Xác định hàm lượng cyanid trong thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

HCN và của các hợp chất được sử dụng trong nhiều quá trình hóa học, bao gồm khử trùng, luyện sắt và thép, xi mạ điện, quặng…Ngoài ra chúng cũng được sử dụng trong việc tổng hợp acrylonit

TRONG THỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI-2017

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Trần Nguyên Hà

2 TS Trần Cao Sơn

Nơi thực hiện:

Viện Kiểm nghiệm

an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng chân thành và sâu sắc tới

TS Trần Nguyên Hà và TS Trần Cao Sơn là những người thầy đã dìu dắt tôi từ

những ngày đầu tiên làm nghiên cứu khoa học và cũng là những người trực tiếp định hướng, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Viện Kiểm nghiệm

an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật - Hà Nội, đặc biệt là cán

bộ khoa Độc học - Dị nguyên đã tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, bộ môn, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em

đã dành cho tôi những lời động viên quý báu trong suốt thời gian tôi hoàn thành khoá luận này

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những tình cảm, sự quan tâm và giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè đã dành cho tôi trong suốt thời gian học tập

và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 16 tháng 03 năm 2017

Sinh viên

Phan Thị Tú Uyên

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH 8

DANH MỤC BẢNG 9

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Thực trạng ô nhiễm môi trường biển do nước thải công nghiệp luyện kim 2

1.2 Tổng quan về cyanid 3

1.2.1 Các dạng tồn tại của cyanid 3

1.2.2 Tính chất hóa học của cyanid 4

1.2.3 Nguồn phát sinh cyanid 5

1.2.4 Độc tính của cyanid 6

1.2.5 Ảnh hưởng của cyanid đối với môi trường biển 7

1.3 Các phương pháp xác định cyanid 8

1.3.1 Phương pháp truyền thống 8

1.3.2 Cảm biến sinh học 10

1.3.3 Phương pháp đo huỳnh quang 11

1.3.4 Phương pháp sắc ký 12

1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

1.4.1 Nguyên tắc 14

1.4.2 Máy HPLC 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Nguyên vật liệu- trang thiết bị 17

2.2.1 Nguyên vật liệu 17

2.2.2 Dụng cụ 19

2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.3.1 Khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp xác định cyanid trong hải sản bằng HPLC 19

2.3.2 Thẩm định phương pháp đã xây dựng 20

2.3.3 Ứng dụng phương pháp 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu 20

2.4.2 Phương pháp HPLC 20

2.4.3 Phương pháp xử lý mẫu 21

2.4.4 Thẩm định phương pháp 22

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Khảo sát phương pháp phân tích cyanid 26

3.1.1 Thiết lập điều kiện sắc ký 26

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 29

3.2 Thẩm định phương pháp 33

3.2.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 33

3.2.2 Tính thích hợp của hệ thống 34

3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 35

3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 35

3.2.5 Độ lặp lại và độ thu hồi 37

3.3 Ứng dụng phương pháp 40

3.4 Bàn luận 40

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Kiến nghị 41

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮTAOAC Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức (Association of

Official Analytical Communities)

APHA Tổ chức sức khoẻ cộng đồng Mỹ (American Public Health

Association)

ATSRD Hiệp hội về đăng kí các chất độc hại và bệnh dịch (Agency for

Toxic Substances and Disease Registry)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm

nghiên cứu (Lethal concentration-time, 50%)

RSD (%) Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

QCVN Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC

Hình 2.1 Bộ chưng cất hồi lưu cyanid

Hình 3.1 Sắc ký đồ của chương trình gradient 1

Hình 3.2 Sắc ký đồ của chương trình gradient 2

Hình 3.3 Sắc ký đồ theo chế độ dung môi đẳng dòng

Hình 3.6 Khảo sát thời gian chưng cất

Hình 3.7 Sơ đồ xử lý mẫu

Hình 3.8 Sắc đồ của cyanid trong mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Hình 3.9 Sắc ký đồ của mẫu cá thêm chuẩn tại nồng độ 0,02 µg/mL (tương ứng 0,1 mg/kg)

