứa nhóm sulfhydryl hoạt động, có khả năng gắn Zn2+ ức chế HDAC, đặc biệt là HDAC1 và HDAC2 [11]

Hình 1.5 Cấu trúc của depsipeptid

(5) Các epoxyceton: trapoxin B, HC-toxin và acid

2-amino-8-oxo-9,10-epoxydecanoic (AOE), có khả năng hoạt động nhờ việc thay đổi vị trí hoạt động ái nhân với nhóm epoxy và hình thành liên kết hydro với nhóm ceton Việc loại trừ ceton, hay thay ceton bằng alcol, làm mất hoạt động của những phân tử này Sự phối hợp của peptid vòng và epoxyceton dẫn đến ức chế hoạt động của HDAC ở nồng độ cỡ nM [7]

Hình 1.6 Một số epoxyceton ức chế HDAC

(6) Các phân tử lai: CHAP31 và CHAP50, có cấu trúc peptid vòng gắn với

hydroxamat no mạch thẳng, có cơ chế hoạt động có thể đảo chiều và khả năng ức chế tương đối tốt, khoảng nồng độ hoạt động tối ưu trong khoảng 1-5 nM Cầu nối tối ưu nhất trong các nghiên cứu này đều có 5 nhóm methylen, giống như những mô tả trước đó của các hydroxamat khác [7]

Hình 1.7 Cấu trúc của CHAP 31

1.1.3 Cấu trúc các chất ức chế HDAC

Cấu trúc chung của một hợp chất ức chế HDAC có 3 phần chính [10] (hình 1.8):

Hình 1.8 Mô hình mô tả cấu trúc chung của hợp chất ức chế HDAC tương ứng với

cấu trúc của SAHA Phần 1: Nhóm nhận diện bề mặt (SRG) hay còn gọi là nhóm khóa hoạt động

(cap group): thường là các peptid vòng hoặc vòng thơm, có vai trò tham gia vào

quá trình nhận diện bề mặt amino acid

Phần 2: Vùng cầu nối (linker) sẽ thường sử dụng các nhóm sơ nước gồm: các

hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hay vòng, no hoặc không no có vai trò trong việc

tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym

Phần 3: Nhóm kết thúc gắn kẽm (ZBG) có thể là các acid hydroxamic, nhóm

o-aminoanilin của benzamid, các thiol… Nhóm này có vai trò gắn với kẽm tại đáy của

túi enzym

Một số nghiên cứu cho thấy các chất ức chế HDAC thuộc nhóm acid hydroxamic còn có thể có thêm nhóm liên kết (connecting unit) có nhiệm vụ kết nối nhóm nhận diện

bề mặt với vùng cầu nối sơ nước như nhóm amid ở SAHA [12]

1.1.4 Liên quan cấu trúc tác dụng

1.1.4.1 Ảnh hưởng của nhóm nhận diện bề mặt

Dựa trên cấu trúc phân tử của SAHA được Cục vệ sinh an toàn Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ (FDA) cấp phép lưu hành để điều trị ung thư, Julave và cộng sự

đã nhận định rằng: Việc có mặt nhóm phenyl ở vùng nhận diện bề mặt sẽ làm tăng hoạt tính của dẫn chất Nếu thêm một nhóm thế thân nước trên phần cầu nối gần nhóm phenyl cũng sẽ làm tăng hoạt tính nhưng nếu có mặt một nhóm thế thân nước ngay sát nhóm acid hydroxamic sẽ gây ảnh hưởng ngược lại Trong nghiên cứu cũng cho thấy, nếu thêm vào các nhóm thế có mật độ electron cao như phenyl ở vùng khoá hoạt động

sẽ làm hoạt tính tăng lên [18]

Năm 2005, Guo cùng cộng sự đã tiến hành một khảo sát về hoạt tính ức chế của dãy hợp chất indol amin đối với HDAC1 và nhận định rằng: Khi ở vùng miệng túi nhóm indol amin sẽ tạo liên kết với protein bề mặt, qua việc hình thành liên kết hydro giữa -COO- của Asp99 và nhóm -NH- amid của phối tử và của nhân indol Một số nhóm thế

ở vị trí gần vòng indol tạo ra liên kết hydro, như nhóm -NH- amid sẽ làm cải thiện hoạt tính ức chế HDAC Khi thêm vào một nhóm thế có kích thước không gian lớn vào vị trí

số 4 trên vòng indol, ví dụ như -OCH3 sẽ làm tăng cao hoạt tính hơn so với không có nhóm thế [14]

