Nghiên cứu định tính, định lượng triclosan và triclocarban trong kem đánh răng và nước rửa tay bằng HPLC

Triclosan TCS và Triclocarban TCC là hai hợp chất có đặc tính kháng khuẩn khá tốt, hoạt phổ rộng, do vậy một số nhà sản xuất đã đưa hai chất này vào trong kem đánh răng và nước rửa tay v

ĐỖ ĐỨC QUÝ

MÃ SINH VIÊN: 1201505

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

TRICLOSAN VÀ TRICLOCARBAN TRONG KEM ĐÁNH RĂNG VÀ

NƯỚC RỬA TAY BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

ĐỖ ĐỨC QUÝ

MÃ SINH VIÊN: 1201505

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

TRICLOSAN VÀ TRICLOCARBAN TRONG KEM ĐÁNH RĂNG VÀ

NƯỚC RỬA TAY BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu

2 TS Lê Thị Hường Hoa

Nơi thực hiện:

Khoa mỹ phẩm Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

HÀ NỘI – 2017

quá trình thực hiện khóa luận

Khóa luận của tôi được thực hiên tại Khoa Mỹ phẩm – Viện kiểm nghiệm thuốc

Trung ương Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới ThS Đỗ Thu Trang cùng với sự

giúp đỡ của cán bộ, nhân viên trong khoa Mỹ phẩm

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của Bộ môn Hóa Phân tích – Độc chất và Khoa Mỹ

phẩm Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa

luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu, Phòng đào tạo

nhà trường và các thầy cô đã dạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè đã luôn động viên tôi

trong suốt quá trình học tập cũng như thời gian tôi thực hiện đề tài này

Hà Nội, tháng 05 năm 2017 Sinh viên

Đỗ Đức Quý

1.1 TỔNG QUAN VỀ TRICLOSAN 2

1.1.1 Đặc điểm chung 2

1.1.2 Ứng dụng của triclosan 3

1.1.3 Độc tính của triclosan 4

1.1.4 Sự đề kháng của vi khuẩn với TCS và kháng sinh 6

1.1.5 Một số nghiên cứu về phân tích triclosan trong mỹ phẩm 6

1.2 TỔNG QUAN VỀ TRICLOCARBAN 9

1.2.1 Đặc điểm chung 9

1.2.2 Ứng dụng của triclocarban 10

1.2.3 Độc tính của triclocarban 12

1.2.4 Mối đe dọa về gia tăng tình trạng kháng kháng sinh khi phơi nhiễm với triclocarban 14

1.2.5 Một số nghiên cứu về phân tích triclocarban trong mỹ phẩm 15

1.3 SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 17

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 17

1.3.2 Cấu tạo máy HPLC 17

1.3.3 Ứng dụng HPLC 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 20

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 KHẢO SÁT LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU 24

3.1.1 Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu 24

3.2.2 Thẩm định phương pháp 27

3.2.2.1 Đánh giá độ thích hợp hệ thống 27

3.2.2.2 Độ đặc hiệu 28

3.2.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 31

3.2.2.4 Đánh giá độ đúng 33

3.2.2.5 Độ lặp lại 37

3.2.2.6 Độ chính xác trung gian 39

3.2.2.7 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 41

3.3 Áp dụng kiểm tra các mẫu kem đánh răng và nước rửa tay trên thị trường 42

3.4 BÀN LUẬN 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

LOQ: Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)

Bảng 2.1 Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích 20 Bảng 3.1 Độ thích hợp của hệ thống sắc ký 28 Bảng 3.2 Thời gian lưu và hệ số phân giải của các chất nghiên cứu trên các nền mẫu thử khác nhau 31 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của triclosan 31 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của triclocarban 33 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với triclosan trên nền kem đánh răng 34 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với triclocarban trên nền kem đánh răng 35 Bảng 3.7 Kết quả xác định lượng triclocarban có trong mẫu thử nước rửa tay Life buoy 36 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với triclocarban trên nền nước rửa tay 36 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với triclosan trên nền nước rửa tay 37 Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với triclosan trên nền kem đánh răng 37 Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với triclocarban trên nền kem đánh răng 38 Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với triclosan trên nền nước rửa tay 38 Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với triclocarban trên nền nước rửa tay 39 Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với triclosan trên nền kem đánh răng 39

triclosan trên nền nước rửa tay 40 Bảng 3.17 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với triclocarban trên nền nước rửa tay 41 Bảng 3.18 LOD và LOQ của TCS và TCS 41 Bảng 3.19 Kết quả phân tích một số mẫu kem đánh răng và nước rửa tay 44

nước 26 Hình 3.3 Sắc ký đồ độ đặc hiệu với TCS, TCC trên nền kem đánh răng 29 Hình 3.4 Sắc ký đồ độ đặc hiệu với TCS, TCC trên nền mẫu nước rửa tay 30 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diên tích pic và nồng độ triclosan.32 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diên tích pic và nồng độ triclocarban 33 Hình 3.7 Sắc ký đồ thu được khi phân tích các mẫu kem đánh răng 42 Hình 3.8 Sắc ký đồ thu được khi phân tích một số mẫu nước rửa tay 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kinh tế phát triển, chất lượng cuộc sống của người dân được nâng cao nên mỹ phẩm trở thành sản phẩm tiêu dùng quen thuộc Mỹ phẩm là loại sản phẩm, hàng hóa có lợi nhuận cao nên khó tránh khỏi việc sản xuất, kinh doanh, buôn bán mỹ phẩm kém chất lượng, không an toàn vì lợi nhuận Do đó việc đảm bảo chất lượng các sản phẩm mỹ phẩm cần được quan tâm nhiều hơn, đặc biệt là với các cơ quan quản lý