Hình 3.10 Sắc ký đồ của mẫu mực thêm chuẩn tại nồng độ 0,02 µg/mL (tương ứng 0,1 mg/kg)

Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu tôm thêm chuẩn tại nồng độ 0,02 µg/mL (tương ứng 0,1 mg/kg)

Bảng 3.5 Số liệu xây dựng đường chuẩn cyanid

Bảng 3.6 Giá trị LOD và LOQ của phương pháp với các nền mẫu khác nhau

Bảng 3.7 Kết quả tính độ lặp lại và độ thu hồi của cá

Bảng 3.8 Kết quả tính độ lặp lại và độ thu hồi của mực

Bảng 3.9 Kết quả tính độ lặp lại và độ thu hồi của tôm

xử lý đó không đảm bảo sẽ gây ra hậu quả nghiêm trọng về cả kinh tế lẫn môi trường

Cyanid là hợp chất có độc tính cao đối với cả con người và các loài sinh vật khác có mặt trong thành phần nước thải từ công nghiệp luyện kim Môi trường sống chứa một lượng cyanid vượt quá ngưỡng cho phép làm thủy sản nhiễm độc Nguồn thực phẩm không đảm bảo này sẽ để lại những hậu quả đáng tiếc nếu đến tay người tiêu dùng Tuy nhiên trên thế giới cũng như ở Việt Nam lại chưa từng giám sát hàm lượng cyanid trong thủy sản do đó chưa có ngưỡng giới hạn nồng độ cyanid trong thủy sản Ở Việt Nam chỉ có quy định về hàm lượng cyanid cho phép trong nước ăn uống là 0,07 mg/L (theo QCVN 6-1 Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với nước khoáng thiên nhiên và nước đóng chai) [3]

Do đó trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, đề tài “Xác định hàm

lượng cyanid trong thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” đã được

thực hiện với các mục tiêu sau đây:

sản

ở vùng biển một số tỉnh miền Trung

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Thực trạng ô nhiễm môi trường biển do nước thải công nghiệp luyện kim

Trong công cuộc hiện đại hoá đất nước không thể phủ nhận những giá trị mà các ngành công nghiệp đặc biệt là các ngành công nghiệp nặng mang lại cho nền kinh tế của một quốc gia Ở Việt Nam, nhóm ngành này đóng vai trò then chốt trong sự phát triển kinh tế Tuy nhiên, hệ lụy mang lại từ ngành công nghiệp luyện kim và gia công kim loại này là sự gia tăng áp lực về ô nhiễm môi trường và sức khỏe con người Các vấn đề ô nhiễm có thể kể đến như ô nhiễm tiếng ồn, ô nhiễm đất, ô nhiễm không khí và đặc biệt là ô nhiễm nguồn nước

Hiện nay có 2 kĩ thuật luyện cốc được dùng trong sản xuất thép là luyện cốc ướt và luyện cốc khô

gây ra nhiều phản ứng hóa học, sinh ra nhiều chất độc hại như cyanid,

xảy ra các phản ứng hóa học và giảm sinh ra các chất độc hại theo nguồn nước thải Như vậy chi phí xử lý chất thải của luyện cốc ướt sẽ cao hơn rất

nên có chi phí đầu tư ban đầu và chi phí vận hành cao hơn

Khi sử dụng kĩ thuật luyện cốc ướt để sản xuất thép thành phần của nước thải thường rất khó xử lý vì bao gồm nhiều hóa chất độc hại như phenol, cyanid, amoniac, dầu, kim loại nặng và một số chất hữu cơ khác Các hóa chất độc hại này nếu không qua xử lý mà thải ra môi trường sẽ dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng cho môi trường kéo theo đó là những ảnh hưởng của kinh tế và xã hội [5], [6]