Những hợp chất không có nhóm khoá hoạt động sơ nước cho hoạt tính yếu [36]

1.1.4.2 Ảnh hưởng của vùng cầu nối

Yếu tố 1: Ảnh hưởng của chiều dài cầu nối

Vùng hoạt động của HDAC có dạng túi kỵ nước, độ dài từ 4 C đến 6 C, kích thước hẹp Ở đáy túi là ion Zn2+ vì vậy chiều dài của cầu nối đóng vai trò quan trọng trong tác dụng ức chế chọn lọc của HDACi Chiều dài phù hợp sẽ đưa nhóm khoá hoạt động đến gắn với Zn2+ và ở vị trí phù hợp để tạo liên kết với acid amin bề mặt Các chất ức

chế HDAC nếu có vùng cầu nối dài từ 4-6 C cho hoạt tính HDAC tốt hơn [15]

Năm 2009, Andrianov và cộng sự đã thiết kế và tổng hợp khoảng 40 dẫn chất amid

ngược (AH8) của SAHA (hình 1.9) [3]

Hình 1.9 Các dẫn chất amid ngược của SAHA

Trong khoảng 40 dẫn chất có những chất có hoạt tính ức chế tương tự như HDAC nhưng có những chất tác dụng còn mạnh hơn SAHA Từ kết quả nghiên cứu và kết

quả thống kê cho thấy các chất có cầu nối 5-6 C thì cho hoạt tính tốt hơn

Yếu tố 2: Ảnh hưởng của mạch thẳng và mạch vòng

Di Micco và nhóm nghiên cứu của ông đã chứng minh được trong kênh enzym của HDAC có hai nhóm phenylalanin tham gia vào quá trình acetyl hóa lysin của histon Nhóm đã nghiên cứu docking nhiều hợp chất có cầu nối mạch thẳng và cầu nối vòng thơm để xác định cấu trúc cầu nối phù hợp tạo tương tác với hai nhóm phenylalanin trong HDAC Kết quả cho thấy các HDACi có cầu nối vòng thơm cho ái lực mạnh với đích, do vòng thơm tạo liên kết π-π với hai nhóm phenylalanin [6]

- Phần A: mang đôi electron tự do, có thể tạo liên kết hydro với hydro trong nhóm

OH của tyrosin, đồng thời tạo phức chelat với ion Zn2+ Mặt khác A cũng có thể chứa hydro (để nhận điện tử từ oxy trong nhóm phenol của tyrosin, tạo liên kết hydro)

- Phần B: nối với vùng cầu nối, do đó B phải tạo ra tối thiểu 3 liên kết

- Phần C: chứa hydro linh động, hình thành liên kết hydro với His132

- Phần D: có vai trò nhường proton cho His131, hình thành liên kết tĩnh điện với His131 và tạo chelat mạnh với Zn2+

- Phần L: vùng cầu nối

Nghiên cứu của Kalyaanamoorthy chỉ ra rằng dạng acid của acid hydroxamic ức chế các HDAC1 tốt hơn so với dạng muối của acid hydroxamic (hydroxamat) vì tạo được nhiều liên kết hydro hơn [19]

1.1.4.4 Một số yếu tố khác ảnh hưởng tới hoạt tính của các HDACi

Nếu năng lượng solvat hóa của phân tử tăng lên sẽ làm cho hoạt tính ức chế HDAC giảm xuống [42]

Nhóm phân tử có tính thân dầu sẽ làm tăng khả năng ức chế, nhưng nếu kích thước phân

tử quá lớn lại làm giảm hoạt tính Phân tử quá thân dầu hoặc những phân tử chứa nhiều vòng 6 cạnh thì hoạt tính sẽ không quá cao, do có ảnh hưởng của hiệu ứng không gian Độ thân nước - thân dầu nên ở mức cân bằng để tạo ra hoạt tính ức chế HDAC6 [22]

Khi phân tử có xu hướng cầu hóa để đạt đươc trạng thái bền vững, sẽ làm thu nhỏ diện tích vùng cho dung môi thâm nhập, do các nhóm thân nước bị che khuất Phân tử

có cấu trúc càng mở thì sẽ có hoạt tính càng cao [38]