Kem đánh răng, nước rửa tay là hai sản phẩm thiết yếu của tất cả các hộ gia đình, nó được sử dụng hàng ngày, cho nên việc kiểm soát độ an toàn của hai chế phẩm này rất quan trọng

Triclosan (TCS) và Triclocarban (TCC) là hai hợp chất có đặc tính kháng khuẩn khá tốt, hoạt phổ rộng, do vậy một số nhà sản xuất đã đưa hai chất này vào trong kem đánh răng và nước rửa tay với mục đích làm tăng tác dụng sát khuẩn của chế phẩm, giúp loại bỏ đáng kể một số vi khuẩn có hại trên cơ thể người tiêu dùng khi sử dụng

Dù chưa có bằng chứng đầy đủ nhưng một số nghiên cứu chỉ ra rằng nếu sử dụng hai hợp chất này mà không kiểm soát được nồng độ thì có thể ảnh hưởng xấu tới người sử dụng như gây dị ứng, gây ung thư và ảnh tới sự cân bằng hormon, ảnh hưởng tới chức năng sinh sản

Để đảm bảo lợi ích cho người Việt sử dụng được chế phẩm kem đánh răng và nước rửa tay và để cung cấp một bằng chứng để cơ quan quản lý quản lý tốt hơn về nhóm hàng kem đánh răng và nước rửa tay, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định tính, định lượng triclosan và triclocarban trong kem đánh răng và nước rửa tay bằng HPLC” nhằm 2 mục tiêu sau:

1 Xây dựng quy trình phân tích triclosan và triclocarban trong kem đánh răng

và nước rửa tay

2 Áp dụng phương pháp xây dựng được để kiểm tra một số mẫu kem đánh răng

và nước rửa tay trên thị trường nhằm sơ bộ đánh giá có việc lạm dụng hai chất này trong chế phẩm kem đánh răng và nước rửa tay hay không

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ TRICLOSAN

1.1.1 Đặc điểm chung

Triclosan (TCS, 5-cloro-2-(2,4-diclorophenoxy) phenol) là một chất thuộc

nhóm kháng khuẩn hóa học, có hoạt phổ kháng khuẩn rộng [16] Ngay từ khi phát minh ra nó đã được sử dụng khá rộng rãi trong các sản phẩm thiết yếu của các hộ gia đình, các sản phẩm chăm sóc cá nhân [9, 41, 42, 50]

Lượng tiêu thụ TCS trên toàn thế giới vào năm 1998 vào khoảng 1500 tấn, trong đó đáng chú ý khoảng 350 tấn được sử dụng ở châu Âu và hơn 450 tấn đã được sử dụng ở Mỹ [25, 56]

Hệ số phân tán octanol/nước (log Kow) 4,76

Thời gian bán hủy (t1/2) Trong môi trường nước: 41 phút

Trong môi trường đất: 18 ngày

TCS thường được sử dụng đóng vai trò làm chất kháng khuẩn trong các sản phẩm như kem đánh răng, nước rửa tay, xà phòng tiệt khuẩn, chế phẩm khử mùi, dầu gội đầu, nước súc miệng và một số chế phẩm tẩy rửa khác

Theo phân loại, TCS là một halogen thơm, trong cấu trúc phân tử của nó có chứa chức phenol, diphenyl ether, polycloro biphenyl (PCB) [7, 8]

TCS ít tan trong nước, tan tốt trong methanol, ethanol và một số dung môi hữu

cơ khác như ether, cloroform

1.1.2 Ứng dụng của triclosan

TCS có tác dụng ức chế sự phát triển vi khuẩn ở nồng độ thấp và có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn ở nồng độ cao, ngoài ra nó còn chống lại nhiều loại vi nấm nên thường được sử dụng với hai mục đích chính sau: bảo quản sự ổn định của chế phẩm và để tiệt khuẩn, khử trùng, tẩy uế [34]

Cơ chế hoạt động của TCS hiện nay vẫn chưa được xác định đầy đủ Nhiều nghiên cứu chỉ ra TCS ức chế hoạt động của enzym Enoyl-acyl carrier protein reductase (ENR) do đó làm suy giảm sự sản xuất lipid của vi khuẩn Vì thế màng tế bào của vi khuẩn không được hoàn thiện và vi khuẩn sẽ ngừng nhân lên

TCS đóng vai trò là thành phần có hoạt tính trong các sản phẩm nha khoa từ năm 1980 ở Châu Âu và ở năm 1990 ở Mỹ [23]

Năm 1989, theo định hướng mỹ phẩm của cộng đồng các nước châu Âu đã phê chuẩn TCS được sử dụng làm chất bảo quản trong mỹ phẩm và các chế phẩm

vệ sinh lên đến 0,3 % [25]

Theo FDA, lượng TCS được khuyến cáo sử dụng trong các sản phẩm thuốc kháng khuẩn chăm sóc sức khỏe, các loại xà phòng kháng khuẩn lên đến 1 %, và trong kem đánh răng là 0,3 % [22]

Trong vòng 30 năm qua, TCS cũng đã được sử dụng làm chất sát khuẩn khá thành công cho các bệnh viện, nó giúp kiểm soát thành công sự bùng phát

Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA), ngoài ra nó còn khá nhạy cảm

với các loại vi khuẩn không điển hình và vi nấm như Plasmodium falciparum và

Toxoplasma gondii [34, 43, 54, 64]

