SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN KHỬ CHLOR YẾM KHÍ 2,3,7,8 – TETRACHLORODIBENZO – P DIOXIN CHO ĐẤT/BÙN Ô NHIỄM CHẤT ĐỘC DA CAM

THỬ NGHIỆM CÁC CẶP MỒI CHUYÊN BIỆT NHẮM VÀO GENE 16S rRNA VÀ GENE CHỨC NĂNG DEHALOGENASE KHỬ CHLOR YẾM KHÍ DIOXINS CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN BẢN ĐỊA67 2.1 Sự hiện diện và đa dạng của các

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN KHỬ

CHLOR YẾM KHÍ 2,3,7,8 – TETRACHLORODIBENZO – P

DIOXIN CHO ĐẤT/BÙN Ô NHIỄM

CHẤT ĐỘC DA CAM

Mã số: B2011–16–03

Chủ nhiệm đề tài: Ths Châu Thị Anh Thy

Cần Thơ, Tháng 12–2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN KHỬ

CHLOR YẾM KHÍ 2,3,7,8 – TETRACHLORODIBENZO – P

DIOXIN CHO ĐẤT/BÙN Ô NHIỄM

CHẤT ĐỘC DA CAM

Mã số B2011–16–03

Xác nhận của cơ quan Chủ nhiệm đề tài

chủ trì đề tài

Ths Châu Thị Anh Thy

Cần Thơ, Tháng 12–2014

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

1 Ths Châu Thị Anh Thy Bm Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ

2 Ts Dương Minh Viễn Bm Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ

3 Ts Trần Văn Dũng Bm Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ

4 Ts Trần Nhân Dũng Viện NCPT CNSH, ĐH Cần Thơ

5 Ts Đỗ Thị Xuân Bm Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ

6 Ks Nguyễn Thị Thu Hà Bm Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ

7 HVCH Lâm Tử Lăng Bm Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ

8 HVCH Diệp Nguyễn

Diễm Châu Bm Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ

9 Ks Nguyễn Vũ Bằng Bm Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ

10 Ths Nguyễn Thị Tố Quyên Bm Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

1 PGS Ts Nils Hogberg Đại học Nông nghiệp Upsala Thụy Điển

2 Gs Ts Max M Haggblom ĐH Rutgers, Hoa Kỳ

MỤC LỤC

Trang Mục lục i

Danh sách hình v

Danh sách bảng viii

Danh sách từ viết tắt x

Thuyết minh đề tài xi

Thông tin kết quả nghiên cứu tiếng Việt xiii

Thông tin kết quả nghiên cứu tiếng Anh xvii

CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1

I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1

1 Tổng quan về dioxins và dibenzofurans 1

1.1 Cấu trúc hóa học của dioxins và dibenzofurans 1

1.2 Độc tính của dioxins và cơ chế ảnh hưởng lên sức khỏe con người và động vật……… 2

1.3 Nguồn gốc phát sinh dioxins trong môi trường……… 3

1.4 Tính chất của dioxins trong môi trường 4

1.5 Sự tích tụ dioxins trong môi trường và trong chuỗi thức ăn 4

2 Tình hình ô nhiễm dioxins trên thế giới và ở Việt Nam 5

2.1 Ô nhiễm dioxins trên thế giới 5

2.2 Ô nhiễm dioxins ở Việt Nam 6

2.2.1 Nguyên nhân ô nhiễm dioxins ở Việt Nam 6

2.2.2 Mức độ ô nhiễm dioxins tại một số điểm nóng ở Việt Nam và ảnh hưởng của sự lưu tồn dioxins đến sức khỏe con người 7

3 Một số biện pháp khắc phục ô nhiễm dioxins 10

3.1 Phương pháp xử lý hoá học, lý học và cơ học 10

3.2 Phương pháp phân hủy sinh học 10

4 Sự khử chlor của các hợp chất PCDDs/Fs bởi vi khuẩn kỵ khí 11

5 Giới thiệu gene chuyên biệt 16S rRNA và gene chức năng dehalogenase khử

chlor của vi sinh vật 12

5.1 Gene 16S rRNA chuyên biệt 12

5.2 Gene chức năng dehalogenase (rdh) 13

6 Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong phân tích sự đa dạng cộng đồng vi sinh vật 14

6.1 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) 14

6.2 Phương pháp điện di biến tính tăng cấp (DGGE–Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 15

6.3 Phương pháp pyrosequencing 15

7 Phương pháp phân tích trên sắc ký khí khối phổ (GCMS – Gas Chromatography– Mass Spectrometry) 17

II TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 17

III MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 19

IV CÁCH TIẾP CẬN ĐỀ TÀI 19

V ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

VI PHẠM VI NGHIÊN CỨU 20

VII NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21

VIII PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

A PHƯƠNG TIỆN 21

B PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

Nội dung 1: Phân lập các dòng vi khuẩn yếm khí 22

Nội dung 2: Xác định gene 16S rRNA chuyên biệt và gene chức năng dehalogenase rdh khử chlor của các dòng vi khuẩn 25

Nội dung 3: Thiết kế và thử nghiệm các cặp mồi (primers) nhắm vào gene 16S rRNA chuyên biệt và gene chức năng dehalogenase rdh khử chlor yếm khí dioxins của các dòng vi khuẩn bản địa 32

Nội dung 4: Xây dựng quy trình ứng dụng phương pháp sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins 36

C PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 37

1 Phương pháp lấy mẫu 37

2 Phân tích dioxins 38

3 Phương pháp trích DNA 39

4 Phương pháp thực hiện phản ứng PCR với các mồi chuyên biệt nhắm vào 16S

rRNA gene và gene chức năng dehalogenase rdh 41

5 Phương pháp pyrosequencing 41

CHƯƠNG 1 PHÂN LẬP CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN KHỬ CHLOR YẾM KHÍ PCDDs 42

1.1 Đánh giá khả năng khử yếm khí chlor dioxins 1,2,3,4–TCDD của cộng đồng

vi khuẩn khu vực A Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị, Biên Hòa, Đà Nẵng 42

1.1.1 Khả năng khử yếm khí chlor 1,2,3,4–TCDD khu vực A Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị 42 1.1.2 Khả năng khử yếm khí chlor 1,2,3,4–TCDD khu vực Biên Hòa, Đà Nẵng45 1.1.3 Khả năng khử yếm khí chlor 1,2,3,4–TCDD trong thí nghiệm với mẫu thu tại A Lưới và Cùa của đợt lấy lần 2 48 1.1.4 Khả năng khử chlor yếm khí 1,2,3,4–TCDD khu vực Huế, Quảng Trị trên silica 49

1.2 Đánh giá khả năng khử yếm khí chlor dioxins 2,3,7,8–TCDD 50

1.2.1 Khả năng khử chlor yếm khí 2,3–DCDD và 2,3,7,8–TCDD tại khu vực A Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị 50 1.2.2 Lưu tồn dioxins và khả năng khử chlor yếm khí dioxins của cộng đồng vi khuẩn ở đất và bùn sân bay Biên Hoà và Đà Nẵng 51 1.2.3 Hoạt động khử chlor yếm khí 2,3,7,8–TCDD của cộng đồng vi khuẩn khu vực A Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị, Biên Hòa, Đà Nẵng 53 1.2.4 Khả năng khử chlor yếm khí 2,3,7,8–TCDD của cộng đồng vi khuẩn khu vực A Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị (thí nghiệm 2, mẫu lấy đợt 2) 54

1.3 Khảo sát đa dạng cộng đồng vi khuẩn khử yếm khí chlor dioxins 55

1.3.1 Khảo sát đa dạng cộng đồng vi khuẩn khử yếm khí chlor dioxins ở khu vực

A Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị 55 1.3.2 Sự đa dạng của cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins trong đất, bùn sân bay Biên Hoà 58 1.3.3 Đa dạng cộng đồng vi khuẩn khử chlor dioxins yếm khí trong đất và bùn sân bay Đà Nẵng 60

1.3.4 So sánh cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins ở sân bay Biên Hoà,

Đà Nẵng với một số vùng ô nhiễm khác như huyện A Lưới, Thừa Thiên Huế và xã

Cam Nghĩa, huyện Cam Lộ, Quảng Trị 62

CHƯƠNG 2 THỬ NGHIỆM CÁC CẶP MỒI CHUYÊN BIỆT NHẮM VÀO GENE 16S rRNA VÀ GENE CHỨC NĂNG DEHALOGENASE KHỬ CHLOR YẾM KHÍ DIOXINS CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN BẢN ĐỊA67 2.1 Sự hiện diện và đa dạng của các cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí PCDDs 63

2.1.1 Sự hiện diện của các cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí PCDDs 63

2.1.2 Kết quả chạy PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào gene 16S rRNA của 10 mẫu được chọn để chạy pyrosequencing 68

2.1.3 Khảo sát đa dạng cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins bằng phương pháp pyrosequencing 72

2.2 Sự hiện diện gene chức năng dehalogenase rdh của các cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí PCDDs 76

CHƯƠNG 3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN VI KHUẨN KHỬ CHLOR YẾM KHÍ DIOXINS 79

3.1 Quy trình thu mẫu đất/ bùn và trữ mẫu 79

3.2 Quy trình trích DNA 79

3.3 Quy trình thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào gene16S rRNA và các cặp mồi gene chức năng dehalogenase rdh 80