Cấu trúc gấp khúc là điều kiện tiên quyết cho tác dụng ức chế chọn lọc HDAC nhóm

2, phân tử có dạng thẳng sẽ cho tác dụng ức chế chọn lọc trên HDAC nhóm 1 [31]

1.2 Tác dụng kháng tế bào ung thư của khung triazol

Sự biến đổi cấu trúc hoá học của các loại thuốc chống ung thư hiện nay rất đa dạng, thuận tiện để tạo ra nhiều tác nhân chống ung thư mới Vòng triazol với nhiều tác dụng sinh học cũng đã được đưa vào cấu trúc hoá học của một số lượng lớn các hợp chất chống ung thư, trong đó có nhiều hợp chất đã tổng hợp cho thấy hoạt tính rất cao

1.2.1 Các hợp chất kháng tế bào ung thư mang khung triazol đã công bố

Theo các tài liệu tham khảo được, các hợp chất mang vòng triazol có thể gây độc nhiều dòng tế bào ung thư thử nghiệm theo nhiều cơ chế khác nhau như: ức chế sốc nhiệt protein (heat shock protein), ức chế sự trùng hợp vi ống (microtubule polymerization), ức chế men thơm hoá (aromatase), ức chế HDAC và một số cơ chế khác [44]

1.2.1.1 Các chất ức chế sốc nhiệt protein mang khung triazol

Sốc nhiệt protein đã được chứng minh, là một trong những đích có giá trị và hấp dẫn với các nhà khoa học trong công cuộc tìm ra các tác nhân chống ung thư, do sự đa dạng của chúng trong các tế bào khối u Kết quả cho thấy sự kết hợp với vòng triazol

sẽ làm tăng cường hoạt động kháng tế bào ung thư [44]

Một số hoạt chất dưới đây có khả năng ức chế tế bào ung thư mang khung triazol theo cơ chế ức chế sốc nhiệt protein (xem hình 1.11)

Hình 1.11 Một số chất ức chế sốc nhiệt protein mang khung triazol

1.2.1.2 Các chất ức chế trùng hợp vi ống mang khung triazol

Combretastatin A-4 là một hợp chất thuộc nhóm phenol tự nhiên có khả năng ức chế trùng hợp vi ống nhưng không thể hiện được hiệu quả trong cơ thể do độ hấp thu kém, độ hoà tan thấp và quan trọng nhất là do hiện tượng đồng phân hoá chuyển từ dạng cis sang dạng trans không có hoạt tính Do vậy trong một nghiên cứu gần đây, nhóm etylenic trong combretastatin A-4 được thay bằng vòng 1,2,3-triazol, thu được

hợp chất 1 có hoạt tính mạnh hơn hẳn so với combretastatin A-4 do làm mất khả năng

đồng phân hoá [44]

Combretastatin A-4 1

Hình 1.12 Cấu trúc của combretastatin A-4 và chất 1

1.2.1.3 Các chất ức chế men thơm hoá mang khung triazol

Các thuốc chống ung thư như letrozol, anastrozol và vorozol đều là các hợp chất mang khung triazol có khả năng ức chế aromatase được sử dụng trong điều trị ung thư lâm sàng Nghiên cứu cho thấy vai trò của vòng triazol khi liên kết với hem của aromatase là thiết yếu cho hoạt tính kháng tế bào ung thư [44]

Hình 1.13 Cấu trúc của một số thuốc ức chế aromatase mang khung triazol

1.2.1.4 Các chất ức chế HDAC mang khung triazol

Như chúng ta đã biết, acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) là một chất có vai trò quan trọng trong điều trị ung thư Việc thiết kế thêm vòng 1,2,3-triazol vào nhóm nhận diện bề mặt của SAHA có thể tạo ra các hợp chất với hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh hơn SAHA

Ví dụ, trong nghiên cứu của Zhou năm 2012, hợp chất 2a mang khung 1,2,3-triazol

đã thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tuỵ

(MiaPaca-2) trên in vitro với giá trị IC50 = 0,02 mM Hợp chất 2b cũng cho thấy khả năng ức chế

tế bào ung thư biểu mô tuyến tuỵ (HupT3) (IC50 = 0,05 mM) mạnh hơn SAHA (IC50

= 0,8 mM) 16 lần [44]

