Nghiên cứu ảnh hưởng của cap toàn phần và một số chất phân lập từ thân cây chuối tiêu lên sự phosphoryl hóa AMPK và IRS 1 in vitro

khoa học về tác dụng và cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu trong điều trị ĐTĐ, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của cao toàn phần và một số chất phân lập từ thân C

IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành cùng sự tri ân sâu sắc tới toàn thể thầy cô giáo và các anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn Hóa Sinh và Dược Lí – Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS

Phùng Thanh Hương - người thầy tâm huyết đã tận tình giúp đỡ em từ những ngày

đầu làm khoa học Nhờ những định hướng sáng suốt và kịp thời của cô mà bản thân

em đã lựa chọn được những hướng nghiên cứu đúng đắn và phù hợp Không những vậy, cô luôn theo sát em trong suốt quá trình làm khoa học và kịp thời đưa ra những lời khuyên, lời động viên bổ ích Bài học cô dạy cho em không chỉ là kiến thức chuyên môn, mà hơn cả đó còn là những bài học về kĩ năng sống Từ những bài học

vỡ lòng quý giá này, bản thân em đã trưởng thành và tự tin hơn trong con đường làm nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Đỗ Thị Nguyệt Quế - người thầy

thứ hai trong quá trình làm khoa học của em Được làm việc cùng cô là một sự may mắn vô cùng lớn Cô không những đã hỗ trợ và chỉ dạy hết mình cho em những phương pháp, kĩ thuật trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, mà bên cạnh

đó, cô còn không ngừng trau dồi thêm cho em những kiến thức và kĩ thuật khoa học mới, từ đó làm giàu thêm kinh nghiệm nghiên cứu cho bản thân em Từ cô, em đã học được rất nhiều bài học bổ ích về sự sáng tạo và niềm đam mê với khoa học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô NCS Ths Nguyễn Thị Đông đã

luôn nhiệt tình hỗ trợ em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn động viên và giúp đỡ em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 AMPK 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Cấu trúc 3

1.1.3 Vai trò của protein AMPK trong tế bào 5

1.1.4 Vai trò của protein AMPK trong điều trị đái tháo đường 7

1.1.5 Các nghiên cứu về tác dụng hoạt hóa protein AMPK 8

1.2 IRS-1 10

1.2.1 Khái niệm 10

1.2.2 Cấu trúc 10

1.2.3 Vai trò của protein IRS-1 trong tế bào 11

1.2.4 Vai trò của sự phosphoryl hóa IRS-1 trong điều trị đái tháo đường 14

1.2.5 Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa Ser307 trên IRS-1 15

1.3 Cây chuối tiêu (Musa paradisiaca L - Musaceae) 16

1.3.1 Vị trí, phân loại 16

1.3.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 16

1.3.3 Bộ phận dùng 17

1.3.4 Các nghiên cứu về tác dụng gây hạ glucose máu của thân cây Chuối tiêu 18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Tế bào thí nghiệm 19

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất nghiên cứu 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên sự phosphoryl hóa AMPK và IRS-1 22

2.3.2 Phương pháp xử lí số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 28

3.1 Ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa AMPKα (Thr172) của cao toàn phần và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây Chuối tiêu 28

3.1.1 Ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa AMPKα (Thr172) của cao toàn phần 28

3.1.2 Ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa AMPKα (Thr172) của hai chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu 29

3.2 Ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa IRS1 (Ser307) của cao toàn phần và hai chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu 31

3.2.1 Ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa IRS1 (Ser307) của cao toàn phần 31

3.2.2 Tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa IRS1(Ser307) của hai chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu 33

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 35

4.1 Về phương pháp nghiên cứu 35

4.2 Về ảnh hưởng của các mẫu thử trên sự phosphoryl hóa AMPK 35

4.3 Về ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa IRS1 37

KẾT LUẬN 40

KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ACC Acetyl-CoA carboxylase 1

ACC1/ACC2 Acetyl-CoA carboxylase 1/2

ADP Adenosine diphosphat

AICAR 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside

AIS Auto-inhibitory sequence

Akt/PKB Protein kinase B

AMPK 5'-adenosine monophosphate-activated protein kinase AS160 AKT substrate of 160 kDa

ATP Adenosine triphosphat

BAD Bcl-2-associated death promoter

CaMK-Kβ Calmodulin-dependent protein kinase kinase β

CBD Carbohydrate-binding module

CPT1 Carnitine–acylcarnitine translocase 1

eNOS Endothelial nitrogen oxyd synthetase

ERK Extracellular signal-regulated kinase

FA Fatty acid (acid béo)

GBD Glycogen-binding domain

GLUT4 Glucose transporter 4

Grb-2/Sos Growth factor receptor-bound protein 2/son of sevenless GSK3 Glycogen synthase kinase 3

HDAC Histone deacetylase

HMG-CoA reductase 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase

IGF-1 Insulin-like growth factor-1

MCD Malonyl-CoA decarboxylase

mtGPAT Mitochondrial sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase mTOR Mammalian target of rapamycin

Nck Non-catalytic region of tyrosine kinase

PGC-1α Peroxisome proliferator-activated receptor gamma

DANH MỤC CÁC BẢNG

3 Bảng 2.3 Lựa chọn kháng thể theo protein đích cần nhận biết Trang 26

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang 22

8 Hình 3.1 Tác dụng của cao toàn phần ở các nồng độ khác nhau

trên lượng AMPK phosphoryl hóa ở Thr172 Trang 28

9 Hình 3.2 So sánh lượng p-AMPKα(Thr172) giữa các lô ủ cao

toàn phần ở các nồng độ khác nhau Trang 29

10 Hình 3.3 Tác dụng của Cycloeucalenon (H1) và Daucosterol

(H2) trên lượng AMPK phosphoryl hóa ở Thr172 Trang 30

11 Hình 3.4

So sánh lượng p-AMPKα(Thr172) giữa các lô ủ Cycloeucalenon (H1) và Daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau

Trang 31

12 Hình 3.5 Tác dụng của cao toàn phần ở các nồng độ khác nhau

trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307 Trang 32

13 Hình 3.6 So sánh lượng p-IRS-1(Ser307) giữa các lô ủ cao

toàn phần ở các nồng độ khác nhau Trang 32

14 Hình 3.7

Ảnh hưởng của Cycloeucalenon (H1) và Daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307

Trang 33

15 Hình 3.8

So sánh lượng p-IRS-1(Ser307) giữa các lô ủ Cycloeucalenon (H1) và Daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau

Trang 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) đang thực sự là mối lo ngại lớn đối với xã hội bởi tốc

độ gia tăng chóng mặt hiện nay Theo thống kê mới nhất của Hiệp hội Đái tháo đường Quốc tế (IDF), năm 2015, cả thế giới có 415 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, theo ước tính, con số này sẽ tăng lên thành 642 triệu người vào năm 2040 Tại thời điểm năm 2015, cứ 10 người lớn lại có một người bị ĐTĐ Cứ 6 giây lại có một người tử vong vì ĐTĐ và tổng cộng, căn bệnh này đã cướp đi mạng sống của 5 triệu người trong vòng một năm Cùng với những hậu quả nghiêm trọng, ĐTĐ đang trở thành một gánh nặng lớn cho ngành Y tế với chi phí điều trị trực tiếp mỗi năm cho bệnh nhân lên đến 673 tỉ đô la, chiếm 9-16% ngân sách chăm sóc sức khỏe của thế giới [26] Mặt khác, các thuốc điều trị ĐTĐ có nguồn gốc tổng hợp hóa học hiện nay thường kèm theo nhiều tác dụng không mong muốn, người bệnh có xu hướng phải tăng liều sau một thời gian dài dùng thuốc [1] Nhằm khắc phục những điểm bất cập này, xu hướng “Tìm về thiên nhiên” với việc tìm kiếm và nghiên cứu các thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm của Y-Dược học hiện đại

Cây chuối tiêu (Musa paradisiaca L.) được biết đến rộng rãi như một loại thực

phẩm và cũng là một vị thuốc Theo kinh nghiệm dân gian của đồng bào dân tộc thiểu số phía bắc Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới, dịch ép thân cây chuối tiêu dùng điều trị ĐTĐ có tác dụng hạ glucose máu rất tốt Trên thế giới có một vài nghiên cứu về tác dụng chữa ĐTĐ của thân cây chuối tiêu nhưng chỉ mới ở mức độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất, đặc biệt, chưa có một nghiên cứu có hệ thống nào đánh giá được tác dụng và cơ chế tác dụng hạ glucose máu của dược liệu này [48] [53] [56] Tại Việt Nam, năm 2015, Phùng Thanh Hương và Nguyễn Thị Đông đã chứng minh được dịch ép thân cây Chuối tiêu có tác dụng hạ glucose máu trên chuột nhắt trắng bị gây ĐTĐ thực nghiệm bởi STZ với mức liều 150mg/kg cân nặng [4] Năm 2016, Phùng Thanh Hương cùng các cộng sự đã chứng minh được tác dụng hạ glucose huyết của dịch ép thân cây chuối tiêu thông qua cơ chế ức chế

hoạt tính PTP1B in vitro [3] Để góp phần làm phong phú thêm những bằng chứng

khoa học về tác dụng và cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu trong điều trị ĐTĐ,

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của cao toàn phần và một số

chất phân lập từ thân Chuối tiêu lên sự phosphoryl hóa AMPK và IRS-1 in vitro” với 2 mục tiêu sau:

Đánh giá khả năng tăng phosphoryl hóa tiểu đơn vị α của AMPK (vị trí

Thr-172) in vitro của cao toàn phần và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây

Chuối tiêu

Đánh giá khả năng ức chế sự phosphoryl hóa IRS-1 (vị trí Ser-307) in vitro

của cao toàn phần và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây Chuối tiêu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 AMPK

1.1.1 Khái niệm

AMPK (EC 2.7.11.3) là tên viết tắt của 5'-adenosine monophosphate-activated protein kinase hay 5'-AMP-activated protein kinase Đây là một họ enzym mang hoạt tính serin/threonin kinase được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 với vai trò

là chất điều hòa âm tính của Acetyl-CoA carboxylase (ACC) và methyl-glutaryl (HMG)-CoA reductase Sau đó, vào năm 1989, ý nghĩa của tên gọi AMPK đã được làm sáng tỏ khi nucleotid AMP - chất điều hòa dương tính của enzym này được khám phá [47]

3-hydroxy-3-AMPK là một trong các enzym giữ vai trò trung tâm trong điều hòa sự phát triển và chuyển hóa của tế bào nhân chuẩn thông qua điều hòa quá trình tổng hợp và tiêu thụ ATP [68] Hoạt tính kinase của enzym này được hoạt hóa bởi tình trạng stress năng lượng (ví dụ, sự giảm tỉ số ATP/AMP hoặc ATP/ADP), từ đó cho phép AMPK điều hòa lên các con đường tạo ATP và ức chế các hoạt động tiêu thụ năng lượng thông qua phosphoryl hóa các phân tử đích khác nhau [48]

1.1.2 Cấu trúc

AMPK thường tồn tại trong tế bào dưới dạng phức hợp gồm 3 tiểu đơn vị: α, β

và γ Ở người, mỗi tiểu đơn vị α và β có 2 isoform (α1, α2 và β1, β2), trong khi đó, tiểu đơn vị γ gồm 3 isoform (γ1, γ2, γ3) Mỗi isoform được mã hóa bởi các gen khác nhau, có 12 cách kết hợp khác nhau giữa các isoform này để cấu trúc nên phân

tử AMPK 12 đồng phân AMPK này sẽ biểu hiện đặc hiệu tùy từng mô và tùy tác nhân hoạt hóa [47]