3.3.1 Quy trình thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào gene 16S rRNA 80

3.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào gene chức năng rdh 81

3.4 Quy trình điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 82

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84

4.1 KẾT LUẬN 84

4.2 KIẾN NGHỊ 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO 86

PHỤ CHƯƠNG 104

DANH SÁCH HÌNH

2 Cơ chế tạo ra sản phẩm phụ 2,3,7,8–TCDD trong quá trình

tổng hợp chất diệt cỏ 2,4,5–T

4

3 Phương thức loại bỏ Chlor của 1,2,3,4– TCDD (A) và

1,2,3,7,8– PeCDD (B) của loài Dehaloccoides sp dòng

CBDB1

11

1.2 Tốc độ và cách thức khử chlor 1,2,3,4–TCDD trong mẫu bùn

1.5 Hoạt động khử chlor yếm khí 1,2,3,4–TCDD trong mẫu đất sân

bay Biên Hòa (BHĐ) nuôi ủ với 1,2,3,4–TCDD theo thời gian

nuôi

45

1.6 Hoạt động khử chlor yếm khí 1,2,3,4–TCDD ở mẫu bùn sân

bay Biên Hòa

46

1.7 Hoạt động khử yếm khí chlor 1,2,3,4–TCDD trong bùn và đất

sau 7 tháng ủ

47

1.8 Hoạt động khử chlor 1,2,3,4–TCDD trong lọ ủ yếm khí với

bùn hồ Bàu Sen, sân bay Đà Nẵng

47

1.9 Hoạt động khử chlor yếm khí 1,2,3,4–TCDD trong đất và bùn

sau 38 tháng ủ (đợt lấy mẫu 2)

48

1.10 Khả năng khử chlor kỵ khí của cộng đồng vi khuẩn đối với

1,2,3,4–TCDD trong đất/bùn suối Vĩnh Phước, đập Mai Đàn,

đập Đội 4, sân bay Đà Nẵng, sân bay Biên Hòa

49

1.11 Hoạt động khử chlor kỵ khí của cộng đồng vi khuẩn đối với

1,2,3,4–TCDD khi chuyển sang môi trường mới

50

1.13 Sự khử chlor 2,3,7,8–TCDD bởi vi khuẩn yếm khí hồ Lâm Ly 51

1.14 Hoạt động khử chlor dioxins trong nghiệm thức không cấy

dioxins sau 7 tháng ủ

53

1.16 Hoạt động khử yếm khí chlor 2,3,7,8 –TCDD trong bùn và đất

sau 38 tháng ủ

55

1.17 Vi khuẩn ngành Chloroflexi trong các mẫu đất/bùn có khả

năng khử yếm khí chlor dioxins

56

1.18 Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ một số loài vi khuẩn thuộc

nhóm Chloroflexi có trong các mẫu bùn/đất tại A lưới và Cam

Nghĩa, Quãng Trị với nhau và với một số loài vi khuẩn yếm

khí khử chlor được biết trên thế giới

57

1.19 Điện di đồ sản phẩm PCR của nhóm vi khuẩn khử chlor

Chloroflexi trong mẫu đất và bùn Biên Hoà với cặp mồi

338F/1101R

58

1.20 Kết quả chạy DGGE các mẫu bùn sân bay ở các mẫu đối

chứng sống (ĐCS) 7 tháng nuôi, mẫu bắt đầu, ủ với 1,2,3,4–

TCDD và 2,3,7,8–TCDD

59

1.21 Kết quả chạy DGGE các mẫu đất sân bay ở các mẫu đối chứng

sống ở các tháng nuôi, mẫu bắt đầu nuôi với 1,2,3,4–TCDD và

2,3,7,8–TCDD

60

1.22 Điện di đồ sản phẩm PCR của nhóm vi khuẩn khử chlor

Chloroflexi trong các nghiệm thức bùn hồ Bàu Sen với cặp mồi

338F/1101R

61

1.23 Điện di đồ sản phẩm PCR (DGGE) của các nghiệm thức hồ

Bàu Sen, sân bay Đà Nẵng

61

1.24 So sánh đa dạng cộng đồng khử chlor yếm dioxins ở bùn sân

bay Biên Hoà, Đà Nẵng và một số ô nhiễm khác như: hồ Lâm

Ly, Huyện A Lưới, Thừa Thiên Huế (TTH) và Đập Đội 4, Xã

Cam Nghĩa, huyện Cam Lộ, Quảng Trị

62

2.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi DHC730F/DHC1350R 69

2.7 Phần trăm sự hiện diện của các ngành (phylum) được xác định

bằng phương pháp pyrosequencing có trong 10 nghiệm thức

74

2.8 Tỉ lệ mole còn lại của ba hoạt chất 1,2,3,4–TCDD, 23–DCDD

và 2,3,7,8–TCDD tại thời điểm lấy mẫu của 10 nghiệm thức

74

2.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi rdh01F/01R 78 2.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi rdh02F/02R 78 2.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi rdh06F/06R 78

DANH SÁCH BẢNG

1 Hệ số độc chất tương đương TEF theo hệ thống quốc tế (I–

TEFs; Kutz et al., 1990) và theo Tổ chức Y tế Thế giới WHO

(WHO–TEFs; Van Den Berg et al., 1998, 2000)

3

2 Hàm lượng dioxins chứa trong một số hợp chất khai hoang 7

3 Dư lượng dioxins trong động vật và các sản phẩm nông

nghiệp ở A Lưới

8

5 Ngưỡng dioxins trong đất và bùn tại các điểm bị ô nhiễm

nặng dioxins tiêu chuẩn quốc gia (TCVN 8183 : 2009)

8 Danh sách các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào gene 16S

rRNA của các vi khuẩn kỵ khí khử chlor các hợp chất hữu cơ

26

9 Trình tự các cặp mồi nhắm vào gen dehalogenase rdh 29

10 Thông tin 28 mẫu trích DNA được chạy PCR với cặp mồi

chuyên biệt cho gene 16S rRNA và gene chức năng rdh

33

11 Thông tin về 10 cộng đồng vi khuẩn (10 nghiệm thức) được

lựa chọn khảo sát đa dạng bằng phương pháp

pyrosequencing

36

12 Danh sách những mẫu đất được lấy ở các vùng từng bị rãi

chất độc da cam của huyện A Lưới, Thừa Thiên Huế; địa bàn

Cùa, Quảng Trị, sân bay quân sự cũ Đà Nẵng và sân bay

Biên Hòa

37

1.1 Lưu tồn dioxins trong đất/bùn (pg/g, trọng lượng khô) 51 2.1 Tổng hợp kết quả PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm

vào gene 16S rRNA của các mẫu trích DNA từ thí nghiệm

khảo sát khả năng khử chlor dioxin yếm khí

63

2.2 Tổng hợp kết quả PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm

vào gene 16S rRNA của các mẫu được chọn chạy

pyrosequencing

68

2.3 Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR với 26 cặp mồi thiết kế

cho gene dehalogenase

76

3.1 Chu trình luân nhiệt thực hiện phản ứng PCR các mồi

chuyên biệt nhắm vào gene 16S rRNA

81

3.2 Chu trình luân nhiệt thực hiện phản ứng PCR các mồi gene

chức năng dehalogenase (rdh)

81

DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

GCMS – QP 2010 Gas Chromatography Mass Spectometry QP–2010

NCBI National Center for Biotechnology

PCDDs Polychlorodibenzo–p–dioxins

PCDFs Polychlorinated dibenzofurans

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

1 TÊN ĐỀ TÀI

Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện

nhanh cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí

XH–NV

Nông

Giáo dục Dược Y Sở hữu trí tuệ

4 LOẠI HÌNH NGHIÊN CỨU

Cơ bản

Ứng dụng

Triển khai

x

5 THỜI GIAN THỰC HIỆN 24 tháng

Từ tháng 01 năm 2011 đến tháng 12 năm 2012

6 CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

Tên cơ quan: Trường Đại học Cần Thơ

Điện thoại: 0710–3831530

E–mail: dhct@ctu.edu.vn

Địa chỉ: Đường 3/2, Q Ninh Kiều, TP Cần Thơ

Họ và tên thủ trưởng cơ quan chủ trì: Nguyễn Anh Tuấn

7 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Họ và tên: Dương Minh Viễn

Chức danh khoa học: Giảng viên

Địa chỉ cơ quan: Bm Khoa học Đất

Cần Thơ Điện thoại nhà riêng:

Fax:

8 NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

TT Họ và tên Đơn vị công tác và

ĐH Cần Thơ

Bm Khoa học Đất,

vi sinh vật đất, ĐH

Hổ trợ thiết bị, kỹ thuật, tư vấn chuyên môn trong lĩnh vực sinh học phân tử

Tham gia thiết kế kiểm tra primers

9 ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Tên đơn vị

trong và ngoài nước Nội dung phối hợp nghiên cứu

Họ và tên người đại diện đơn vị

1 Bm Sinh hoá & Vi sinh,

Springael

10 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI Ở TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

10.1 Ngoài nước (phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài trên thế

giới, liệt kê danh mục các công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài được trích dẫn khi đánh giá tổng quan)

Dioxins là nhóm hợp chất có gồm có hai vòng thơm nối với nhau qua một hoặc hai cầu nối oxy Chúng có thể bị chlor hoá từ 0 đến 8 chlor và được gọi theo tiếng Anh là

