Nghiên cứu tối ưu khả năng sinh tổng hợp và sơ bộ tinh sạch lipase từ chủng geotrichum candidum geo 26 3

Từ rất lâu, lipase từ chủng G.candidum đã được sử dụng làm chất xúc tác cho quá trình tổng hợp các acid béo không bão hòa [32] là thực phẩm bổ sung hiệu quả trong điều trị nhiều bệnh kh

GEOTRICHUM CANDIDUM GEO 26.3

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

GEOTRICHUM CANDIDUM GEO 26.3

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Đào Thị Mai Anh

2 TS Đỗ Thị Tuyên

Nơi thực hiện:

1 Viện Công nghệ sinh học

2 Bộ môn Hóa Sinh

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin được gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo của Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và truyền đạt những tri thức quý báu cho em trong suốt thời gian em học tập và rèn luyện tại trường Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, cũng như các anh chị tại phòng Công nghệ sinh học enzym – Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình hướng dẫn em trong quá trình nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, người đã trực tiếp chỉ bảo,

hướng dẫn em từ những ngày đầu tham gia nghiên cứu khoa học

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Mai Anh Cô không chỉ là người thầy giúp em định hướng, học tập và nghiên

cứu khoa học, mà cô còn là người bạn - cho em những lời khuyên chân thành trong cuộc sống Đó sẽ là hành trang quý giá để em có thể tự tin, vững chãi bước đi trên con đường sự nghiệp cũng như cuộc sống sau này

Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình

và bạn bè đã luôn động viên và tiếp thêm sức mạnh cho em trong những lúc khó khăn nhất

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017

Sinh Viên

Nguyễn Thị Thập

MỤC LỤC

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Enzyme lipase 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân bố trong tự nhiên 3

1.1.3 Cấu trúc 3

1.1.4 Đặc điểm xúc tác 5

1.1.5 Ứng dụng của lipase 9

1.2 Chủng Geotrichum candidum 10

1.2.1 Nguồn gốc, phân loại 10

1.2.2 Hình thái 11

1.2.3 Điều kiện nuôi cấy 11

1.2.4 Ứng dụng 11

1.3 Enzym lipase từ chủng Geotrichum candidum 12

1.3.1 Cấu trúc 12

1.3.2 Đặc điểm hóa lý, vị trí bài tiết enzym 13

1.3.3 Đặc điểm xúc tác 13

1.3.4 Ứng dụng trong y dược 15

1.3.5 Tình hình nghiên cứu lipase từ chủng Geotrichum candidum trên thế giới và ở Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Chủng giống, hóa chất, thiết bị 19

2.1.1 Chủng giống 19

2.1.2 Hóa chất 19

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 20

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Nuôi cấy chủng giống 22

2.3.2 Xác định hoạt tính enzym lipase 22

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới khả năng sinh tổng hợp lipase ở chủng G.candidum Geo 26.3 23

2.3.4 Tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp lipase bằng phương pháp đáp ứng bề mặt, phương án cấu trúc có tâm 25

2.3.5 Tinh sạch enzym bằng amoni sulfat 27

2.3.6 Xác định hàm lượng protein 29

2.3.7 Xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Kết quả 31

3.1.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới khả năng sinh tổng hợp lipase 31

3.1.2 Tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp lipase 37

3.1.3 Tinh sạch enzym lipase 41

3.2 Bàn luận 43

3.2.1 Về kết quả tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp lipase từ chủng G.candidum Geo26.3 bằng phương pháp RSM-CCD 43

3.2.2 Về kết quả tinh sạch lipase từ chủng G.candidum Geo26.3 46

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 49

CHƯƠNG 5 KIẾN NGHỊ 49

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

ACEIs Angiotensin coverting enzyme inhibitors

Nhóm thuốc ức chế men chuyển

CCBs Calcium channel blockers

Nhóm thuốc chẹn kênh canxi

DHPA 9-(2,3-dihydroxy propyl)adenin

NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory drugs

Nhóm thuốc giảm đau, chống viêm phi steroid PUFA Polyunsaturated fatty acid

Acid béo không bão hòa có nhiều hơn 1 nối đôi

SDA Sabouraud dextrose agar

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các chủng vi sinh vật sản xuất lipase 3

Bảng 1.2 Các ứng dụng chung của lipase 10

Bảng 1.3 Đặc điểm hóa lý của một số lipase ngoại bào G.candidum 13

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 19

Bảng 2.2 Thành phần các loại đệm và dung dịch 20

Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng 21

Bảng 2.4 Thành phần môi trường khảo sát nguồn carbon và nitrogen hữu cơ 24

Bảng 2.5 Thành phần gel cô và gel tách 29

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitrogen hữu cơ đến hoạt tính lipase (xác định bằng phương pháp chuẩn độ pH tự động) 32

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính lipase 34

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến hoạt tính lipase 35

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ dầu đậu nành đến hoạt tính lipase 36

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ amoni nitrat đến hoạt tính lipase 37

Bảng 3.6 Phạm vi nghiên cứu của các biến 38

Bảng 3.7 Giá trị hàm đáp ứng thực nghiệm 38

Bảng 3.8 Phân tích phương sai (ANOVA) 39

Bảng 3.9 Hoạt tính enzym và mức kì vọng của các phương án tối ưu 40

Bảng 3.10 Độ sạch và hiệu suất khi tủa protein bằng amoni sulfat ở các khoảng nồng độ khác nhau 41