Do vậy, một số cơ sở y tế đã cho bệnh nhân có da mang MRSA tắm với dung dịch 2 % triclosan, tuy nhiên người ta nhận ra rằng sự nhạy cảm của MRSA đã giảm hẳn trong những năm gần đây và đã xuất hiện tình trạng đề kháng kháng sinh [17] Năm 2009, Hiệp hội Y tế Công cộng Hoa Kỳ (APHA) đã đề xuất nên cấm sử dụng TCS, tuy nhiên từ đó đến nay vẫn chưa có văn bản cụ thể nào về việc cấm tuyệt đối sử dụng chất này

1.1.3 Độc tính của triclosan

1.1.3.1 Độc tính trên người

TCS khi vào trong cơ thể người, nó được hấp thu phân bố, chuyển hóa, thải trừ rất nhanh Sau khi liên hợp với glucoronid và sunfur (chuyển hóa pha II tại gan) thì nó được bài tiết chủ yếu qua nước tiểu

Hiện nay, về độc tính cụ thể trên người của TCS còn khá nhiều tranh cãi Một

số nghiên cứu chỉ ra rằng triclosan ít độc với con người và động vật có vú khác [48]

Ngược lại, một số nghiên cứu chỉ ra triclosan gây ra một số tác dụng bất lợi cho con người như sau:

- Viêm da do tiếp xúc, hoặc kích ứng da: phản ứng viêm da (PACD) có thể được kích hoạt khi da tiếp xúc với TCS và phản ứng này tăng lên nếu vùng da đó tiếp tục được tiếp xúc với ánh nắng mặt trời [53] Theo công bố của các hãng sản xuất khác nhau về kem đánh răng và xà phòng tiệt khuẩn có chứa TCS thì nó vẫn tiếp tục hoạt động sau 12 giờ sử dụng Như vậy, việc tiếp xúc kéo dài với triclosan

sẽ làm tăng phản ứng PACD Kết quả thử nghiệm của nhiều tác giả khi nghiên cứu test phản ứng trên da với nồng độ từ 0,5 tới 20 % của triclosan đã chỉ ra rằng việc xuất hiện các phản ứng viêm da và khả năng gây kích ứng da là rất thấp (1 % quan sát được trong tổng số người tình nguyện được nghiên cứu) [21]

- TCS đã được tìm thấy trong nước tiểu, huyết tương và sữa mẹ [5, 12], tuy nhiên chưa xác định được nguồn cụ thể, mức độ TCS ở ngưỡng cao được tìm thấy ở trên 60 % các mẫu sữa mẹ, điều này cho thấy tiềm năng hấp thu của TCS vào cơ thể người là rất cao

- Theo Cục khảo sát về sức khỏe và điều tra dinh dưỡng quốc tế (NHANES) thu thập năm 2003 – 2004, TCS đã được tìm thấy trong 75 % mẫu nước tiểu của phụ nữ và trẻ em từ 6 tới 11 tuổi [11, 12]

- Tuy nhiên cho đến nay, chưa có nghiên cứu cụ thể và toàn diện nào chỉ ra rằng TCS đã tạo ra chất gây ung thư, gây đột biến tế bào, gây tác động quái thai của TCS trên người

- Một số giả thuyết cho rằng TCS làm gia tăng lượng cloroform (một chất gây ung thư theo phân loại của Mỹ) trong nước do nó phản ứng với clo hoạt động có trong nước máy được khử trùng bởi clo, nghiên cứu này được thực hiện bởi Fiss và cộng sự nhưng các nghiên cứu khác nói rằng không đo lường được lượng cloroform tạo ra trong bàn chải đánh răng thông thường khi sử dụng kem đánh răng có chứa TCS và nước uống có chứa clo [26] Cho đến này vấn đề này vẫn được tiếp tục nghiên cứu và tranh luận khá sôi nổi ở Anh nhưng vẫn chưa có kết luận cụ thể [18]

1.1.3.2 Độc tính trên động vật và các vi sinh vật khác

- Ảnh hưởng tới quá trình sản xuất hormon tuyến giáp, gây hạ thân nhiệt, gây trầm cảm, tác động xấu tới hệ thần kinh trung ương ở chuột Tiếp xúc với lượng 0,03 mg/l có thể gây ra các biểu hiện biến đổi gen ở nòng nọc, gây ra tình trạng quá sản, loạn sản tế bào [66]

- Theo nghiên cứu của Kumar và cộng sự, việc tiếp xúc và phơi nhiễm lâu dài với TCS có thể làm giảm sản xuất tinh trùng, ảnh hưởng tới chức năng sinh sản ở chuột đực [32]

- Do có cấu trúc tương tự với estrogen, vì thế nó ức chế enzym Estrogen sulfotransferase trong bào thai cừu và nó có thể gây quái thai [28]

- Người ta nhận thấy rằng tiếp xúc lâu dài với TCS làm tăng khả năng gây ung thư gan ở chuột Do đặc tính thân dầu nên TCS tích tụ trong các mô của chuột và hoạt hóa yếu tố tăng trưởng gây ung thư [59, 62]

- Nghiên cứu của Trutter (1993) cho thấy khi chuột đực tiếp xúc với liều ≥ 25 mg/kg/ngày và chuột cái là ≥ 75 mg/kg/ngày trong 90 ngày thì giảm đáng kể lượng hồng cầu, hemoglobin và hematocrit

- Nghiên cứu của James và cộng sự cho thấy độc tính của TCS với động vật thủy sinh là rất cao, các giá trị độc tính cấp dao động từ 1,4 tới 3000 mg/l Chính vì nồng độ TCS ngày càng cao trong môi trường, nên xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật kháng lại TCS, đó là mối hiểm họa rất lớn cho con người [52]