Đầu N-tận của tiểu đơn vị xúc tác α gần như giống nhau giữa các loài khác nhau, chứa một vùng serin/threonin kinase và nối tiếp ngay sau là một vùng ức chế

tự động (AIS-auto-inhibitory sequence) Đầu C-tận của tiểu đơn vị chứa vùng tương tác với tiểu đơn vị β (β-SID - subunit interacting domain) Tiểu đơn vị β gồm 2 vùng chức năng đặc hiệu Vùng trung tâm là vùng gắn glycogen (GBD - glycogen-binding domain) hay vùng gắn carbohydrat (CBM - carbohydrate-binding module),

chức năng của vùng này hiện nay còn chưa được làm rõ, mặc dù có nghiên cứu cho rằng đây là vùng hỗ trợ AMPK gắn với các đích điều hòa âm tính nằm trên phân tử glycogen Vùng chức năng đặc hiệu thứ 2 của tiểu đơn vị β nằm ở đầu C-tận được gọi là vùng ASC/SBS, đây là vị trí tương tác với tiểu đơn vị α hoặc γ của AMPK ở động vật có vú Tiểu đơn vị γ bao gồm 4 vùng điều hòa dị lập thể bởi AMP/ATP: CBS1, CBS2, CBS3 và CBS4 AMP và ATP hoạt động tương ứng như là các chất hoạt hóa và ức chế AMPK ở động vật có vú bằng cách gắn vào một trong 2 vùng CBS1 và CBS3 Trong khi đó, AMP gắn vĩnh viễn và không thay đổi ở vùng CBS4, chưa xác định được liệu có adenylat nucleotid nào gắn vào vùng CBS2 hay không

Dữ liệu từ các nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng: ADP - phân tử trước đây bị cho rằng không khả năng hoạt hóa AMPK - có khả năng gắn với vùng CBS3, bảo vệ enzym khỏi sự bất hoạt bởi phản ứng khử phosphoryl, mặc dù khả năng này không liên quan tới sự hoạt hóa dị lập thể [47] [48]

Hoạt động của AMPK được điều hòa bởi các adenin nucleotid (điều hòa dị lập thể), sự phosphoryl hóa, sự myristoyl hóa, sự gắn kết của các yếu tố điều hòa khác nhau Trong các điều kiện sinh lí, sự kiện xảy ra đầu tiên khi hoạt hóa AMPK của động vật có vú là sự thay đổi ái lực gắn của AMP/ADP/ATP với vùng CBS của tiểu đơn vị γ [47] Hoạt động của AMPK được tăng cường khi phosphoryl hóa vùng mang hoạt tính kinase ở tiểu đơn vị α bởi các kinase điều hòa dương tính, bao gồm LKB1 và CaMK-Kβ AMP gắn vào tiểu đơn vị γ sẽ làm gia tăng sự phosphoryl hóa vòng hoạt hóa do kích thích sự tương tác vật lí của LKB1 và AMPK với protein Axin và do giảm khả năng tiếp cận của vòng hoạt hóa với các phosphatase Hơn nữa, AMP liên kết với tiểu đơn vị γ cũng hoạt hóa trực tiếp hoạt tính kinase của AMPK Trong khi đó, ADP dường như lại thể hiện khả năng bảo vệ kém vòng hoạt hóa trước sự khử phosphoryl và được cho rằng có ảnh hưởng tới sự phosphoryl hóa thông qua các kinase điều hòa dương tính Ngược lại, ATP chống lại và làm giảm hoạt tính kích thích AMPK của AMP bằng cách cạnh tranh với AMP trong việc gắn vào các vùng điều hòa trên tiểu đơn vị γ: CBS-1, CBS-3, CBS-4 [48]

Hình 1.1 Cấu trúc của protein AMPK [30]

1.1.3 Vai trò của protein AMPK trong tế bào

Hình 1.2 Con đường truyền tín hiệu của AMPK [30]

TSC1/TSC2: tuberous sclerosis complex 1 and 2; mTOR: mammalian target of rapamycin; mtGPAT: mitochondrial sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase; ACC1/2: acetyl-CoA carboxylase-1/2; FA: fatty acids; TBC1D1: (Tre-2/USP6, BUB2, Cdc16) Domain Family, Member 1; AS160: AKT substrate of 160 kDa; PGC-1a: peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 a; HDAC: histone deacetylase; SIRT1: sirtuin

AMPK được hoạt hóa trực tiếp hoặc gián tiếp bởi một số hoạt chất như AICAR, salicylat, các biguanid và các hoạt chất chiết xuất từ thực vật (berberin, resveratrol, quercetin, EGCG) Nhìn chung, AMPK ức chế các con đường đồng hóa tiêu thụ ATP (tổng hợp protein, tổng hợp lipid, tổng hợp glycogen và glucose) và hoạt hóa các quá trình làm gia tăng lượng ATP (sự dung nạp glucose, đường phân, oxy hóa acid béo sự hình thành ty thể mới)

a) Điều hòa sự dung nạp và chuyển hóa glucose

AMPK là một chất điều biến quá trình dị hóa quan trọng thông qua việc tăng cường dung nạp glucose khi co cơ để sản sinh ra ATP, nhưng đồng thời nó cũng bị kích thích bởi insulin trong các mô cơ ở trạng thái nghỉ để thực hiện quá trình đồng hóa tổng hợp nên glycogen Trong cả 2 trường hợp, tăng cường dung nạp glucose đều đồng nghĩa với sự di chuyển của GLUT4 từ các bọc dự trữ trong nội bào ra màng bào tương Sự tăng cường dung nạp glucose do hoạt động thể lực hoặc sự co

cơ độc lập với con đường truyền tin của insulin, từ đó tạo cơ sở khoa học cho việc

sử dụng liệu pháp điều trị bằng AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside)