Bảng 3.11 Độ sạch và hiệu suất khi tủa protein bằng amoni sulfat 55 – 65% 42

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Nội dung nghiên cứu 22

Sơ đồ 2.2 Quá trình tinh sạch 27

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc α/β của lipase 4

Hình 1.2 Các phản ứng xúc tác bởi lipase 5

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân triglycerid của lipase 6

Hình 1.4 Hai dạng lỗ oxyanion 7

Hình 1.5 Trạng thái đóng (màu xanh) và mở (màu tím) của nắp che vị trí hoạt động ở lipase từ chủng Rhizomucor miehei 7

Hình 1.6 Các kiểu xúc tác đặc hiệu của lipase 9

Hình 1.7 Đặc điểm hình thái của G.candidum 11

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của lipase từ chủng G.candidum 12

Hình 1.9 Lipase chủng ATCC34614 xúc tác đặc hiệu vị trí liên kết số 2 14

Hình 1.10 Ester hóa 9-(2,3-dihydroxypropyl)adenin có lipase xúc tác 16

Hình 2.1 Đường chuẩn Bradford có sử dụng BSA làm chuẩn 30

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitrogen hữu cơ đến hoạt tính lipase (xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch) 31

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitrogen hữu cơ đến hoạt tính lipase (xác định bằng phương pháp chuẩn độ pH tự động) 32

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính lipase 34

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến hoạt tính lipase 35

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ dầu đậu nành tới hoạt tính lipase 36

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ amoni nitrat đến hoạt tính lipase 37

Hình 3.7 Mặt đáp ứng hoạt tính lipase theo nồng độ CNM và AN (1) và theo nồng độ DĐN và AN (2) 39

Hình 3.8 Điện di đồ enzym tủa bằng amoni sulfat ở các nồng độ khác nhau 42

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lipase (EC 3.1.1.3) là nhóm enzym thủy phân các triglycerid, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong những năm gần đây, mối quan tâm cũng như nhu cầu sử dụng lipase ngày càng tăng, khiến cho thị phần lipase trên thị trường thế giới cũng tăng một cách đáng kể, doanh số dự tính thu về từ lipase năm 2020 là khoảng 590,4 triệu USD [54] Đây là lí do vì sao các nguồn sản xuất, các đặc tính vượt trội của sản phẩm, cũng như các phương pháp làm tăng hiệu suất sản xuất lipase được các nhà khoa học thế giới vô cùng quan tâm

Từ lâu, vi sinh vật đã được biết đến là nguồn sản xuất lipase phong phú và

đem lại lợi ích kinh tế lớn, trong đó, Geotrichum candidum (G.candidum) là một trong những nhân tố tiềm năng nhất Lipase sản xuất từ G.candidum có nhiều đặc

tính vượt trội như tính xúc tác đặc hiệu loại acid béo [17] [26], đặc hiệu vị trí liên kết [73] [76], đặc hiệu lập thể [88] và tính an toàn [64] Với những ưu điểm đó, li-

pase từ G.candidum không chỉ được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp

hóa chất, thực phẩm mà còn là một công cụ hiệu quả trong tổng hợp hóa dược Từ

rất lâu, lipase từ chủng G.candidum đã được sử dụng làm chất xúc tác cho quá trình

tổng hợp các acid béo không bão hòa [32] là thực phẩm bổ sung hiệu quả trong điều trị nhiều bệnh khác nhau Gần đây, lipase cũng được nghiên cứu sử dụng làm xúc tác cho phản ứng tổng hợp ester tiền thuốc kháng virus để tăng sinh khả dụng đường uống của nó [16]

Không nằm ngoài xu hướng chung của toàn cầu, ở Việt Nam, chủng

G.candidum và enzym lipase của nó cũng được các nhà khoa học vô cùng quan tâm.

Rất nhiều nghiên cứu phân lập vi sinh vật, tìm hiểu đặc tính hay tái tổ hợp lipase đã được thực hiện [2] [4] Không dừng lại ở đó, nhằm mục đích gia tăng quy mô sản

xuất lipase từ G.candidum, các điều kiện vật lí, sinh hóa ảnh hưởng tới quá trình lên

men cũng được các nhà khoa học tiến hành tối ưu hóa bằng phương pháp truyền thống: tối ưu hóa từng yếu tố và giữ nguyên các yếu tố khác Tuy nhiên, cách thực hiện này tốn thời gian và không xác định được sự tác động qua lại của các yếu tố

2

Trong khi đó, tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt là một cách thực hiện hiệu quả, giảm chi phí, cho phép nghiên cứu sự tương tác giữa các yếu tố, đồng thời tiên đoán được giá trị tối ưu của các yếu tố lại chưa hề được áp dụng nghiên cứu

G.candidum Geo26.3 là chủng nấm được phân lập từ mẫu nước biển ở Việt Nam

Các nghiên cứu sàng lọc ban đầu cho thấy chủng nấm này có khả năng sản xuất pase với hoạt tính cao, hứa hẹn sẽ là một nguồn sản xuất lipase hiệu quả Để có thể góp phần khai thác tối đa tiềm năng của một tài nguyên của đất nước, cung cấp thêm một công cụ hiệu quả cho ngành Dược, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu

li-tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch lipase từ chủng G.candidum

Geo26.3” với mục tiêu là:

1 Xác định các điều kiện tối ưu nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp lipase từ

G.candidum Geo26.3

2 Bước đầu tinh sạch enzym lipase từ chủng G.candidum Geo26.3

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Enzyme lipase

1.1.1 Định nghĩa

Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC (3.1.1.3)) là enzym nhóm lase, tham gia xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester trong tri-, di-, và mono-glycerid để tạo ra sản phẩm là các di-, monoglycerid, acid béo tự do và glycerol [7]

hydro-1.1.2 Phân bố trong tự nhiên

Lipase phân bố rộng rãi trong tự nhiên, từ vi sinh vật, thực vật đến động vật Lipase được tìm thấy ở tuyến tụy của động vật có vú (người, lợn); ở thực vật bậc

cao như cây thầu dầu (Ricinus communis), hạt cải dầu (Brassica napus); và vi sinh

vật (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men) [38] Trong đó, vi sinh vật là nguồn cung cấp pase lớn và quan trọng nhất trong công nghiệp nhờ tạo ra các sản phẩm có nhiều ưu điểm như: có tính ổn định, tính chọn lọc, cơ chất đa dạng, không cần cofactor, xúc tác cho nhiều loại phản ứng khác nhau, dễ dàng áp dụng các kĩ thuật công nghệ sinh học, và đặc biệt là vi sinh vật phát triển nhanh trong môi trường nuôi cấy rẻ tiền [36] Một số chủng vi sinh vật là nguồn sản xuất lipase được liệt kê tại bảng 1.1

li-Bảng 1.1 Các chủng vi sinh vật sản xuất lipase [69]

Loài Rhizopus arrhizus Candida utilis Geobacillus sp

4

pase từ chủng nấm Rhizomucor miehei chỉ chứa 269 gốc acid amin [12] Tuy nhiên

giữa các loại lipase này, có sự tương đồng về trình tự bộ ba xúc tác đóng vai trò cốt lõi trong trung tâm hoạt động của enzym, bao gồm: Ser là nhóm ái nhân, Asp/Glu là nhóm mang tính acid, và His [19]

Ngoài ra, giữa các loại lipase còn có sự tương đồng ở trình tự xung quanh vùng trung tâm hoạt động dạng Gly-X1-Ser-X2-Gly, trong đó X1, X2 là các gốc acid amin bất kì Gốc Gly không được bảo toàn ở tất cả các lipase, ví dụ ở lipase B

từ chủng Candida antartica là Thr-X1-Ser-X2-Gly [78]

1.1.3.2 Cấu trúc không gian

Lipase có cấu trúc không gian phức tạp Phần lớn cấu trúc có dạng α/β; trong

đó trung tâm là dải gấp nếp β gồm 8 sợi song song với nhau ngoại trừ sợi β2 Các sợi β3 đến β8 được liên kết với nhau bởi các chuỗi xoắn α nằm bên cạnh nếp gấp β trung tâm [66] Một vài biến thể của cấu trúc α/β cũng được tìm thấy, chúng khác biệt ở số lượng chuỗi α, số sợi β, chiều dài vòng lặp hoặc cấu trúc của vị trí gắn cơ chất [63] [44] Trong cấu trúc α/β, Ser xúc tác nằm sau sợi β5 và trước chuỗi α theo sau đó; Asp/Glu nằm ở sau sợi β7; còn His nằm ở vòng lặp sau sợi β8 Lipase cũng được đặc trưng bởi các cầu nối disulfid (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc α/β của lipase [44]

Hình 1.2 Các phản ứng xúc tác bởi lipase

1.1.4.2 Cơ chế xúc tác cho phản ứng thủy phân triglycerid

Phản ứng bắt đầu bằng bước acyl hóa: có sự trao đổi proton giữa Asp/Glu, His và Ser ở vị trí hoạt động làm tăng tính ái nhân của nhóm hydroxyl của Ser; nhóm hydroxyl này tấn công nhóm carbonyl của cơ chất tạo sản phẩm trung gian hình tứ diện với điện tích âm trên nguyên tử oxy của nhóm carbonyl của cơ chất Trong quá trình xúc tác, có mặt lỗ oxyanion giúp giải tỏa điện tích của trung gian tứ diện nên làm giảm năng lượng hoạt hóa Alcol được tách ra tạo sản phẩm trung gian dạng acyl-enzym Bước tiếp theo là deacyl hóa: tác nhân ái nhân (là nước trong

6

trường hợp thủy phân triglycerid) tấn công enzym, giải phóng sản phẩm và tái sinh enzym cũng bằng cách tạo sản phẩm trung gian tứ diện tương tự bước acyl hóa (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân triglycerid của lipase [34]

Lỗ oxyanion được cấu tạo bởi các liên kết hydro cùng với 2 acid amin, nó ổn định cấu trúc tứ diện trung gian thông qua liên kết hydro giữa proton trên nhóm amid của 2 acid amin và nguyên tử oxy trên nhóm carbonyl của cơ chất

Acid amin thứ nhất của lỗ oxyanion nằm ở phía đầu N-tận của lipase, giữa sợi β3 và chuỗi αA; acid amin thứ hai chính là X2 trong trình tự bảo toàn Gly-X1-Ser-X2-Gly, nằm ở sau sợi β5 Tùy vào acid amin thứ hai, lỗ oxyanion được chia thành 2 nhóm: GX và GGGX, liên quan trực tiếp tới khả năng xúc tác đặc hiệu của lipase Lipase với lỗ oxyanion dạng GX thường xúc tác đặc hiệu cho triglycerid của các acid béo mạch carbon dài hoặc trung bình, ngược lại, dạng GGGX lại xúc tác đặc hiệu cho triglycerid của acid béo mạch carbon ngắn (Hình 1.4) [62]

7

Hình 1.4 Hai dạng lỗ oxyanion [34]