1.1.4 Sự đề kháng của vi khuẩn với TCS và kháng sinh

Việc lạm dụng TCS đã không những làm gia tăng khả năng đề kháng của vi khuẩn với TCS mà còn làm gia tăng đề kháng của vi khuẩn với một số loại kháng sinh

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự phát triển của vi khuẩn kháng kháng sinh

sau khi tiếp xúc với TCS, Pseudomonas aeruginosa sau khi phơi nhiễm với TCS đã

Streptococci với các nhóm kháng sinh [37]

Như vậy, việc kháng chéo của các vi khuẩn đối với kháng sinh khi phơi nhiễm đối với triclosan ngày càng tăng, do vậy việc sử dụng triclosan trong các chế phẩm cần được tuân thủ một cách nghiêm ngặt hơn

1.1.5 Một số nghiên cứu về phân tích triclosan trong mỹ phẩm

Ở Việt Nam, cho tới nay chưa tìm thấy nghiên cứu nào nói về việc phân tích triclosan nói chung và phân tích triclosan trong mỹ phẩm nói riêng

Đã có một số nghiên cứu phân tích triclosan trên thế giới như:

- Phân tích triclosan trong sản phẩm chăm sóc cá nhân với LC-MS [12] với:

- Thể tích tiêm: 5 µl

- Nhiệt độ cột: 40oC

Điều kiện MS: ESI – MS:

- Nhiệt độ nguồn phun ion: 300 oC

- Xác định hàm lượng triclosan trong một số chế phẩm chăm sóc cá nhân bằng

HPLC với các loại detector khác nhau [4] với:

- Thời gian chạy sắc ký: 15 phút

- Detector mảng diod DAD

- Khoảng nồng độ tuyến tính 0,008 – 0,06 mg/ml

- Hệ số R2 = 0,9995

- LOD = 2 g/ml

Với detector ESI – MS/MS:

- Nhiệt độ nguồn phun ion: 180 oC

- Ion mẹ có m/z = 288,4 và 289,5

- Ion con có m/z = 270,3 và 252,5

- Xác định hàm lượng triclosan trong chế phẩm khử mùi và xà phòng tiệt khuẩn

bằng HPLC [51] với :

- Cột CH-8 (250 x 4 mm, 5 m; Merck, Darmstadt, Germany)

- Pha động: hỗn hợp methanol, acetonitril, tetrahydrofuran, nước với tỷ lệ (35 : 25 : 10 : 30)(v/v/v/v)

- Giới hạn phát hiện (LOD): 2,08 µg/l

- Pha động: theo chế độ gradient với kênh A là đệm pH = 9 của acid boric và kênh B là acetonitril

- Bước sóng phát hiện: 283 nm

- Phân tích triclosan trong các mẫu nước thải bằng HPLC với các loại detector

khác nhau [29]:

- Cột SB C – 18 (100 mm x 3 mm, 18 µm)

- Pha động: theo chế độ gradient với kênh A là methanol và kênh B là nước

- Detector UV – VIS, bước sóng 280 nm

- LOD và LOQ lần lượt là 1,2 ng/l và 4,1 ng/l

Với detector ESI – MS/MS:

- Nhiệt độ nguồn phun ion: 350 oC

- Nebulizer: 50 psi

- Hiệu điện thế nguồn phun ion: 3500 V

- Ion mẹ có m/z = 287

- Ion con có m/z = 35,1

- Phân tích triclosan trong đất và một số chất rắn sinh học bằng HPLC với detector

UV – VIS sử dụng cột C-18 SPE có chất hấp phụ chọn lọc TCS là một polymer (MIP) cho kết quả LOQ 300 g/kg, việc sử dụng MIP làm sạch mẫu đã làm giảm chi

phí phân tích do tính chọn lọc cao và khả năng tái sử dụng lên đến 35 lần [58]

1.2 TỔNG QUAN VỀ TRICLOCARBAN

1.2.1 Đặc điểm chung

Triclocarban (TCC, 3-(4-clorophenyl)-1-(3,4-diclorophenyl) ure) là một chất

thuộc nhóm kháng khuẩn hóa học, có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, hoạt phổ kháng khuẩn khá rộng [19] Từ khi tìm ra cho đến nay nó được sử dụng khá rộng rãi trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân, các sản phẩm thiết yếu của hộ gia đình và một số chất tẩy uế, khử trùng dùng trong y khoa [10, 55, 60]

Người ta ước tính rằng, trung bình mỗi năm có khoảng 454.000 kg triclocarban được sử dụng ở Hoa Kỳ Thêm vào đó Hoa Kỳ hằng năm chi gần 1 tỷ USD cho việc sử dụng các sản phẩm có chứa TCC [3, 31, 33] TCC có thể được tìm

thấy trong xà phòng tiệt khuẩn, sản phẩm khử mùi, kem đánh răng, nước súc miệng,

và một số dung dich sát khuẩn khác [10, 55]

Theo phân loại, triclocarban thuộc nhóm chất hydroclocarbon thơm, có cấu trúc tương tự các hợp chất carbanilid khác được tìm thấy trong một số hóa chất bảo

vệ thực vật và một số thuốc khác, trong phân tử có chứa 2 vòng cloro phenyl [34] TCC tan rất ít trong nước, tan được trong methanol và một số dung môi hữu

cơ khác như ether, cloroform

Bảng 1.2 Một số tính chất của triclocarban [29]