2

Hình 1.14 Cấu trúc chung của chất 2

Một ví dụ khác là nghiên cứu của Nahrwold năm 2010 đã chỉ ra sự tương đương hoạt tính sinh học giữa vòng 1,2,3-triazol với liên kết amid Để chứng minh điều này, nhóm nghiên cứu của ông đã tiến hành thay thế nhóm amid trong phân tử của

cryptophycin-52 (3a) bằng vòng 1,2,3-triazol để thu được hợp chất 3b Kết quả thu được

là hợp chất 3b có IC50 = 0,0032 μM xấp xỉ giá trị IC50 của cryptophycin-52 [27]

3

Hình 1.15 Cấu trúc chung của chất 3

Năm 2008, nghiên cứu của Chen và cộng sự cho thấy tác dụng ức chế tế bào DU-145 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt) của các dẫn chất hydroxamic mang khung 1,2,3-triazol mạnh hơn nhiều lần so với SAHA, kết quả được trình bày ở bảng 1.1 [5]

Bảng 1.1 So sánh IC50 của các chất có vòng 1,2,3-triazol so với SAHA

1.2.2 Vai trò của vòng triazol trong thiết kế công thức các chất ức chế HDAC

Theo nghiên cứu của Chen năm 2008, vòng triazol có hai vai trò chính [5]:

- Tạo điều kiện để nhóm hoạt động bề mặt liên kết mạnh hơn với đầu N ở phía

ngoài (túi enzym) tại vị trí hoạt động của HDAC2

- Đóng vai trò là nhóm đẳng cấu điện tử sinh học của amid (bio-isosteric)

Theo một nghiên cứu khác, Pirali và các cộng sự đã làm rõ vai trò của vòng triazol bằng việc thay thế nhóm amid trong công thức của SAHA bằng hợp phần này Nghiên cứu này cho thấy vòng triazol có vai trò là nhóm đẳng cấu điện tử sinh học của nhóm amid trong phân tử SAHA (vòng triazol không làm thay đổi đáng kể cấu trúc hoá học nhưng lại có thể

tăng cường được tính chất sinh học và sự bền vững hoá học) [30] Về mặt hoá học, nhóm amid dễ biến đổi và kém bền hơn so với vòng triazol Ngoài ra phản ứng tổng hợp amid khó khăn hơn phản ứng Click tổng hợp vòng triazol

Từ những kết quả nghiên cứu trên, cho thấy việc thêm khung triazol vào thiết kế công thức sẽ tạo thuận lợi hơn cho quá trình tổng hợp, tạo ra các hợp chất bền hơn về mặt vật lý và vẫn có hiệu lực ức chế HDAC tốt

1.3 Các phương pháp tổng hợp khung 1,2,3-triazol bằng phản ứng Click

1.3.1 Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Kolarovič

Kolarovič cùng cộng sự đã đưa ra quy trình tổng hợp (sơ đồ 1.1) [21]

Sơ đồ 1.1 Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Kolarovič

Nguyên liệu đầu đi từ các acid alk-2-ynoic và aryl iodid được hoà tan trong hỗn hợp dung môi DMSO/H2O, ở nhiệt độ khoảng 65oC trong vòng 24 h Phản ứng dựa trên việc nối sản phẩm decarboxyl của acid alk-2-ynoic với một azid tạo ra vòng 1,2,3-triazol nhờ xúc tác Cu(I) (được khử từ CuSO4 với natri ascorbat) Phản ứng trên đây bao gồm ba bước, không có các quá trình xử lý trung gian, sản phẩm tạo ra có độ tinh khiết và hiệu suất cao

Bước 1: Cu(I) xúc tác cho quá trình decarboxyl hoá acid alkynoic tạo ra sản phẩm

là một alkyn đầu mạch

Bước 2: Thực hiện phản ứng thế ái nhân giữa một dẫn xuất halogen với azid là NaN3 để tạo ra sản phẩm là hợp chất có dạng R2-N3.