1.2 Tổng quan về cyanid

Acid cyanhydric (HCN) được phát hiện vào năm 1782 bởi một nhà hóa học Thụy Điển, Carl Wilhelm Scheele HCN và của các hợp chất được sử dụng trong nhiều quá trình hóa học, bao gồm khử trùng, luyện sắt và thép, xi mạ điện, quặng…Ngoài ra chúng cũng được sử dụng trong việc tổng hợp acrylonitrile trong

Cyanid là thuật ngữ chung cho các hóa chất có chứa một nhóm cyano (liên kết ba carbon và nitơ) xuất hiện tự nhiên hoặc được tạo ra bởi con người dưới nhiều hình thức khác nhau Nồng độ cyanid thấp có mặt trong môi trường hàng ngày như chất ổn định trong muối ăn, một số loại thực vật như sắn, măng, mận và mơ [18]

1.2.1 Các dạng tồn tại của cyanid

Acid cyanhydric, thể khan là chất lỏng rất linh động, tỷ trọng d=0,696 Nhiệt

độ sôi ở 20ºC, đông đặc ở -14 ºC, không màu, có mùi hạnh nhân, vị rất đắng, hoà

HCN có tỷ trọng d=0,968 Ở trong phòng kín, hơi HCN trở nên rất độc Lợi dụng tính chất này, trong chiến tranh các nhà quân sự đã sử dụng HCN làm chất độc giết người trong phòng kín Trong không khí, HCN bốc hơi và phân tán nhanh chóng, làm cho nó ít độc hại hơn [18]

Các muối cyanid như NaCN, KCN là các muối tinh thể trắng, dễ bị phân huỷ trong không khí bởi hơi nước, carbon dioxid, lưu huỳnh dioxid , tan rất tốt trong nước tạo dung dịch trong suốt, ít tan trong rượu, tan trong dung dịch nước rượu Dung dịch nước của các muối này có tính kiềm mạnh [18]

Cyanogen clorid (CNCl) là chất khí, rất ít tan trong nước, rất độc, độc hơn so

ở pH ≥12 phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn [5], [18]

carbon và nitrogen kết hợp với nhau Các thiocyanat được tìm thấy trong nhiều thức

ăn và thực vật Tuy nhiên, chúng được sinh ra chủ yếu từ những phản ứng giữa cyanid tự do và sulfid Phản ứng này xảy ra trong môi trường (ví dụ như trong

những dòng chất thải có chứa cyanid) và trong cơ thể con người sau khi nuốt hoặc hấp thụ cyanid [5]

Cyanid ở trạng thái tự do rất độc nhưng khi nó liên kết bền trong phức thì sự

[5]

1.2.2 Tính chất hóa học của cyanid

[18]

thành acid formic, acid formic tiếp tục xúc tác cho một phản ứng kết hợp của

huỷ thành carbon dioxid, lưu huỳnh dioxid và amoniac

RCHO + HCN → RCH(OH)CN (aldehyd) (cyanohydrin) RCOR’ + HCN → RC(OH)(CN)R’

2 NaCN + CO2 + H2O → 2 HCN + Na2CO3

Vì vậy phải bảo quản muối kim loại cyanid trong thùng kín, để ở chỗ mát

thành phức không tan

alkaloid, tanin cũng tạo nên HCN [13]

chất có khả năng phát huỳnh quang [7], [8]

1.2.3 Nguồn phát sinh cyanid

Có hai nguồn phát sinh cyanid: trong thiên nhiên và do hoạt động sản xuất của con người

Trong tự nhiên, cyanid có thể được sản sinh ra bởi vi khuẩn, nấm hay một số loài động, thực vật Trong cơ thể của con người, cyanid có thể kết hợp với hydroxocobalamin để hình thành vitamin B12 (cyanocobalamin) [6], [16], [21]