(A): Lỗ oxyanion dạng GX ở lipase của Rhizomucor miehei,

2 acid amin tạo liên kết hydro là Ser82 và Leu145; (B): Lỗ oxyanion dạng GGGX

ở lipase của Candida rugosa, 2 acid amin tạo liên kết hydro là Gly124 và Ala210

Lipase xúc tác phản ứng thủy phân triglycerid tại bề mặt phân cách hai pha

dầu – nước Hoạt tính xúc tác của lipase tăng lên khi có những giọt dầu phân tán

trong nước hoặc dung môi hữu cơ Hiện tượng này liên quan đến sự có mặt của nắp

kị nước cấu tạo từ chuỗi oligopeptid (gồm 1-2 chuỗi α) che phủ vị trí hoạt động của

lipase Trong hầu hết các trường hợp, nắp này sẽ dịch chuyển sang một bên khi gặp

bề mặt phân cách pha, chuyển lipase từ trạng thái đóng sang mở, để lộ túi của vị trí

hoạt động tiếp xúc với cơ chất [14]

Hình 1.5 Trạng thái đóng (màu xanh) và mở (màu tím) của nắp che vị trí hoạt

động ở lipase từ chủng Rhizomucor miehei [27]

ví dụ như lipase từ Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia glumae, Candida

ant-arctica B, và tuyến tụy của Myocastor coypus [80]

1.1.4.3 Tính xúc tác đặc hiệu của lipase

Tính đặc hiệu của lipase có thể chia thành 3 kiểu chính [72] [81]:

 Đặc hiệu cơ chất: cơ chất tự nhiên của lipase là các ester của glycerol, nó có thể thủy phân tri-, di- và monoglycerid, ngoài ra cơ chất còn có thể là phos-pholipid trong trường hợp enzym là phospholipase

 Đặc hiệu liên kết: lipase ưu tiên tạo ra hoặc phá vỡ một loại liên kết hóa học hơn so với các loại khác Tính đặc hiệu này có thể chia thành 3 phân nhóm như sau:

 Lipase không đặc hiệu: chúng có thể thủy phân hoàn toàn triglycerid thành glycerol và các acid béo một cách ngẫu nhiên, di- và monoglycerid

là các sản phẩm trung gian

 Lipase đặc hiệu liên kết 1,3: chúng chỉ thủy phân liên kết ester tại vị trí C1 và C3 của triglycerid tạo ra các acid béo, 2-monoglycerid Sản phẩm trung gian là 1,2-diglycerid và 2,3-diglycerid, chúng chứa các liên kết hóa học không ổn định, có thể di dời các nhóm acyl tạo ra 1,3-diglycerid, 1- hoặc 3-monoglycerid (Hình 1.6)

 Lipase đặc hiệu loại acid béo: chúng thủy phân liên kết ester của một nhóm acid béo đặc trưng, có thể ở các vị trí liên kết khác nhau (Hình 1.6)

Trong công nghiệp dược phẩm, lipase cũng được sử dụng rộng rãi để tổng hợp các hoạt chất nhờ tính đặc hiệu lập thể, sự có mặt của lipase giúp phân lập hoạt chất từ hỗn hợp racemic [49], [58], [70] Đặc biệt là các thuốc nhóm NSAIDs như naproxen [86], ibuprofen [29] [52] [85]; thuốc điều trị tăng huyết áp như ACEIs (captopril, enalapril, ceranopril, zofenapril, lisinopril) và CCBs (diltiazem)

Các ứng dụng chung của lipase được trình bày tại bảng 1.2

10

Bảng 1.2 Các ứng dụng chung của lipase [82]

STT Ngành công nghiệp Tính chất áp dụng Ứng dụng - Sản phẩm

1 Chất tẩy rửa Thủy phân chất béo Loại vết bẩn trên mặt vải

2 Thực phẩm Thủy phân chất béo

trong sữa, biến đổi chất béo của bơ

Tạo hương vị cho sữa, bơ

3 Bánh mì Cải thiện hương vị Kéo dài hạn sử dụng

4 Thực phẩm chức năng Trao đổi ester Sản xuất thực phẩm chức

6 Hóa chất Đặc hiệu lập thể Sản xuất hóa chất, chọn lọc

đồng phân lập thể

dưỡng ẩm

10 Dược phẩm Trao đổi ester, thủy

phân

Sản xuất các lipid đặc biệt, thuốc hỗ trợ tiêu hóa

1.2 Chủng Geotrichum candidum

1.2.1 Nguồn gốc, phân loại

Geotrichum candidum (G.candidum) được phân lập từ nhiều nguồn khác

nhau như đất [53], nước biển [2], rác thải dầu phân hủy sinh học [56]

Việc phân loại G.candidum có nhiều sự thay đổi Theo những nghiên cứu

ban đầu, nó được xếp vào nhóm nấm men [10] nhưng cũng có nhiều tác giả xếp nó

vào nhóm nấm mốc [84] Năm 2004, Sybren de Hoog et al đã kết luận rằng tất cả các loài Geotrichum đều là nấm sợi giả nấm men [77] và G.candidum thuộc lớp

Deuteromycetes hay còn gọi là nhóm nấm bất toàn vì khả năng sinh sản vô tính của

nó Tuy nhiên, Jacques et al lại cho rằng G.candidum thuộc lớp Hemiascomycetes

là nhóm sinh sản hữu tính bằng bào tử túi [43] Năm 2008, Ivannah Pottier đã thống

11

nhất phân loại G.candidum như sau: ngành Ascomycota, lớp Hemiascomycetes, bộ Saccharomycetales, họ Candidaceae, chi Geotrichum, loài G.candidum