để kích thích sự dung nạp glucose thông qua một con đường độc lập với phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) để gián tiếp làm giảm sự kháng insulin [30] [38]

b) Điều hòa sự tạo thành ty thể mới

Sự khiếm khuyết đồng thời AMPKβ1/AMPKβ2 dẫn đến hiện tượng suy giảm các thành phần trong ty thể của tế bào cơ và cơ chất PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha) của AMPK ở chuột nhắt, đồng thời tăng cường hoạt động của một số yếu tố dịch mã có tác dụng trên các gen

mã hóa ty thể, từ đó gợi ý vai trò của AMPK trong việc điều hòa sự tăng sinh của ty thể AMPK có thể phosphoryl hóa và hoạt hóa PGC-1α là một chất có khả năng làm tăng cường sự dịch mã của chính nó, hoặc tham gia vào quá trình hình thành các ty thể mới thông qua hoạt động deacetyl PGC-1α phụ thuộc sirtuin (SIRT1) trong quá trình điều hòa dịch mã các gen thoái hóa ty thể và lipid [30]

c) Điều hòa chuyển hóa lipid

Khi đói, sự điều hòa chuyển hóa lipid và carbohydrat được kiểm soát đồng thời bởi AMPK ở giai đoạn trong và sau dịch mã Để đáp ứng lại với các tác nhân kích thích sinh lí được tạo ra trong quá trình chuyển hóa ở các mô, mô mỡ giải phóng ra các acid béo tự do (FA) và hoạt hóa quá trình chuyển hóa carbohydrate AMPK hoạt động ở các mức độ khác nhau AMPK điều hòa sự dịch mã FAT/CD36 làm gia tăng mức độ biểu hiện protein ở chuột nhắt thiếu hụt AMPKγ3 Khi các acid béo đi qua màng tế bào, chúng có thể được oxy hóa trực tiếp hoặc được lưu trữ AMPK phosphoryl hóa (Ser79) và bất hoạt ACC1 và HMG-CoA reductase dẫn đến

ức chế sự tổng hợp tương ứng các acid béo và cholesterol Sự phosphoryl hóa ACC2 bởi AMPK tại vị trí Ser221 làm gia tăng sự oxy hóa các acid béo ACC điều hòa nồng độ malonyl-CoA- cơ chất chủ chốt cho sự tổng hợp và đồng thời là chất

ức chế sự oxy hóa các acid béo của tế bào [30] AMPK cũng có thể làm gia tăng hoạt động của malonyl-CoA decarboxylase (MCD) Sự khử malonyl-CoA cũng giảm ức chế carnitine–acylcarnitine translocase 1 (CPT1), làm tăng sự oxy hóa lipid Hơn nữa, AMPK làm giảm sự tổng hợp acid béo thông qua việc ức chế yếu tố dịch mã kiểm soát toàn bộ con đường tổng hợp SREBP1c, hoặc ức chế trực tiếp hoạt động của FAS [38]

1.1.4 Vai trò của protein AMPK trong điều trị đái tháo đường

AMPK được xem là chiếc chìa khóa trung gian trong con đường truyền tin điều hòa sự thay đổi trong chuyển hóa lipid và glucose ở tế bào cơ và gan, đặc biệt

là quá trình dung nạp glucose Nhận định này xuất phát từ các nghiên cứu sử dụng AICAR là một chất có khả năng đi qua màng tế bào và được phosphoryl hóa nội bào trở thành 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (ZMP) Sau đó, ZMP sẽ bắt chước ảnh hưởng của AMP để hoạt hóa AMPK bằng cách tạo ra sự thay đổi dị lập thể và phosphoryl hóa enzym này bằng các AMPK kinase Kết quả

của các nghiên cứu invitro đã chỉ ra: việc hoạt hóa AMPK bằng AICAR dẫn đến sự

gia tăng dung nạp glucose ở các tế bào cơ vân và cơ tim thông qua một con đường độc lập với PI-3-kinase (phosphoinositol-3-kinase) nhưng lại có liên quan tới sự di

chuyển của GLUT4 đến màng bào tương Duy trì điều trị với AICAR làm gia tăng đáng kể lượng protein GLUT4 trong cơ - một quá trình thích nghi tương tự với hiện tượng quan sát thấy khi luyện tập thể dục [16] Tuy nhiên, việc tồn tại nhiều dạng isoform khác nhau của AMPK đã gây khó khăn cho việc xác định vai trò cụ thể của mỗi dạng isoform này Liệu có phải tất cả 12 dạng isoform AMPK khác nhau đó đều làm gia tăng khả năng dung nạp glucose của tế bào? Hạn chế này đã được khắc phục bằng việc sử dụng các mô hình động vật bị gây khiếm khuyết một trong hai tiểu đơn vị xúc tác (AMPKα1 và AMPKα2) Kết quả cho thấy, chỉ có động vật bị khiếm khuyết isoform AMPKα2 thể hiện sự đề kháng đối với tác dụng hạ đường huyết của AICAR Hơn thế nữa, những cá thể thiếu hụt tuyệt đối AMPKα2 có biểu hiện đặc trưng của ĐTĐ type 2 Trong khi đó điều này không được quan sát thấy trên những cá thể bị thiếu hụt AMPKα1 [41]

AMPK đã được xác nhận là một đích tác dụng của các thuốc điều trị ĐTĐ Trong các tế bào nguyên vẹn, metformin làm gia tăng hoạt động của AMPK, từ đó làm gia tăng sự oxy hóa acid béo, điều hòa âm tính các gen tổng hợp lipid, làm giảm quá trình tổng hợp glucose ở gan và kích thích sự dung nạp glucose Cơ chế hoạt hóa AMPK của metformin hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu toàn diện Tuy nhiên, có giả thiết cho rằng, metformin hoạt hóa AMPK bằng cách ức chế phức hợp

I của chuỗi hô hấp, từ đó làm giảm nồng độ ATP trong tế bào và làm tăng tỉ số AMP/ATP Sự gia tăng tỉ số AMP/ATP ức chế sự khử phosphoryl hóa AMPK, từ

đó làm tăng tỉ lệ AMPK được phosphoryl hóa bởi kinase điều hòa lên LKB1 Vì vậy, AMPK được xem là nhân tố trung gian quan trọng việc thể hiện tác dụng hạ glucose huyết của metformin Khẳng định được đưa ra từ các nghiên cứu này đã làm gia tăng xu hướng nghiên cứu về các chất có khả năng hoạt hóa AMPK [59]