Bảng 1.1 Hàm lượng cyanid tự do trong một số thực vật

và thép, đặc biệt trong công nghiệp luyện thép Trong công nghiệp thép, cyanid được sử dụng như chất trợ dung hỗ trợ quá trình chảy của hỗn hợp, làm cứng, mạ

thép… Nước được dùng để làm nguội xỉ trong lò, do đó sẽ chứa nhiều chất hóa học trong đó có cyanid [5], [20]

Những nguồn cyanid khác từ xuất phát từ xe cộ, chất đốt từ những nhà dân trong thành phố và thuốc trừ sâu có chứa cyanid Cyanid có trong những bãi chôn lấp có thể làm nhiễm bẩn nguồn nước ngầm

Quá trình khai thác vàng cyanid được dùng để hòa tách vàng từ quặng Nếu quá trình khai thác được tiến hành theo quy trình khép kín có tái thu hồi cyanid sau khi thu hồi vàng sẽ không gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, thực tế tại các bãi đào vàng những người làm vàng tự do lại không thực hiện khâu xử lý cyanid dư thừa sau khi tách vàng ở trong bùn và nước lọc Vì vậy, lượng cyanid thải ra môi trường rất lớn [12]

Bên cạnh đó một lượng lớn cyanid trong nước có nguồn gốc từ việc sử dụng cyanid để đánh cá của ngư dân [15]

1.2.4 Độc tính của cyanid

Phơi nhiễm cyanid thường xảy ra ở đường tiêu hoá và đường hô hấp, tuy nhiên trong một số trường hợp cyanid lỏng có thể xâm nhập vào cơ thể khi tiếp xúc với mắt hoặc da Sau khi xâm nhập vào cơ thể cyanid vào máu theo tuần hoàn đi khắp các mô và cơ quan trong cơ thể [6], [13]

Trong tế bào cyanid gắn với enzym metalloenzym và làm bất hoạt enzym này Kết quả là làm bất hoạt enzym cytochrome oxidase (tại cytochrome a3), do đó

ức chế hô hấp tế bào ngay ở điều kiện đầy đủ oxy Chuyển hoá tế bào chuyển từ điều kiện hiếu khí sang kị khí và sinh ra acid acetic Các mô và cơ quan có nhu cầu oxy cao nhất (não và tim) là những ảnh hưởng sâu sắc nhất của ngộ độc cyanid cấp tính

cyanid là khoảng 100 và 200 mg/kg [13]

Cyanogen clorid được sử dụng trong khai thác mỏ và kim loại do đó có thể

có mặt trong nước thải công nghiệp Do thành phần có clo nên cyanogen clorid gây kích ứng mắt, đường hô hấp và nhiễm độc phổi chậm mức độ tương tự với clo hoặc phosgene khí Ở nồng độ cao (ví dụ, trong không gian kín), tác nhân này có thể gây

1.2.5 Ảnh hưởng của cyanid đối với môi trường biển

Nghiên cứu cho thấy cyanid không chỉ độc với con người mà còn tác động không nhỏ với môi trường đặc biệt là môi trường biển Nhiều nghiên cứu cho thấy cyanid phá huỷ san hô, gây chết hầu như toàn bộ sinh vật biển khi tiếp xúc, số còn lại bị ảnh hưởng đến chức năng vận động gây mất cân bằng hệ sinh thái

Năm 1958, nghiên cứu đã chỉ ra cyanid tác động lên hệ thần kinh của sinh vật biển với liều lượng đủ cao có thể gây chết sinh vật Sau đó tính chất này đã được sử dụng trong việc đánh bắt cá phục vụ cho công nghiệp cá cảnh ở các nước Đông Nam Á tiêu biểu là Philippin Lợi nhuận cùng với sự dễ dàng của việc mua hoá chất này đã khiến cho đánh cá bằng cyanid trở nên cực kì phổ biến trong công nghiệp cá cảnh thậm chí còn lan sang bắt các loại cá thương phẩm như cá mú và xuất khẩu sang các nước khác trong khu vực Sự bùng nổ của đánh cá bằng cyanid ở Philippin những năm 60 đã để lại những hậu quả không thể khắc phục cho vùng biển của quốc gia này Vốn được biết đến là một quốc gia có tài nguyên biển vô cùng phong phú nhưng chỉ sau một thời gian đánh cá bằng cyanid bùng nổ, hàng năm hàng ngàn hecta san hô đã bị tàn phá kéo theo đó là ảnh hưởng không hề nhỏ đến hệ sinh vật