Thời gian bán hủy (t1/2) Trong môi trường nước: 12 giờ

Trong môi trường đất: 108 ngày

1.2.2 Ứng dụng của triclocarban

Triclocarban có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn nếu ở nồng độ thấp, ở nồng độ cao có tác dụng diệt khuẩn rất mạnh Triclocarban khá nhạy cảm đối với vi khuẩn Gram (+) (vi khuẩn có thành tế bào dày) hơn vi khuẩn Gram (-) [27, 37, 44, 45]

Cơ chế hoạt động của triclocarban hiện nay vẫn chưa được xác định đầy đủ Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng TCC ức chế hoạt động của enzym Enoyl-acyl carrier protein reductase (ENR) do đó làm suy giảm sự sản xuất lipid của vi khuẩn Vì thế

màng tế bào của vi khuẩn không được hoàn thiện và vi khuẩn sẽ ngừng nhân lên [27), 44, 54]

Từ những năm 1960, TCC được sử dụng như một chất có vai trò kháng khuẩn

và kháng nấm trong rất nhiều các loại xà phòng (kể cả xà phòng dung dịch và xà phòng thanh, bánh) ở Mỹ [44]

Theo Ủy ban khoa học và sản phẩm mỹ phẩm ở châu Âu quy định thì triclocarban được phép làm chất bảo quản trong các sản phẩm lên tới 0,2 % [19, 55]

Ngay từ năm 1957-1958, TCC đã được sử dụng ở các nước châu Âu với nồng

độ lên tới 1,5 % trong xà phòng thanh [49]

Năm 1986, Ủy ban khoa học về sản phẩm mỹ phẩm và các sản phẩm không

phải là thực phẩm được sử dụng cho người tiêu dùng (Scientific Committee on

Cosmetic Products and Non-Food Products intended for Consumers, SCCNFP) quy

định nồng độ TCC được sử dụng với mục đích bảo quản cho phép là 0,2 % [19] Năm 1999, Ủy ban châu Âu quy định nồng độ TCC an toàn được sử dụng trong nước rửa tay và các sản phẩm chăm sóc cơ thể lên đến 1,5 % [19]

Triclocarban là khá hiệu quả đối với những bệnh nhân nhiễm trùng niêm mạc ban đầu, đồng thời nó còn làm giảm thiểu khả năng nhiễm siêu vi khuẩn của một số bệnh nhiễm trùng khác [20]

Các nghiên cứu được công bố trong y văn cho thấy TCC khá nhạy cảm đối với

các chủng Staphylococcus, Streptococcus và Enterococcus Nồng độ ức chế tối

thiểu đối với các dòng này khá thấp từ 0,5 đến 8 mg/l [20]

Đặc biệt nó khá nhạy cảm đối với Staphylococcus aureus, một chủng khá phổ

biến trên bề mặt da, do vậy triclocarban có tác dụng hiệp đồng trong điều trị các nhiễm khuẩn trên bề mặt da khá tốt [44]

Với nhiều lợi ích như vậy, các nhà sản xuất đã sử dụng triclocarban để đưa vào chế phẩm của mình một cách tràn lan Nhận thấy tình hình này, vào tháng 12

năm 2013, FDA (Food and Drug Administration) yêu cầu các công ty phải chứng

minh rằng các sản phẩm của mình có chứa triclocarban thì phải vô hại đối với người tiêu dùng

Trong những năm gần đây, các công ty Jonhson & Jonhson, Procter & Gamble, Colgate – Palmolive và Avon đã bắt đầu loại bỏ việc sử dụng hóa chất này

do mối quan ngại về sức khỏe

Tất cả các phương pháp này đều cho kết quả TCC không gây kích ứng đối với

da người bình thường Tuy nhiên nó có thể gây kích ứng da và viêm da đối với những đối tượng nhạy cảm với nó [21, 24, 30]

- Rối loạn nội tiết:

Cơ chế tác động gây rối loạn nội tiết chưa thực sự rõ ràng Có rất nhiều giả thiết cho rằng triclocarban hoạt động tương tự như các chất đồng kết hợp hoặc đồng tác động điều chỉnh hoặt động của các thụ thể estrogen và thụ thể androgen Các thí nghiệm cho thấy triclocarban kích hoạt receptor Constitutive Androgen và receptor

Estrogen alpha cả in vitro và invivo Do đó là tăng cường hoạt động của các hormon

testosteron, estrogen và một số hormon có bản chất steroid khác như cortisol, do đó

nó làm rối loạn cân bằng nội tiết của cơ thể [6, 61, 63]

Gần đây người ta còn tìm ra một cơ chế gây rối loạn nội tiết khác thông qua sự kích thích tổng hợp nhiều chất trung gian hóa học làm tăng cường sự hoạt động của các hormon có bản chất steroid và gây rối loạn nội tiết [13]

Việc triclocarban gây rối loạn nội tiết ảnh tới tới chức năng sinh sản và phát triển của cơ thể được thể hiện rất rõ Cụ thể đối với nam: chậm phát triển cơ quan sinh dục, chậm phát triển xương, giảm sản xuất tinh trùng; đối với nữ: chậm phát triển cơ thể, rối loạn kinh nguyệt, chậm dậy thì [9, 33]

Triclocarban còn làm tăng hoạt động của kênh RyR1, làm phá vỡ cân bằng nội môi canxi trong một số loại tế bào (tế bào cơ xương, tim, thần kinh, tế bào miễn dịch) làm thay đổi sự hoạt động của các tế bào này [24, 46]

- Độc tính sinh ung thư :