Polychlorinated dibenzo–p–dioxins và Polychlorinated Dibenzofurans (PCDD/Fs) Các chất

dioxins thuộc nhóm PCDD/Fs có mức độ độc hại khác nhau tuỳ thuộc vào số chlor và vị trí của chúng Độc tính của các chất PCDD/Fs được phân loại dựa trên chỉ số độc tương đương TEF của WHO Trong đó, chất dioxin chứa 4 chlor 2,3,7,8 TCDD/Fs độc nhất và có chỉ số TEF bằng 1 Quá trình phân huỷ sinh học dioxins trong tự nhiên được thực hiện chủ yếu bởi một số loài vi sinh vật chuyên biệt thuộc nhóm hiếu khí hoặc yếm khí (Mohn and Tiedje, 1992) Nhóm yếm khí khử chlor có vai trò rất quan trọng trong phân hủy dioxins có mức chlor hóa cao (lớn hơn hai chlor) vì thường chúng không thể bị phân hủy dưới tác động của vi khuẩn phân hủy

hiếu khí Ngoài ra, sự khử chlor cũng làm giảm độc tính của dioxins, đặc biệt đối với 2,3,7,8– tetrachlorodibenzo–p–dioxin

Hoạt động khử chlor yếm khí PCDD/Fs trong môi trường đất/bùn ô nhiễm có thể được xác định dựa trên sự hiện diện các sản phẩm dioxins con (dioxins có mức chlor thấp hình thành

từ sự khử chlor của các dioxins có mức chlor hoá cao hơn) qua phương pháp phân tích trực tiếp (phân tích các mẫu đất/bùn lấy từ môi trường) và gián tiếp (phân tích các mẫu đất/bùn được ủ yếm khí và có bổ sung dioxins trước khi ủ) Với phương pháp trực tiếp, tất cả các hợp chất dioxins trong mẫu đất/bùn cần được ly trích và làm sạch theo quy trình phức tạp và nghiêm ngặt với sử dụng nhiều dung môi khác nhau để trích như toluene, acetone, dichloromethane Dung dịch chứa dioxins sau khi trích cần được làm sạch để loại bỏ các tạp chất hữu cơ khác có thể ảnh hưởng lên độ nhạy và kết quả phân tích dioxins như các cột ly tách chứa silica và alumina (Dwernychuk et al., 2002; Lohmann et al, 1998) Đối với đất/bùn được gọi là ô nhiễm dioxins nặng như sân bay Aso thì tổng hàm lượng các chất chỉ đạt khoảng 1000 pg/g (Dwernychuck et al, 2002) Với hàm lượng thấp như vậy việc phân tích cần thiết bị có độ nhạy rất cao là sắc ký khối phổ có độ phân giải cao HRGC/HRMS (Dwernychuk et al, 2002; Lohman, 1998) và đây là thiết bị rất hiện đại và đắt tiền nên ít phòng thí nghiệm trên thế giới

có được Do đó, ở Việt Nam do thiếu phương tiện nên việc thực hiện phân tích dioxins trong mẫu đất/bùn thu từ vùng ô nhiễm có nhiều trở ngại Hơn nữa, ngay cả khi phát hiện các chất dioxins có số chlor hoá thấp trong môi trường chưa hẳn 100% nói lên được trong đất có hoạt động khử chlor do có khả năng chúng đã hiện diện sẵn trong thuốc khai hoang màu da cam Đối với phương pháp gián tiếp, do có bổ sung thêm dioxins vào trong mẫu trước khi ủ nên trong trường hợp trong mẫu có vi khuẩn yếm khí khử chlor chất dioxin được cấy vào, thì sau thời gian ủ khoảng vài tháng nếu hoạt động khử chlor yếm khí xảy ra thì có khả năng sẽ xuất hiện các sản phẩm dioxins con Do mẫu được cấy thêm dioxin nên hàm lượng các sản phẩm con cũng sẽ cao và có thể kiểm tra sự hiện diện của chúng trên máy sắc ký khối phổ GC/MS sau khi trích và làm sạch mẫu Như vậy, cả hai phương pháp đều có những trở ngại chung là quá trình trích mẫu tốn nhiều thời gian, phức tạp, hóa chất rất đắt tiền, cần độ tinh khiết cao, thiết bị rất hiện đại Ngoài ra, các phòng thí nghiệm đáp ứng đủ các tiêu chuẩn để phân tích được dioxins rất ít ở Việt Nam Đối với phương pháp gián tiếp còn có thêm trở ngại là phải bổ sung thêm dioxins và cần thời gian ủ dài, mất nhiều thời gian Tuy thiết bị để phân tích trong phương pháp gián tiếp là GC/MS thông thường, nhưng đây cũng là thiết bị rất đắt tiền và ít phòng thí nghiệm có Ngoài ra, dioxins là hóa chất rất đắt tiền và độc hại nên việc bổ sung dioxins vào mẫu ủ có nhiều bất cập

Hiện nay phương pháp sinh học phân tử được ứng dụng rất nhiều vào trong việc xác

định sự hiện diện, sự đa dạng và hoạt động chức năng của các loài vi sinh vật từ các mẫu đất/bùn thu từ môi trường Ưu điểm của các phương pháp sinh học phân tử cho phép có thể kiểm tra sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên thông qua sự hiện diện của một chuổi DNA hoặc gene đặc trưng nào đó của chúng không cần qua sự nuôi cấy trước trong môi trường nhân tạo Với bộ kit đặc hiệu để chạy PCR cho chủng loài nào đó có thể dễ dàng nhận dạng chúng trong môi trường Như vậy, phương pháp sinh học phân tử tránh được yếu điểm của phương pháp nuôi cấy trong môi trường nhân tạo là nhiều vi sinh vật không thể tồn tại được trong môi trường nhân tạo Đồng thời với bộ kit đặc hiệu việc nhận biết cộng đồng vi sinh vật than gia khử chlor yếm khí cũng dễ dàng và ít tốn chi phí, thời gian và chính xác hơn nhiều

so với phương pháp phân tích hoá học Hiện nay, nhiều nghiên cứu ở nước ngoài đã phân lập một số dòng vi khuẩn khử chlor yếm khí một số các hợp chất hữu cơ chứa chlor như

tetrachloroethane (TCE), PCB và polychlorinated dioxins… như Dehalococcoides cbdb1, 195,

BAV1 và FL2 ( (Bunge et al 2003, He at al 2002, Loffler et al 2002) Một số dòng vi khuẩn

yếm khí thuộc Dehalococcoides có thể khử chlor yếm khí PCDD/Fs bởi enzyme dehalogenase (rdh) và Viện nghiên cứu Genomic đã tìm thấy gần 17 gene có khả năng tham gia khử chlor trong dòng Dehalococcoides ethenogen 195 (Villemur et al, 2002) Phần lớn vi khuẩn yếm khí khử chlor thuộc họ Cloroflexi và một số primers đặc hiệu cũng đã được phát triển để nhận diện

và đánh giá tính đa dạng của chúng (Watts et al 2005)

Tài liệu liên quan:

Bunge M., L Adrian, A Kraus, M Opel, W Lorenz, J Andreesen, H Gorish, U Lechner

2003 Reductive dehalogenation of chlorinated dioxins by anaerobic bacterium Letters to nature Natural Publishing Group

He, J., Y Sung, M E Dollhopf, B Z Fathepure, J M Tiedje, and F E Löffler 2002 Acetate

versus hydrogen as direct electron donors to stimulate the microbial reductive dechlorination

process at chloroethene–contaminated sites Environ Sci Technol 36: 2945–3952

Loffler, F.E., Q Sun, J Li and J.M Tiedje 2002 16S rRNA gene –based detection of

tetrachloroethene–dechlorinating Desulforomonas and Dehaloccocoides species Appl Environ Microbiol 66: 1369–1374

Maymo–Gatell X, Chien Y, Gossett JM, Zinder SH 1997 Isolation of a bacterium that reductively dechlorinates tetrachloroethene to ethene" Science 276 (5318): 1568–1571

Mohn, W W., and J M Tiedje 1992 Microbial Reductive Dehalogenation Microbiological

reviews Vol.56, No 3, 482–507

Villemur, R., M Saucier, A., Gauthier, R Beaudet Can J Microbiol 2002, 48, 697–706

Watts, J E M., S K Fagervold, K R Sowers And H D May 2005 A PCR based specific

assay reveals a population of bacteria within the Chloroflexi associated with the reductive dehalogenation of polychlorinated biphenyls Microbiology 2: 710–719

10.2 Trong nước (phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở Việt

Nam, liệt kê danh mục các công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài được trích dẫn khi đánh giá tổng quan)

Theo thông tin của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường mức độ ô nhiễm dioxins tại một số điểm nóng ở Việt Nam hiện nay vẫn còn cao, được các cơ quan chức năng nghiên cứu và đặc biệt quan tâm là các khu vực sân bay quân sự cũ như Aso (thuộc huyện A Lưới), sân bay Đà Nẵng, Phù Cát, Biên Hòa Cho đến nay các nghiên cứu về dioxins ở Việt Nam phần lớn tập trung vào nghiên cứu dư tồn dioxins trong đất, xâm nhập của chúng vào con người qua chuổi thức ăn ở các vùng ô nhiễm và tác động lên sức khoẻ của con người như: Dự án “Giải quyết hậu quả của

các chất diệt cỏ và phát quang tại vùng A Lưới – tỉnh Thừa Thiên Huế” của Uỷ ban 10–80 là đề

tài có nhiều nghiên cứu sâu về tác động của chất diệt cỏ Mỹ sử dụng trong chiến tranh ở Việt Nam tác động lên môi trường và con người; Nghiên cứu của tổ chức Hatfield tại khu vực A