rặng san hô Cyanid giết chết loài tảo cộng sinh Zooxanthallae trong các cụm san

hô, san hô thiếu dinh dưỡng bị tẩy trắng trong khi cấu trúc lá vẫn còn nguyên vẹn Chất lượng sinh vật biển giảm mạnh Cân bằng hệ sinh thái biển bị đảo lộn [15]

Ở Việt Nam theo thống kê sơ bộ cyanid đã gây thiệt hại khoảng 100 tấn hải sản chết dạt vào bờ Do không thể đánh bắt trong phạm vi từ bờ đến 20 hải lý, có tới 90% tàu lắp máy công suất thấp và gần 4.000 tàu không lắp máy đã phải nằm bờ Sản lượng khai thác ven bờ thiệt hại khoảng 1.600 tấn/tháng Với hoạt động nuôi

trồng thủy sản, có 9 triệu tôm giống bị chết, hàng ngàn lồng nuôi cá cũng bị thiệt hại Hoạt động du lịch thì không chỉ gây thiệt hại cho doanh nghiệp ở 4 tỉnh miền Trung vì theo Chính phủ, nhiều doanh nghiệp du lịch ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh cũng bị thiệt hại khi khách dự định đến 4 tỉnh miền trung hủy tour, khiến công suất sử dụng phòng tại bốn tỉnh trên mất 40-50% Các rạn san hô, phù du sinh vật chết tăng nguy cơ làm gián đoạn chuỗi thức ăn biển, khiến suy giảm đa dạng sinh học và nguồn lợi thủy sản khu vực, ảnh hưởng đến sinh kế lâu dài của dân

1.3 Các phương pháp xác định cyanid

1.3.1 Phương pháp truyền thống

Các phương pháp được đưa ra để xác định nồng độ cyanid trong nước như chuẩn độ, đo màu, điện cực chọn lọc ion … tuy nhiên những phương pháp này đều khó khăn khi áp dụng với các mẫu sinh học do trong kỹ thuật phân tích cyanid trong thủy sản có nhiều yếu tố nhiễu ảnh hưởng đến kết quả phép đo như các acid béo, một số đường khử, các hợp chất sulfat, các hợp chất chứa nito, độ đục…

Acid béo có thể bị lôi cuốn cùng trong quá trình chưng cất gây ra ảnh hưởng đối với phép đo Ảnh hưởng của acid béo có thể được loại bỏ bằng cách acid hóa mẫu Tuy nhiên không nên chiết trong thời gian quá dài vì cyanid tiếp xúc với pH

Các hợp chất lưu huỳnh có khả năng phản ứng với HCN tạo thiocyanat là một chất không độc Do đó nếu không loại trừ ảnh hưởng của sulfit sẽ gây ra sai số đối với phép đo Để loại trừ ảnh hưởng của các hợp chất lưu huỳnh trước khi chưng

thiocyanat

Các hợp chất nitrat và nitrit trong quá trình chưng cất có khả năng phản ứng với các acid hữu cơ tạo thành cyanid gây ra sai số thừa Để loại trừ ảnh hưởng này trước khi chưng cất thêm một lượng acid sulfamic để ngăn phản ứng trên xảy ra

Các ảnh hưởng của màu sắc và độ đục có thể loại trừ qua quá trình chưng cất [9], [10]