Chưa có nghiên cứu cụ thể về khả năng sinh ung thư trên người Một số nghiên cứu trên động vật chỉ ra rằng TCC nếu tiếp xúc lâu có thể làm gia tăng nguy

cơ ung thư

Ung thư tuyến tiền liệt: tác động làm tăng sinh tế bào LNCaP và C4-2B là các

tế bào góp phần gây ung thư tuyến tiền liệt [21]

Ung thư vú: do sự khuếch đại quá mức hormon giới tính do vậy nó có thể làm

gia tăng nguy cơ mắc ung thư vú ở cả nam giới và nữ giới [36]

Trên gan: nó được chứng minh là kích hoạt PXR và CAR, dẫn đến khởi phát

của mỗi gen Cyp2b10, điều này có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người [14]

Trên thận: người ta thấy rằng phơi nhiễm lâu dài với TCC có thể là giảm trọng

lượng thận

Ngoài ra, TCC còn làm suy giảm trọng lượng lách, suy giảm khả năng sản xuất các loại tế bào tham gia vào chức năng miễn dịch [32]

1.2.3.2 Độc tính trên động vật và các vi sinh vật khác

Triclocarban tích tụ ở một số sinh vật như giun đất, tích lũy nhanh trong tảo và

ốc sên, tích lũy với lượng khá cao trong động vật thủy sinh [47]

Khả năng triclocarban tích tụ sinh học trong thực vật đã được khai thác trong việc xây dựng các vùng đất ngập nước để giúp loại bỏ triclocarban khỏi nước

thải Những vùng đất ngập nước này được coi là một phương pháp hiệu quả để loại

bỏ PPCPs, bao gồm triclocarban và triclosan, từ nước thải sinh hoạt Các hợp chất như vậy có xu hướng tập trung vào rễ cây trồng ở đầm lầy Do đó việc tiếp xúc lâu

dài của các hệ sinh thái đất ngập nước với nước thải có chứa triclocarban như là một

giải pháp chính cho xử lý ô nhiễm nước thải vẫn đang được hướng tới [65]

Khi triclocarban được tìm thấy ở nồng độ cao trong môi trường nước, có

những lo ngại về tính độc của nó đối với các loài thủy sinh Cụ thể, triclocarban đã

được chứng minh là độc đối với lưỡng cư, cá, động vật không xương sống và thực vật thủy sinh Dấu vết của hợp chất này đã được tìm thấy ở cá heo Atlantic [10] Hoạt tính kháng khuẩn của triclocarban có thể phá vỡ các hormon quan trọng đối

với quá trình phát triển và nội tiết trong động vật hoang dã Các hệ thống thần kinh và sinh sản đặc biệt bị ảnh hưởng khi tiếp xúc với hợp chất này Ví dụ,

triclosan và triclocarban hiệu quả gấp 100 – 1000 lần trong việc ức chế và giết tảo,

cá nhám và các loài cá khác so với việc tiêu diệt vi khuẩn Triclocarban và triclosan

cũng đã được tìm thấy ở nhiều sinh vật, bao gồm tảo, giun sán dưới nước, cá heo và

vi khuẩn chia sẻ gen, các dòng vi khuẩn kháng này nhân lên rất mạnh Hậu quả là một nhóm vi khuẩn kháng thuốc mới xuất hiện

Khi vi khuẩn kháng được tiếp xúc với thuốc kháng sinh, chúng tăng sự biểu hiện các gen đề kháng Nguy cơ kháng kháng sinh kháng sinh đã được nghiên cứu bằng cách theo dõi định lượng sự phong phú của gen tetQ trong nước thải Vì tetQ

là gen kháng phổ biến nhất trong môi trường Việc bổ sung triclocarban đã làm tăng

sự biểu hiện của gen tetQ này

Biểu hiện gen tetQ trong vi khuẩn cũng tăng lên đáng kể khi nhiều chất như tetracyclin, triclosan và triclocarban được thêm vào hệ thống thí nghiệm cùng một lúc Tính chất phức tạp của các cộng đồng vi sinh vật và vô số các kháng sinh có trong môi trường nước thường dẫn đến các mô hình kháng kháng sinh được thấy ở các vi khuẩn trong tự nhiên [57]

1.2.5 Một số nghiên cứu về phân tích triclocarban trong mỹ phẩm

Ở Việt Nam chưa thấy có công bố nào về việc phân tích TCC trong mỹ phẩm cũng như các sản phẩm khác

Có khá nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới, cụ thể như sau:

- Phân tích đồng thời triclosan và triclocarban trong các sản phẩm mỹ phẩm bằng

- Pha động: hỗn hợp ACN và nước, chạy theo chế độ gradient

- Detector UV – VIS, bước sóng 265 nm

- Nhiệt độ: 25 oC

- Phân tích triclocarban trong các sản phẩm mỹ phẩm bằng RP-HPLC [40] với:

- Cột Merck Superspher 100 RP 18 (250,0 mm × 4,6 mm, 4 m) cùng với cột bảo vệ Chrompack C18 (3,0 mm × 4,6 mm, 5 m)

- Pha động: hỗn hợp acetonitril và nước, chạy theo chế độ gradient

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Detector UV – VIS

- Kết quả R2 = 0,9965, LOD = 0,095 mg/l, LOQ = 0,318 mg/l

- Phân tích triclocarban trong mỹ phẩm và chế phẩm chăm sóc cá nhân bằng

- Nhiệt độ nguồn phun ion: 450 oC

- Hiệu điện thế nguồn phun ion: 15000 V

- Ion mẹ có m/z = 315,0

- Hệ số R2 > 0,99

- Phân tích triclocarban trong nguồn nước mặt sử dụng HPLC [35] với:

- Cột: Develosil RP Aqueous AR – 5RP – 30

- Pha động: hỗn hợp methanol và nước với tỷ lệ (90 : 10)(v/v)

- Detector : mảng diod với bước sóng phát hiện 265 nm

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Khoảng nồng độ tuyến tính: 0,3 – 20 g/ml

- LOD = 0,17 µg/ml và LOQ = 0,50 µg/ml

1.3 SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.1.1 Sắc ký

Sắc ký là một nhóm các phương pháp dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: pha tĩnh và pha động [2]

1.3.1.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC (High performance liquid chromatography) là một kỹ thuật tách trong

đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha, tức là liên quan đến

ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất

ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [1], [2]

1.3.2 Cấu tạo máy HPLC

Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật để tách định lượng bằng sắc ký lỏng Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận được kết nối với nhau:

1.3.4.1 Định tính

Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng điều kiện sắc ký (pha động, pha tĩnh, nhiệt độ) là những thông tin định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ thường gặp khó khăn Do vậy, HPLC thường dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ

1.3.4.2 Phân tích định lượng

Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic Chiều cao pic dễ đo, tuy nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp, cân đối Diện tích pic được dùng phổ biến và đảm bảo cho kết quả tin cậy

Những phương pháp thường dùng trong phân tích sắc ký:

- Phương pháp chuẩn ngoại: tiến hành chạy sắc ký ở cả hai mẫu chuẩn và thử

trong cùng điều kiện So sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu

chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

- Phương pháp thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các

chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu

và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết của chất trong mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ ΔC và sự tăng của diện tích pic ΔS

- Phương pháp chuẩn nội: người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong

mẫu phân tích và trong dung dịch đối chiếu Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn

Một số yêu cầu đối với chất chuẩn nội:

+ Pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác

+ Pic của chất chuẩn nội phải gần với pic của chất phân tích

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: hàm lượng phần trăm của chất phân tích

được xác định bằng tỷ số (tính theo %) của diện tích pic chất đó và diện tích các pic

có trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và pic các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện)

+ Triclosan: NSX: Anh, lô: 106MHC CAS 3380-34-5; HL: 99,0 %

+ Triclocarban: NSX: Mỹ, lô: MKBT7249V CAS 101-20-2; HL: 99,0 %

- Acetonitril HPLC (Merck), nước tinh khiết

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng Shimadzu với 5 module:

+ Bơm: Modle LC – 10Atvp

+ Detector mảng diod: Model SPD - M10Avp

+ Module điều khiển: Model SCL – 10Avp

+ Degasser: loại DGU – 14A

+ Bộ trộn dung môi: loại FCV – 10Alvp

- Cân phân tích chính xác tới 0,1 mg

- Máy lắc siêu âm

- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, bình cầu, ống đong, phễu lọc…

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Bảng 2.1 Các mẫu nền được sử dụng để xây dựng phương pháp phân tích

1 Kem đánh răng

Sensodyne fresh mint

Neocosmed Company Ltd, Thailand

Không có chứa TCS, TCC

2 Nước rửa tay Life Buoy

loại 500 ml

Công ty TNHH Quốc tế Unilever Việt Nam

Có chứa Triclocarban

3 Nước rửa tay Dr Clean

Hand Wash (Grape)

Công ty cổ phần Today Cosmetic

Có chứa Triclosan

- Một số mẫu kem đánh răng và nước rửa tay trên thị trường để xác định sự có mặt của triclosan và triclocarban

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xây dựng phương pháp phát hiện TCS, TCC có mặt trong chế phẩm với hai quy trình: Quy trình xử lý mẫu và Quy trình phân tích, phát hiện TCC, TCS bằng HPLC

- Đánh giá phương pháp đã xây dựng:

- Tính đặc hiệu

- Độ chính xác của phương pháp (gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian)

- Độ đúng

- Khoảng tuyến tính

- Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện

- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện TCS, TCC trong một số chế phẩm kem đánh răng và nước rửa tay đang lưu hành trên thị trường

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Xây dựng phương pháp phân tích với HPLC:

Sử dụng là 2 mẫu đại diện cho các nhóm sản phẩm: để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký thích hợp, sau đó xử lý các kết quả thu được bằng thuật toán thống kê

- Xây dựng quy trình xử lý mẫu:

Chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, chất phân tích bên trong môi trường pha mẫu (dựa vào 3 yếu tố: tính tan của chất phân tích, đặc điểm của nền mẫu, phương pháp phân tích)

- Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp:

Cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, bước sóng phân tích với detector, thể tích tiêm mẫu Định tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết pic

và chồng phổ UV – VIS, so sánh hệ số tương đương của pic nghi ngờ thu được từ mẫu thử với pic thu được từ mẫu chuẩn Định lượng bằng cách so sánh diện tích thu được từ mẫu thử với mẫu chuẩn

Do đặc thù của các mẫu chế phẩm nghiên cứu, nếu có chứa chất TCS, TCC ở hàm lượng rất nhỏ nên chúng tôi chọn vùng giới hạn định lượng để đánh giá phương pháp, bao gồm các nội dung: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại

- Độ đặc hiệu:

Tiến hành sắc ký các loại mẫu: mẫu nền (mẫu chế phẩm không có chất cần phân tích); mẫu chuẩn; mẫu tự tạo (mẫu chế phẩm không có chất cần phân tích đã được cho thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình

Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo: pic của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic khác (nếu có trong nền mẫu), pic của của chất cần phân tích có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn thu được từ mẫu chuẩn Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn Pic của chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết Hệ

số chồng phổ UV – VIS của pic hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc ký đồ của dung dịch thử hay tự tạo với pic tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn phải đạt từ 99 % trở lên