Lưới cũng cho thấy dư tồn cao của chất độc dioxins trong đất và sự xâm nhiễm dioxin vào cơ thể động vật và người sống trong khu vực theo chuỗi thức ăn (Dwernychuk et al 2002) Tuy nhiên các nghiên cứu về phân hủy sinh học dioxins ở nước ta chưa được thấy trình bày trong các tạp chí Khoa học trong và ngoài nước Trong dự án “Tồn dư dioxins và phân lập vi khuẩn phân huỷ dioxins vùng nhiễm chất độc da cam A Lưới, Thừa Thiên Huế” do quỹ nghiên cứu khoa học quốc tế IFS tài trợ, tác giả bản thuyết minh đề tài cũng đã phân lập được một số dòng

vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân huỷ dibenzofuran không chứa chlor (tài liệu chưa xuất bản) Trong nghiên cứu khác chưa được công bố được thực hiện trong thời gian nghiên cứu sau

tiến sĩ 2008–2009 tại Bộ môn Sinh hóa, Trường ĐH Quốc gia bang New Jersey (ĐH Rutgers),

tác giả bản thuyết minh đã nuôi cấy, làm giàu được một số cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí khử chlor dioxins (một mắt xích đặc biệt quan trọng trong khử độc dioxins bằng biện pháp

sinh học, nhất là đối với 2,3,7,8–tetrachlorodibenzo–p–dioxin, chất độc nhất trong nhóm chất

dioxins) từ các mẫu đất/bùn thuộc khu vực A Lưới, Huế và Cam Lộ, Quãng Trị Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy sự đa dạng trong cách thức khử chlor và tính thường trú khá cao của một số dòng vi khuẩn tại A Lưới và Cam Lộ

Tài liệu liên quan:

Dwernychuk, L W., Hoang, D C., Hatfield C T., Boivin T G., Tran, M H., Phung, T D.,

Nguyen, D T 2002 Dioxin reservoirs in southern Viet Nam – A legacy of Agent Orange Chemosphere 47: 117–137

10.3 Danh mục các công trình đã công bố thuộc lĩnh vực của đề tài của chủ nhiệm và những

thành viên tham gia nghiên cứu (họ và tên tác giả; bài báo; ấn phẩm; các yếu tố về xuất bản)

Dương Minh Viễn: Tồn dư dioxins và phân lập vi khuẩn phân huỷ dioxins vùng nhiễm chất độc da cam A Lưới, Thừa Thiên Huế Đề tài NCKH được tài trợ của IFS, 2006 (Quỹ Nghiên cứu Khoa học Quốc tế)

Dương Minh Viễn: Nghiên cứu sau tiến sĩ tại ĐH Rutgers, Mỹ về “Khử chlor yếm khí

dibenzo–p–dioxins trong đất/bùn của vùng bị phun chất độc da cam” dưới tài trợ của Quỹ Giáo dục Việt Nam (Vietnam Education Foundation) 2008–2009

Dương Minh Viễn: Khả năng phân hủy dioxins bị chlor hóa của quần thể vi khuẩn hiếu khí và yếm khí Đề tài NCKH cấp Bộ 2009

Tran Van Dung, D.M Vien, V.T Guong, Domingues P., Merckx R., Springael D 2010

Diversity of the Actinomycetes Community Colonising Rice Straw Residues in Cultured

Soil Undergoing Various Crop Rotation Systems in the Mekong Delta of Vietnam IJERD 1– 1: 104–112

Ahn Y–B, Liu F, Fennell DE, Häggblom MM 2008 Biostimulation and bioaugmentation to enhance dechlorination of polychlorinated–p–dioxins in contaminated sediments FEMS

Microbiology Ecology 66:271–281

Ahn Y–B, Rhee S–K, Fennell DE, Kerkhof LJ, Hentschel U, Häggblom MM (2003) Reductive

dehalogenation of brominated phenolic compounds by microorganisms associated with the

marine sponge Aplysina aerophoba Appl Environ Microbiol 69:4159–4166

Häggblom MM, Bossert ID (2003) Organohalides – a global perspective In: Häggblom MM,

Bossert ID (eds) Dehalogenation: Microbial Processes and Environmental Applications, pp.,

3–29, Kluwer Academic Publishers, Boston

De Wilde, T., Spanoghe P., Debaer C., Ryckeboer J., Springael D., and Jaeken P 2007

Overview of on–farm bioremediation systems to reduce the occurrence of point source contamination Pest Management Science 63: 111–128

Breugelmans, P., D’Huys J.P., De Mot R., and Springael D 2007 Characterization of novel

linuron–mineralizing bacterial consortia enriched from long–term linuron–treated

agricultural soils FEMS Microbiol Ecol 62: 374–385

Breugelmans, P., Barken K B.,Tolker–Nielsen T., Hofkens J., Dejonghe W and Springael D

2008 Architecture and spatial organization of a triple–species bacterial biofilm degrading synergistically the phenylurea herbicide linuron FEMS Microbiol Ecol 64: 271–282

11 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Các hợp chất dioxins có chứa chlor thường có tính độc cao, đặc biệt là 2,3,7,8– tetrachlorodibenzo–p–dioxin (2,3,7,8–TCDD) và chúng không có khả năng bị phân huỷ sinh

học nếu như chưa được khử bỏ chlor (Mohn and Tiedje, 1992; Häggblom and Bossert, 2003)

Trong khảo sát về ô nhiễm dioxins ở A Lưới, Dwernychuck và ctv (2002) đã tìm thấy 2,3,7,8– TCDD chiểm tỉ lệ 90–97% trong tổng số độc chất I–TEQ do các hợp chất dioxins gây ra Ngoài

ra, sau nhiều năm từ khi chất độc da cam được rãi ở Việt Nam, chúng có thể theo lớp đất mặt bị rửa trôi tích tụ trong các bùn của ao, hồ và sông suối Vì vậy, nguy cơ gây hại cho môi trường

và sức khoẻ con người rất cao do chúng có thể xâm nhập vào chuổi thức ăn từ ốc, cá sống ở ao

hồ, sông suối Do đó, hoạt động khử chlor yếm khí đối với chất độc 2,3,7,8– tetrachlorodibenzo–p–dioxin của cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí Dehalococcoides rất

quan trọng trong vấn đề khử độc dioxin tại các nơi ô nhiễm dioxin do quân đội Mỹ phun thuốc khai hoang trong thời gian chiến tranh và trong bùn nơi chúng có khả năng tích tụ Mật số vi

khuẩn khử chlor yếm khí đối với chlorodibenzo–p–dioxins trong tự nhiên rất ít và phân lập

chúng rất khó và tốn nhiều thời gian Vì vậy, vấn đề kiểm tra sự hiện diện và hoạt động của chúng trong tự nhiên bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật gặp nhiều khó khăn về thời gian

và tốn nhiều chi phí cho việc phân tích dioxins Tuy nhiên, bằng phương pháp công nghệ sinh học có thể xác định được sự hiện diện của cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí cũng như hoạt động khử chlor yếm khí của chúng Kết quả nghiên cứu trên một số mẫu đất và bùn ở A Lưới, Thừa Thiên Huế và Cam Nghĩa, Quảng Trị, chúng tôi đã tìm thấy hoạt động khử chlor

bởi vi sinh vật yếm khí đối với chlorodibenzo–p–dioxins ở A Lưới, Thừa Thiên Huế và Cam

Nghĩa, Quảng Trị Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy các dòng vi sinh vật khử chlor của

chlorodibenzo–p–dioxins tại A Lưới, Thừa Thiên Huế và Cam Nghĩa, Quảng Trị có nhiều khả

năng khác với với các dòng khử chlor đã được biết đến trên thế giới Do đó, việc sử dụng các primers đặc hiệu nhằm vào 16S rRNA gene hoặc gene chức năng và xây dựng phương pháp sử dụng các primers đó để dò tìm, phát hiện nhanh cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins

sẽ giúp rất nhiều đối với việc khảo sát và nghiên cứu hoạt động khử chlor dioxins của các loài

vi sinh vật bản địa trong công tác đánh giá và khôi phục đất/bùn ô nhiễm dioxins

12 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí 2,3,7,8–

tetrachlorodibenzo–p–dioxin cho đất/bùn ô nhiễm chất độc da cam bằng phương pháp PCR bao

gồm: sử dụng primers chuyên biệt nhằm vào 16S rRNA gene và primers nhắm vào

dehalogenase gene, quy trình trích mẫu DNA từ đất/bùn, chu trình luân nhiệt và đảm bảo độ

nhạy cao với cộng đồng vi sinh vật yếm khí khử chlor dioxins

13 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU

13.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các dòng vi khuẩn yếm khí bản địa có khả năng khử chlor các hợp

chất chlorodibenzo–p–dioxins (còn được gọi chung là dioxins) được nuôi cấy từ vùng đất ô

nhiễm dioxins ở A Lưới, Huế và Cam Lộ, Quảng Trị Để có thể kiểm tra được sự hiện diện, thành phần cũng như hoạt động khử chlor của các dòng vi khuẩn bản địa trong môi trường tự

nhiên, trọng tâm của đề tài nhằm vào khảo sát trình tự của 16S rRNA của các dòng vi khuẩn nuôi cấy và các gene chức năng khử chlor để từ đó có thể thiết kế được primers phù hợp có thể ứng dụng dò tìm, phân tích nhanh thành phần của chúng trong môi trường bằng các phương pháp phân tích thông thường như PCR (polymerase chain reaction) và điện di biến tính DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)