Phương pháp này được phát hiện và công bố lần đầu tiên vào năm 1950 bởi nhà khoa học Liebig Năm 1963 phương pháp này được hai nhà khoa học Bark và

với thuốc thử p- dimethylaminobenzalrhodanme Dung dịch trong bình chuẩn độ chuyển từ vàng sang đỏ Phương pháp chuẩn độ được dùng để phát hiện cyanid khi

pháp chuẩn độ để xác định lượng cyanid trong dung dịch thì một yêu cầu bắt buộc phải được đáp ứng là trong dung dịch không được phép có mặt phức chất của cyanid và kim loại [15]

-trong mẫu dựa trên phản ứng tổng hợp của nhà khoa học König xây dựng năm 1904-1905 Trong phản ứng König, cyanogen clorid hoặc cyanogen bromid được cho phản ứng với pyridin và một amin thơm tạo ra một phẩm nhuộm Dựa trên

acid asenic, cyanobromid được cho phản ứng với hỗn hợp pyridin-benzidin Hỗn hợp phản ứng sẽ có màu cam và chuyển sang màu đỏ trong vòng 6 phút, màu đỏ

dụng nhiều hoá chất độc hại như benzidine - một chất được cho là có khả năng gây ung thư

Một phương pháp tương tự phát triển dựa trên phản ứng màu của König là

thành cyanogen clorid là Cloramin-T Cyanogen clorid sau đó phản ứng với pyridin gồm cả pyrazolon cho sản phẩm có màu xanh đo được ở bước sóng 630nm Phương pháp này có thể sử dụng được trong môi trường acid, trung tính hoặc hơi kiềm Một

đề xuất khác cho phương pháp này được đưa ra bởi APHA (APHA,1985; Burtisand Ashwood, 1994) là thay thế hỗn hợp pyridine - pyrazolon bằng hỗn hợp bền hơn là pyridine - acid barbituric

Phương pháp so màu thích hợp để phát hiện cyanid trong khoảng 0,1-1 ppm

M) [15]

Đây là một phương pháp tương đối phổ biến vì đáp ứng nhanh và có độ nhạy cao Phương pháp này hoạt động trên cơ sở của màng chọn lọc ion Điện cực chọn lọc ion (ISEs) là ứng dụng của máy đo điện thế Khi đo, giá trị điện thế của dung dịch phụ thuộc vào hoạt độ một ion chính do đó có thể xác định sự có mặt của một ion chọn lọc khi có mặt các ion khác

Trong số các điện cực halogen màng điện cực bạc iodid hoặc sự phối hợp của điện cực bạc iodid và điện cực bạc sulfid thường được sử dụng để làm điện cực

(2), quá trình trao đổi ion xảy ra trên bề mặt điện cực

ppm) Tuy nhiên hầu hết các điện cực chọn lọc cyanid đều không chỉ đáp ứng với

Sử dụng cảm biến sinh học để phát hiện hoặc định lượng cyanid được phát triển dựa vào các sinh vật có khả năng thoái hoá cyanid

Mặc dù cyanid là một chất cực độc đối với con người và hầu hết sinh vật tuy nhiên có những loại vi sinh vật có khả năng chuyển cyanid thành chất không độc hoặc ít độc hơn nhờ có hệ thống enzym phân giải độc đáo Cảm biến vi khuẩn được tạo thành trên cơ sở những vi sinh vật có khả năng phân giải cyanid Mặt khác, một loại cảm biến vi khuẩn khá còn được phát triển dựa trên sự ức chế cytochrome oxydase trong chuỗi hô hấp tế bào do đó làm giảm sự tiêu thụ oxy của một số vi khuẩn hiếu khí Đo lường sự giảm tiêu thụ oxy bằng một điện cực sẽ có được thông tin về cyanid trong mẫu Giới hạn xác định được cyanid của phương pháp này là 0,8

còn gồm các cảm biến enzym, bao gồm các enzym ức chế và các enzym thoái hoá cyanid