Bước 3: Thực hiện phản ứng đóng vòng Click giữa hai sản phẩm của bước 1 và bước 2 để tạo thành khung 1,2,3-triazol

1.3.2 Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Steven Lal

Sơ đồ 1.2 Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Steven Lal

Steven Lal cùng cộng sự đã tiến hành thực hiện các thử nghiệm để tìm ra ưu nhược điểm của xúc tác [CuBr(PPh3)3] Bắt đầu đi từ azid và một alk-1-yn bằng phản ứng đóng vòng với xúc tác Cu(I) được cung cấp từ phức [CuBr(PPh3)3] Sản phẩm có độ tinh khiết cao, dễ tinh chế, phản ứng này diễn ra ngay ở nhiệt độ thường, có thể tiến hành trong nhiều loại dung môi khác nhau Kết quả thu được ở bảng 1.2 [23]

Bảng 1.2 Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol đi từ azid và

alkyl bằng phản ứng Click, xúc tác [CuBr(PPh3)3] với một số dung môi thông dụng

STT Dung môi [Cu](mol%) Thời gian (giờ) Hiệu suất

Từ bảng 1.2 cho thấy, khi sử dụng các dung môi phân cực đa phần đều cho hiệu suất cao và thời gian phản ứng rút ngắn, ngoại trừ ethanol Đáng chú ý nhất là kết quả thử nghiệm với dung môi nước, một dung môi thông dụng, không độc hại, chỉ cần tiến hành trong khoảng thời gian ngắn ( 2 h) nhưng hiệu suất rất cao (> 95%)

1.3.3 Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Yan

Sơ đồ 1.3 Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Yan

Yan và cộng sự đã tiến hành tối ưu hoá phản ứng đóng vòng 1,2,3-triazol với xúc tác được khảo sát là các loại muối đồng I và II Tất cả các phản ứng đều được thực hiện với 2,0 mmol triethylamin; 1,2 mmol diethylamin; 1,2 mmol propargyl bromid; 1,0 mmol azid

và 10% mol chất xúc tác tại nhiệt độ phòng Kết quả khảo sát thể hiện ở bảng 1.3 [43]

Bảng 1.3 Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol đi từ azid và

alkyl bằng phản ứng Click, xúc tác muối đồng với một số dung môi thông dụng

STT Xúc tác Dung môi

Thời gian (giờ)

Hiệu suất (%)

Từ kết quả nghiên cứu trên có thể thấy rằng: Xúc tác Cu(I) được sử dụng trong phản ứng đóng vòng 1,2,3-triazol có hiệu suất cao và có thể tiến hành được trong nhiều loại dung môi Khi sử dụng xúc tác Cu(II) phản ứng vẫn xảy ra nhưng hiệu suất phản ứng không cao Ngoài ra nghiên cứu còn tiến hành thử các xúc tác khác như ZnCl2, InCl3, AgCl, kim loại bạc, đồng nhưng những xúc tác này không hiệu quả hoặc phản ứng không xảy ra [43]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

Các hoá chất, dung môi, dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong đề tài

2.1.1 Hoá chất

Bảng 2.1 Bảng liệt kê danh sách các hoá chất sử dụng trong đề tài

khiết

Nguồn gốc

* Ghi chú: TCTH: Tiêu chuẩn tổng hợp

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết 50 và 100 ml, phễu thủy tinh, ống đong, cốc có mỏ các loại

- Bình chạy sắc ký lớp mỏng Camag (TLC), micro pipet Gilson các loại 1000; 200; 20; 1-10; 2-20 µl

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng

- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

- Máy cất quay chân không Buchi R-200

- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Melting point apparatus Smp3

- Máy đo hồng ngoại Cary 660 FTIR để khi phổ IR, thuộc bộ môn Hoá Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội

- Máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM để ghi phổ MS, thuộc khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

+

N-hydroxy-5-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid (VIe)

+

N-hydroxy-5-(4-((7-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid (VIf)

- Kiểm tra độ tinh khiết

- Khẳng định cấu trúc của các chất vừa tổng hợp

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các chất vừa tổng hợp được

- Thử tác dụng ức chế HDAC

- Thử độc tính trên một số tế bào ung thư: ung thư đại tràng (SW620), ung thư tuyến tụy (AsPC-1), ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PC-3)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu docking

- Sử dụng chương trình AutoDock Vina (Viện Scripps Research, CA, USA), đưa

ra dự đoán năng lượng liên kết của 6 chất với trung tâm hoạt động của HDAC2

2.3.2 Tổng hợp hoá học

2.3.2.1 Tổng hợp

- Tổng hợp 6 chất đã thiết kế dựa theo các nguyên tắc của hoá học hữu cơ và một

số phản ứng kinh điển

- Theo dõi tiến trình của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

2.3.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và xác định nhiệt độ nóng chảy