1,2,3,4–tetrachlorodibenzo–p–dioxin, 2,3–dichlorodibenzo–p–dioxin và 2,3,7,8– tetrachlorodibenzo–p–dioxin của cộng đồng vi khuẩn yếm khí thuộc một số mẫu đất/bùn được

thu từ nhiều điểm thuộc hai khu vực trên Ngoài ra, chúng tôi cũng mong muốn được kiểm nghiệm sản phẩm nghiên cứu trên đất bùn tại điểm nóng ô nhiễm dioxins hiện nay như sân bay

Đà Nẵng nếu có điều kiện vào được khu vực ô nhiễm lấy mẫu Hiện nay khu ô nhiễm thuộc sân bay Đà Năng và Biên Hoà thuộc khu vực quân sự nên việc vào lấy mẫu có nhiều hạn chế

Do đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn yếm khí khử chlor dioxins và nội dung nghiên cứu

đi sâu vào lĩnh vực sinh học phân tử nên các hoạt động nghiên cứu của đề tài thuộc lĩnh vi sinh môi trường, công nghệ sinh học ứng dụng và hóa môi trường

14 CÁCH TIẾP CẬN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

14.1 Cách tiếp cận

Cách tiếp cận nghiên cứu của đề tài được thực hiện theo hướng đi từ những kết quả nghiên cứu thực tế trong lĩnh vực liên quan kết hợp với lý thuyết và phương pháp được biết để đề ra các nội dung cần thực hiện cho đề tài, xây dựng phương pháp thực hiện Sản phẩm, kết quả thí nghiệm của đề tài sẽ được thử nghiệm thực tế để đi đến kết luận Trên cơ sở cách tiếp cận đó,

đề tài sẽ tiếp tục sử dụng các cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins đã được làm giàu trong các đề tài nghiên cứu trước đây từ khu vực A Lưới, Huế và Cam Lộ, Quảng Trị làm đối tượng nghiên cứu cho việc thiết kế các primers chuyên biệt và xây dựng quy trình chạy PCR để

có thể phát hiện và kiểm tra hoạt động chức năng của vi khuẩn khử chlor yếmkhí dioxins trong môi trường Các tài liệu khoa học được đăng trên các tạp chí quốc tế và trong nước liên quan đến nội dung nghiên cứu của đề tài cũng sẽ được chúng tôi nghiên cứu kỹ lưỡng Đặc biệt chúng tôi sẽ chú ý đến nghiên cứu đã có trên các dòng vi khuẩn khử chlor yếm khí đã được

phân lập ở nước ngoài và giải mã toàn bộ genome như Dehalococcoides ethenogen strain 195,

Dehalococcoides sp strain CBDB1, strain BAV1, strain FL2 được biết có khả năng khử chlor

dioxins Trong đề tài chúng tôi sẽ sử dụng cơ sở dữ liệu gene của Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ Sinh học NCBI của Mỹ (National Center for Biotechnology) để thu thập thông tin về gene của các dòng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins, PCB (polychlorinated biphenyl) hoặc của các độc chất hữu cơ chứa chlor khác để làm cơ sở tham chiếu trong việc khảo sát, thiết kế primers cho các gene tương ứng

Vị trí thu thập mẫu đất/bùn bùn để tìm kiếm các dòng vi khuẩn yếm khí khử chlor của dioxins được thực hiện dựa trên thông tin đã nghiên cứu về ô nhiễm dioxins ở A Lưới, Huế (Dwernychuk et al 2000) và thông tin hổ trợ của Sở Tài Nguyên Môi Trường Huế và Quảng Trị Từ các mẫu đất/bùn trên trong nghiên cứu trước chúng tôi đã nuôi cấy được vi khuẩn yếm

khí khử chlor của 1,2,3,4–tetrachlorodibenzo–p–dioxin, 2,3–dichlorodibenzo–p–dioxin 2,3,7,8–tetrachlorodibenzo–p–dioxin Đây là nguồn vi sinh vật bản địa làm đối tượng cho

nghiên cứu trong đề tài này

14.2 Phương pháp nghiên cứu

Một số phương pháp trong lĩnh vực công nghệ sinh học và phân tích sau được sử dụng trong nghiên cứu:

- Nuôi cấy làm giàu các vi khuẩn yếm khí trong môi trường chuyên biệt có sử dụng

chlorodibenzo–p–dioxin làm chất nhận điện tử trong hoạt động hô hấp yếm khí để loại bỏ

dần các loài vi khuẩn khác không liên quan đến hoạt động khử chlor dioxins ra khỏi cộng đồng, hướng tới phân lập được các dòng vi khuẩn yếm khí thuần có khả năng khử chlor dioxins

- Kiểm chứng hoạt động khử chlor dioxins của các dòng vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy làm giàu hoặc phân lập thông qua phân tích thay đổi thành phần của các chất dioxins được

bổ sung vào môi trường nuôi cấy Chất dioxins được trích ly từ các mẫu và làm sạch theo quy trình 1613B của cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ EPA và sau đó được phân tích trên GC/MS

- Kỹ thuật PCR được sử dụng để nhân các đoạn trình tự DNA được khảo sát

- Kỹ thuật điện di biến tính DGGE được sử dụng để khảo sát sự đa dạng của cộng đồng vi khuẩn yếm khí trong môi trường nuôi cấy và đồng thời giúp phân tách các chuổi trình tự DNA khác nhau của cộng đồng vi khuẩn yếm khí trong môi trường nuôi cấy để từ đó có thể làm khuôn mồi cho chạy PCR và giải mã trình tự trong chuổi DNA của dòng vi khuẩn được khảo sát

- Nhân bản sản phẩm PCR vào plasmid vector chuyển vào tế bào E coli để phân lập các

đoạn DNA được nhân trong PCR

- Tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ mRNA được trích và làm sạch từ các dòng vi khuẩn yếm khí khử chlor và giải mã trình tự cDNA để có thể dò tìm gene chức năng liên quan đến khử chlor dioxins

- Giải mã trình tự DNA

15 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN

15.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1 Phân lập các dòng vi khuẩn yếm khí:

Cơ sở thiết kế các trình tự nucleic acid trong primers đặc hiệu cho các dòng vi khuẩn bản địa khử chlor yếm khí dựa trên giải mã trình tự acid nucleic trong gene 16S rRNA Hiện nay chúng tôi đã nuôi cấy được 6 cộng đồng vi khuẩn yếm khí có tốc độ và cách thức khử chlor dioxins khác nhau Qua khảo sát sơ bộ về cấu trúc bằng phương pháp DGGE cho thấy trong mỗi cộng đồng có thể có một số dòng vi khuẩn khác nhau tham gia khử chlor Do đó, phần quan trọng trong đề tài là cần phân lập được các dòng vi khuẩn này để có thể giải mã trình tự DNA của 16S rRNA chúng và các gene chức năng liên quan đến khử chlor dioxins để có thể thiết kế primers đặc hiệu và phương pháp ứng dụng phù hợp

Sáu cộng đồng vi khuẩn trên được nuôi cấy riêng lẽ trong môi trường yếm khí chuyên biệt có bổ sung các hợp chất nhận điện tử là dioxins Vi khuẩn được luân chuyển nhiều lần trong các môi trường trên để giảm dần sự hiện diện của các vi khuẩn không liên quan đến khử chlor Trong quá trình phân lập khả năng khử chlor dioxins của các dòng vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy phân lập cũng được kiểm tra song song với tính thuần của chúng dựa trên kỹ thuật điện di biến tính chuổi DNA (DGGE) Các thí nghiệm trong nội dung này bao gồm:

1.1 Nuôi cấy các cộng đồng vi khuẩn khử chlor dioxins trong môi trường yếm khí chuyên biệt

có bổ sung chlorodibenzo–p–dioxin

1.2 Kiểm tra khả năng khử chlor 2,3,7,8–TCDD của vi khuẩn trong quá trình phân lập

Nội dung 2 Xác định gene 16S rRNA chuyên biệt và gene chức năng khử chlor của các dòng vi khuẩn

Nội dung này được thực hiện sau khi có được các dòng vi khuẩn thuần Giải mã trình tự DNA trong 16S rRNA hoặc của gene chức năng được thực hiện sau khi ly trích DNA và mRNA của các dòng vi khuẩn thuần Các kỹ thuật như PCR, giải trình tự và tổng hợp cDNA từ mRNA được áp dụng để có thể có được trình tự của các gene nghiên cứu Các thí nghiệm của phần nội dung này như sau:

2.1 Xác định gene 16S rRNA chuyên biệt của các vi khử yếm khí chlor dioxins:

- Trích và nhân DNA của toàn bộ 16S rRNA gene của các dòng vi khuẩn thuần

- Giải mã trình tự DNA của bộ gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn

- Xác định gene

2.2 Xác định gene chức năng rdh khử yếm khí chlor dioxins

- Trích mRNA của các dòng vi khuẩn

- Tổng hợp cDNA từ mRNA

- Giải mã trình tự cDNA

- Xác định gene

Nội dung 3: Thiết kế và thử nghiệm các bộ mồi (primers) nhắm vào gene 16S rRNA

chuyên biệt và gene chức năng rdh khử chlor yếm khí dioxins của các dòng vi khuẩn bản

địa: mồi được thiết kế dựa trên khảo sát trình tự của 16S rRNA gene và gene chức năng và sự

hổ trợ của phần mềm PrimerGene Chuổi oligonucleotide trong primers sau khi thiết kế và tổng hợp sẽ được khảo nghiệm tính chuyên biệt đối với các dòng vi khuẩn phân lập và các mẫu môi trường Ngoài ra, tính chuyên biệt của primer thiết kế đối với các dòng vi khuẩn bản địa cũng

sẽ được so sánh với các loại primers được thiết kế dựa trên trình tự DNA của các dòng vi

khuẩn đã được nghiên cứu ở nước ngoài như: Dehalococcoides ethenogens dòng 195,

Dehalococcoides sp dòng cbdb1, 195, BAV1 và FL2 Nội dung này của đề tài được thực hiện

qua các thí nghiệm sau:

3.1 Thiết kế mồi (primers) cho 16S rRNA gene: thiết kế mồi và xây dựng chương trình luân nhiệt chạy PCR cho mồi

3.2 Thiết kế mồi (primers) cho gene chức năng khử chlor rdh và và xây dựng chương trình

luân nhiệt chạy PCR cho mồi

3.3 Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi đối với các dòng vi khuẩn bản địa

Nội dung 4 Xây dựng qui trình ứng dụng phương pháp sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxin

Thiết lập và thử nghiệm và xây dựng qui trình phương pháp ứng dụng các bộ mồi (primers) đặc

hiều nhằm vào gene 16S rRNA và gene chức năng khử chlor rdh để dò tìm sự hiện diện và hoạt

động của vi khuẩn khử yếm khí chlor dioxins: bắt đầu việc lấy mẫu đất/bùn, trữ mẫu, trích và

làm sạch DNA, chương trình nhiệt chạy PCR, qui trình phân tích trên DGGE (trong trường hợp

cần phân tích thành phần cộng đồng vi khuẩn khử chlor), điện di agarose gel và chụp ảnh gel Nội dung của phần này gồm các hoạt động sau:

4.1 Xây dựng quy trình phương pháp ứng dụng các bộ mồi

4.2 Kiểm nghiệm độ nhạy của quy trình phương pháp đối với hoạt động khử yếm khí chlor dioxins

(bắt đầu–

kết thúc)

Người thực hiện

1 Phân lập các dòng vi khuẩn yếm

khí:

- Nuôi cấy các cộng đồng vi

khuẩn khử chlor dioxins trong

môi trường yếm khí chuyên

– Các dòng vi sinh vật

khử chlor yếm khí dioxins

– Đánh giá khả năng

khử yếm khí chlor của các dòng vi khuẩn phân lập

01/2011 đến 08/2012

Châu Thị Anh Thy

chuyên biệt của các vi khử

yếm khí chlor dioxins

- Xác định gene chức năng rdh

khử yếm khí chlor dioxins

– Chuyên đề 2: Xác

định gene 16S rRNA vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins

– Chuyên đề 3: Xác

định gene chức năng khử yếm khí chlor dioxins

06/2011 đến 8/2012

Trần Văn Dũng

3

Thiết kế và thử nghiệm các bộ

mồi (primers) nhắm vào gene

16S rRNA chuyên biệt và gene

chức năng rdh khử chlor yếm

khí dioxins của các dòng vi

khuẩn bản địa

- Thiết kế mồi (primers) cho

16S rRNA gene: thiết kế mồi

và xây dựng chương trình luân

nhiệt chạy PCR cho mồi

- Thiết kế mồi (primers) cho

gene chức năng khử chlor rdh

và và xây dựng chương trình

luân nhiệt chạy PCR cho mồi

- Kiểm tra tính đặc hiệu của

mồi đối với các dòng vi khuẩn

Nguyễn Thị Thu Hà

4 Xây dựng qui trình ứng dụng

phương pháp sinh học phân tử

phát hiện vi khuẩn khử chlor

yếm khí dioxin

- Xây dựng quy trình phương

pháp ứng dụng các bộ mồi

- Kiểm nghiệm độ nhạy của quy

trình phương pháp đối với

hoạt động khử yếm khí chlor

dioxins

– Chuyên đề 6: Quy

trình, phương pháp ứng dụng bộ mồi để dò tìm

sự hiện diện và hoạt động khử yếm khí chlor dioxins được kiểm nghiệm

12/2011 đến 12/2012

Trần Nhân Dũng,

Dương Minh Viễn

5 Lập báo cáo tổng kết đề tài

Nghiệm thu đề tài

Các báo cáo khoa học Các sản phẩm

11/2012

–

12/2012

Dương Minh Viễn

16 SẢN PHẨM

16.1 Sản phẩm khoa học

Sách chuyên khảo Bài báo đăng tạp chí nước ngoài: 1

Sách tham khảo Bài báo đăng tạp chí trong nước: 1

Giáo trình Bài đăng kỷ yếu hội nghị, hội thảo quốc tế: 1

16.2 Sản phẩm đào tạo

Nghiên cứu sinh Cao học

16.3 Sản phẩm ứng dụng

Mẫu x Vật liệu Thiết bị máy móc

Giống cây trồng Giống vật nuôi Qui trình công nghệ

Tiêu chuẩn Qui phạm Sơ đồ, bản thiết kế Tài liệu dự báo Đề án Luận chứng kinh tế

Phương pháp x Chương trình máy tính Bản kiến nghị

Dây chuyền công nghệ Báo cáo phân tích Bản quy hoạch

16.4 Các sản phẩm khác

16.5 Tên sản phẩm, số lượng và yêu cầu khoa học đối với sản phẩm

của 2 cao học viên

3 Cặp mồi (primers) chuyên

biệt nhắm vào 16S rRNA

gene của các dòng vi khuẩn

khử chlor yếm khí dioxins

01 cặp mồi chung cho tất

cả các dòng vi khuẩn được phân lập

Liệt kê trình tự nucleic acid trong cặp mồi Cặp mồi bắt cặp chuyên biệt với các dòng vi khuẩn khử phân lập

4 Cặp mồi (primers) chuyên

biệt nhắm vào gene chức

năng khử chlor yếm khí

dehalogenase – rdh)

01 cặp mồi chung cho tất

cả các dòng khuẩn được phân lập trong trường hợp chỉ xác định được gene duy nhất tham gia vào khử chlor Trường hợp xác định nhiều gene cùng tham gia việc khử chlor thì sẽ thiết kế các cặp mồi khác nhau cho các gene đó

Liệt kê trình tự nucleic acid trong cặp mồi Cặp mồi chỉ bắt cặp khi phát hiện sự

hiện diện của gene rdh của

các dòng vi khuẩn phân lập

2

5

Qui trình chạy PCR với cặp

mồi chuyên biệt nhằm vào

16S rRNA gene

01 cặp mồi Bao gồm từ quy trình trích

và làm sạch DNA từ mẫu đất/bùn, công thức pha chế hổn hợp chạy PCR, chu trinh nhiệt trên máy luân nhiệt và chạy điện di và cách nhận diện băng dương tính trên gel agarose khi chụp hình bằng UV

06 Qui trình chạy PCR với cặp

mồi chuyên biệt nhằm vào

rdh gene

01 cho trường hợp chỉ có một gene khử chlor

Trường hợp có nhiều hơn một gene thì sẽ xây dụng quy trình PCR cho tất cả các cặp mồi thiết kế

Bao gồm từ quy trình trích

và làm sạch DNA từ mẫu đất/bùn, công thức pha chế hổn hợp chạy PCR, chu trinh nhiệt trên máy luân nhiệt và chạy điện di và cách nhận diện băng dương tính trên gel agarose khi chụp hình bằng UV

07

Bài báo đăng trên tạp chí

khoa học

Tên bài báo 1: Về các dòng

vi sinh vật mới phát hiện từ

yếm khí chlor thông qua gene

16Sr RNA và gene khử chlor

rdh của chúng

2

– Một bài đăng trên tạp chí

quốc tế, một bài đang trên tạp chí trong nước

– Nội dung đăng trên bài

báo cung cấp thông tin về các dòng vi khuẩn mới khử yếm khí chlor dioxins và phương pháp sinh học phân

tử với các bộ mồi được thiết kế trên chính các dòng này nhằm tạo độ nhạy cao trong phát hiện sự hiện diện cũng như hoạt động khử chlor dioxins của chúng trong môi trường

17 HIỆU QUẢ (giáo dục và đào tạo, kinh tế – xã hội)

- Đóng góp, hổ trợ vào công tác giải độc các các vùng ô nhiễm dioxins ở Việt Nam

- Quá trình nghiên cứu của đề tài sẽ giúp nâng cao năng lực và kinh nghiệm nghiên cứu của các cán bộ và học viên cao học tham gia trong đề tài Kiến thức và chuyên môn trong lĩnh vực sinh học phân tử và đặc biệt kiến thức chuyên môn về hồi phục sinh học đất/bùn ô nhiễm dioxins của cán bộ và học viên tham gia nghiên cứu sẽ được nâng cao