1.2.2 Hình thái

Khuẩn lạc G.candidum nuôi cấy sau 24h có màu trắng, mềm, mượt như

nhung, có núm ở trung tâm tỏa dần ra ngoài, có nhiều sợi nấm nhỏ li ti Khi nuôi cấy ở 30oC, sợi nấm trở nên ẩm ướt và bán trong suốt Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, chúng phát triển thành dạng có vỏ bọc và nổi trên bề mặt môi trường Sau 4 ngày, bào tử được hình thành nhờ sự đứt gãy của các sợi nấm trưởng thành ở vách ngăn và tế bào cuối [53] Các đặc điểm này được thể hiện ở hình 1.7

Hình 1.7 Đặc điểm hình thái của G.candidum [53]

(1) Đặc điểm hình thái khuẩn lạc; (2) Sự phát triển hình thái trong môi trường dinh dưỡng lỏng: (A) Sự phát triển của sợi nấm và bào tử (x100), (B) Bào tử nấm

(x400), (C) Hình thành các bào tử từ sự đứt gãy sợi nấm (x400)

1.2.3 Điều kiện nuôi cấy

Các chủng G.candidum khác nhau có điều kiện nuôi cấy tối thích khác nhau,

tuy nhiên giữa chúng có một số đặc điểm chung như: chủng phát triển tốt hơn khi môi trường có chứa dầu; pH 6 – 8; nhiệt độ 30 – 40oC; tốc độ lắc khoảng 200 – 300 vòng/phút; nguồn carbon có thể là glucose, các loại dầu; và nguồn nitrogen là cám ngô hoặc amoni nitrat [22] [9] [39] [5]

1.2.4 Ứng dụng

Không chỉ là nguồn sản xuất lipase tiềm năng, G.candidum còn được ứng

dụng rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm Nó được sử dụng như tác nhân khơi mào cho quá trình lên men bia lúa mạch [30], là yếu tố cải

12

thiện mùi vị và kiểm soát độ mềm của pho-mát [15] Nhờ khả năng thủy phân dầu,

G.candidum được ứng dụng trong xử lí nước thải có chứa dầu ô-liu [8] Ngoài ra,

nó cũng được xem là một trong những nguồn sản xuất protease đầy tiềm năng [89]

1.3 Enzym lipase từ chủng Geotrichum candidum

Các nghiên cứu về G.candidum đều cho thấy nó sản xuất nhiều hơn 1 loại

li-pase: lipase ngoại bào và lipase liên kết với tế bào [17]; lipase I và lipase II [67];

lipase A và lipase B; thậm chí là 4 loại lipase I, II, III, và IV [76] Giữa các lipase

này có sự tương đồng về cấu trúc nhưng có sự khác biệt nhất định về vị trí bài tiết

enzym, đặc điểm hóa lý và khả năng xúc tác đặc hiệu

1.3.1 Cấu trúc

Cấu trúc không gian của lipase từ G.candidum có dạng α/β với tổng số 16

chuỗi xoắn α và vùng trung tâm là nếp gấp β gồm 11 sợi Trong đó, nếp gấp β xoắn

rất chặt và hầu hết các sợi song song với nhau, chỉ có 3 đoạn gần như vuông góc với

phần còn lại Ở mỗi phía của đoạn β là các chuỗi xoắn α chạy song song với các sợi

β Tương tự như các lipase khác, vùng trung tâm hoạt động của lipase từ

G.candidum chứa bộ ba xúc tác Ser-His-Glu, và Ser đóng vai trò quan trọng trong

quá trình xúc tác [48] (Hình 1.8)

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của lipase từ chủng G.candidum [48]

(A): Gấp nếp β gồm 11 sợi; (B): Chuỗi xoắn α nhìn từ phía dưới với các acid amin có vai trò xúc tác; (C): Hai chuỗi xoắn α che phủ vị trí hoạt động

13

1.3.2 Đặc điểm hóa lý, vị trí bài tiết enzym

G.candidum sản xuất nhiều loại lipase khác nhau, tuy nhiên enzym ngoại bào

nhận được sự quan tâm và có nhiều công trình nghiên cứu hơn cả Bảng 1.3 dưới

đây liệt kê một số enzym lipase ngoại bào sản xuất bởi G.candidum cùng các đặc

tính hóa lý của nó Nhìn chung, pI của các lipase tương đồng nhau trong khoảng 4 - 5; nhưng trọng lượng phân tử (MW) lại khá đa dạng, nằm trong khoảng 32 – 61,6 kDa

Bảng 1.3 Đặc điểm hóa lý của một số lipase ngoại bào G.candidum

Lipase từ G.candidum là một trong số ít các lipase có tính đặc hiệu loại acid

béo [42], [73] Tuy nhiên tính đặc hiệu này lại phụ thuộc vào điều kiện sinh trưởng của vi sinh vật [41] Trong khi lipase B từ chủng CMICC 335426 xúc tác đặc hiệu với triglycerid của acid béo không no có nối đôi tại C9 với cấu hình cis [26] thì li-

pase từ chủng G.candidum phân lập bởi Jensen et al lại không có tính chất này, khả

14

năng xúc tác không có sự khác biệt giữa các triglycerid của acid béo 9:1, 18:1 và 18:2 [47]

Ở chủng G.candidum 4013, lipase ngoại bào xúc tác đặc hiệu cho phản ứng

thủy phân triglycerid của các acid béo không no (tính đặc hiệu giảm dần từ C18:2, C18:1, C18:0) Về phía enzym liên kết với tế bào, nó ưu tiên thủy phân các triglyc-cerid của các acid béo mạch trung bình (C13-C16), trong đó hoạt tính thể hiện cao nhất khi thủy phân triglycerid của acid myristic (C14) [17]