2.3.3 Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được

Sau khi tổng hợp và kết tinh lại 6 chất (VIa-f) được xác định cấu trúc bằng các

phương pháp phổ:phổ hồng ngoại IR, phổ khối lượng MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Cary 660 FTIR tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400 cm-1, phân tán

các mẫu rắn đã được sấy khô trong bột KBr với tỉ lệ 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao, hút chân không để loại bỏ hơi ẩm, ghi phổ ở độ phân giải 4cm-1

- Phổ khối lượng phân giải cao (HRMS) và phổ khối lượng phân giải thường (MS): được đo bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM, tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, dung môi methanol

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): ghi trên máy Bruker AV-500 tại

Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi DMSO-d 6 Phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz, nhiệt độ ghi phổ

khoảng 300K Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per

million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

2.3.4 Thử tác dụng sinh học

2.3.4.1 Thử tác dụng ức chế HDAC2

Khả năng ức chế HDAC2 của các chất đã tổng hợp được thử tại Khoa Dược - Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Enzym HDAC2 được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA), sử dụng bộ KIT định lượng HDAC có phát huỳnh quang (Fluoregenic HDAC Assay Kit - BPS Bioscience) Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ KIT thử nghiệm

Độ hấp thụ được đọc trên máy đo hấp thụ huỳnh quang VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) tại bước sóng kích thích 360 nm, bước sóng phát quang 450 nm Kết quả này được nhập vào phần mềm excel, sau đó tiến hành tính toán thu được phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC2 Phần trăm này chuyển sang phần mềm GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) để tính toán IC50 Độ lệch chuẩn tương đối không quá 10%

2.3.4.2 Thử độc tính tế bào

 Nguyên tắc thử

Độc tính với tế bào được thử theo các phương pháp Sulforhodamin B (SRB) [35] Dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong tế

bào, sau đó sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượng protein, từ đó suy ra số lượng tế bào Phương pháp có độ nhạy, độ tuyến tính cao, điểm kết thúc ổn định và

không yêu cầu độ chính xác về thời gian, giá thành thấp

 Quá trình thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro

Bảng 2.2 Quá trình thử độc tính tế bào

Dòng tế bào thử nghiệm Nguồn gốc Môi trường nuôi cấy

PC-3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt)

Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB)

RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò)

SW620 (tế bào ung thư đại tràng)

Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB)

RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò)

AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tuỵ)

Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB)

RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò)

 Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (mẫu trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Kết quả cuối cùng

là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50

được tính dựa theo phương pháp Probits

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu docking

Dựa trên kết quả đã công bố về tác dụng sinh học của các acid hydroxamic và khung triazol đối với enzym HDAC, chúng tôi đã kết hợp hai hợp phần này và thiết

kế ra dãy hợp chất VIa-f

Để dự đoán khả năng ức chế HDAC của dãy hợp chất này, chúng tôi sử dụng chương trình AutoDock Vina (Viện Scripps Research, CA, USA) để lắp ghép với các cấu trúc HDAC2 được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein, từ đó đưa ra dự đoán năng lượng liên kết của các chất với trung tâm hoạt động của HDAC2 Với kết quả thu được cho thấy sơ bộ hoạt tính ức chế của dãy dẫn chất với HDAC2 Kết quả được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả docking của các dẫn chất VIa-f với HDAC2

Nhận xét: Từ bảng 3.1 và hình ảnh docking của các dẫn chất chất VIa-f với HDAC2

(phụ lục 25), cho thấy gần như tất cả các chất đều có giá trị năng lượng tương tác bằng hoặc nhỏ hơn so với SAHA (trong khoảng từ -8,1 đến -7,2 kcal/mol) Sơ bộ có thể dự đoán dãy chất này hầu hết đều có ái lực với HDAC2 mạnh hơn SAHA, chỉ riêng có

hợp chất VIf có ái lực thấp hơn một chút so với SAHA Vì vậy chúng tôi tiếp tục tiến hành tổng hợp dãy chất VIa-f

Hình 3.1 Hình ảnh docking của dẫn chất VIc 3.2 Hoá học

3.2.1 Tổng hợp hoá học

Quy trình tổng hợp 6 chất VIa-f trong khoá luận được thực hiện theo sơ đồ quy

trình chung như sau:

Tác nhân và điều kiện: (1), (5): NaN 3 , MeOH

(2): Propargyl bromid, K 2 CO 3 , KI, DMF, 50°C (3), (6): Acetonitril,CuI, 50°C

(4), (7): Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, MeOH-H 2 O,-5°C

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung

3.2.1.1 Tổng hợp nguyên liệu methyl 4-azidobutanoat (II 1 ) và methyl 5-azido

pentanoat (II 2 )