- Giáo trình giảng dạy lĩnh vực vi sinh vật đất và vi sinh môi trường cho sinh viên sẽ được bổ sung qua kết quả nghiên cứu của đề tài

18 PHƯƠNG THỨC CHUYỂN GIAO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA CHỈ ỨNG DỤNG

Kết quả nghiên cứu sẽ được đăng trên tạp chí khoa học trong nước và quốc tế nhằm chia

sẻ thông tin khoa học cho các nhà nghiên cứu và đặc biệt nhằm hỗ trợ trong các dự án kiểm soát và giải độc dioxins ở các vùng ô nhiễm ở Việt Nam

Quy trình chạy PCR các cặp primers chuyên biệt để nhận biết sự hiện diện và hoạt động khử chlor yếm khí dioxins của cộng đồng vi sinh vật bản địa sẽ được chuyển giao cho chi cục bảo vệ môi trường Thừa thiên Huế và Quảng Trị bằng Hợp đồng chuyển giao

19 KINH PHÍ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI VÀ NGUỒN KINH PHÍ

Tổng kinh phí: 550.00.000

Trong đó:

Ngân sách Nhà nước: 550.000.000 Các nguồn kinh phí khác:

Nhu cầu kinh phí từng năm:

chú Kinh

phí từ NSNN

Các nguồn khác

I Chi công lao động tham

gia trực tiếp thực hiện

Cơ quan chủ quản duyệt

TL BỘ TRƯỞNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VỤ TRƯỞNG VỤ KHOA HỌC, CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG

DANH MỤC CHUYÊN ĐỀ

1 Nội dung 1: Phân lập các dòng vi

khuẩn yếm khí

1.1 Báo cáo chuyên đề 1: Sự đa dạng và

tiềm năng của cộng đồng vi khuẩn

bản địa khử chlor yếm khí dioxins

2 Nội dung 2: Xác định gene 16S

rRNA chuyên biệt và gene chức

năng khử chlor của các dòng vi

3 Nội dung 3: Thiết kế và thử nghiệm

các bộ mồi (primers) nhắm vào

gene 16S rRNA chuyên biệt và gene

chức năng rdh khử chlor yếm khí

dioxins của các dòng vi khuẩn bản

3.2 Chuyên đề 5: thiết kế mồi cho gene

chức năng khử yếm khí chlor rdh

4 Nội dung 4: Xây dựng qui trình ứng

dụng phương pháp sinh học phân

tử phát hiện vi khuẩn khử chlor

yếm khí dioxin

4.1 Chuyên đề 6: Quy trình, phương pháp

ứng dụng các bộ mồi để dò tìm sự

hiện diện và hoạt động khử yếm khí

chlor dioxins được kiểm nghiệm

Phụ lục

DỰ TOÁN CHI TIẾT KINH PHÍ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

(Theo nội dung chi)

– Căn cứ quyết định số 4482/QĐ–BGDĐT ngày 06/10/2011của Bộ trưởng Bộ Giáo dục và Đào

tạo và danh sách các tổ chức, cá nhân trúng tuyển chủ trì thực hiện đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ năm 2011;

– Căn cứ thông tư liên tịch số 93/2006/TTLT/BTC–BKHCN ngày 04/10/2006 của liên Bộ Tài

chính và Bộ Khoa học và Công nghệ Hướng dẫn chế độ khoán kinh phí của các đề tài, dự án khoa học và công nghệ có sử dụng ngân sách Nhà nước;

– Căn cứ thông tư liên tịch số 44/2007/TTLT–BTC–BKHCN ngày 07/05/2007 của Bộ Tài

chính, Bộ Khoa học và Công nghệ Hướng dẫn định mức xây dựng và phân bổ dự toán kinh phí đối với các đề tài, dự án khoa học và công nghệ có sử dụng ngân sách Nhà nước;

– Căn cứ thông tư số 97/2010/TT–BTC ngày 06/07/2010 của Bộ Tài chính Quy định chế độ

công tác phí, chế độ chi tổ chức các cuộc hội nghị đối với các cơ quan nhà nước và đơn vị sự nghiệp công lập;

– Căn cứ quyết định số 1150/QQD–ĐHCT của Hiệu trưởng Trường Đại học Cần Thơ về việc

ban hành quy chế chi tiêu nội bộ Trường Đại học Cần Thơ

1 Thuê khoán chuyên môn 359.000.000 65,3% 359.000.000

2 Nguyên, vật liệu, năng lượng 112.000.000 20.3% 112.000.000

3 Chi sửa chữa, mua sắm tài sản

cố định

GIẢI TRÌNH CÁC KHOẢN CHI

I Chi công lao động tham gia

trực tiếp thực hiện đề tài

1.1 Chi công lao động của cán bộ

khoa học, nhân viên kỹ thuật

trực tiếp tham gia thực hiện đề

tài

Thuê khoáng chuyên môn triển

khai, thực hiện, báo cáo cho 6

chuyên đề nghiên cứu khoa học

Công kỹ thuật viên thực hiện

việc ly trích dioxins từ mẫu

Công kỹ thuật viên thực hiện

việc ly trích DNA, RNA, chạy

DGGE, chụp ảnh gel 450 mẫu x

100,000đ/mẫu

Mua hoá chất phục vụ cho thí

nghiệm: dioxins, dung môi,

4.1 Đi công tác Cần Thơ – A Lưới,

Huế để lấy mẫu đất, bùn

Thuê ôtô từ Huế đi A Lưới để

lấy và vận chuyển mẫu: 2

Nhận xét của UVPB: 0,8 triệu x

TIỀM LỰC KHOA HỌC CỦA TỔ CHỨC, CÁ NHÂN

THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN CẤP BỘ

(Kèm theo Thuyết minh đề tài KH&CN cấp Bộ)

A Thông tin về chủ nhiệm và các thành viên tham gia nghiên cứu đề tài:

1 Chủ nhiệm đề tài: Dương Minh Viễn

1.1 Các hướng nghiên cứu khoa học chủ yếu:

- Phân hủy sinh học dioxins:

o Chủ nhiệm đề tài đã chủ nhiệm đề tài IFS về “Dư tồn dioxin và phân lập vi khuẩn háo khí phân hủy dioxin tại vùng đât sô nhiễm chất độc da cam A Lưới, Huế, Việt Nam

o Nghiên cứu sau tiến sĩ ở ĐH Rutgers, Hoa kỳ 2008–2009 về vi sinh vật yếm khí

khử chlor dioxins trên đất/bùn ô nhiễm chất độc da cam, A lưới Huế

- Tái sử dụng chất thải hữu cơ làm phân hữu cơ và hiệu quả trong cải thiện độ phì nhiêu đất và năng suất cây trồng (dề tài cấp bộ và dự án hợp tác quốc tế)

1.2 Kết quả nghiên cứu khoa học trong 5 năm gần đây:

 Chủ nhiệm hoặc tham gia chương trình, đề tài NCKH đã nghiệm thu:

Stt Tên chương trình, đề tài Chủ nhiệm Tham

gia

Mã số và cấp quản lý

Thời gian thực hiện

Kết quả nghiệm thu

1 Dự án hợp tác quốc tế Vie–020:

“Lục Bình"

Chủ nhiệm mảng compost

Vie–020 2007–2010 Tốt

3 Đề tài từ quỹ nghiên cứu koa học

quốc tế IFS: “Dư tồn dioxin và

phân lập vi khuẩn háo khí phân

hủy dioxin tại vùng đất ô nhiễm

chất độc da cam A Lưới, Huế, Việt

Nam”

4 CT Ươm tạo Công nghệ: Nghiên

cứu sản xuất phân hữu cơ vi sinh

từ bã bùn mía”

5 Sử dụng bã bùn mía làm phân hữu

cơ trong cải thiện một số tính chất

hoá học đất phèn/Nông nghiệp



Stt Tên công trình khoa học Tác giả/Đồng

tác giả Địa chỉ công bố

Năm công bố

1

Diversity of the Actinomycetes

Community Colonising Rice Straw

Residues in Cultured Soil

Undergoing Various Crop Rotation

Systems in the Mekong Delta of

Vietnam

Đồng tác giả

International Journal of Environmental and Rural

2 Effects of continuous rice straw

compost application on rice yield and

soil properties in the Mekong Delta

Đồng tác giả Soil Science and Plant

Nutrition

2009

3 Carbon dioxide emission from

peatland in relation to hydrology,

peat moisture and humification at Vo

Doi national park, Vietnam

Tác giả Proceedings of “International

symposium and workshop on tropical peatland”

(application of compost from

sugarcane filter cake to alleviate Al

toxicity and to improve P availability

on acid sulfate soil)

Tác giả Tạp chí Khoa học trường Đại

Năm bảo vệ

Nghiê

n cứu sinh

Học viên cao học

Chính Phụ

1

Ảnh hưởng các loại phân hữu

cơ lên thành phần Al, Fe, P

nguồn chất thải hữu cơ khác và

hiệu quả trên cây trồng

 Biên soạn sách phục vụ đào tạo đại học và sau đại học:

xuất bản

Chủ biên hoặc tham gia

2 Các thành viên tham gia nghiên cứu

Stt Họ tên thành viên Tên công trình khoa học Địa chỉ công bố Năm

Genetic Resources and Crop Evolution, 57 (2): 183

2010

Using polymerase chain reaction (PCR) for detection of Enterotoxigenic Vibrio cholera in seafood