Ưu điểm của phương pháp này là đáp ứng nhanh, nhạy, tín hiệu ổn định, không gây ô nhiễm môi trường, giá thành phù hợp và tiện sử dụng Tuy nhiên nhược điểm lớn của phương pháp này là độ chọn lọc không cao Trên thực tế đây không phải là biện pháp lý tưởng để xác định cyanid do số lượng enzym ức chế hay thoái hóa cyanid là không nhiều Điện cực theo dõi tín hiệu sự tiêu thụ oxy chỉ hoạt động trong thời gian ngắn (7 ngày) do sự bất hoạt enzym Các cảm biến sinh học dựa trên enzym phân giải cyanid có độ nhạy kém cho tất cả các loại detector Cảm biến dựa trên vi khuẩn có độ chọn lọc kém và dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường dinh dưỡng [15]

1.3.3 Phương pháp đo huỳnh quang

Nguyên lý chung: dựa trên phản ứng của tạo chất phát huỳnh quang của cyanid khi phản ứng với taurin và o-phtalaldehyd (OPA) ở pH = 9

Trong phương pháp này cyanid được cho phản ứng với taurin và OPA với tỉ

lệ đề xuất 500 µL dung dịch mẫu cùng 100 µL dung dịch OPA 1,5 mM 100 µL dung dịch taurin 3 mM và 800 µL 2- propanol vào bình thủy tinh 1,5 mL

Trong dung dịch đệm borat – phosphat (pH =9) cyanid tạo chất có khả năng

có độ chọn lọc cao và phản ứng tạo huỳnh quang xảy ra hoàn toàn ở nhiệt độ phòng Diaminoethan cho huỳnh quang mạnh gấp 7 lần so với taurin tuy nhiên phản ứng tạo huỳnh quang xảy ra rất chậm ở nhiệt độ phòng Cho thêm vào hỗn hợp dung

dịch β-cyclodextrin hoặc một dung môi hữu cơ như 2-propanol, dioxan, aceton…sẽ

kích hoạt hỗn hợp phản ứng khiến phản ứng xảy ra nhanh hơn Trong số trên thì propanol là dung môi cho kết quả tối ưu nhất

1.3.4 Phương pháp sắc ký

Từ 1974, sắc ký khí đã được sử dụng để phát hiện cyanid tuy nhiên phương pháp này không trở nên phổ biến vì độ nhạy kém Để cải thiện độ nhạy phương pháp người ta oxy hoá cyanid thành cyanogen bằng Cloramin- T Tuy có cải thiện được độ nhạy nhưng sắc ký khí vẫn không phải là lựa chọn hàng đầu do có nhiều phương pháp khác ưu việt hơn [15]

Hiện nay để phát hiện cyanid người ta dung một số kỹ thuật khác như sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký ion với detector phát hiện ion, detector UV-VIS, detector huỳnh quang, detector dẫn điện…là những phương pháp tối ưu hơn được dùng để phát hiện cyanid [15]

 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao detector phát hiện huỳnh quang đã được

sử dụng để phát hiện cyanid trong nước tiểu [8]

Chuẩn bị mẫu: 20 mL nước tiểu được cho vào một chén sứ chứa 100 µL

NaOH 4M Sau khi ly tâm ở 1000*g trong 15 phút, lấy 500 µL dung dịch này được

pha loãng thành 10 mL với nước và sử dụng cho phản ứng sinh huỳnh quang

Phản ứng phát sinh huỳnh quang: lấy 500 µL dung dịch mẫu hoặc dung dịch cyanid đã pha loãng trong một ống nghiệm màu nâu 1,5 mL có nắp thủy tinh Thêm

100 µL dung dịch taurin 30 mM và 100 µL dung dịch 2,3- naphtalenaldehyd 2 mM trong đệm borat-phosphat (pH = 9) Hỗn hợp được để yên trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng

hiện cyanid trong máu

Chuẩn bị mẫu: 0,1 mL máu được cho vào một chén sứ chứa 0,5 mL nước và

2 mL methanol Sau khi ly tâm ở 1600*g trong 10 phút Dung dịch này được đem đi

dẫn xuất huỳnh quang với NDA và taurin để ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi khai triển sắc ký