Tính xúc tác đặc hiệu vị trí liên kết 1,3 cũng được quan sát thấy ở lipase từ

chủng G.candidum 4166, tuy nhiên tính xúc tác chọn lọc loại acid béo lại không

được thể hiện ở chủng này [73] Ngược lại, trong 4 lipase đồng phân từ chủng

G.candidum ATCC34614 thì lipase III, IV xúc tác đặc hiệu vị trí liên kết số 2, tính

đặc hiệu này tăng lên khi acid béo ở vị trí số 2 là oleic (Hình 1.9) [76]

Hình 1.9 Lipase chủng ATCC34614 xúc tác đặc hiệu vị trí liên kết số 2 [76]

Khả năng xúc tác đặc hiệu lập thể của enzym lipase ngoại bào cũng đã được

quan sát thấy ở một số chủng G.candidum [88]

Như vậy, lipase G.candidum có đầy đủ các kiểu xúc tác đặc hiệu của lipase nói chung, tuy nhiên kiểu xúc tác đặc hiệu của lipase ở các chủng G.candidum khác

nhau là rất khác nhau, phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh trưởng của vi sinh vật

1.3.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng khả năng xúc tác của enzym

Khả năng xúc tác của lipase chịu ảnh hưởng của nhiều điều kiện phản ứng khác nhau như: cơ chất, nhiệt độ, pH, sự có mặt của các yếu tố điều hòa hoạt động enzym (yếu tố hoạt hóa enzym và yếu tố ức chế hoạt động enzym)

15

 Ảnh hưởng của cơ chất: Hoạt tính của enym đạt cao nhất khi cơ chất là cơ chất đặc hiệu của nó Có báo cáo cho thấy lipase đạt hoạt tính cao nhất khi

cơ chất là dầu ô-liu [4]

 Ảnh hưởng của nhiệt độ: Ở nhiệt độ dưới 40oC, lipase giữ được 72 - 90% hoạt tính, khi tăng nhiệt độ lên 60oC thì lipase mất hoàn toàn hoạt tính [4] Phản ứng thủy phân diễn ra mạnh mẽ nhất ở 40oC [75]

 Ảnh hưởng của pH: Khi thay đổi pH, khả năng xúc tác của enzym thay đổi khá nhiều: nó không có hoạt tính ở pH 4 - 6, hoạt tính tăng dần ở khoảng pH

6 – 8, đạt cực đại ở pH 8 và giảm dần ở pH 8 – 9 [4]

 Ảnh hưởng của các yếu tố hoạt hóa enzym: Ion Ca2+ ở nồng độ 1 mM làm tăng 6% hoạt tính enzym [4], một số nghiên cứu cho thấy ion Ca2+ làm bền vùng trung tâm hoạt động của enzym

 Ảnh hưởng của các yếu tố ức chế hoạt động enzym:

Ethylendiamintetraacetic (EDTA) ức chế mạnh hoạt động của lipase, nó ức chế 70% hoạt động của enzym ở nồng độ 1 mM Bên cạnh đó, dithiothreitol (DTT) (làm giảm số liên kết disulfid) và 2-mercaptoethanol (phá vỡ liên kết disulfid) có thể ức chế hoạt động enzym ở nồng độ 10 mM Ngoài ra, acid phenylboronic ức chế hoạt động của enzym ở nồng độ 10 mM bằng cách ức chế trung tâm hoạt động, so-dium dodecyl sulfat (SDS) ức chế hoàn toàn khả năng xúc tác của lipase ở nồng độ 1% [17]

Một số ion kim loại có xu hướng làm giảm hoạt tính enzym Ion Pb2+ làm giảm 11% hoạt tính enzym ở nồng độ 1 mM, ức chế hoàn toàn enzym ở 10 mM, có thể do nồng độ quá cao làm thay đổi cấu hình không gian của enzym hay ngăn cản

sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất Các ion khác như Zn2+, Cu2+, Na+ cũng làm giảm 25 - 50% hoạt tính enzym ở các nồng độ 1 mM và 10 mM [4]

1.3.4 Ứng dụng trong y dược

Trong y dược, lipase G.candidum được ứng dụng với nhiều vai trò khác nhau

16

như: là thành phần của một số chế phẩm hỗ trợ tiêu hóa, là công cụ xúc tác cho nhiều phản ứng trong công nghiệp hóa dược…Trong đó, ứng dụng được biết đến nhiều nhất là xúc tác cho phản ứng thủy phân dầu sản xuất các acid béo không bão hòa (PUFA) ω-3, ω-6, hoặc ω-9 Gamma-linoleic acid (GLA) là một ví dụ GLA (18:3, cis-6,9,12-octadecatrenoic acid) là một trong những hợp chất quan trọng trong họ n-6-eicosanoid, cấu tạo nên lipid của một vài loài thực vật và vi sinh vật GLA được biết đến như là một thực phẩm chức năng hiệu quả để góp phần điều trị hội chứng tiền kinh [20], ung thư [23], một số bệnh về da [31] và tăng lipid máu [61] Một số nghiên cứu đã chứng minh vai trò có ý nghĩa của các acid béo không bão hòa (PUFA) omega-6 trong điều trị tăng huyết áp [28] Khi sàng lọc 352 chủng

vi sinh vật sinh tổng hợp lipase trên cả môi trường nuôi cấy rắn và lỏng, lipase

G.candidum là enzym duy nhất có khả năng xúc tác thủy phân đặc hiệu liên kết

es-ter của GLA trong dầu cây lưu ly (borage oil), làm tăng hàm lượng GLA lên 21,6% tổng số acid béo thu được [32]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy lipase từ G.candidum 4013 là chất xúc tác

hiệu quả để tổng hợp ester tiền thuốc điều trị virus herpes từ hỗn hợp racemic (2,3-dihydroxypropyl)adenin (DHPA) trong dung môi dimethylformamid với vinyl ester của các acid khác nhau như acetat, butyrat, decanoat, laurat, palmitat nhờ khả năng xúc tác đặc hiệu lập thể (Hình 1.10) Việc sản xuất tiền thuốc dạng ester sẽ giúp cải thiện sinh khả dụng đường uống và nâng cao hiệu quả điều trị của DHPA [16]