 Tổng hợp nguyên liệu methyl 4-azidobutanoat (II1)

Chất II 1 được tổng hợp từ methyl 4-bromobutanoat với NaN3 theo sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II1

 Tiến hành phản ứng:

- Hoà tan 0,36 g methyl 4-bromobutanoat (I 1) (2,0 mmol) và 0,26 g NaN3

(4,0 mmol) trong MeOH

- Khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12 h

 Xử lý phản ứng:

- Cất quay chân không ở 40°C để loại dung môi

- Phân tán chất rắn thu được vào 40 ml dung môi DCM, phần sản phẩm tan vào trong DCM, còn phần không tan là NaN3 và NaBr.

- Lọc loại NaN3 và NaBr

- Lấy phần dịch DCM, cất quay chân không ở 50°C loại dung môi, thu được sản phẩm dạng lỏng có màu vàng, đem cân, tính hiệu suất

- Bảo quản sản phẩm trong ngăn mát tủ lạnh ở 0-5°C, đậy nút kín

 Kết quả:

- Cảm quan: chất lỏng, màu vàng nhạt

- Hiệu suất: 85,3%

 Tổng hợp nguyên liệu methyl 5-azido pentanoat (II 2 )

Quy trình tổng hợp chất II 2 từ 0,39 g (2,0 mmol) chất 5-bromopentanoat (I 2) được

thực hiện tương tự như dẫn chất II 1 Kết quả thu được như sau:

- Cảm quan: chất lỏng, màu vàng nhạt

- Hiệu suất: 84,4%

 Khảo sát thời phản ứng tạo II 1

Theo nghiên cứu của Ju năm 2006, phản ứng được thực hiện trong dung môi là

nước [17], tuy nhiên thực tế nguyên liệu đầu là chất I 1 lại không đồng tan được với nước nên chúng tôi đã sử dụng MeOH để làm dung môi Thời gian phản ứng được

chúng tôi sơ bộ khảo sát và thấy hiệu suất tối ưu khi thực hiện ở thời gian 12 giờ Sau đây là bảng khảo sát

Bảng 3.2 Khảo sát thời gian phản ứng tạo II 1

STT Tỉ lệ mol I 1 : NaN 3

Nhiệt độ (oC)

Thời gian (giờ)

Hiệu suất (%)

Chất IVa được tổng hợp từ isatin (IIIa) qua phản ứng N-alkyl hóa với propargyl

bromid sử dụng xúc tác là K2CO3 và KI theo sơ đồ 3.3:

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất IVa

 Tiến hành phản ứng:

- Hòa tan 0,29 g (2,0 mmol) isatin vào 1,5 ml DMF khan trong bình cầu đáy tròn

dung tích 50 ml Thêm 0,28 g (2,0 mmol) K2CO3 Khuấy ở 50°C trong vòng 1 h

- Thêm 0,33 g (2,0 mmol) KI và 0,29 g (2,4 mmol) propargyl bromid vào bình

phản ứng Tiếp tục tiến hành phản ứng ở 50°C trong vòng 3 h

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 100:1

 Xử lý phản ứng:

- Để nguội bình phản ứng Trung tính hóa hỗn hợp phản ứng bằng HCl 5% lạnh

- Thêm vào 40 ml nước cất lạnh để tạo tủa Ổn định tủa trong tủ lạnh khoảng 1h

- Lọc thu tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60°C

Quy trình tổng hợp chất IVb từ 0,36 g (2,0 mmol) chất 5-cloroisatin (IIIb) được

thực hiện tương tự như tổng hợp dẫn chất IVa Kết quả thu được như sau:

- Cảm quan: chất rắn, màu da cam

- Hiệu suất: 95,7% (0,42 g)

- t°nc = 155,7-156,1°C

- Rf = 0,65 (DCM:MeOH = 100:1)

 Tổng hợp chất 5-methyl-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVc)

Quy trình tổng hợp chất IVc từ 0,32 g (2,0 mmol) chất 5-methylisatin (IIIc) được

thực hiện tương tự như tổng hợp dẫn chất IVa Kết quả thu được như sau:

Quy trình tổng hợp chất IVd từ 0,36 g (2,0 mmol) chất 7-cloroisatin (IIId) được

thực hiện tương tự như tổng hợp dẫn chất IVa Kết quả thu được như sau:

- Cảm quan: chất rắn, màu vàng cam

- Hiệu suất: 93,6% (0,41 g)

- t°nc = 149,4-150,8°C

- Rf = 0,68 (DCM:MeOH = 100:1)

3.2.1.3 Tổng hợp các chất Va-f

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM và DCM:MeOH = 9:1

 Xử lý phản ứng:

- Cất quay chân không ở 70°C loại dung môi

- Phân tán cắn vào 30 ml DCM, gia nhiệt ở nhiệt độ 40°C để hòa tan hết chất Va

và nguyên liệu II 1, còn CuI không tan lắng ở đáy bình, lọc loại CuI, làm khan dịch lọc bằng Na2SO4 khan

- Cất quay loại dung môi thu được cắn gồm hỗn hợp 2 chất Va và II 1

- Hòa tan cắn vào lượng MeCN tối thiểu, thêm từ từ nước cất vào sẽ thấy xuất hiện tủa nhỏ, thêm tiếp tục nước đến khi thấy tủa không tăng thì dừng Gạn, lọc thu

tủa, rửa tủa với nhiều lần nước cất để loại II 1

- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60°C

Chất Vb được tổng hợp từ 0,22 g (1,0 mmol) chất IVb Quy trình tổng hợp được thực hiện tương tự như tổng hợp dẫn chất Va Kết quả thu được như sau:

- Cảm quan: chất rắn, màu vàng cam

Chất Ve được tổng hợp từ 0,20 g (1,0 mmol) chất IVc và 0,19 g (1,2 mmol) chất

II 2 Quy trình tổng hợp được thực hiện tương tự như tổng hợp dẫn chất Va Kết quả

thu được như sau:

- Cảm quan: chất rắn, màu vàng cam

- Hiệu suất: 87,4% (0,31 g)

Chất Vf được tổng hợp từ 0,22 g (1,0 mmol) chất IVd và 0,19 g (1,2mmol) chất

II 2 Quy trình tổng hợp được thực hiện tương tự như tổng hợp dẫn chất Va Kết quả

thu được như sau:

- Cảm quan: chất rắn, màu vàng cam

Chất VIa được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic giữa chất Va và

hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ 3.5:

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất VIa

 Tiến hành phản ứng:

- Phân tán 0,16 g (0,5 mmol) chất Va và 0,35 g (5,0 mmol) NH2OH.HCl vào 4,0

ml MeOH trong bình cầu sạch dung tích 50 ml

- Khuấy hỗn hợp trong bình đồng thời làm lạnh bình phản ứng về -5°C bằng hỗn hợp đá muối

- Pha dung dịch NaOH bão hòa, rồi làm lạnh Sau đó thêm từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng đến pH = 12

- Tiến hành phản ứng trong 30 phút ở -5°C

- Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử FeCl3 5% và TLC, thực hiện như sau: + Lấy khoảng 0,1 ml dịch từ bình phản ứng cho vào khay sứ, acid hóa bằng dung dịch HCl 5% Nhỏ 1 giọt thuốc thử FeCl3 5% vào hỗn hợp trên, nếu xuất hiện màu tím chứng tỏ sản phẩm đã có acid hydroxamic

+ Lấy khoảng 0,1 ml dịch từ bình phản ứng cho vào vial, acid hóa bằng dung dịch HCl loãng 5%, thêm ethyl acetat để chiết lấy sản phẩm Tiến hành TLC với pha động

DCM:MeOH = 9:1 Khi thấy vết ester Va đã mất đi hoàn toàn thì dừng phản ứng

 Xử lý phản ứng:

- Acid hóa hỗn hợp trong bình phản ứng đến pH = 6 bằng HCl lạnh 5%

- Thêm vào 20 ml nước cất lạnh Lọc thu tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60°C

 Tinh chế sản phẩm:

Kết tinh lại bằng hệ MeOH-H2O: Hòa tan sản phẩm thu được trong lượng MeOH tối thiểu Nhỏ từ từ nước cất vào cho đến khi bắt đầu xuất hiện tủa mịn và ổn định Để lạnh ở 0-5°C trong 48 h Lọc thu tủa, sấy ở 60°C

 Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn, màu vàng

- Hiệu suất: 54,0% (0,10 g)

- t°nc và Rf của chất VIa được trình bày trong bảng 3.4

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong mục 3.2.3