Điều kiện sắc ký:

- Pha tĩnh: cột sắc ký trao đổi ion TSK-gel

- Pha động: đệm phosphat (pH =6,1): MeOH = 1:1

Đây là phương pháp có độ nhạy cao, có thể phát hiện được cyanid và thiocyanat trong máu Tuy nhiên, với phương pháp xử lý mẫu này sẽ gặp khó khăn với mẫu thủy sản do ở mẫu thủy sản cyanid không tồn tại hoàn toàn ở dạng hòa tan như trong mẫu máu [19]

1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao

tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng các tương tác:

Tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định quá trình tách của các chất Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của của quá trình sắc ký Nếu pha tĩnh

là chất hấp thụ thì ta có sắc ký hấp thụ pha thường hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố [1], [2]

1.4.2 Máy HPLC

Máy HPLC gồm một hệ thống cấp dung môi, bơm, bộ tiêm mẫu, buồng cột chứa cột sắc ký, detector, và hệ thống thu nhận và xử lý số liệu

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC

Trong đó detector là bộ phận phát hiện chất phân tích và đo các tín hiệu sinh

ứng các nhu cầu phân tích khác nhau, ví dụ nhƣ: detector hấp thụ UV-VIS, detector huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay hơi, detector điện hóa, detector khối phổ

Nghiên cứu này sử dụng detector huỳnh quang do chất nghiên cứu có khả năng tạo dẫn chất phát huỳnh quang Đây là loại detector có độ nhạy rất cao vì bức

xạ phát ra đƣợc đo trên nền tối Tuy nhiên detector huỳnh quang không phổ biến nhƣ detector UV- VIS vì trên thực tế không nhiều chất có khả năng phát huỳnh quang hay tạo đƣợc dẫn chất phát huỳnh quang

Detector huỳnh quang được sử dụng cho cả chất có khả năng phát huỳnh quang và chất có khả năng tạo ra dẫn chất phát huỳnh quang khi phản ứng với thuốc thử

Độ chọn lọc của việc phát huỳnh quang được tạo ra dựa trên hai bước sóng là bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ và đặc biệt là chất phân tích phải có cấu trúc nhất định để có khả năng phát huỳnh quang [1], [2]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong đề tài này chúng tôi thực hiện nghiên cứu về phương pháp xác định hàm lượng cyanid trong thuỷ sản bao gồm các loại cá, tôm, mực lấy tại vùng biển một số tỉnh miền Trung: Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế trong tháng 9,10,11 năm 2016

2.2 Nguyên vật liệu- trang thiết bị

2.2.1 Nguyên vật liệu

a Chất chuẩn

- Chuẩn KCN (Merck), độ tinh khiết ≥ 96%

- Dung dịch chuẩn gốc cyanid 100 µg/mL: Hòa tan 0,0232 g KCN chuẩn

-) trong nước cất và định mức đến 100 mL bằng

- Dung dịch chuẩn cyanid 10 µg/mL: Hút 10 mL dung dịch chuẩn gốc cyanid

100 µg/mL vào bình định mức 100 mL, định mức đến 100 mL bằng nước

- Dãy dung dịch chuẩn làm việc: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn cyanid có nồng độ từ 0,1; 0,2; 0,4; 1 và 2 µg/mL

Chuẩn 2 µg/mL: Hút 2 mL chuẩn cyanid 10 µg/mL cho vào bình định mức

Chuẩn 1 µg/mL: Hút 1 mL chuẩn cyanid 10 µg/mL cho vào bình định mức

Chuẩn 0,4 µg/mL: Hút 2 mL chuẩn cyanid 2 µg/mL cho vào bình định mức

Chuẩn 0,2 µg/m: Hút 1 mL chuẩn cyanid 2 µg/mL cho vào bình định mức 10

Chuẩn 0,1 µg/mL: Hút 1 mL chuẩn cyanid 1 µg/mL cho vào bình định mức