9-Hình 1.10 Ester hóa 9-(2,3-dihydroxypropyl)adenin có lipase xúc tác [16]

17

1.3.5 Tình hình nghiên cứu lipase từ chủng Geotrichum candidum trên thế giới

và ở Việt Nam

Trên thế giới, các đặc tính quan trọng của lipase từ chủng G.candidum được

các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ rất sớm như: tính đa hình gen [11]; bộ ba acid amin tại vùng trung tâm hoạt động [48]; tính xúc tác đặc hiệu [41] [47]; v.v Trong bối cảnh nhu cầu lipase không ngừng tăng, các phương pháp tăng hiệu suất

sản xuất lipase cũng được nghiên cứu rất nhiều như công trình của Gopinath et al.,

2003 [35], Burkert et al., 2004 [22] hay Galvão de Morais et al., 2016 [33], …

Trong đó, các nhà khoa học sử dụng nhiều phương án khác nhau, nhưng đa số các nghiên cứu tiến hành sàng lọc các yếu tố bằng ma trận Plackett - Burman hoặc bằng thí nghiệm khảo sát sau đó tối ưu hóa bằng phương án giai thừa, Box - Behnken hoặc cấu trúc có tâm tùy thuộc vào số yếu tố tối ưu hóa và yêu cầu của thí nghiệm

Bên cạnh đó, nghiên cứu điều kiện tinh sạch lipase từ G.candidum cũng là một

hướng nghiên cứu được các nhà khoa học vô cùng quan tâm Với pI nằm trong khoảng 4 – 5, lipase thường được tinh sạch bằng sắc kí trao đổi ion sau bước tinh sạch sơ bộ bằng tủa protein [79] Đồng thời, cũng có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc kí lọc gel [35], [57] hoặc sắc kí ái lực để thay thế sắc kí trao đổi ion Nhằm mục đích nâng cao độ sạch của enzym, các phương pháp sắc kí này cũng được phối hợp với nhau một cách hợp lí [55], [40], [56], [24] Song song với các nghiên cứu kể trên, ứng dụng của lipase cũng được mở rộng nghiên cứu trên mọi lĩnh vực, đặc biệt là trong các ngành công nghiệp chất tẩy rửa và thực phẩm Gần đây, ứng dụng trong y dược của loại enzym này cũng nhận được sự quan tâm vô cùng lớn, không chỉ là thực phẩm hỗ trợ tiêu hóa và tim mạch, lipase còn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất các acid béo thiết yếu ω-3, 6, 9 Đặc biệt, lipase còn là một công cụ hiệu quả trong công nghiệp hóa dược nhờ khả năng xúc tác đặc hiệu lập thể, phân lập các đồng phân trong hỗn hợp racemic giúp tăng hiệu suất sản xuất, tăng hiệu quả điều trị của hoạt chất thu được

Ở Việt Nam, mặc dù lipase đã được nghiên cứu rất nhiều và từ rất sớm

nhưng nghiên cứu về lipase từ chủng G.candidum còn rất nhiều hạn chế Năm 2006,

18

Viện Công nghệ sinh học đã phân lập thành công chủng G.candidum Geo26.3 và

nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng đã gặt hái được những thành công đầu tiên trong quá trình nghiên cứu về loại lipase này: tái tổ hợp, tối ưu sinh tổng hợp lipase bằng phương pháp truyền thống [5], đánh giá tính chất lí hóa của lipase [4] Để tiếp

nối chuỗi nghiên cứu về chủng G.candidum, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu

tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp lipase bằng phương pháp đáp ứng bề mặt và

bước đầu tinh sạch loại enzym này

19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Chủng giống, hóa chất, thiết bị

2.1.1 Chủng giống

Chủng G.candidum Geo26.3 được cung cấp bởi phòng Công nghệ sinh học

Enzyme - Viện Công nghệ sinh học Chủng được hoạt hóa trong môi trường Sabouraud dextrose (SD), nuôi lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 30oC, trong 24h

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng đều đạt tiêu chuẩn phân tích, được liệt kê ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng Tên hóa chất Hãng sản xuất (nước)

Acrylamid và bis-acrylamid Merck ( Đức)

Cao nấm men Bio Basic Canada Inc (Canada)

Bột đậu tương, bột mỳ, dầu đậu nành đều đạt tiêu chuẩn của nhà sản xuất tại Việt Nam

Dung dịch và đệm

Các dung dịch và đệm sử dụng được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong bảng 2.2

20

Bảng 2.2 Thành phần các loại đệm và dung dịch

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Dung dịch nhuộm PAGE 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v)

methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch tẩy PAGE 60% (v/v) H2O; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid

acetic Đệm điện di protein 20 mM Tris-HCl; 192 mM glycerin; 0,1% (w/v) SDS;

pH 8,8 Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl; pH 8,8

Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8

Dung dịch C 30% acrylamid; 0,8% bis-acrylamid

Dung dịch APS 10% amoni persulfat

Các hóa chất thông thường khác: NaOH, HCl, ethanol, nước khử RO Các

hóa chất này đều đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường SD: 4% (w/v) glucose; 2% (w/v) pepton; pH 5,5 - 6,0 Môi trường rắn Sabouraud dextrose agar (SDA) được bổ sung 2% (w/v) agar