- Khoảng nồng độ tuyến tính:

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (tối thiểu 5 dung dịch) Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995) Nếu r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp

- Độ đúng:

Xác định trên các mẫu tự tạo Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu không có chất cần phân tích Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80 %, 100 % và 120 % so với nồng độ phân tích Tại mỗi mức nồng

độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính Tính lượng thu hồi theo công thức:

Tham khảo hướng dẫn của ICH, ASEAN và AOAC, yêu cầu với phép thử định lượng: tỷ lệ thu hồi 95,0 – 105,0 % và RSD của tỷ lệ thu hồi không quá 3,7 %

ở mỗi mức nồng độ

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

Có thể tiến hành theo cách pha loãng hoặc dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng Giá trị LOD = (3,3 x δ)/a, trong đó δ: Độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu nền (placebo), a: Hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính (y = ax + b) giữa nồng độ và đáp ứng pic của chất cần phân tích LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt)

2.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Các kết quả thực nghiệm được xử lý thống kê trên Microsoft Excel 2013

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

3.1 KHẢO SÁT LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU

3.1.1 Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu

Lựa chọn dung môi để chiết rất quan trọng, chúng tôi đã khảo sát sơ bộ trên một số dung môi hòa tan mẫu như methanol, methanol – nước, acetonitril, acetonitril – nước… và nhận thấy hỗn hợp dung môi acetonitril – nước (70 : 30) (v/v) là hệ dung môi phù hợp với điều kiện tại cơ sở, đồng thời hòa tan được hoạt chất cần phân tích, ít lẫn tạp chất và loại được nhiều thành phần khác có trong nền mẫu

Đối với cả hai mẫu kem đánh răng và nước rửa tay, quy trình xử lý khá đơn giản, chỉ cần cho hỗn hợp dung môi acetonitril – nước (70 : 30) và lắc siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

3.1.2 Cách chuẩn bị mẫu

3.1.2.1 Chuẩn bị mẫu thử từ kem đánh răng và nước rửa tay

Cân khoảng 1,0 g chế phẩm cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml acetonitril, lắc siêu âm ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó để nguội rồi thêm nước vừa

đủ đến vạch Lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 5 ml dịch lọc đầu Lọc qua màng lọc 0,45

µm

3.1.2.2 Chuẩn bị mẫu chuẩn

- Cân chính xác khoảng 30,0 mg từng chất chuẩn cho vào bình định mức 100

ml, thêm methanol để hòa tan và vừa đủ tới vạch Hút và pha loãng tiếp bằng pha động để được các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1,5 – 4,5 µg/ml Các dung dịch này được sử dụng để pha dãy chuẩn hoặc pha dung dịch hỗn hợp chuẩn

- Dung dịch chuẩn đánh giá (QC): cân chính xác 1,0 g chế phẩm vào bình định

mức 100 ml, thêm một lượng mẫu chuẩn sao cho đạt nồng độ 100 – 120 % của quy trình phân tích và xử lý giống như mẫu thử (Dùng trong quy trình thường quy để kiểm tra mẫu)

3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.2.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký

Chúng tôi thử nghiệm lựa chọn điều kiện sắc ký trên hệ thống gồm:

Kết quả thu được như ở Hình 3.1

Hình 3.1 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn với hệ pha động methanol-nước

Kết quả cho thấy hệ pha động chứa MeOH là không phù hợp do không tách hoàn toàn được hai pic TCS và TCC ra khỏi nhau

Tiếp tục khảo sát với các điều kiện:

Kết quả cho thấy hệ dung môi chứa acetonitril tách khá tốt các chất phân tích Đặc biệt hệ có tỷ lệ 70 : 30 cho độ phân giải và thời gian phân tích phù hợp,

do vậy được chọn làm pha động cho nghiên cứu tiếp theo

Dựa vào kết quả thử nghiệm, điều kiện sắc ký tương đối thích hợp đã được chọn để phân tích như sau:

So sánh phổ UV – VIS của pic thu được từ dung dịch thử có thời gian lưu tương ứng với pic thu được từ dung dịch chuẩn và hệ số chồng phổ của các pic này phải đạt từ 0,99 trở lên

Phương pháp xây dựng được thẩm định với các nội dung: độ thích hợp của hệ thống sắc ký, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ lặp lại trung gian, độ đúng

3.2.2.1 Đánh giá độ thích hợp hệ thống

Tiêm 6 lần dung dịch đối chiếu hỗn hợp có nồng độ từng chất chuẩn khoảng 3 µg/l vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ, kết quả thu được như ở Bảng 3.1

- Dung dịch mẫu tự tạo hoặc mẫu thử, dung dịch chuẩn được xử lý theo mục 3.1.2.1 và 3.1.2.2

Hình 3.3 Sắc ký đồ độ đặc hiệu với TCS, TCC trên nền kem đánh răng

Hình 3.4 Sắc ký đồ độ đặc hiệu với TCS, TCC trên nền nước rửa tay

Kết quả thu được cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu placebo không xuất hiện pic ở thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu bất kỳ chất nào trong số 2 chất nghiên cứu TCS, TCC Trên sắc ký đồ của dung dịch tự tạo cho 2 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 2 pic chính thu được từ sắc ký đồ của dung dịch hỗn hợp chuẩn

Thứ tự rửa giải và thời gian lưu của các chất trong các mẫu khác nhau thể hiện

3.2.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của triclosan

(µg/ml)

% so với nồng độ định lượng

Diện tích pic (mAu.s)