1.1.5 Các nghiên cứu về tác dụng hoạt hóa protein AMPK

Một trong những nghiên cứu đầu tiên trên thế giới về tác dụng hoạt hóa AMPK được tiến hành bởi José M Cacicedo và các cộng sự vào tháng 6 năm 2011 Theo kết quả nghiên cứu được công bố, hoạt động thể lực với cường độ cao trong một thời gian ngắn (cho chuột nhắt chạy trong lồng quay đến kiệt sức) có khả năng

hoạt hóa AMPK và một số protein điều hòa lên hoạt động của AMPK (LKB1 (Ser431) CaMKI (Thr177)) ở động mạch chủ thông qua phản ứng phosphoryl hóa Cùng với đó là sự hoạt hóa endothelial nitrogen oxyd synthetase (eNOS) và một số enzym có khả năng phosphoryl hóa eNOS ở tế bào nội mô ở động mạch chủ, từ đó làm giảm nguy cơ thoái hóa lớp tế bào này cùng các biến cố tim mạch [28]

Trong một nghiên cứu khác của Ju-Young Kim và cộng sự tiến hành năm

2012, kết quả đã chỉ ra rằng 17β-estradiol có khả năng hoạt hóa đồng thời AMPK

và 1/Akt, từ đó đưa đến tương tác giữa AMPK và con đường truyền tin 1/Akt thông qua estrogen receptor (ER) ở các tế bào tạo mỡ 3T3-L1 mặc dù không

IRS-có mặt insulin Hơn nữa, kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra việc hoạt hóa AMPK thông qua tương tác giữa 17β-estradiol và ER sẽ điều hòa sự biểu hiện của một số gen liên quan đến chuyển hóa glucose theo hướng làm giảm nồng độ glucose máu [37] Theo kết quả tổng hợp trong một nghiên cứu tổng quan của Joungmok Kim được công bố gần đây năm 2016, các chất hoạt hóa gián tiếp AMPK đã được biết cho đến nay gồm: biguanid (metformin), thiazolidinedion (troglitazon, pioglitazon

và rosiglitazon), các polyphenol có nguồn gốc tự nhiên (resveratrol trong nho đỏ; quercetin trong hoa quả, rau, ngũ cốc; genistein trong dầu đậu nành, epigallocatechin gallate trong trà xanh, berberin trong hoàng liên và curcumin trong nghệ vàng); ginsenoside trong nhân sâm; α-Lipoic acid Bên cạnh đó, các chất hoạt hóa trực tiếp AMPK gồm: AICAR, các dẫn xuất thienopyridon (A-769662) và benzimidazol (Compound 911, salicylat, Compound-13, PT-1, MT 63–78 [30] Tại Việt Nam, TS Đỗ Thị Nguyệt Quế là người đầu tiên tiến hành nghiên cứu

tác dụng hoạt hóa AMPK của rễ cây Chóc máu Nam bộ (Salacia cochinchinensis

L., Celastraceae) Kết quả cho thấy, cắn dịch chiết phân đoạn n-hexan rễ cây Chóc máu Nam bộ (PĐ n-hexan) ở các nồng độ 20 và 50µg/mL đều có tác dụng làm tăng biểu hiện của p-AMPK, đồng thời làm tăng biểu hiện của p-ACC trong khi biểu hiện của β-actin (protein đối chứng) không thay đổi ở tất cả các mẫu Điều đó chứng tỏ PĐ n-hexan có tác dụng hoạt hóa AMPK Tác dụng của PĐ n-hexan ở nông độ 50µg/mL là rõ nhất [5]

1, do vậy, các gốc tyrosin trên phân tử này không được phosphoryl hóa dẫn đến bất hoạt chuỗi truyền tin nội bào của insulin [45]

Hình 1.3 Cấu trúc của protein IRS-1 [46]

1.2.3 Vai trò của protein IRS-1 trong tế bào

Insulin và IGF-1 thể hiện tác dụng sinh học thông qua việc gắn vào các receptor của chính nó: insulin receptor (IR) và IGF-1 receptor (IGF-1R) IR và IGF-1R có bản chất là các tetra-protein bao gồm 2 tiểu đơn vị α nằm phía ngoài tế bào và

2 tiểu đơn vị β bắc ngang qua màng tế bào liên kết với nhau thông qua 2 cầu nối disulfid Thông thường, insulin và IGF-1 sẽ ưu tiên gắn vào các receptor của chính

nó Tuy nhiên, khi ái lực liên kết giảm, các ligand này có thể gắn chéo vào các receptor của nhau Khi insulin/IGF-1 gắn vào tiểu đơn vị α, IR/IGF-1R sẽ thay đổi cấu hình và làm hoạt hóa vùng hoạt tính tyrosin kinase ở mặt trong tế bào trên tiểu đơn vị β Sau khi được hoạt hóa, vùng tyrosin kinase sẽ tự phosphoryl hóa 6 gốc tyrosin ở chuỗi β [44] tạo ra ái lực thu hút các cơ chất (IRS-1-6) tìm đến gắn vào IR [46] thông qua liên kết giữa đoạn NPEY trên IR và vùng PTB trên IRS-1 [58] Sau khi IRS-1 gắn vào IR, các gốc tyrosin sẽ được phosphoryl hóa để lộ các vị trí gắn các phân tử nội bào chứa vùng SH2 (PI3K, phức hợp Grb-2/Sos, Nck, Crk, Fyn, Syp và SHP2) trên protein IRS-1 Tương ứng với sự liên kết của mỗi phân tử nội bào này với IRS-1 là quá trình hoạt hóa một con đường truyền tin khác nhau Trong đó, hai con đường truyền tin được nghiên cứu nhiều nhất là PI3K/Akt và MAPK (mitogen-activated protein kinase) tương ứng với sự liên kết của 2 phân tử PI3K và Grb-2 với protein IRS-1