In the Sixth Vietnam–Japan

B Tiềm lực về trang thiết bị của cơ quan chủ trì để thực hiện đề tài:

Stt Tên trang thiết bị Thuộc phòng thí nghiệm Mô tả vai trò của thiết bị

đối với đề tài Tình trạng

01 Thiết bị điện di biến tính Sinh học Đất Khảo sát đa dạng cộng đồng

vi sinh vật và tách các chuỗi DNA khác nhau

Tốt

03 Máy chup gel diện di Sinh học Đất Chụp ảnh gel sau điện di Tốt

04 Máy giải trình tự DNA Viện NCPT CNSH Giải trình tự chuổi DNA Tốt

Ngày tháng năm

Châu Thị Anh Thy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Cần Thơ

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

(Đề tài, dự án)

1 Thông tin chung

- Tên đề tài: Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện nhanh

cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí 2,3,7,8–tetrachlorodibenzo–p–

dioxin cho đất/bùn ô nhiễm chất độc da cam

- Mã số: B2011–16–03

- Chủ nhiệm: ThS Châu Thị Anh Thy

- Cơ quan chủ trì: Đại học Cần Thơ

- Thời gian thực hiện: 36 tháng, 6/2011 – 06/2014

2 Mục tiêu

- Phân lập và khảo sát hoạt động khử chlor yếm khí 1,2,3,4– tetrachlorodibenzo–p–dioxin (1,2,3,4–TCDD) và 2,3,7,8– tetrachlorodibenzo–p–dioxin (2,3,7,8–TCDD) của cộng đồng vi khuẩn

thu từ các điểm nóng ô nhiễm dioxins ở Việt Nam

- Khảo sát các gene chuyên biệt 16S rRNA và gene chức năng khử chlor

dehalogenase rdh liên quan đến các hoạt động khử chlor 1,2,3,4–TCDD

và 2,3,7,8–TCDD trong cộng đồng vi khuẩn phân lập

khử chlor dehalogenase rdh của vi khuẩn khử chlor được phân lập từ các điểm ô

nhiễm ở Việt Nam Đề tài đã lần đầu đưa ứng dụng công nghệ sinh học để có thể phát hiện sự hiện diện và hoạt động khử chlor PCDDs bởi các vi khuẩn kỵ khí trong đất/bùn ô nhiễm dioxins ở Việt Nam Nghiên cứu đã đưa ra được quy trình

để có thể xác định sự hiện diện của các vi khuẩn có tiềm năng khử chlor PCDDs

và sự hiện diện của gene khử chlor bằng kỹ thuật sinh học phân tử thông qua phản ứng PCR

4 Kết quả nghiên cứu

Hoạt động khử chlor yếm khí dioxins của vi khuẩn là hoạt động then chốt trong phân hủy sinh học độc chất dioxins Vấn đề kiểm tra sự hiện diện và hoạt động của vi khuẩn trong tự nhiên ở các điểm ô nhiễm dioxins bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật gặp nhiều khó khăn về thời gian và tốn nhiều chi phí cho việc phân tích dioxins Do đó, đề tài này được thực hiện nhằm mục tiêu x g

quy trình kit phát hiện nhanh cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí 2,3,7,8–

TCDD cho đất/bùn ô nhiễm chất độc da cam bằng phương pháp PCR bao gồm:

sử dụng primers (mồi) chuyên biệt nhắm vào 16S rRNA gene và primers (mồi)

nhắm vào dehalogenase gene, quy trình trích mẫu DNA từ đất/bùn, chu trình

luân nhiệt thực hiện phản ứng PCR Trong phần phương pháp, đề tài thu thập nhiều mẫu đất/bùn tại các khu vực ô nhiễm dioxins ở Việt Nam như sân bay Đà Nẵng, Biên Hòa, khu vực A Lưới – Huế và Cùa – Quảng Trị để nuôi ủ yếm khí

trong lọ với môi trường yếm khí có bổ sung 1,2,3,4–TCDD hoặc 2,3,7,8–TCDD

và không bổ sung dioxins (đối chứng sống) để khảo sát hoạt động khử chlor dioxins của vi khuẩn cửa các vùng ô nhiễm cũng như để làm giàu mật số của chúng trong cộng đồng vi khuẩn có trong mẫu đất/bùn Khảo sát sự hiện diện, đa

dạng và gene chức năng khử chlor dehalogenase rdh của vi khuẩn khử yếm khí

chlor dioxins được thực hiện dựa trên sự khảo sát các gene 16S rRNA chuyên

biệt và các gene rdh của các vi khuẩn khử chlor yếm khí các độc chất hữu cơ gốc chlor như chlorobenzen, chloroethane, polychlorobiphenyls và chlorodibenzo–

p–dioxins đã được nghiên cứu Tổng cộng 26 gene chức năng khử chlor rdh và

15 gene chuyên biệt nhắm vào 16S rRNA của các vi khuẩn khác nhau được sử dụng Ngoài ra, kỹ thuật pyrosequencing cho nghiên cứu metagenomics cũng được sử dụng để khảo sát sự đa dạng của các nhóm vi khuẩn trong cộng đồng vi khuẩn phân lập từ các mẫu đất/bùn ô nhiễm dioxins Kết quả khảo sát cho thấy hầu hết các mẫu bùn ở các khu vực ô nhiễm dioxins hoặc đã từng bị rãi chất độc

da cam huyện A Lưới – Huế, Cùa – Quảng Trị, sân bay Biên Hòa và sân bay Đà Nẵng đều có vi khuẩn có khả năng phân hủy dioxins theo kiểu khử chlor yếm khí Trong môi trường tự nhiên ô nhiễm dioxins, hầu hết bùn đáy sông ao hồ có đều có vi khuẩn kỵ khí khử chlor dioxins Trong khi đó, vi khuẩn kỵ khí khử chlor dioxins cũng tồn tại trong đất nhưng ở mức độ thấp hơn Đề tài phân lập được 8 cộng đồng vi khuẩn có khả năng khử chlor PCDDs từ các sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng, huyện A Lưới –Thừa Thiên Huế và Cùa – Quảng Trị Kết quả khảo sát dựa trên các mồi chuyên biệt gene 16S rRNA và pyrosequencing cho thấy vi khuẩn khử chlor dioxins ở các vùng ô nhiễm ở Việt Nam thuộc nhiều

nhóm khác nhau như Chloroflexi, Dehalobacter và cả Bacteroidetes Đề tài xác

định được 4 cặp mồi chuyên biệt nhắm vào gene 16S rRNA, có thể dùng cho phản ứng PCR để xác định sự hiện diện của các vi khuẩn thuộc nhóm

Chloroflexi, Dehalococcoides spp và Dehalococcoides sp 195 có trong cộng

đồng vi khuẩn khử chlor PCDDs ở các điểm ô nhiễm Đề tài cũng xác định các

gene dehalogenase rdh cbdb_A187, cbdb_A243, cbdb_A1588 của vi khuẩn

Dehalococcoides sp CBDB1 được tìm thấy các cộng đồng vi khuẩn khử chlor ở

các điểm ô nhiễm nên các mồi chuyên biệt cho phản ứng PCR nhắm vào gene này được dùng để khảo sát hoạt động khử chlor dioxins của vi khuẩn trong môi trường

2

Cặp mồi (primers)

chuyên biệt nhắm vào

16S rRNA gene của các

dòng vi khuẩn khử chlor

yếm khí dioxins

4 cặp

Các cặp mồi nhằm xác định gene chuyên biệt 16S rRNA của các nhóm

vi khuẩn thuộc nhóm Chloroflexi,

Dehalococcoides spp và cho vi

khuẩn Dehalococcoides sp 195

Trình tự các cặp mồi được trình bày trong báo cáo tổng kết

Quy trình xác định sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn có khả năng khử chlor PCDDs và quy trình xác định sự hiện diện của gene chức năng

dehalogenase rdh

5 Bài báo đăng trên tạp chí 2

– Một bài được báo cáo poster trong

hội nghị Khoa học Đất Thế giới lần thức 20, tổ chức từ ngày 8/6 đến 14/6/2014 tại Jeju, Hàn Quốc

– Một bài đăng trong tạp chí Khoa

học Đại học Cần Thơ

6 Đào tạo 2 Hai học viên cao học đã tốt nghiệp

6 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng

Các cộng đồng vi khuẩn được phân lập có thể sử dụng cho nghiên cứu và ứng dụng để hồi phục vùng đất ô nhiễm dioxins và giúp tăng cường sự phân hủy thông qua bổ sung sinh học Xác định được nhóm vi khuẩn khử chlor PCDDs và

các gene rdh liên quan sẽ giúp cho việc phát triển phương pháp sinh học phân tử

(quy trình đã được đề xuất) để khảo sát hiện diện và hoạt động của vi khuẩn khử chlor trong môi trường Những kết quả nghiên cứu tuy chưa được chuyển giao nhưng trong tương lai có thể được chuyển giao cho các đơn vị trực tiếp xử lý vấn

đề dioxins ở Viêt Nam