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phòng Công nghệ sinh học enzym, Viện công nghệ sinh học và Bộ môn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà Nội được liệt kê ở bảng 2.3

21

 Dụng cụ thủy tinh: đĩa petri, cốc có mỏ, ống đong, chai đựng hóa chất

 Dụng cụ nhựa khác: hộp đựng mẫu, giá để ống eppendorf, giá để ống falcon Các dụng cụ đều đạt chuẩn phân tích

Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng

Box cấy vi sinh vật clean bench TTCG Công nghệ (Việt Nam)

Máy đo hoạt tính lipase 718 STAT Titrino Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy lắc rung ổn nhiệt ProvocellTM Esco (Mỹ)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố

ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp lipase của G.candidum Geo26.3: nguồn

car-bon và nitrogen hữu cơ, nguồn nitrogen vô cơ và nồng độ của chúng, nồng độ cơ chất cảm ứng, thời gian lên men; lựa chọn 3 yếu tố để tiến hành tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt, phương án cấu trúc có tâm (RSM - CCD) Sau khi tìm ra điều kiện sinh tổng hợp lipase tối ưu, chúng tôi tiến hành tinh sạch sơ bộ bằng amoni sulfat và đánh giá mức độ tinh sạch lipase từ môi trường nuôi cấy Quá trình nghiên cứu được mô tả tóm tắt ở sơ đồ 2.1

2.3.1.2 Lên men sinh tổng hợp lipase

Chủng giống trong môi trường SD được cấy truyền sang môi trường lên men, nuôi lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 30oC

2.3.2 Xác định hoạt tính enzym lipase

2.3.2.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch

Nguyên lý: Dựa vào khả năng thủy phân tributyrin 0,2% của lipase Hoạt

tính enzym được đánh giá theo bán kính vòng sáng do lipase thủy phân tributyrin

tạo ra

23

Quy trình: Tạo các giếng thạch có đường kính 8 mm Nhỏ 50 μl dịch nổi lên

men trên giếng thạch và ủ ở nhiệt độ 37oC qua đêm Đo bán kính vòng sáng do pase thủy phân tributyrin tạo ra để đánh giá hoạt tính của lipase [2]

li-2.3.2.2 Phương pháp chuẩn độ pH tự động

Nguyên lý: Dựa vào khả năng thủy phân lipid của lipase, sau phản ứng các

acid béo được giải phóng làm thay đổi pH của môi trường Lượng acid béo giải phóng đặc trưng cho hoạt tính của enzym Xác định lượng acid béo tạo ra trong một khoảng thời gian nhất định bằng lượng NaOH 10 mM cần bổ sung để duy trì pH cố định (pH 8) Hiệu số giữa lượng NaOH 10 mM cần dùng sau và trước khi bổ sung enzym đặc trưng cho hoạt tính xúc tác của lipase

Một đơn vị hoạt tính của enzym là lượng enzym để giải phóng 1 μmol acid béo trong 1 phút ở điều kiện nhất định [3], [65]

Quy trình: gồm 2 bước:

Chuẩn bị dịch cơ chất: hỗn hợp cơ chất gồm 2% (v/v) dầu đậu nành và 1%

(w/v) gum arabic được đánh huyền phù 10 phút bằng máy xay sinh tố

Đo hoạt tính: 20 ml dịch cơ chất được đưa vào cốc phản ứng đặt trên máy

khuấy từ của máy đo pH tự động Cốc được giữ nhiệt độ ổn định ở 40oC bằng nước bơm từ bể ổn nhiệt Thêm 370 μl dung dịch CaCl2 22%, đợi ổn định ở pH 8 Đo độ

tự thủy phân của dung dịch cơ chất bằng thể tích dung dịch NaOH 10 mM bơm vào

để giữ pH 8 ổn định trong 10 phút Sau đó thêm 100 μl dịch chứa enzym, xác định thể tích dung dịch NaOH 10 mM bơm vào để giữ pH 8 ổn định trong 10 phút

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới khả năng sinh tổng hợp lipase ở chủng G.candidum Geo 26.3

Lần lượt tiến hành khảo sát các yếu tố: nguồn carbon và nitrogen hữu cơ, thời gian lên men, nồng độ cao nấm men, nồng độ dầu đậu nành, và nồng độ amoni nitrat bằng cách thay đổi yếu tố khảo sát và giữ nguyên các yếu tố còn lại Kết quả của thí nghiệm khảo sát trước được sử dụng cho thí nghiệm khảo sát sau [6], [51]

24

Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần

2.3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitrogen hữu cơ

Các nguồn dinh dưỡng được lựa chọn là: bột mỳ (BM), bột đậu tương (BĐT)

và cao nấm men (CNM) Để khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng này lên

khả năng sinh tổng hợp lipase, chúng tôi tiến hành nuôi cấy G.candidum Geo26.3

trong môi trường lên men chứa 1% (w/v) đơn độc hoặc phối hợp các nguồn dinh dưỡng kể trên; 1% (v/v) dầu đậu nành (DĐN) và 0,2% (w/v) amoni nitrat (AN)trong 72h

Bảng 2.4 Thành phần môi trường khảo sát nguồn carbon và nitrogen hữu cơ

độ pH tự động

2.3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Tiến hành nuôi cấy G.candidum Geo26.3 trong môi trường lên men chứa 1%

(w/v) BĐT; 1% (w/v) CNM; 1% (v/v) DĐN; và 0,2% (w/v) AN Tại các thời điểm 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h; lấy 1ml môi trường lên men; li tâm ở 4000