Đối với con đường PI3K/Akt, sau khi gắn vào IRS-1, PI3K được hoạt hóa và thực hiện phản ứng phosphoryl hóa phosphatidylinositol (4,5) bisphosphat [PtdIns(4,5)P2] thành Ptd(3,4,5)P3 [50] Ptd(3,4,5)P3 đóng vai trò như các chất truyền tin thứ hai, tập hợp các serin/threonin kinase phụ thuộc PI3K (PDK1) và Akt

từ bào tương đến màng tế bào bằng cách gắn vào vùng pleckstrin homology (PH) trên các kinase Sự liên kết với lipid và dịch chuyển trên màng tế bào dẫn đến sự thay đổi hình dạng của Akt Ngay sau đó, phân tử này sẽ được phosphoryl hóa bởi PDK1 tại các vị trí Thr 308 và Ser 473 hoàn chỉnh quá trình hoạt hóa Akt [44] [46] [58] Akt hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa và điều hòa hoạt động của các protein có liên quan đến nhiều hoạt động sinh lí khác nhau trong tế bào, trong đó có phức hợp

glucose transporter 4 (GLUT4) và Glycogen synthase kinase 3 (GSK3) Đây là những protein giữ vai trò thiết yếu trong trong các quá trình chuyển hóa với chất trung gian là insulin [25] [57] [64] [15] Sau khi được hoạt hóa, Akt di chuyển vào bào tương, phosphoryl hóa và bất hoạt GSK3 Quá trình phosphoryl hóa glycogen synthase bởi GSK3 ức chế sự tổng hợp glycogen Do vậy, bất hoạt GSK3 bởi Akt sẽ kích thích quá trình dự trữ glucose dưới dạng glycogen Mặt khác, Akt hoạt hóa làm tăng cường vận chuyển phức hợp GLUT4 di chuyển ra phía ngoài màng tế bào, thúc đẩy sự dung nạp glucose [12] Ngoài ra, Akt còn phosphoryl hóa BAD, ức chế sự chết theo chương trình của tế bào Bên cạnh khả năng hoạt hóa Akt, các PDK còn hoạt hóa các isoform không điển hình của PKC (protein kinase C), cùng với Akt, tăng cường vận chuyển glucose vào trong tế bào

Theo con đường MAPK, sự liên kết của phức hợp Grb-2/Sos (RAS) với IRS-1

sẽ hoạt hóa p21ras, từ đó hoạt hóa dòng thác phản ứng ras/raf/MEK/MAPK(ERK) đưa đến sự hoạt hóa ERK1/2 giúp hoàn thiện các chức năng phân bào như sự phát triển của tế bào và biểu hiện gen

Trong khi đó, sau khi liên kết với IRS-1 ở một số mô, SHP2 lại ức chế quá trình phosphoryl hóa của protein này nhờ khả năng khử phosphoryl hóa trực tiếp IRS-1[12] [37] Mặt khác SHP2 lại có thể truyền đi một tín hiệu độc lập hoạt hóa MAP kinase [37]

Hình 1.4 Con đường truyền tin nội bào của IRS-1 [58]

Như vậy, trong điều kiện sinh lí bình thường, quá trình truyền tin nội bào của insulin luôn đi kèm với sự phosphoryl hóa các gốc tyrosin trên phân tử IRS-1 Còn trong điều kiện bệnh lí với tình trạng kháng insulin hoặc ĐTĐ type II lại quan sát thấy sự gia tăng quá trình phosphoryl hóa phân tử serin trên phân tử IRS-1 [35] [45] Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng sự phosphoryl hóa gốc serin ở IRS-1 không làm ảnh hưởng đến quá trình tự phosphoryl hóa của IR nhưng lại ức chế protein này liên kết với IR để phosphoryl hóa các gốc tyrosin [46] Lúc này, vùng SHP2 trên phân tử IRS-1 không còn để lộ các vị trí gắn cho các phân tử nội bào chứa vùng SH2, bao gồm PI3K và Grb-2, từ đó ức chế hai con đường PI3K à MAPK Hậu quả là làm tăng tình trạng kháng insulin và giảm sự hoàn thiện của tế bào

Có tối thiểu 3 kinase làm trung gian trong quá trình phosphoryl hóa Ser307, bao gồm kinase hoạt hóa TNF-α/anisomycin, JNK và một kinase kích thích insulin/IGF-1 bị ức chế bởi wortmannin/LY294002 Ban đầu, có nhiều giả thiết cho rằng, JNK là điểm chốt cuối cùng trong quá trình phosphryl hóa Ser307 của rất nhiều cytokin Bởi vì JNK1 gắn với IRS-1 [58] và vùng liên kết với JNK của IRS-1

có vai trò thiết yếu trong việc ức chế quá trình phosphoryl hóa các gốc tyrosin của IRS-1 bởi anisomycin Tuy nhiên, một vài thí nghiệm được tiến hành với các chất trung gian gây kháng insulin mạnh lại không ủng hộ giả thiết này Trong khi anisomysin và TNF-α kích thích JNK và sự phosphoryl hóa Ser307, chất ức chế MEK kinase PD98059 lại ức chế hoàn toàn sự phosphoryl hóa Ser307 mà không có bất kì ảnh hưởng nào tới hoạt động của JNK [22] Ngoài ra, mặc dù insulin hoạt hóa JNK ở một vài tế bào nhất định nhưng con đường này lại không bị ức chế bởi wortmannin/LY294002 Vì vậy bên cạnh JNK, có tối thiểu 2 kinase khác làm trung gian trong quá trình phosphoryl hóa Ser307 Những kinase này đám nhận vai trò tạo liên kết giữa IRS-1 và JNK-1

Thực tế, sự phosphoryl hóa các gốc tyrosin của IRS-1 phụ thuộc vào 2 vùng nằm ở đầu N-tận: vùng PH và vùng PTB [46] Khiếm khuyết cả 2 vùng PH và PTB

ức chế hoàn toàn sự phosphoryl hóa các gốc tyrosin trong suốt quá trình kích thích bởi insulin của tế bào 32DIR, trong khi nếu khiếm khuyết một trong hai vùng PH

hoặc PTB chỉ làm giảm một phần quá trình phosphoryl hóa này Thực tế cho thấy,

sự phosphoryl hóa Ser307 chỉ ức chế chức năng vùng PTB mà không ngăn cản được sự bắt cặp của IR và vùng PH của IRS-1 Điều này giải thích cho hiện tượng

ức chế không hoàn toàn quá trình phosphoryl hóa các gốc tyrosin khi khiếm khuyết một trong 2 vùng PH hoặc PTB Khi lượng IR thấp, sự phosphoryl hóa IRS-1 tại các gốc tyrosin chỉ tỏ ra thực sự hiệu quả khi cả 2 vùng PH và PTB cùng liên kết với các IR Trong khi đó, ở những tế bào có mức độ biểu hiện IR cao, thì chỉ cần một trong hai vùng PH hoặc PTB liên kết với IRS-1 đã mang lại tác dụng đầy đủ trong việc phosphoryl hóa các gốc tyrosin của IRS-1 Do vậy, ở các tế bào có số lượng IR thấp, sự phosphoryl hóa Ser307 đóng một vai trò chủ chốt trong việc điều hòa quá trình phosphoryl hóa các gốc tyrosine của IRS-1 [44]

Ser307 được phosphoryl hóa bởi nhiều nhân tố như: các chất gây stress tế bào, tình trạng tăng đường huyết [44], insulin/IGF-1, TNF-α, các lipid, tất cả các yếu tố gây ra tình trạng kháng insulin, c-Jun amino-terminal kinase (JNK), IKK, PKCs, mTORC1/S6K và MAPK [12] Ví dụ, insulin/IGF-1 kích thích sự phosphoryl hóa Ser307 thông qua một con đường phụ thuộc PI-3 kinase, trong khi đó, TNF-α sử dụng con đường nhạy cảm với PD98059 không liên quan đến Erk ½ hoặc con đường nhạy cảm với acid salicylic Cuối cùng, sự phosphoryl hóa Ser307 có thể được kích thích bởi anisomycin, đặc biệt là Jun N-terminal kinase (JNK) [23] Một vài bằng chứng chỉ ra vai trò trung tâm của mTOR trong sự phát triển của tình trạng kháng insulin và điều hòa sự phosphoryl hóa IRS-1 tại vị trí Ser307 Rapamycin một chất ức chế mTOR đã cho thấy khả năng ngăn ngừa sự phát triển của tình trạng kháng insulin thông qua việc ức chế sự phosphoryl hóa Ser của IRS-1 Thêm vào

đó, ức chế mTOR bằng rapamycin có thể ức chế sự phosporyl hóa Ser307 dưới tác dụng của insulin hoặc stress áp lực thẩm thấu

1.2.4 Vai trò của sự phosphoryl hóa IRS-1 trong điều trị đái tháo đường

Protein IRS-1 là phần tử trung gian quan trọng trong con đường truyền tin nội bào của insulin Thiếu hụt IRS-1 là một trong các nguyên nhân gây ra tình trạng kháng insulin [58]

Sau khi gắn vào IR, các gốc tyrosin của IRS-1 được phosphoryl hóa sẽ hoạt hóa con đường truyền tín hiệu PI3K/Akt Akt hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa và bất hoạt glycogen synthase kinase 3 (GSK3), tăng cường vận chuyển phức hợp GLUT4

ra phía ngoài màng tế bào từ đó kích thích quá trình tổng hợp dự trữ glucose dưới dạng glycogen và thúc đẩy sự dung nạp glucose [23] Bên cạnh đó, IRS-1 còn hoạt hóa các isoform không điển hình của PKC (protein kinase C), cùng với Akt, tăng cường vận chuyển glucose vào trong tế bào Như vậy, cả hai hướng tác động này của IRS-1 đều có xu hướng làm giảm nồng độ glucose huyết và cải thiện tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 Mặt khác, sự phosphoryl hóa các gốc serin/threonine trên IRS-1, đặc biệt là Ser307 lại gây xuất hiện tình trạng kháng insulin hoặc ĐTĐ type II [12] Sự phosphoryl hóa Ser307 ở IRS-1 ức chế protein này liên kết với IR để phosphoryl hóa các gốc tyrosin [46] Khi đó, vùng SHP2 trên phân tử IRS-1 không còn để lộ vị trí gắn cho PI3K Hậu quả là làm giảm khả năng dung nạp glucose và gia tăng tình trạng kháng insulin

Tóm lại, có thể coi IRS-1 là một đích tác dụng tiềm năng trong điều trị ĐTĐ hiện nay Để mang lại hiệu quả điều trị cho các bệnh nhân ĐTĐ type 2, có thể tác động lên protein này theo nhiều xu hướng khác nhau Trong đó, hai xu hướng chính được nghiên cứu nhiều nhất là tăng cường sự phosphoryl hóa các gốc tyrosin hoặc

ức chế sự phosphoryl hóa các gốc serin, đặc biệt là Ser307, trên phân tử IRS-1

1.2.5 Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa Ser307 trên IRS-1

Năm 2014, Weidong Yin và cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu chứng minh tác dụng của Metalonin trên các tế bào mô mỡ 3T3-L1 đã bị kháng insulin do các acid béo tự do (FFA) Metalonin được sinh tổng hợp ở tuyến tùng, sau đó tiết vào máu đảm nhận vai trò điều hòa chuyển hóa glucose Theo nghiên cứu, tế bào tạo mỡ 3T3-L1 bị gây kháng insulin trước đó bởi acid palmitic (300µM, 6h) sau khi được ủ với metalonin trong vòng 30 phút có sự gia tăng đáng kể lượng GLUT-4 và giảm lượng IRS-1 được phosphoryl hóa ở vị trí Ser307 Kết quả này cho thấy, metalonin

có thể làm tăng độ nhạy cảm với insulin thông qua tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa Ser307 ở IRS-1 và tăng biểu hiện GLUT-4 ở các tế bào tạo mỡ 3T3-L1 xuất

hiện tình trạng kháng insulin Từ đó, nghiên cứu đưa đến kết luận: metalonin làm tăng độ nhạy cảm với insulin thông qua tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa Ser và tăng cường chức năng của IRS-1 [45]

Năm 2015, György Kéri cùng các cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu lớn nhằm sàng lọc khả năng ức chế sự phosphoryl hóa Ser307 trên IRS-1 ở mô hình tế bào bị gây ĐTĐ thực nghiệm của các hợp chất tổng hợp có tác dụng điều trị ĐTĐ Nghiên cứu tiến hành trên 51 chất, tất cả đều là các dẫn chất của pyrido[2,3-d] pyrimidin-7-one Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, các hợp chất ức chế hiệu quả sự phosphoryl hóa Ser307 của IRS-1 khi có nhóm thế phenoxxy ở vị trí số 6 của lõi pyrido-pyrimidin Trong đó, 5 hợp chất có tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa Ser307 hiệu quả nhất là Cyclopentyl-2,4-F2Ph (61%), Cyclohexyl-2,4-F2Ph (59%), 3-methanesulfonamidopropyl-2,4-F2Ph (87%), 1-aminosulfonylpiperidin-4-yl-2,4-

từ thân, hoa mọc thành bông buồng, có lá bắc màu đỏ, bầu dưới 3 ngăn Quả nằm

trên buồng, buồng có từ 6-8 nải, mỗi nải từ 12-15 quả Quả thuộc loại đơn tính, quả nhỏ, dài, khi chín có màu vàng, mùi thơm, vị ngọt [2]

Chuối tiêu mọc hoang hoặc được trồng khắp nơi ở nước ta, các nước nằm trong khu vực Đông Nam Á và các vùng nhiệt đới khác ở châu Á, châu Âu, châu

Mỹ [2]

Hình 1.5 Cây chuối tiêu chụp ở xã Giang sơn, huyện Gia Bình, tỉnh Bắc Ninh

(Musa paradisiaca L.) 1.3.3 Bộ phận dùng

Các bộ phận thường được sử dụng trong công nghệ thực phẩm của cây Chuối tiêu bao gồm: Quả (quả xanh, quả chín, vỏ quả), lá, hoa, thân ngầm (củ chuối), thân giả, rễ

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thân giả của cây Chuối tiêu

1.3.4 Các nghiên cứu về tác dụng gây hạ glucose máu của thân cây Chuối tiêu

Năm 2010, Suneetha B và các cộng sự đã triển khai một nghiên cứu nhằm đánh giá tác dụng chống ĐTĐ và chống oxy hóa của dịch ép thân cây chuối tiêu ở 2 mức liều khác nhau 1 và 2 g/kg Nghiên cứu được tiến hành trên mô hình chuột cống bị gây ĐTĐ thực nghiệm bởi alloxan (150mg/kg) Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tác dụng chống ĐTĐ vượt trội của dịch ép thân cây chuối tiêu thông qua khả năng làm giảm đáng kể nồng độ glucose, triglycerid, cholesterol, AST và ALT trong huyết tương ở cả 2 mức liều được sử dụng [53]

Ekpo.B và cộng sự (2011) đã nghiên cứu cao toàn phần thân cây chuối tiêu trên chuột cống đã bị ĐTĐ bởi alloxan (150mg/kg) với các liều 250, 500, 1000 mg/kg chuột Kết quả cho thấy sau 20 ngày điều trị bằng cắn toàn phần thân cây chuối tiêu glucose máu tại các thời điểm khác biệt so với lô đối chứng uống nước cất và tác dụng này phụ thuộc vào liều [25]

Tại Việt Nam, bắt đầu từ năm 2015, nhóm nghiên cứu Phùng Thanh Hương và cộng sự đã tiến hành triển khai hướng nghiên cứu về tác dụng điều trị ĐTĐ của dịch

ép thân cây chuối tiêu Kết quả ban đầu cho thấy mẫu thử có tác dụng hạ glucose huyết, giảm lipid máu và hoạt tính G6Pase ở gan trên chuột nhắt trắng bị gây ĐTĐ thực nghiệm bởi STZ (150mg/kg) [6] [42] Tuy nhiên, cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu vẫn là một vấn đề chưa được làm sáng tỏ Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm làm sáng tỏ một phần cơ chế gây hạ đường huyết của thân cây chuối tiêu

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Cao toàn phần thân giả cây Chuối tiêu (Musa paradisiaca L.), được thu hoạch tại Xã Giang Sơn, huyện Gia Bình, tỉnh Bắc Ninh Để đơn giản, trong

đề tài này thống nhất gọi thân giả cây Chuối tiêu là thân cây Chuối tiêu

- Hai chất phân lập từ dịch chiết phân đoạn ethylacetat của thân cây Chuối tiêu là: Cycloeucalenone và Daucosterol

- Hệ thống máy ELISA Thermo Labsystem gồm máy ủ lắc, máy rửa, đầu đọc

có gắn liền với máy tính và máy in của hãng Bio-tek Instrument (Mỹ)

- Máy chỉnh pH Eutech instrument pH 510

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5702 R - Đức

- Tủ âm sâu MDF của hãng Sanyo - Nhật Bản

- Máy ủ lắc khay của hãng Awareness – Mỹ

- Micropipette 8 kênh điều chỉnh thể tích của hãng Eppendorf – Đức

- Cân phân tích Precisa XB 220A

- Chai nuôi cấy, đĩa nuôi cấy, ống effendor… của hãng Corning

- Phim chụp X-quang Fuji Medical của tập đoàn FUJIFILM, Nhật Bản

b Hóa chất nghiên cứu

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong thí nghiệm

Bộ dung dịch ECL Prime gồm

dung dịch luminol (solution A) và

dung dịch peroxid (solution B

GE Heathcare UK Limited

Anh

2.2 Nội dung nghiên cứu

Xuất phát từ mục tiêu, đề tài triển khai 2 nội dung nghiên cứu sau:

Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây Chuối tiêu lên khả năng phosphoryl hóa tiểu đơn vị α của AMPK (vị trí Thr-172)

Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây Chuối tiêu lên sự phosphoryl hóa IRS-1 (vị trí Ser-307)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu