Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và di truyền của heo rừng tây nguyên

Một số quần thể heo hoang dã, chẳng hạn như ở Úc và các vùng của Bắc Mỹ, có nguồn gốc hoàn toàn từ heo nhà nhưng các loài động vật hiện tại ở Anh với hình dáng giống heo rừng, có thể là

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ DI

TRUYỀN CỦA HEO RỪNG TÂY NGUYÊN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Tp HCM, năm 2017

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ

DI TRUYỀN CỦA HEO RỪNG TÂY NGUYÊN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số: 62.42.01.20

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn

PGS.TS Bùi Văn Lai

Tp HCM, năm 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Các số liệu trong luận án này là kết quả nghiên cứu của tôi và nhóm đồng tác giả nghiên cứu từ năm 2012 cho tới nay Các đồng tác giả đã có cam kết đồng ý cho tôi sử dụng kết quả nghiên cứu chung trong luận án này

Các số liệu trong luận án này chưa được công bố bởi tác giả nào khác

Đà Lạt, ngày tháng năm 2017

Người cam đoan

Nguyễn Thị Phương Mai

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn:

PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn và Cố PGS.TS Bùi Văn Lai, đã hướng dẫn khoa học, chỉ bảo kinh nghiệm quý báu, tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

và nghiên cứu để hoàn thành luận án

Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên và Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện đề tài này

Các anh, chị, em đồng nghiệp tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã luôn đồng hành và tạo mọi điều kiện thuận lợi

TS Lê Thành Long và các anh chị em phòng Công nghệ sinh học động vật, Viện Sinh học nhiệt đới đã cùng thực hiện các nghiên cứu và công bố

Bố, Mẹ, Chồng, con và toàn thể thành viên trong gia đình luôn là nguồn động viên, an ủi, giúp đỡ và dành những tình cảm thiêng liêng nhất

Đề tài thuộc Chương trình Tây Nguyên 3 mã số TN3/C06 và các đề tài cấp

cơ sở Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên đã hỗ trợ kinh phí thực hiện các nghiên cứu

Đà Lạt, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1

3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2

4 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về heo rừng 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Sự phân bố của heo rừng 4

1.1.3 Đặc điểm chung củ a heo rừng 6

1.1.4 Phương thức tìm kiếm thức ăn 7

1.1.5 Phạm vi sống và mật độ quần thể củ a heo rừng 8

1.1.6 Đặc điểm của heo rừng Việt Nam 11

1.2 Tiến hóa và phát sinh loài 12

1.2.1 Chọn lọc nhân tạo trong tiến hóa 12

1.2.2 Phát sinh loài và tiến hóa 13

1.2.3 Các khái niệm về phát sinh loài 15

1.3 Một số marker phân tử 18

1.3.1 ADN ty thể (mtADN) 18

1.3.2 Gen cytochrome b 19

1.3.3 Vùng kiểm soát (control region) 20

1.3.4 Gen 16S rRNA 21

1.3.5 Intron vùng nhân 22

1.3.6 Protein kinase C 22

1.3.7 Các nghiên cứu về quan hệ phát sinh loài phân tử của heo rừng 23

1.4 Bảo tồn heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên 24

1.4.1 Bảo tồn giao tử heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên 25

1.4.2 Bảo tồn tế bào sinh dưỡng 29

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu 32

2.2 Phương pháp 32

2.2.1 Điều tra các giống heo rừng đang được nuôi tại khu vực Tây Nguyên 32

2.2.2 Phân tích ADN, đánh giá hình thái 33

2.2.3 Thu thập, nuôi thuần dưỡng heo rừng thuần Tây Nguyên thu nhận được 38

2.2.4 Bảo tồn nguồn gen heo rừng thuần Tây Nguyên 39

2.2.5 Phương pháp thống kê 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47

3.1 Điều tra các giống heo rừng đang được nuôi tại khu vực Tây Nguyên 47

3.2 Phân tích ADN, đánh giá hình thái 47

3.2.1 Kết quả phân tích trình tự D-loop 52

3.2.2 Kết quả phân tích trình tự cytochrome b 57

3.2.3 Kết quả phân tích trình tự 16S 62

3.2.4 Đánh giá hình thái heo rừng thuần Tây nguyên 48

3.3 Thuần dưỡng heo rừng thuần Tây Nguyên Việt Nam thu nhận được 65

3.3.1 Mô tả đặc điểm sinh học heo rừng thuần Tây Nguyên 65

3.3.2 Thuần hóa heo rừ ng thuần Tây Nguyên 66

3.4 Bảo tồn nguồn gen heo rừng thuần Tây Nguyên- Việt Nam 70

3.4.1 Tinh trùng heo rừng 70

3.4.2 Đông lạnh tế bào 76

KẾT LUẬN 79

ĐỀ NGHỊ 80

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT

ADN : Acid Deoxyribo Nucleic

bp : base pair

CPA : Cryoprotectant agents

ĐDSH : Đa dạng Sinh học

DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMSO : Dimethyl Sulfoxide

EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

FBS : Fetal Bovine Serum

GEYC : Glycerol Egg Yolk Citrate

HST : Hệ sinh thái

IIF : Intracellular Ice Formation

NIH : National Institutes of Healthn

PBS : Phosphate-Buffered Saline

PCR : Polymerase Chain Reaction

ROS : Reactive Oxygen Species

SNP : Single Nucleotide Polymorphisms

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Heo rừng trong điều kiện tự nhiên 4

Hình 1.2 Phân loại cây phát sinh loài theo Page và Holmes 16

Hình 1.3 Cấu trúc ADN ty thể 18

Hình 1.4 Cấu trúc của protein cytochrome b 20

Hình 1.5 Cấu trúc vùng kiểm soát của ty thể ở động vật có vú 21

Hình 2.1 Các thông số đo bên ngoài của cơ thể heo rừng 33

Hình 2.2 Các chỉ số hộp sọ được phân tích 34

Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích ADN ty thể 35

Hình 2.4 Sơ đồ tóm tắt quá trình thuần hóa 38

Hình 2.5 Heo rừng thuần nguồn gốc Tây Nguyên 39

Hình 2.6 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm bảo tồn nguồn gen heo rừng 40

Hình 2.7 Buồng đếm Neubauer 41

Hình 2.8 Các dạng kì hình của tinh trùng 43

Hình 2.9 Thu nhâ ̣n tinh từ mào tinh 44

Hình 3.1 Các vị trí biến đổi trong vùng D-loop ty thể của các cá thể heo rừng 53

Hình 3.2 Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự D-loop 55

Hình 3.3 Các vị trí biến đổi trong vùng cytochrome b 58

Hình 3.4 Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự cytochrom b 61

Hình 3.5 Các vị trí biến đổi trong trình tự 16S 63

Hình 3.6 Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự 16S 64

Hình 3.7 Heo rừng Sus scrofa khu vực Tây Nguyên 66

Hình 3.8 Heo rừng được thuần hóa 67

Hình 3.9 Tinh trùng nhuộm Eosin-Nigrosin 72

Hình 3.10 Sự kết dính tinh trùng 73

Hình 3.11 Kỳ hình tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên 74

Hình 3.12 Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy sơ cấp 77

Hình 3.13 Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy chuyền trong phòng thí nghiệm 77

Hình 3.14 Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên sau giải đông 78

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong PCR và giải trình tự 36

Bảng 2.2.Thành phần phản ứng 36

Bảng 2.3 Chu kì phản ứng 37

Bảng 2.4 Nhiệt độ phản ứng của các đoạn mồi 37

Bảng 3.1 Nguồn gốc giống heo rừng đang nuôi trên đi ̣a bàn Tây Nguyên 47

Bảng 3.2 Thông số đo cơ thể của heo 49

Bảng 3.3 Thông số đo hộp sọ của heo 51

Bảng 3.4 Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei giữa các quần thể heo rừng dựa trên trình tự D-loop 54

Bảng 3.5 Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei giữa các quần thể heo rừng dựa trên trình tự cytochrome b 59

Bảng 3.6 Đi ̣a điểm và số lượng heo rừng thu nhâ ̣n trong tự nhiên 67

Bảng 3.7 Tỷ lê ̣ thuần hóa thành công 68

Bảng 3.8 Một số đặc điểm sinh sản của heo rừng Tây Nguyên trong giai đoạn sinh con 69

Bảng 3.9 Một số đặc điểm sinh sản của heo rừng Tây Nguyên sau giai đoạn sinh con 70

Bảng 3.10 Các thông số của tinh dịch 71

Bảng 3.11 Tỉ lệ tinh trùng sống sau giải đông ở các nghiệm thức khác nhau 75

Bảng 3.12 Tỷ lê ̣ sống của tinh trùng thu từ mào tinh đông la ̣nh 76

PHẦN MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một trong những nơi được đánh giá có mức độ đa dạng sinh học

cao nhất trên thế giới Hai loài heo rừng được xác định có tồn tại ở Việt Nam là Sus bucculentus và Sus scrofa Tuy nhiên, loài Sus bucculentus hiện nay khó tìm thấy còn sống trong tự nhiên; loài Sus scrofa được cho là phân bố khá rộng, đặc biệt có

nhiều ở vùng rừng núi khu vực Tây Nguyên Các nghiên cứu về đặc điểm hình thái

và di truyền của quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên cho đến nay còn rất hạn chế

Ở khu vực Tây Nguyên, các giống heo rừng mà người dân địa phương đang nuôi hầu hết đều là heo lai được nhập từ các nước Thái Lan, Malaysia… Các dòng heo lai này có đặc điểm di truyền không rõ ràng, không có lý lịch và nguồn gốc cụ thể Việc phát triển chăn nuôi tự phát các giống heo rừng lai này sẽ làm tăng nguy

cơ đe dọa tới sự bảo tồn nguồn gen các quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên Thêm vào đó, tình hình săn bắt bừa bãi, nạn chặt phá rừng… đang là nguyên nhân làm cho số lượng heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên bị giảm sút nhanh và sẽ có nguy cơ đe dọa tới sự tồn vong của chúng Do đó, các nghiên cứu về việc thu nhận, thuần hóa và nhân rộng các quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên có vai trò rất quan trọng trong việc bảo tồn loài heo rừng của Việt Nam nói chung và khu vực Tây Nguyên nói riêng

Sự phân biệt những nhóm heo rừng khác nhau ngoài việc dựa vào đặc điểm hình thái thì hiện nay người ta còn dựa vào kiểu gen, đặc biệt là các trình tự đặc trưng trong các vùng bảo tồn của ADN nhân hoặc ADN ty thể Các loài heo rừng khác nhau có các vị trí đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorphism) tạo nên các haplotype đặc trưng cho loài heo đó Trên cơ sở đó xây dựng cây phát sinh loài để xác định được nguồn gốc và sự khác biệt giữa heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên với các giống heo rừng khác

Xuất phát từ những tình hình trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và di truyền của heo rừng Tây Nguyên”

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Xây dựng được cây phát sinh loài và đánh giá một số đặc điểm sinh học heo rừng Tây Nguyên

- Góp phần bảo tồn nguồn gen heo rừng Tây Nguyên trong tự nhiên và trong phòng thí nghiệm

3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài có ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong việc xác định nguồn gốc di truyền của heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên

Các kết quả đạt được giúp định hướng bảo tồn nguồn gen quý hiếm của heo rừng và từ đó có thể được ứng dụng trong sản xuất giống heo rừng thuần và heo rừng lai từ nguồn gen heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên

4 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Xác định được vị trí phân loại của heo rừng có nguồn gốc khu vực Tây Nguyên trong mối quan hệ phát sinh loài của heo rừng trên thế giới

- Xác định được 3 vị trí SNP mới của vùng D-loop và 3 vị trí SNP mới của gen cytochrome b của heo rừng Tây Nguyên, giúp phân biệt giữa heo rừng Tây Nguyên

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HEO RỪNG

Heo rừng còn gọi là lợn lòi, tên khoa học là Sus scrofa (Linnaeus, 1758) thuộc họ heo (Suidae), bộ ngón chẵn (Artiodaclyta) (Hình 1.1) Heo rừng có rất nhiều loài phụ Các loài phụ khác nhau có thể được phân biệt dựa trên chiều dài, hình dáng của xương hốc mắt ví dụ như S.scrofa cristatus và S.scrofa vittatis có

xương hốc mắt ngắn hơn các loài Châu Âu [58] Dưới đây là một số phụ loài heo rừng đã được nhận biết [40]:

Nòi Viễn Tây (nhóm scrofa)

 Heo rừng phổ biến nhất Sus scrofa scrofa: phân bố chính từ Pháp tới vùng

phía Tây Châu Âu (Nga)

 Heo rừng Iberia Sus scrofa baeticus: một phụ loài nhỏ trên bán đảo Iberia

 Heo rừng Castilia Sus scrofa castilia: lớn hơn S s baeticus, phân bố chính ở

phía Bắc Tây Ban Nha

 Heo rừng Sandinia Sus scrofa meridionalis: một loài heo rừng nhỏ từ

Corsica, Sadinia và Andalisua

 Heo rừng Italia Sus scrofa majori: loài heo rừng này nhỏ hơn S s scrofa

 Sus scrofa Attila: loài heo rừng rất lớn sống ở phía Tây Châu Âu từ

Kazakhstan, tới bắc Caucausus và Iran

 Heo rừng Barbary Sus scrofa algria: sống ở vùng Maghreb phía Tây Bắc

Châu Phi

 Sus scrofa lybica: một loài heo rừng nhỏ sinh sống ở khu vực Caucasus,

đồng bằng sông Nile, Thổ Nhĩ Kì và khu vực Balkan

 Sus scrofa sennaarensis: phân bố ở Ai Cập và phía Bắc Sudan

 Sus scrofa nigripes: loài heo rừng chân đen sinh sống ở dãy núi Tianshan,

khu vực Trung Á

Nòi heo Ấn Độ

 Heo rừng Ấn Độ Sus scrofa cristatus: sinh sống ở vùng phía Nam núi

Hymalaya tới trung Ấn Độ và phía Tây Indonesia

 Sus scrofa affinis: phân bố vùng phía Nam Ấn độ và Srilanka

 Sus scrofa davidi: phân bố phía Đông Iran tới phía Bắc Tajikistan

Hình 1.1 Heo rừng trong điều kiện tự nhiên

(http://www.vertebratejournal.org)

Nòi heo Đông Á

 Heo rừng Manchuria Sus scrofa ussuricus: loài heo rừng lớn nhất, phân bố từ

Manchuria tới Hàn Quốc

 Heo rừng Nhật Bản Sus scrofa leucomystax: là loài heo nhỏ phân bố ở Nhật

Bản (trừ đảo Hokkaido)

 Heo rừng Ruykyu Sus scrofa riukiuanus: phân bố ở quần đảo Ryukyu

 Heo rừng Formosa Sus scrofa taivanus, phân bố ở Đài Loan

 Sus scrofa moupinensis: phân bố ở Trung Quốc và Việt Nam

 Heo rừng Siberia Sus scrofa sibiricus: phân bố ở Mông Cổ và Transbaikalia

Nòi Sundaic

 Sus scrofa vittatus: loài heo rừng nhỏ, mặt ngắn, phân bố từ bán đảo

Malaysia và Indonesia từ đảo Sumatra và Java tới Komodo

1.1.2 SỰ PHÂN BỐ CỦA HEO RỪNG

Suidae là một họ bao gồm tất cả các loài heo Ngoài 16 loài đang có hiện nay, một số lượng lớn các loài hóa thạch cũng được công nhận thuộc họ heo này

Những loài hiện nay được phân loại thành từ 4 đến 8 chi Mẫu hóa thạch sớm nhất

có từ kỷ nguyên Oligocene ở Châu Á và con cháu của chúng di cư tới Châu Âu trong suốt kỷ nguyên Miocene Heo rừng hiện nay có thể tìm thấy ở nhiều môi trường và vùng địa lý khác nhau Môi trường sống chủ yếu của loài này là ở những khu rừng ẩm ướt, vùng đất đầy bụi gai Chúng được tìm thấy nhiều nhất vào mùa đông do nhiệt độ thấp cản trở việc di chuyển và kiếm mồi [4]

Heo rừng Sus scrofa là loài phân bố rộng rãi nhất của của họ Suidae Phạm vi

của chúng kéo dài từ Tây Âu và lưu vực Địa Trung Hải đến Taiga (Nga), qua Ấn

Độ và Đông Nam Á đến các đảo Sri Lanka và Nhật Bản Ở Bắc Âu, gần đây chúng

đã xâm lấn sang Thụy Điển, Phần Lan, Estonia và Karelia (Liên Xô), sự hiện diện của chúng được ghi lại ở cả 65 độ Bắc [23], ngoại trừ Nam Cực [87], heo rừng Châu Âu đã được đưa vào Bắc Mỹ và heo hoang dã thuộc cùng một loài đã sống ở

Úc, New Zealand, và nhiều đảo ở Thái Bình Dương [118] Heo rừng Sus scrofa đã

từng có nguồn gốc từ nước Anh nhưng có thể bị con người săn bắn đến tuyệt chủng vào khoảng cuối thế kỷ XIII [90] Tuy nhiên, sự phát triển của việc chăn nuôi heo rừng bắt đầu vào những năm 1980 [9], cùng với việc một số con thỉnh thoảng thoát

ra từ các trang trại và cơ sở giết mổ dẫn đến việc hình thành một số lượng nhỏ các quần thể heo rừng sinh sản Ngoài khu phân bố tự nhiên của chúng, heo rừng hay heo hoang dã đã thích nghi rộng rãi, bao gồm các vùng của Hoa Kỳ, Châu Phi và hầu hết các nhóm đảo đại dương [65]

Tại châu Âu, sự gia tăng của heo rừng trong vài thập kỷ qua là do một số yếu

tố như sự thay đổi kinh tế xã hội, sự đa dạng trong các loại cây trồng chủ đạo, ít động vật ăn thịt, săn bắn bị hạn chế, thêm thực phẩm và biến đổi khí hậu [34]… đã cải thiện điều kiện môi trường sống cho các loài Sự phân loại heo rừng ở châu Âu

là phức tạp do chúng di chuyển và giao phối giữa các động vật có xuất xứ địa lý khác nhau hoặc với heo nhà Tuy nhiên, gần đây Genov đã kết luận rằng tất cả các

con heo châu Âu thuộc về một phân loài là Sus scrofa [33]

Ở Việt Nam, heo rừng có mặt từ trung du đến miền núi Phạm vi hoạt động của heo rừng rất rộng Chúng sống được trong nhiều sinh cảnh khác nhau như rừng thứ sinh, rừng thưa (trừ núi đá) nhưng thích hợp nhất là những thung lũng ven các suối nước, đầm lầy có độ ẩm cao, nhiều thức ăn như rừng tre nứa, gần nương rẫy Heo rừng thường sống theo bầy đàn, có những bầy đàn lớn từ 20 – 100 con Tuy

nhiên, chúng ta thường chỉ gặp những đàn dưới 20 con Những con đực bình thường vẫn kiếm ăn một mình, đến mùa động dục chúng mới nhập đàn, tìm bạn tình Heo rừng trong tự nhiên thường kiếm ăn vào ban đêm, khoảng từ chập tối đến gần sáng

và nghỉ ngơi trong bụi rậm vào ban ngày Mùa đông, chúng làm tổ để nằm Thỉnh thoảng chúng cũng ra khỏi rừng tìm đến những nương rẫy hoặc những nơi có sẵn măng tre vào sáng sớm hoặc chiều tối

1.1.3 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA HEO RỪNG

Heo thuộc Bộ ngón chẵn và nhìn chung chúng được đánh giá là các dạng sống giống nhất với các dạng tổ tiên thuộc bộ này Heo rừng vừa là tổ tiên vừa có thể giao phối tự do với heo nhà Một số quần thể heo hoang dã, chẳng hạn như ở Úc

và các vùng của Bắc Mỹ, có nguồn gốc hoàn toàn từ heo nhà nhưng các loài động vật hiện tại ở Anh với hình dáng giống heo rừng, có thể là heo rừng thuần hoặc lai heo rừng [65] Tuy nhiên, kể từ khi một số nông trại cho lai với heo nhà thì tình trạng di truyền thực sự của các quần thể hoang dã là không chắc chắn, rõ ràng Heo rừng là thủy tổ của heo nhà nên hình dáng heo rừng cũng tương đồng như heo nhà, phần mông của heo rừng nhỏ hơn heo nhà nhưng phần đầu và ngực của heo rừng rất phát triển Bộ lông thô, dài, cứng, màu đen xám bao phủ toàn thân heo rừng Lông gáy dày và rậm, khi bị kích động hàng lông này dựng lên [4] Heo rừng trưởng thành có chiều dài khoảng 90 - 180 cm, chiều dài đuôi khoảng 30 cm, chiều cao vai khoảng 55 - 110 cm, trọng lượng cơ thể từ 50 - 350 kg Con đực thường lớn hơn con cái, heo rừng thường có 2 đôi răng nanh, 6 cặp vú Sọ heo rừng khá dài, khẩu cái dài 20 – 22 cm, phù hợp cho việc đào bới, ủi đất tìm kiếm thức ăn [4]

Dưới tác động của phân vùng địa lý, da heo rừng có màu khác nhau, chiều dài đuôi và hình dáng mõm cũng thay đổi Heo rừng có thân mình thon dài, lưng thẳng, mõm dài và nhọn, tai nhỏ, mắt màu nâu lợt và ánh mắt hoang dại, lông màu đen hoặc nâu sậm, bốn chân nhỏ và khỏe Heo rừng có bờm lông ở trên gáy mọc dài theo sống lưng Chùm lông bờm dài và dày, có ba chấu mọc thành hình tam giác đặc trưng [4] Heo rừng trưởng thành là loài động vật cỡ lớn và có thể nặng tới 300

kg nhưng phần lớn trọng lượng lúc trưởng thành là khoảng 100 kg đối với con đực

và 75 kg đối với con cái [84] Tại Châu Âu, kích thước cơ thể của heo rừng trưởng thành thay đổi 35 - 230 kg, các cá thể nhỏ nhất được tìm thấy ở các nước Địa Trung Hải [107] Bộ lông của heo rừng có màu tối nhưng có thể thay đổi từ màu vàng xám

nhạt đến toàn thân đỏ - nâu hoặc đen [67] Heo con khi mới sinh dài khoảng 25 cm

và cân nặng nhỏ hơn 1 kg Chúng có bộ lông màu đỏ nâu với các sọc dọc Bộ lông

sẽ được thay đồng đều thành màu đỏ nâu ở tháng thứ 4 đến tháng thứ 5, sau đó có

bộ lông của con trưởng thành ở khoảng tháng thứ 10 đến tháng 12 [70] Mặt, má và họng có nhúm lông hoa râm hơi trắng, lưng tròn và chân tương đối dài Heo rừng đực trưởng thành đều có răng nanh Răng nanh thường dài khoảng 6 cm Răng nanh trên mọc hướng lên phía trên và cong ra ngoài Răng nanh dưới thì giống dao cạo,

tự mài sắc bằng cách tỳ sát vào răng nanh trên Heo rừng cái cũng có răng nanh nhưng nhỏ hơn heo rừng đực và không nhô ra ngoài Đuôi ngắn với 1 chùm lông đơn giản phía cuối

Răng của heo rừng phản ánh chế độ thức ăn Họ heo vẫn còn răng cửa trên trong khi ở các họ khác của Bộ ngón chẵn không còn Răng nanh phát triển to, lồi lên, dùng để ủi đất ẩm ướt hoặc bụi cây thấp và để chiến đấu Số lượng răng thay đổi giữa các loài Họ heo có thính giác rất phát triển và chúng giao tiếp với nhau bằng một loạt các tiếng kêu đặc trưng Heo rừng bơi rất giỏi, có tài liệu ghi lại rằng chúng có thể bơi giữa các đảo cách nhau đến 7 km [70] Heo rừng là loài ăn tạp Thức ăn phổ biến là các loại củ quả giàu tinh bột và các loại cây nhiều chất xơ như chuối, măng Heo rừng sinh sản quanh năm Thời gian mang thai là 4 tháng, mỗi năm đẻ 1 - 2 lứa, mỗi lứa 5 - 6 con Tuy nhiên, mùa sinh sản thích hợp nhất là mùa xuân và mùa thu

1.1.4 PHƯƠNG THỨC TÌM KIẾM THỨC ĂN

Heo rừng là loài ăn tạp, nguyên liệu thực vật chiếm từ 80 đến 90% trong chế

độ ăn uống [33] Heo rừng có thể tiêu thụ từ các loại động vật như chim, động vật

có vú, lưỡng cư, bò sát, trứng, xác chết, động vật chân đốt, động vật thân mềm đến thức ăn thực vật gồm các nhóm thực phẩm như trái cây và các loại hạt (hạt, hoa quả, trái cây rừng nhiệt đới); lá và thân cây: cỏ, mía, cây chuối, thân rễ; củ và quả, bao gồm cả cây củ như khoai tây và những loại thức ăn khác là phân, nấm…[1] Ở phía Đông và Tây Ba Lan, nơi heo rừng sống ở rừng rụng lá và rìa đồng ruộng, Genov đã tìm thấy 131 loài thực vật được heo rừng tiêu thụ trong hơn một năm; những loài được trồng chiếm 71% trong dạ dày (theo khối lượng), các loài cỏ và cây rừng chiếm 21% và nguyên liệu động vật là 9% Một phần đáng chú ý của chế độ ăn của heo rừng là các loại thức ăn dưới lòng đất như rễ, củ và động vật không xương sống

[33] Thức ăn động vật chỉ đóng vai trò thứ yếu trong chế độ ăn của heo rừng, ước tính khoảng 2-9% [33], bao gồm ấu trùng côn trùng, giun đất, ốc sên và xác thối rữa [20] Heo rừng có nhu cầu năng lượng tương đối cao, đặc biệt là trong thời gian cho con bú và tăng trưởng của heo con [17] Heo nái cần khoảng 15% protein thô trong chế độ ăn uống để cho con non bú Lượng protein này có thể được đáp ứng từ nguyên liệu thực vật nhưng thường được đáp ứng nhiều hơn từ động vật

Cây trồng nông nghiệp là loa ̣i thức ăn được heo rừng sử dụng nhiều Ở châu

Âu heo rừng tiêu thụ chủ yếu là khoai tây, nho và ngũ cốc [36] Heo rừng có dạ dày đơn, do đó ít có khả năng phân hủy và thu nhâ ̣n carbohydrate từ cellulose so với các động vật móng guốc nhai lại khác Khi cây trồng và thực phẩm bổ sung không có sẵn, các thực phẩm giàu năng lượng như quả sồi rất được ưa thích trong chế độ ăn uống tự nhiên của heo rừng [71] Heo rừng cũng sống trong rừng lá kim và lau sậy

và do đó chế độ ăn uống của chúng dựa trên một hỗn hợp thức ăn dưới lòng đất, vỏ cây, động vật không xương và xác thối [23] Thói quen của heo rừng là bắt đầu đi tìm thức ăn từ lúc trời vừa chạng vạng tối đến lúc trời hừng sáng mới trở về nơi ở của chúng Như vậy, chúng đi tìm thức ăn suốt đêm và ban đêm mới là bữa ăn chính Khi đi tìm thức ăn, heo rừng không những chỉ ăn trên mặt đất mà thường dùng mõm đào bới dưới mặt đất sâu để tìm được các thứ củ quả, rễ non để ăn Chúng thường men theo bờ sông, suối để đào bới dưới đất cát để tìm cá, tôm, sò, ốc… [4] Thức ăn bổ sung có chủ đích cho heo rừng thường là ngô, viê ̣c này rất quan trọng đối với một số vùng của châu Âu vào mùa đông, chiếm khoảng 50% chế

độ ăn uống [29] Heo rừng có khả năng thích ứng cao với sự thay đổi của nguồn thức ăn [34]

1.1.5 PHẠM VI SỐNG VÀ MẬT ĐỘ QUẦN THỂ CỦA HEO RỪNG

Heo rừng được tìm thấy ở nhiều môi trường sống khác nhau, từ các khu vực khô cằn, rừng núi cao và đồng cỏ, đến rừng mưa nhiệt đới dày đặc Môi trường sống của heo rừng được xác định bởi lượng lương thực sẵn có, chỗ trú ngu ̣ và điều kiện thời tiết [9] Heo rừng trong tự nhiên chọn môi trường sống là nơi có thể cung cấp thực phẩm năng lượng cao, trốn các động vật ăn thịt và chúng tránh những khu vực

có điều kiện thời tiết cực đoan, ví dụ như nơi tuyết che phủ cản trở đến sự di chuyển [106] Trong mùa hè nóng, heo rừng thích những khu vực râm mát bởi vì chúng thiếu tuyến mồ hôi, chúng cần phải điều chỉnh nhiệt bằng cách đầm mình và nghỉ

ngơi ở những nơi mát Nước rất cần thiết để heo rừng sống sót Nơi nghỉ ngơi thường là những khu vực có thảm thực vật dày đặc, chúng nằm trên một mặt đất lún [116] Singer và cs (1981), Boitani và cs (1994) cho rằng heo rừng đực sắp trưởng thành lựa chọn môi trường sống chủ yếu cho tiềm năng thực phẩm của chúng và heo rừng cái cùng với heo con lựa chọn môi trường sống có sự kết hợp giữa thực phẩm phong phú, an toàn và điều này làm nên sự phân bố giới tính của heo rừng trong tự nhiên [9], [106] Heo rừng sẽ di chuyển để đáp ứng với thực phẩm sẵn có, đặc biệt là theo mùa cần yêu cầu cao về protein và năng lượng liên quan đến sinh sản và tăng trưởng [110]

Heo rừng trong tự nhiên chủ yếu hoạt động về đêm hoặc trong thời gian nhiệt

độ thấp của ngày (cuối buổi chiều, buổi sáng sớm, thời tiết lạnh, mưa hoặc điều kiện

u ám) [106] Kích thước phạm vi chỗ ở của chúng thay đổi liên quan đến một số yếu

tố như sự phong phú và phân tán của các nguồn thực phẩm, độ tuổi, giới tính và tình trạng sinh lý của con vật, môi trường sống chất lượng, mật độ quần thể Kích thước phạm vi hoa ̣t đô ̣ng của con đực thường lớn hơn con cái [68] Ước tính kích thước phạm vi hoa ̣t đô ̣ng thông thường của heo rừng trong tự nhiên thay đổi từ 4,0 - 21,8

km2 [107] Phạm vi hoa ̣t đô ̣ng của heo rừng theo các nghiên cứu có khác nhau nhưng tập trung chủ yếu về kích thước, phu ̣ thuô ̣c vào giới tính, mùa vu ̣, thời tiết Kích thước phạm vi hoa ̣t đô ̣ng cũng có thể tăng khi lượng thức ăn giảm [106] Các yếu tố như mật độ quần thể và stress sinh lý cũng có thể ảnh hưởng đến kích thước phạm vi chỗ ở Mô ̣t số nghiên cứu của Spitz và Janeau (1990) cho rằng ở Châu Âu phạm vi hoa ̣t đô ̣ng trung bình của heo rừng là không lớn, khoảng 4 km2 [111] Đặc biệt, heo rừng cái ít di chuyển hơn và có xu hướng tập trung hoạt động xung quanh

tổ của nó trước khi đẻ [36]

Heo đực thích ứng với mật độ quần thể cao và tình trạng thiếu lương thực bằng cách giảm kích thước phạm vi chỗ ở và gia tăng hoạt động tìm kiếm thức ăn Andrzejewski và Jezierski (1978) cũng đã chỉ ra rằng cá thể heo rừng dành nhiều thời gian tìm kiếm thức ăn khi mật độ quần thể tăng lên [6] Nghiên cứu theo dõi bằng sóng radio đã cho thấy rằng suốt một đêm, heo có thể đi lại từ 2-15 km, mặc

dù khoảng cách trực tiếp giữa các nơi nghỉ ngơi thay đổi từ 0 - 7 km [111] Trong suốt mùa di cư giữa các độ cao trên 1000 m và dưới 1000 m so với mặt nước biển, heo rừng có thể di chuyển trên một khoảng cách dài, từ 12 km đến 250 km [106]

Cấu trúc bầy đàn điển hình của heo rừng liên quan đến những con cái sống trong nhóm, cùng với con gần trưởng thành và con nhỏ (cá thể dưới 18 tháng tuổi) Trong khi những con đực trưởng thành (thường là lớn hơn 18 tháng tuổi) sống đơn độc trong phần lớn cả năm [31] Kích thước nhóm thay đổi theo độ tuổi, giới tính, thức ăn, nguồn nước Kích thước nhóm có thể dao động từ nhóm có một cá thể cho đến các nhóm có từ 100 cá thể hoặc hơn Mô ̣t đă ̣c tính cơ bản của heo rừng là sự tách nhóm (bầy) của con cái trước khi sinh vào mùa xuân, sau khi sinh thì cả heo

me ̣ và heo con tái nhập la ̣i vào nhóm Cũng có thể có sự xâm nhập của những con cái chưa có con trong mùa thu, sự xuất hiện của con đực trưởng thành trong suốt mùa giao phối cùng với sự ra đi đồng thời của con đực gần trưởng thành [36] Hoạt động sinh sản và sự sản xuất testosterone ở con đực được khởi phát theo mùa, trong đó có đô ̣ ngắn, dài của thời gian trong ngày Con đực phải chiến đấu để đến gần con cái và giành quyền được giao phối, sau đó chúng di chuyển đến một nhóm khác Thường những con heo đực lớn nhất và khỏe nhất sẽ chiến thắng và giành quyền giao phối với heo cái Trên thực tế, con đực không thể chiếm lĩnh được con cái trong tự nhiên đến khi nó đạt được kích thước cơ thể đầy đủ, thời gian này mất khoảng 4 năm Nhìn chung, con đực thường không gây chiến nhưng chỉ trở nên xung đột trong suốt mùa giao phối

Trong thiên nhiên hoang dã, heo rừng cái đẻ nhiều lần trong năm và mùa giao phối thay đổi tùy theo vùng địa lý và môi trường sinh sống Số lượng con mỗi lần sinh là 1 - 12 con, trung bình 4 - 8 con/lần Thời gian mang thai trung bình là 115 ngày, thời gian cho con bú là 3 - 4 tháng, thời gian heo con trưởng thành trung bình

là 7 tháng và dần trở nên độc lập [1].Tuổi động dục của heo cái sớm hay muộn là tùy vào từng giống heo và tùy vào sự phát triển cơ thể của mỗi cá thể, chu kỳ động dục ở heo thường kéo dài 21 ngày [5] Tuổi được coi là trưởng thành về mặt sinh dục có thể giao phối ở con cái và con đực là 8 - 10 tháng, nhưng thường đến 12 tháng tuổi con cái mới giao phối và những con đực thường không thích tiếp xúc đến những con heo cái dưới 1 tuổi [1] Trong mùa sinh sản, những con đực mạnh nhất

có thể có từ 8 - 10 con heo cái [1] Việc giao phối xảy ra quanh năm nhưng tập trung vào cuối mùa khô và đầu mùa mưa (hoă ̣c là mùa thu, đầu mùa đông)

Khi đến ngày đẻ, heo rừng mẹ thường tách ra khỏi đàn để tìm một khu lùm bụi kín đáo cách xa nơi cả đàn đang sống để đẻ con [4] Heo rừng cái sinh heo con

trong một cái ổ bằng cỏ, heo con sẽ ở lại ổ vài ngày, chờ bầy con đủ cứng cáp, đi đứng vững vàng, chúng mới kéo ra nhập bầy Heo con có một tập tính là chỉ bú duy nhất một đầu vú heo mẹ Các vú ở phía ngực trước có lượng sữa nhiều hơn các vú sau [1] Trái với vẻ khỏe mạnh ban đầu, chỉ có khoảng một nửa heo rừng con sống đến trưởng thành, một vài con chết vì bệnh hay bị những loài động vật khác ăn thịt Trong thiên nhiên hoang dã, heo rừng có thể sống 10 năm, đôi khi chúng có thể sống tới 27 năm [1].Tuổi thành thu ̣c sinh du ̣c của heo rừng dao động trong khoảng 8

- 24 tháng tuổi và con cái thường không sinh sản cho đến năm tuổi thứ hai Sự sinh sản cùng một lúc thường được quan sát thấy trong một nhóm các con cái Các hoạt động sinh sản của heo rừng là theo mùa với việc giao phối trong mùa thu - mùa đông và sinh sản vào mùa xuân So với các động vật móng guốc khác, khoảng thời gian giao phối ở heo rừng được xác định rõ, thời gian sinh sản ở heo rừng cái liên quan chặt chẽ đến thực phẩm sẵn có trong mùa thu - đông [72], [84]

1.1.6 ĐẶC ĐIỂM CỦA HEO RỪNG VIỆT NAM

Hiện nay chưa có nhiều tài liệu mô tả về đặc điểm sinh học của heo rừng Việt Nam nói chung cũng như heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên Heo rừng Việt Nam có tầm vóc trung bình, thường con đến tuổi trưởng thành nặng từ 35 – 50kg, mõm dài và nhọn, đầu nhỏ, tai nhỏ, không có má Lông heo rừng mọc 3 lông cùng một chỗ, trong khi heo nhà thì lông mọc rời rạc Con non chậm lớn, màu lông thường là hung đen, có sọc vàng chạy dọc theo thân Heo con mới đẻ nuôi rất khó

và hay bị chết do hay bị bệnh đi phân trắng Heo mẹ thường đẻ ít con (2 - 3 con/lứa) nên hiệu quả kinh tế không cao Trong sản xuất, người dân thường chỉ nuôi con lai giữa heo rừng (heo bố) và heo nhà (heo mẹ) [4], [5]

Heo rừng Việt Nam hoang dã thường được phát hiện ở những khu vực rừng có đầm lầy, thung lũng, chúng sống thành bầy đàn, số lượng có thể lên đến trên 100 con, những đàn heo rừng này là tập hợp nhiều thế hệ cả con già và những con chưa trưởng thành [1] Heo rừng hoạt động nhiều hơn vào ban đêm, lúc chạng vạng tối và bình minh Khi heo đực trưởng thành, nó sẽ rời khỏi bầy đàn và sống độc lập [4] Heo rừng có khứu giác rất nhạy, chúng có thể nhanh chóng xác định những loài động vật lạ hoặc những vật thể chưa rõ ràng chỉ bằng khứu giác Thính giác heo rừng cũng rất phát triển [4] Heo rừng có khả năng cảm nhận được sự thay đổi của

nhiệt độ Để đối phó với cái lạnh, chúng dầm mình xuống bùn hay nước để có được thân nhiệt thích hợp [4]

1.2 TIẾN HÓA VÀ PHÁT SINH LOÀI

1.2.1 CHỌN LỌC NHÂN TẠO TRONG TIẾN HÓA

Tiến hóa là sự thay đổi đặc tính di truyền của một quần thể sinh học qua những thế hệ nối tiếp nhau Cơ chế chính của tiến hóa là chọn lọc tự nhiên, nó làm thay đổi các tính trạng của một quần thể sinh vật qua thời gian Từ khi con người xuất hiện, chọn lọc nhân tạo đã hình thành và được con người sử dụng phổ biến trong quá trình thuần hóa các quần thể sinh vật Chọn lọc nhân tạo được thể hiện qua quá trình trồng hay thuần dưỡng một quần thể sinh vật để làm nổi bật những tính trạng mà con người mong muốn

Quá trình thuần hóa tập trung vào các cây trồng nông nghiệp và gia súc, gia cầm Chúng luôn liên quan đến mối quan hệ song song giữa con người và các quần thể thực vật hay động vật mục tiêu Quá trình thuần hóa có thể được xem là mối quan hệ phụ thuộc lẫn nhau giữa con người và đối tượng động vật, thực vật được thuần hóa Trong mối quan hệ này, đối tượng được thuần hóa có những đặc điểm thuận lợi về mặt tiến hóa có giá trị với con người [14], [74] Mối quan hệ đồng tiến hóa giữa con người và đối tượng thuần hóa mục tiêu được diễn ra dựa trên việc con người khám phá ra những tập tính mới, những tập tính này giúp các thế hệ đối tượng thuần hóa con cháu sẽ làm quen được với tập tính xã hội của con người

Dù các tiến trình đồng tiến hóa sẽ điều khiển quá trình thuần hóa của cả thực vật và động vật nhưng vẫn có sự khác biệt giữa thực vật và động vật trong quá trình thuần hóa Sự khác biệt này liên quan trực tiếp giữa đối tượng được thuần hóa với con người Ở động vật, quá trình thuần hóa phụ thuộc vào các đặc tính tập tính [89] Các đáp ứng về hình thái và sinh lý của động vật được thuần hóa thường là các đặc điểm thứ cấp do áp lực chọn lọc của quá trình thuần hóa [123] Việc nắm bắt các tập tính trong quá trình thuần hóa ở động vật rất quan trọng cho việc hiểu biết quá trình thuần hóa động vật

Các đặc điểm tập tính của động vật thuần hóa: Quá trình thích ứng với thuần hóa của động vật có thể chia thành 5 dạng tập tính chung như sau [43], [88]:

- Cấu trúc nhóm

- Tập tính giới tính

- Các tương tác giữa cá thể non với quần thể, gia đình

- Những đặc tính đáp ứng với yêu cầu của con người

- Sự linh động trong khả năng thích nghi của động vật

Não và tập tính: Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng kích thước não của của động vật thuần hóa giảm một cách có hệ thống khi so sánh với tổ tiên của chúng [62], [21] Động vật có não lớn có sự giảm kích thước não là nhiều nhất Trong khi

đó, những động vật có kích thước não nhỏ hơn lại có sự giảm kích thước não ít hơn

hoặc không giảm [61] Heo (Sus scrofa) có lẽ là loài động vật thuần hóa có mức độ

giảm kích thước não nhiều nhất trong quá trình thuần hóa (33,6%) Đối với các loài động vật móng guốc khác mức độ suy giảm kích thước não từ 20,14% đến 24%, trong khi các loài gậm nhấm có sự giảm kích thước não ít nhất [99], [21]

Mức độ giảm kích thước não không tương ứng với chiều dài thời gian thuần

hóa Ví dụ loài cừu (Ovis aries) có thời gian thuần hóa hơn 10.000 năm, giảm 24% kích thước não so với loài tổ tiên của chúng (Ovis orientalis), ngược lại loài chồn đèn (Mustela furo) được thuần hóa chỉ 2.500 năm nhưng lại giảm đến 30% kích thước não so với tổ tiên của chúng là Mustela putorius Không phải tất cả các phần

của não chịu tác động như nhau bởi các áp lực chọn lọc trong quá trình thuần hóa và chúng khác biệt theo từng loài Ở heo, các phần não liên quan đến quá trình kích thước thính giác và khướu giác ít giảm hơn so với so với cấu trúc thị giác [85]

1.2.2 PHÁT SINH LOÀI VÀ TIẾN HÓA

Thông tin di truyền của mọi sinh vật trong sinh giới (trừ vài virus) được quy định bởi trình tự sắp xếp của bốn loại nucleotide: Adenine (A), Thymine (T), Guanine (G), Cytosine (C) Trong quá trình tồn tại và phát triển, trải qua quá trình tiến hóa, trình tự thông tin di truyền của sinh vật xuất hiện những sai khác ở một hay một vài vị trí nucleotide so với trình tự ban đầu Vì vậy, trình tự thông tin di truyền của sinh vật này có thể so sánh với các sinh vật khác để tìm ra mối quan hệ tiến hóa giữa chúng Ngày 14 tháng 04 năm 2003, toàn bộ trình tự ADN người đã được giải mã và công bố tại hội nghị thường niên của NIH Trình tự ADN được công nhận là tài liệu vô giá ghi nhận lịch sử sự sống trên trái đất Những thông tin thu được từ hình thái các nhóm sinh vật còn tồn tại cũng như từ những mẫu vật hóa thạch vẫn không thể giải thích đầy đủ và chính xác nguyên nhân quá trình tiến hóa hình thành loài mới, bằng cách nào mà tỷ lệ hình thành loài mới vượt qua thời gian

Những vấn đề này sẽ giúp chúng ta hiểu hơn về những mô hình cơ bản và cả những quá trình tiến hóa hình thành loài mới và tồn tại sự sống [94]

Kể từ thời Linnaeus, khái niệm “loài” ngày càng được hoàn thiện nhờ những kiến thức từ sinh hóa và di truyền học Ngày nay, nhiều khái niệm “loài” được phát biểu dựa trên các quan điểm về hình thái, di truyền, nguồn gốc…vẫn tồn tại song song

Loài hình thái: là một nhóm các cá thể hay nhóm quần thể có đặc điểm hình thái giống nhau hoặc tương tự nhau Đây là khái niệm loài được phát biểu từ thời Linnaeus (1707–1778), khi ông cho rằng mọi sinh vật đều phải thuộc một đơn vị phân loại thấp nhất là “loài” [119]

Loài sinh học: là mô ̣t hoă ̣c mô ̣t nhóm quần thể có khả năng giao phối với nhau trong tự nhiên, sinh ra đời con có sức sống, có khả năng sinh sản, cách ly sinh sản với các nhóm quần thể khác” Tuy nhiên, khái niệm loài sinh học chỉ có thể áp dụng cho các loài sinh sản hữu tính mà bỏ qua các loài sinh sản vô tính, trinh sản Bên cạnh đó, khái niệm này cũng không nêu được trình tự thời gian tồn tại loài, đánh giá mức độ cách ly sinh sản giữa các loài [54]

Loài tiến hóa: là một dòng duy nhất các cá thể hậu duệ của một tổ tiên chung, duy trì và phân biệt đặc điểm với loài khác, chịu sự tác động của lịch sử và quá trình tiến hóa Theo quan điểm này, tất cả các loài trong quá khứ và loài hiện tại

có chung một con đường tiến hóa; không có dòng sinh vật nào có thể được chia thành loài tổ tiên và loài hậu duệ Mayr (1982) đã chỉ ra các khuyết điểm của khái niệm loài tiến hóa như: giảm thiểu các vấn đề của loài, quá trình tích lũy và duy trì những gián đoạn giữa các loài, làm thế nào để phân loại các loài đa chiều…[108]

Loài phát sinh: là một nhóm nhỏ nhất các cá thể mang một phần đặc điểm của tổ tiên và của bố mẹ, nếu cách ly sinh sản không được coi là vấn đề chính trong

sự khác biệt phân loại thì đó phải là hoạt động sơ khai và sinh sản ngẫu nhiên Theo khái niệm này, loài được ghi nhận rất nghiêm ngặt về tình trạng của chúng, chẳng hạn như thông tin quá trình tiến hóa Theo đó, hai đơn vị phân loại thân thuộc có thể giao phối và vẫn được xem là loài nếu như chúng có những đặc điểm riêng biệt nhau [78]

1.2.3 CÁC KHÁI NIỆM VỀ PHÁT SINH LOÀI

Ngày nay, các đặc tính loài kế thừa từ tổ tiên, được lưu giữ thông qua trình tự ADN đã bổ sung thêm thông tin cho hình thái học, cung cấp những hiểu biết tốt hơn

về phát sinh loài Điều này giúp cho chúng ta hiểu hơn về lịch sử của loài cũng như mối quan hệ giữa loài này với các loài khác Phát sinh loài hay cây tiến hóa là một cấu trúc toán học được sử dụng để mô hình hóa thực tế lịch sử tiến hóa của các nhóm trình tự hay các sinh vật

1.2.3.1 Cây phát sinh loài

Một cây phát sinh loài gồm có các node (điểm) được nối với nhau bởi các

“nhánh” [79] (Hình 1.2) Cấu trúc của nó bao gồm: “điểm tận cùng” là thông tin đại diện cho nhóm trình tự hay loài sinh vật, vẫn đang tồn tại hoặc đã tuyệt chủng;

“điểm trung gian” thể hiện các tổ tiên giả thuyết; “gốc” thể hiện tổ tiên của tất cả trình tự trên cây tiến hóa Nghiên cứu phát sinh loài tập trung vào mức độ cấu trúc của loài, cụ thể là mối quan hệ giữa các loài trong nhóm cao hơn (chẳng hạn như chi) Page và Holmes (1998) giải thích rằng cây phát sinh loài phân thành ba dạng phân loại cơ bản dựa vào tên chính thức của các nhóm, bao gồm:

- Monophyletic: tất cả các loài trong nhóm là hậu duệ từ một tổ tiên chung và tổ tiên

này không là tổ tiên của bất kì nhóm nào khác

- Polyphyletic: những loài trong nhóm này là hậu duệ từ một vài tổ tiên mà tổ tiên

này cũng là tổ tiên của những loài trong nhóm khác

- Paraphyletic: đây là nhóm không chứa những loài là hậu duệ từ những tổ tiên

chung gần nhất của các loài thành viên

Hình 1.2 Phân loại cây phát sinh loài theo Page và Holmes (1998)[116]

1.2.3.2 Xây dựng cây phát sinh loài [116]

Phân tích thông tin di truyền nghiên cứu phát sinh loài rất quan trọng trong nghiên cứu lịch sử tiến hóa của sự sống Nhiệm vụ cơ bản của tiến hóa phân tử là chuyển đổi thông tin di truyền trong trình tự ADN thành cây phát sinh loài Có hai phương pháp thường được sử dụng dựa trên những dữ liệu đã được xử lý:

Phương pháp khoảng cách: đầu tiên là chuyển đổi các trình tự thành những đơn vị khoảng cách “pair–wise”, sau đó nhập các đơn vị này vào ma trận xây dựng cây phát sinh loài

Phương pháp tách biệt: xây dựng cây dựa trên vị trí nucleotide một cách trực tiếp

Phương pháp khoảng cách

Trong các phương pháp khoảng cách, khoảng cách tiến hóa của nucleotide thay thế giữa hai đơn vị phân loại, tính cho tất cả các cặp của các đơn vị phân loại

và cây phát sinh loài được xây dựng bằng cách sử dụng một thuật toán dựa trên một

số mối quan hệ chức năng trong số các giá trị khoảng cách [79]

Goodness of fit measures: phương pháp này tạo ra cây tốt nhất cho khoảng cách quan sát đầu tiên, bước thứ hai tạo ra cây có tổng chiều dài nhánh là tối thiểu

Phương pháp ME (Minimum Evolution): cây tiến hóa ME là cây có tổng chiều dài nhánh thấp nhất Tuy nhiên, chiều dài trong trường hợp này được tính toán từ khoảng cách pair–wise giữa những trình tự thì ít hơn từ vị trí của các

nucleotide Một cây tương đồng được thiết lập trước tiên Sau đó, cây này sẽ được tính toán và sắp xếp lại tạo ra một cây tiến hóa ngắn hơn

Phương pháp NJ (Neighbor - Joining): là phương pháp được sử dụng rộng rãi

để xây dựng cây tiến hóa dựa trên sự kết hợp giữa tốc độ tính toán và tính duy nhất của kết quả Phương pháp này là một phương pháp phân nhóm chứ không phải phương pháp tối ưu Điểm chính của phương pháp này là hai đơn vị phân loại được kết nối với nhau bằng một node nội bộ riêng lẻ thành một cây chia hai nhánh không

có gốc Như vậy, hai loài được coi là có quan hệ thân thuộc nếu chúng được liên kết bằng một node nội bộ riêng lẻ

Phương pháp UPGMA (Unweighted Pair - Group Method with Arithmetic mean): đây là phương pháp đơn giản nhất để xây đựng cây tiến hóa Phương pháp này ban đầu được sử dụng trong những bản ghi xây dựng nhưng nó cũng được dùng

để dựng cây tiến hóa khi tỷ lệ tiến hóa gần như không đổi Trừ khi tỷ lệ thay đổi vị trí thông tin di truyền là một hằng số, UPGMA thường cho một cấu trúc liên kết không chính xác

Phương pháp tách biệt

Phương pháp này hoạt động trực tiếp trên những trình tự hoặc dữ liệu đặc điểm riêng và hạn chế hoạt động trên những khoảng cách “pair–wise” Do đó, phương pháp này sẽ hạn chế tình trạng thiếu sót thông tin khi những trình tự ở quá

xa nhau [79]

Phương pháp MP (Maximum Parsimony): phương pháp này chọn lựa cây tiến hóa thỏa điều kiện về số lượng đặc tính bị biến đổi thấp nhất trong những dữ liệu đã quan sát được Phương pháp MP giả định cây tiến hóa tốt nhất là cây mô tả được các loài ít thay đổi nhất tức là có ít đột biến nhất [79]

Phương pháp ML (Maximum Likelihood): nhóm phương pháp này dựa trên một hàm toán học tính toán xác suất của một cây tiến hóa được tạo thành từ dữ liệu

đã quan sát Hàm này cho phép tích hợp các quá trình tiến hóa thành mô hình xác suất Phương pháp ML chọn lựa cây tiến hóa tối đa dựa trên việc quan sát các dữ liệu từ một mô hình có xác suất tối đa [79]

1.3 MỘT SỐ MARKER PHÂN TỬ

1.3.1 ADN TY THỂ (MTADN)

Mỗi ty thể có khoảng 12-15 phân tử ADN dạng vòng trong chất nền ADN của ty thể (mtADN) cũng có cấu trúc sợi xoắn kép theo mô hình Watson-Crick và giống ADN của vi khuẩn (ADN dạng trần, không có histone và có cấu tạo vòng) (Hình 1.3) ADN ty thể chứa hệ gen mã hóa cho khoảng 13 protein của riêng ty thể Các dạng mRNA, tRNA, rRNA trong ty thể đều được phiên mã từ ADN ty thể và chúng là cơ sở để ty thể tự tổng hợp lấy một số protein của mình Hệ gen của ty thể được sắp xếp rất hiệu quả: không có intron, vùng “trống” do khung đọc mở chồng lên nhau nhỏ Vùng kiểm soát là vùng không mã hóa chính, có chức năng điều hòa quá trình phiên mã ở chuỗi nặng và chuỗi nhẹ cũng như quá trình sao chép chuỗi nặng

Hình 1.3 Cấu trúc ADN ty thể

ADN ty thể được xem như một marker phân tử có những ưu điểm [78] Tỷ lệ đột biến của ADN ty thể cao gấp 10 lần so với ADN trong nhân do cơ chế sửa sai trong quá trình sao chép không hiệu quả Chính vì vậy ADN ty thể rất hữu ích cho việc phân tích mối quan hệ di truyền của từng cá thể trong nhóm của cùng một loài hoặc đánh giá mối quan hệ giữa các cá thể (mối quan hệ tiến hóa) giữa các loài khác nhau, từ đó có thể biết được khoảng cách tiến hóa giữa các loài Khi một loài nào đó

có mối quan hệ tiến hóa càng xa thì số lượng sự khác biệt trở nên lớn hơn

Những vùng khác nhau của ADN ty thể có mức độ tiến hóa khác nhau Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn vùng gen thích hợp với từng mục tiêu nghiên cứu Ở động vật, ADN ty thể di truyền theo dòng mẹ ở hầu hết các loài, do

đó nó rất hữu ích trong việc nghiên cứu di truyền phả hệ theo dòng mẹ Bên cạnh

đó, ADN ty thể còn là cơ sở nghiên cứu tổ tiên chung của các loài sau một quá trình tiến hóa lâu dài do không xảy ra quá trình tái tổ hợp ADN ty thể được xem như một marker trung tính do những đột biến xảy ra trên ADN ty thể không làm ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của sinh vật Vì vậy, đột biến xảy ra trên ty thể không làm mất

đi những kiểu gen của sinh vật đã được chọn lọc trong quá trình tiến hóa

1.3.2 GEN CYTOCHROME B

Cytochrome b là một thành viên trong họ cytochrome (a, b và c) Mỗi phân

tử mang 2 nhân heme có khối lượng khoảng 40 kDa và hấp thu ánh sáng ở bước sóng 556-560 nm [55] Cytochrome b có vai trò vận chuyển điện tử trong quá trình

hô hấp ở ty thể (Hình 1.4)

Gen cytochrome b được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu tiến hóa vì quá trình đột biến xảy ra chậm chạp Nhiều phần của gen cytochrome b được bảo tồn do chức năng của nó còn hạn chế Mặc dù gen cytochrome b đột biến chậm nhưng tỷ lệ những đột biến im lặng lại xảy ra rất cao Vì vậy, cytochrome b có tính ổn định và biến đổi phù hợp để nghiên cứu sâu hơn về những mối quan hệ tiến hóa Phần lớn những vị trí hay xảy ra biến động nằm trong vùng mã hóa cho màng vận chuyển, các gốc amin và gốc cacboxyl ở vùng đầu tận cùng [78]

Hình 1.4 Cấu trúc của protein cytochrome b [78]

1.3.3 VÙNG KIỂM SOÁT (CONTROL REGION)

Vùng kiểm soát của ADN ty thể là vùng không mã hóa, chứa trình tự sao chép chuỗi nặng và các promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ Ở động vật, vùng kiểm soát là trình tự nằm giữa đầu 5’ ở chuỗi nhẹ của tRNAPro và đầu 3’ ở chuỗi nặng của tRNAPhe Vì vùng kiểm soát nằm trong vùng thường xuyên xảy ra các biến động về số lượng nucleotide (thêm nucleotide, mất nucleotide hay lặp đoạn) nên chiều dài biến thiên từ 880–1400 cặp nucleotide Vùng kiểm soát còn được gọi D-loop

Vùng kiểm soát được chia làm 3 vùng với hai chức năng chính Vùng kiểm soát II là vùng trình tự bảo tồn do tỷ lệ đột biến xảy ra chậm chạp Vùng I và vùng III là vùng gần đầu tận 5’ và 3’ nên có tỷ lệ đột biến cao (Hình 1.5) Ở động vật có

vú, vùng kiểm soát I nằm ở đầu 5’ mang trình tự liên quan đến sự kết thúc giả định (TAS) Vùng kiểm soát trung tâm mang những đoạn trình tự bảo tồn giữa các loài, thậm chí là giữa hai loài cách xa nhau về mặt tiến hóa Những vùng bảo tồn này còn được gọi là “hộp trình tự bảo tồn” (CSB, B-F box) Đây là vùng trình tự nhận biết đặc hiệu cho quá trình sao mã và phiên mã Quá trình kéo dài chuỗi nặng trong sao

mã sẽ chấm dứt khi gặp trình tự CBS và TAS Vùng kiểm soát III nằm ở đầu 3’ là vùng linh động nhất vùng này mang các “hộp trình tự bảo tồn” (CBS1, CBS2,

CBS3), vùng sao chép của chuỗi nặng và các promoter điều khiển quá trình phiên

mã xảy ra ở cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (HSP và LSP) [78]

Hình 1.5 Cấu trúc vùng kiểm soát của ty thể ở động vật có vú

Ở nhiều loài sinh vật, vùng kiểm soát có tốc độ tiến hóa nhanh hơn các vùng gen khác của ty thể Vì vậy, vùng kiểm soát được sử dụng trong các nghiên cứu xác định cấu trúc dân số loài, mối quan hệ thân thiết giữa các loài… giúp giải quyết các vấn đề liên quan đến quan hệ phát sinh loài [78]

1.3.4 GEN 16S rRNA

Phân tử 16S rRNA có cấu trúc đặc biệt do nó có thể hình thành cấu trúc bậc

2 và tạo thành 4 domains Nó có cuộn gấp lại nhờ những liên kết từ những đoạn xa nhau và thường nhỏ hơn 8 bp Những đoạn cặp đôi này thường không hoàn chỉnh và

có những đoạn phồng ra do bị lồi lên cấu trúc bậc 2 của một phân tử 16S rRNA [100]

Trên đoạn gen 16S rRNA xác định được các vùng ổn định (universal) là các vùng có sự biến đổi rất ít giữa các loài và các vùng biến đổi (variable) là những vùng có sự khác nhau giữa các loài, chủng Có 8 vùng biến đổi và mỗi vùng có chiều dài khoảng 18-20 nucleotide Giữa hai vùng có những vùng có biến đổi ít và được gọi là vùng bán bảo tồn (semi-conserved) Ribosome có mặt ở mọi hình thức sống, trình tự gen 16S rRNA rất ít thay đổi theo thời gian Vì vậy, 16S rRNA đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu phát sinh loài, đặc biệt là ở các loài vi khuẩn [100]

1.3.5 INTRON VÙNG NHÂN

Intron là trình tự nằm trong ADN nhưng không mã hóa cho protein và không hiện diện ở mRNA trưởng thành Ở eukaryote, sự hiện diện của intron là tăng đáng

kể chiều dài, kích thước và khối lượng của gen Mặc dù intron được xem là không

có chức năng và bị cắt bỏ trong quá trình biểu hiện gen nhưng trình tự intron gần vùng nối giữa intron-exon lại có tính bảo tồn cao Hầu hết các đoạn intron ở eukaryote được nhận diện nhờ trình tự các nucleotide bắt đầu và kết thúc

“GT…AG” Quá trình cắt ghép intron có vai trò rất quan trọng trong biểu hiện gen Với các vị trí cắt ghép khác nhau, từ một gen có thể tạo ra nhiều protein khác nhau

Ở eukaryote, phần lớn intron là “spliceosomal intron” hay “intron nhân” do được cắt ghép bởi spliceosome Ở ty thể vi khuẩn và hầu hết các sinh vật prokaryote đều không có sự hiện diện của intron Chính sự vắng mặt này đã dẫn đến giả thuyết

“intron–muộn” cho rằng các intron chỉ mới nhập bào hoặc sống nội cộng sinh trong

tế bào eukaryote Trải qua thời gian dài, intron đã chèn vào và tồn tại cùng với ADN của tế bào eukaryote, tương tự như trường hợp giả thuyết ty thể

1.3.6 PROTEIN KINASE C

Protein kinase C (PKC) là một họ enzyme kinase liên quan đến quá trình kiểm soát chức năng của các protein khác thông qua con đường phosphoryl hóa nhóm hydroxyl của amino acid serine và threonine trên phân tử protein Các protein kinase C có vai trò quan trọng trong con đường truyền tín hiệu của tế bào Nồng độ diacylglycerol (DAG) hay ion canxi (Ca2+) tăng cao là tín hiệu hoạt hóa của họ protein này Họ protein kinase C được chia thành ba nhóm [76]:

- Nhóm hoạt hóa nhờ nồng độ diacylglycerol và ion canxi cao

- Nhóm hoạt hóa không phụ thuộc vào ion canxi

-Nhóm hoạt hóa nhờ phosphatidylserine không phụ thuộc canxi và diacylglycerol

Protein kinase C iota (PKCi) là enzyme hoạt hóa nhờ phosphatidylserine không phụ thuộc canxi và diacylglycerol Ở người, PKCi là enzyme cần thiết trong quá trình truyền tin thông qua con đường Ras ở các tế bào ung thư phổi và ung thư biểu mô ruột Ở các tế bào ung thư tụy và ống động mạch tụy cũng có sự biểu hiện vượt mức của PKCi Sự biểu hiện của PKCi quy định quá trình tạo thành mạch, xâm lấn và di căn của các tế bào ung thư ống động mạch tụy theo chiều thẳng [104]

1.3.7 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ QUAN HỆ PHÁT SINH LOÀI PHÂN TỬ CỦA HEO RỪNG

Bộ gen ADN ty thể của một số loài heo của một số nước trên thế giới (Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ý,…) đã được giải trình tự bằng nhiều phương pháp khác nhau trong đó phương pháp PCR và giải trình tự là phương pháp phổ biến dễ sử dụng [16] Việc giải toàn bộ trình tự ADN ty thể hoặc giải trình tự một số vùng trên ADN ty thể như vùng kiểm soát [66], cytochrome b [51],… giúp xác định những biến dị cũng như cây phát sinh loài giữa các loài heo trên thế giới, từ đó xác định được mức độ đa dạng cũng nguồn gốc của loài heo trên thế giới [39] Năm 2002, Kim và cộng sự đã phân tích vùng D–loop của các loài gia súc và chỉ ra rằng loài Bershire có nguồn gốc từ Châu Á [56] Sử dụng phương pháp NJ để phân tích đoạn trình tự D–loop ở các loài heo rừng Nhật Bản, Watanabe (2003) nhận thấy tổ tiên của các loài heo rừng Nhật Bản có nguồn gốc từ vùng Nam Á và Đông Bắc Á [121] Nghiên cứu cũng chỉ ra vùng phân bố rộng lớn của tổ tiên các loài heo rừng ngày nay

Heo rừng phân bố rộng khắp Châu Á, Châu Âu, Bắc Phi và là tổ tiên của ít nhất 16 loài heo rừng ngày nay Kijas (2001) tìm thấy sự khác biệt giữa loài heo rừng Thụy Điển và Mỹ Sơn (Trung Quốc) là 1.21 ± 0.09% [39] Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2011) cũng chỉ ra mối quan hệ tiến hóa giữa heo rừng Ryukyu và Lanyu với các loài gia súc khác có những điểm rất gần gũi nhau ở trình tự vùng D–loop [16] Cả heo rừng Ryukyu và Lanyu đều là những nhánh của heo rừng Châu Á xuất hiện từ rất sớm Năm 1999, Watanabe và Okumura đã phân tích trình tự cytochrome b và vùng D–loop của heo rừng Nhật Bản, heo rừng Ryukyu cùng với các loài heo rừng và heo nhà khác [122] Bằng các phương pháp phân tích cây tiến hóa, nhóm nghiên cứu đã cho thấy nguồn gốc khác biệt của heo rừng Ryukyu so với loài heo rừng Nhật Bản Ryukyu có nguồn gốc từ loài heo rừng Châu Á và có tổ tiên khác xa với tổ tiên của heo rừng Nhật Bản Ramayo và cộng sự (2011) đã nghiên cứu cytochrome b và vùng D-loop của heo rừng ở vùng Primorsky (Nga) Những kết quả thu được từ phân tích trình tự cho thấy các loài heo rừng ở vùng này

có quan hệ gần gũi Bảy trong số 14 loài heo rừng ở đây có nguồn gốc từ một loài heo rừng Trung Quốc [92]

Hiện nay, một số nghiên cứu trên heo rừng thuần Việt Nam đã được tiến hành Vùng D-loop của ADN heo rừng Việt Nam ở một số tỉnh miền Bắc đã được giải trình tự và xác định các biến dị giữa các loài heo bản địa cũng như so sánh loài heo Việt Nam với loài heo của Nhật Bản [122] Microsatellites cũng được sử dụng

để đánh giá, so sánh tính đa hình cũng như mức độ đa dạng di truyền của một số loài heo rừng miền Bắc với Châu Âu [117] Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng heo rừng khu vực miền Trung, miền Nam cũng như trình tự cytochrome b và 16S trong đánh giá biến dị và đa dạng di truyền vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu đầy đủ

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng D-loop, cytochrome

b và 16S của ADN ty thể heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên và phân tích điểm đa hình cũng như những khác biệt di truyền của heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên so với một số loài heo rừng các nước khác Kết quả nghiên cứu này là

cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo như bảo tồn hay sử dụng nguồn gen heo rừng Tây Nguyên trong công tác lai tạo giống

1.4 BẢO TỒN HEO RỪNG THUẦN CÓ NGUỒN GỐC TÂY NGUYÊN

Sinh học bảo tồn là một khoa học đa ngành được xây dựng nhằm hạn chế các mối đe dọa đối với đa dạng sinh học Sinh học bảo tồn có hai mục tiêu: một là tìm hiểu những tác động tiêu cực do các hoạt động của con người gây ra đối với các loài, quần xã và các hệ sinh thái; hai là xây dựng các phương pháp tiếp cận để hạn chế tuyệt diệt của các loài và nếu có thể được, cứu các loài đang bị đe dọa bằng cách đưa chúng hội nhập trở lại các hệ sinh thái đang còn phù hợp đối với chúng Các khoa học kinh điển như sinh học quần thể, phân loại học, sinh thái học, di truyền học… là nội dung cơ bản của sinh học bảo tồn

Quỹ Bảo vệ Thiên nhiên Quốc tế (WWF) (1989) quan niệm: “Đa đạng sinh học (ĐDSH) là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gen chứa đựng trong các loài và là những Hệ sinh thái (HST) vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường” Do vậy, ĐDSH bao gồm sự đa dạng trong loài (đa dạng di truyền hay còn gọi là đa dạng gen), giữa các loài (đa dạng loài) và các HST (đa dạng HST) Việc bảo vệ đa dạng sinh học là trọng tâm của sinh học bảo tồn

Có nhiều phương pháp và công cụ để bảo tồn và quản lý ĐDSH Một số phương pháp và công cụ được sử dụng để phục hồi một số loài đặc biệt nào đó, các

dòng di truyền hay các sinh cảnh Một số khác được sử dụng để sản xuất một cách bền vững các sản phẩm, hàng hoá và dịch vụ từ các tài nguyên sinh học Một số nữa

có xu hướng tạo ra sự phân phối một cách công bằng các lợi nhuận thu được từ việc bảo tồn ĐDSH, sử dụng bền vững các tài nguyên sinh học [109] Có thể phân chia các phương pháp và công cụ thành các nhóm như sau:

Bảo tồn nguyên vị (in situ):

Bảo tồn nguyên vị bao gồm các phương pháp và công cụ nhằm mục đích bảo

vệ các loài, các chủng và các sinh cảnh, các HST trong điều kiện tự nhiên Tùy theo đối tượng bảo tồn mà các hành động quản lý thay đổi Thông thường bảo tồn nguyên vị được thực hiện bằng cách thành lập các khu bảo tồn và đề xuất các biện pháp quản lý phù hợp [109]

Bảo tồn chuyển vị (ex situ):

Bảo tồn chuyển vị bao gồm các biện pháp di dời các loài cây, con và các vi sinh vật ra khỏi môi trường sống thiên nhiên của chúng Mục đích của việc di dời này là để nhân giống, lưu giữ, nhân nuôi vô tính hay cứu hộ trong trường hợp: (1) nơi sinh sống bị suy thoái hay huỷ hoại không thể lưu giữ lâu hơn các loài nói trên, (2) dùng để làm vật liệu cho nghiên cứu, thực nghiệm và phát triển sản phẩm mới,

để nâng cao kiến thức cho cộng đồng [109]

1.4.1 BẢO TỒN GIAO TỬ HEO RỪNG THUẦN CO NGUỒN GỐC TÂY NGUYÊN

1.4.1.1 Bảo tồn tinh trùng

Đông lạnh tinh heo là một biê ̣n pháp hữu ích cho việc bảo quản các nguồn di truyền, cải thiện di truyền và tăng cường khả năng trao đổi di truyền giữa các nước khác nhau [52] Hơn nữa, tinh dịch đông lạnh còn được sử dụng cho các công nghệ

sinh sản như thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF), chuyển phôi

(embryo transfer) và chọn lọc giới tính [37] Tuy nhiên, một điều không thuận lợi là những nghiên cứu của quá trình đông lạnh tinh diễn ra chậm Ở heo, phương pháp đông lạnh tinh gặp một số khó khăn trong quá trình đông lạnh và giải đông Việc sử dụng tinh trùng đông lạnh để thụ tinh vẫn cho tỉ lệ thụ tinh thấp hơn so với thụ tinh

sử dụng tinh tươi [22] Tinh dịch thường được pha loãng với môi trường thích hợp,

có thành phần lòng đỏ trứng hay sữa Nhiệt độ pha loãng phải tương thích với nhiệt

độ cơ thể [86] Đông lạnh gây ra các stress lên tinh trùng như sự sắp xếp lại cũng

như giảm tính bền vững các thành phần của màng tinh trùng và dòng canxi trong tinh trùng Do đó, để đảm bảo chất lượng cũng như khả năng thụ tinh của tinh trùng, cần phải giảm các nhân tố có thể tác động xấu đến tinh trùng trong quá trình đông lạnh [96], [98]

Phương pháp đông lạnh và giải đông tinh heo được bắt đầu nghiên cứu và phát triển phục vụ gieo tinh nhân tạo cách đây khá lâu ở các nước châu Âu và Mỹ [63] Trong những năm gần đây, nghiên cứu đông lạnh tinh trùng heo đã có những cải tiến và tối ưu hóa quan trọng [98] Ví dụ như phương pháp ly tâm và giải đông tinh trùng cũng như bổ sung các nhân tố giúp cải thiện quá trình đông lạnh tinh trùng [97] Tinh trùng heo khác với tinh trùng của các nhóm động vật khác, tinh dịch heo được sản xuất trên một thể tích lớn và tinh trùng nhạy cảm với shock nhiệt lạnh, khả năng sống của tế bào tinh giảm rõ rệt khi nhiệt độ thấp hơn 15oC [38] Do

đó, đông lạnh tinh heo đòi hỏi phải có những kỹ thuật đặc biệt [53] Nhiều yếu tố có thể liên quan tới quá trình đông lạnh tinh heo bao gồm môi trường pha loãng, loại chất bảo vệ, thời gian đông lạnh, tốc độ làm lạnh và giải đông [53]

Ngày nay, có hai kỹ thuật chính trong đông lạnh tinh heo là đông lạnh truyền thống và đông lạnh kiểm soát tốc độ hạ nhiệt Verheyen (1993) đã mô tả rằng kết quả tinh trùng sau giải đông sẽ tốt hơn khi máy tính kiểm soát tốc độ làm lạnh được

sử dụng, kết quả này tốt hơn phương pháp đông lạnh không kiểm soát tốc độ làm lạnh Việc kiểm soát tốc độ làm lạnh sẽ cải thiện rõ rệt khả năng di động của tinh trùng, khả năng sống khi so sánh với phương pháp đông lạnh truyền thống Bên cạnh việc thụ tinh phụ thuộc vào các giống heo, các dữ liệu cho thấy khả năng di động của tinh trùng đông lạnh giữa giống heo Landrace và giống heo Duroc là khác nhau Sự khác biệt này có nguyên nhân từ việc khác biệt trong thành phần lipid của màng sinh chất ở tinh trùng, nó có thể ảnh hưởng tới sự khác biệt chính trong tỉ lệ sống sót và thụ tinh sau giải đông giữa các giống heo khác nhau [81]

Hạn chế của tinh heo đông lạnh là tỉ lệ thụ thai thấp [53] Tỉ lệ thụ tinh thấp của tinh trùng đông lạnh liên quan tới nhiều yếu tố: việc sản sinh mạnh các chất oxy hóa, hoạt đô ̣ng của ROS được cảm ứng bởi quá trình đông lạnh, các sai hỏng, kỳ hình tinh trùng Sự sản xuất ROS còn liên quan tới quá trình làm giảm hoạt động của tinh trùng, giảm khả năng dung hợp giữa tinh trùng và trứng Tinh trùng rất nhạy với quá trình peroxide hóa lipid, quá trình này dựa vào nồng độ cao của các

acid béo chưa bão hòa và chúng có khả năng tái tổng hợp các thành phần trên màng sinh chất của tinh trùng Nhiều nghiên cứu cho thấy việc bổ sung các chất chống oxy hóa trong môi trường bảo quản tinh trùng heo có thể cải thiện cả tinh trùng heo tươi [30] và tinh trùng heo đông lạnh [12], [32], [83], [95] Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng việc bổ sung các chất chống oxy hóa như vitamin E 200 µM vào môi trường đông lạnh để đông lạnh tinh trùng sẽ làm giảm sự sản sinh các chất oxy hóa ROS và cải thiện khả năng sống và di động của tinh trùng [83]

Funahashi và Sano (2005) chỉ ra rằng việc bổ sung glutathione hay cysteine 5 µM vào môi trường đông lạnh sẽ cải thiện khả năng sống của tinh trùng của tinh trùng trong quá trình dự trữ tinh ở 10oC trong vòng ít nhất 14 ngày [30] Một nghiên cứu gần đây mô tả rằng việc bổ sung 1µM glutathione vào môi trường đông lạnh sẽ có tác động bảo vệ chức năng của tinh trùng [32] Đông lạnh tinh dịch heo liên quan đến nhiều bước chung như pha loãng, đông lạnh, làm lạnh và giải đông, mỗi bước đều tác động đến cấu trúc và chức năng của tinh trùng

L-1.4.1.2 Bảo tồn trứng

Đông lạnh tế bào trứng (TBT) (giao tử cái, noãn bào) là quá trình đưa TBT sống từ điều kiện sinh lý xuống điều kiện nhiệt độ rất thấp (-1960C, trong môi trường có chất bảo quản đông lạnh) Tại điều kiện này, mọi hoạt động sống, các quá trình chuyển hóa và phát triển của TBT đều dừng lại, nhưng các cấu trúc và thành phần sinh học của chúng được bảo tồn, nhờ đó người ta có thể giữ TBT ở trạng thái tiềm sinh trong một thời gian dài [19], [42]

Các phương pháp đông lạnh hiện nay được sử dụng có thể chia làm hai nhóm chính: nhóm đông lạnh cân bằng (equilibrium cooling) với hai phương pháp là đông lạnh chậm (slow freezing) và đông lạnh nhanh (rapid freezing); nhóm đông lạnh không cân bằng (non – equilibrium cooling) với phương pháp đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa, vitrification) Sự lựa chọn phương pháp đông lạnh phụ thuộc vào một số yêu cầu như: (1) tính hiệu quả, (2) tính an toàn, (3) tính tiện lợi [25], [19], [42]

Đông lạnh chậm (Slow-cooling)

Đông lạnh chậm sử dụng nồng độ chất bảo vệ lạnh (Cryoprotectant agents_CPA) với nồng độ thấp (khoảng 1 – 2M) thêm vào môi trường đông lạnh,

tốc độ làm lạnh giới hạn khoảng 0,1 – 1,0oC/phút) Quá trình làm lạnh thực hiện nhờ các máy giảm nhiệt, các tế bào được khử nước với tốc độ chậm.[19]

Trước khi giảm nhiệt độ tế bào dưới 0oC, TBT sẽ được tiếp xúc với môi trường có CPA với nồng độ thấp (khoảng 1 – 1,5M/lít) để làm mất nước nội bào nhằm hạn chế sự hình thành tinh thể đá Thường trong giai đoạn này, người ta chỉ

sử dụng một loại CPA (propanediol_PROH, dimethylsulfoxide_DMSO hay ethylene glycol_EG) Do tính thấm qua màng tế bào của nước cao hơn của CPA, nên sự di chuyển của nước ra khỏi tế bào nhanh hơn sự di chuyển của CPA vào tế bào Chính điều này làm cho tế bào ban đầu bị giảm thể tích, sau đó phục hồi dần thể tích[19], [42]

Giai đoạn mất nước thứ hai diễn ra khi cho TBT tiếp xúc với môi trường có CPA ban đầu kết hợp với một CPA không có khả năng thấm qua màng tế bào (sucrose hay oligosaccharide khác) Sau đó TBT được làm lạnh xuống dưới 0oC Kết quả của phương pháp đông lạnh chậm sẽ tối ưu khi tốc độ hạ nhiệt tạo nên sự cân bằng giữa tốc độ nước ra khỏi tế bào và tốc độ nước hình thành nên tinh thể đá ngoại bào[19], [42]

Trong phương pháp này, các tổn thương do độc tính chất bảo vệ lạnh và nồng độ thẩm thấu cao thường không đáng kể Tuy nhiên, nồng độ của các CPA không đủ để ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá nội bào Vì vậy, cần có một bước can thiệp trong phương pháp này, đó chính là sự tạo mầm tinh thể đá (seeding) Bước này kích thích sự hình thành tinh thể khác lan tỏa dần khắp môi trường, làm cho nồng độ thẩm thấu xung quanh TBT tăng dần Lúc này nước thoát ra khỏi TBT nhờ hiện tượng thẩm thấu, vì vậy sẽ làm giảm nguy cơ hình thành tinh thể đá nội bào Trong quá trình tiến hành cần kiểm soát chặt chẽ, nếu không sẽ làm tổn thương đến màng tế bào[19], [42]

Ở nhiệt độ -30oC đến -40oC, khi nước trong nội bào đã được loại bỏ hết và nước ngoại bào đã chuyển sang dạng tinh thể đá thì sẽ chuyển cọng rạ chứa TBT xuống -196oC và lưu trữ tại đây Sau thời gian bảo quản, sẽ tiến hành rã đông tùy theo cách trữ lạnh Quá trình rã đông diễn ra với nguyên lý hoàn toàn trái ngược với quy trình đông lạnh, trong đó quá trình bù nước phải diễn ra theo từng bước với nồng độ CPA giảm dần [19], [42]

Đông lạnh nhanh (Rapid freezing)

Phương pháp đông lạnh nhanh hầu như giống phương pháp đông lạnh chậm chậm (sử dụng nồng độ chất bảo vệ thấp tương tự như đông lạnh chậm) chỉ khác ở chỗ tốc tộ làm lạnh cao hơn: ngay sau khi ở nhiệt độ -5oC hay -7oC cọng rạ chứa TBT được nhấn chìm vào nitơ lỏng và giai đoạn cân bằng với chất bảo vệ lạnh có glycerol 1,08M và sucrose 0,4M kéo dài 20 phút[19],[42]

Đông lạnh cực nhanh (Thủy tinh hóa, vitrification)

Thủy tinh hóa là một phương pháp trữ lạnh không cân bằng equylibrium cryopreservation method) được thiết lập dựa trên nguyên lý cơ bản là không có sự hình thành tinh thể đá bên trong tế bào Trong phương pháp này, mẫu

(non-tế bào được nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng ngay khi được cho trao đổi với CPA mà không qua giai đoạn hạ nhiệt độ từ từ Toàn bộ khối vật chất (kể cả nước) bên trong

và môi trường bên ngoài tế bào sẽ chuyển thành thể rắn dạng “kính” (glass-like solidification) và hoàn toàn không có sự hình thành tinh thể đá [19], [42]

1.4.2 BẢO TỒN TẾ BÀO SINH DƯỠNG

1.4.2.1 Đông lạnh tế bào sinh dưỡng

Quá trình bảo quản tế bào ở nhiệt độ thấp dưới 0oC trong thời gian dài, được gọi là bảo quản lạnh Tuy nhiên nhiệt độ dưới 0oC làm ngưng mọi hoạt động sinh học dẫn đến chết tế bào, do vậy phải có một quy trình giúp tế bào không chết và cũng không mất đi các thành phần, cấu trúc và nhiều tính năng sinh học sau đó Về nguyên lí chung, đông lạnh tế bào là quá trình đưa tế bào từ điều kiện sinh lí (37oC, 5% CO2) vào môi trường dịch sinh lí, xuống điều kiện nhiệt độ rất thấp (-196oC, trong nitơ lỏng) ở dung dịch là môi trường đông lạnh (còn gọi là chất bảo quản đông lạnh- cryoprotectant) Tại điều kiện này, mọi hoạt động sống, các quá trình chuyển hoá và phát triển của tế bào dừng lại, nhưng chúng không chết, nhờ đó người ta có thể giữ tế bào ở trạng thái tiềm sinh trong một thời gian dài Bảo quản lạnh đã giúp khả năng tối ưu hoá việc sử dụng, cũng như tính sẵn sàng để sử dụng đối với những vật liệu sinh học sống nói chung, một khi mà nguồn cung ứng ban đầu của chúng hạn chế Công nghệ này cho phép lưu trữ lâu dài các nguồn vật liệu sinh học sống, mà không làm hư hỏng chúng trong thời gian lâu dài [3]

Với các quá trình, nguyên lí quan trọng của sinh học đông lạnh, rõ ràng khoa học của bảo quản lạnh đã được nghiên cứu có hệ thống, gần như đạt mức hoàn hảo

ngay từ cuối thế kỉ 20 Trong những năm gần đây, những tiến bộ của sinh học đông lạnh tiếp tục phát triển giúp hoàn thiện hơn lí thuyết cơ bản về sinh học đông lạnh (cryopreservation) Ở nhiệt độ rất thấp của nitơ lỏng (-196oC), nước bên trong tế bào và bên ngoài môi trường tồn tại ở dạng tinh thể và các dạng vật chất khác (không phải nước) sẽ ở dạng rắn giống như thủy tinh (glass-like) Phương pháp gọi

là đông lạnh chậm (slow-freezing) thường được sử dụng Với kĩ thuật này, những tế

bào được làm lạnh ở một gradient nhiệt độ lạnh; tuy gọi là đông lạnh chậm, nhưng tiến trình cũng phải đủ nhanh, sao cho kịp khử hết nước bên trong tế bào, nhằm ngăn chặn sự hình thành đá nội bào (IIF), khiến tế bào vỡ do giãn nở thể tích

1.4.2.2 Chất bảo quản đông lạnh

Chất bảo quản đông lạnh có vai trò nhằm chống lại những tác động bất lợi của nhiệt độ thấp, hay nhiệt độ đông lạnh Một chất bảo quản đông lạnh có thể làm cho nước đông lại giống như thủy tinh mà không hề hình thành các tinh thể đá Những chất bảo quản này cũng ngăn chặn được sự tạo thành muối (tủa), cũng như việc tạo thành tinh thể trong tế bào trong suốt thời gian đông lạnh Ở nồng độ muối cao và những tinh thể nước đá hình thành có thể làm tổn thương hoặc giết chết tế bào trong suốt quá trình đông lạnh cho đến khi tiến hành quá trình giải đông Glycerol có khả năng bảo vệ tế bào trong điều kiện đông lạnh, đánh dấu một bước tiến triển mới trong lĩnh vực sinh học đông lạnh Những chất thường được sử dụng trong thời gian đó để bảo quản tinh trùng là dung dịch muối sinh lý có bổ sung thêm bột sữa, lòng đỏ trứng, đường trái cây và một số chất khác [3]

Những nhà nghiên cứu đang cố gắng thay đổi thành phần các chất bảo quản đông lạnh và kiểm tra sự di động của tinh trùng sau khi đông lạnh Kết quả trung bình đạt được là khoảng 5% tinh trùng di động sau khi giải đông Lúc đầu, Glycerol được sử dụng như một chất đặc trưng để làm bất động tinh trùng khi quan sát chúng dưới kính hiển vi Trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm, có lần các nhà khoa học đạt được mức độ di động của tinh trùng là 50% và kết quả này được xem như không bình thường Họ đã lặp lại thí nghiệm nhiều lần và chúng vẫn cho kết quả tương tự Ngày tiếp theo, trong khi các nhà nghiên cứu đang cố gắng chứng minh sự tiến bộ đáng chú ý này với các đồng nghiệp của họ trong một lô thí nghiệm mới, thì kết quả sau khi giải đông đã trở lại bình thường là 5% Những phân tích về chất bảo

quản đông lạnh trước đó cho thấy một điều bất ngờ rằng, trong thành phần dung dịch bảo quản lần này, nồng độ glycerol cao hơn các lô thí nghiệm trước đây

Từ đó, glyceol được sử dụng như là một chất bảo quản lạnh, phương pháp bảo quản bằng đông lạnh đã được thay đổi căn cơ về bản chất Khái niệm chất bảo quản đông lạnh ra đời, từ kết quả này, chiến dịch tìm kiếm những chất mới, được cho là có khả năng đóng vai trò là một chất bảo quản lạnh được tiến hành Tất cả được khởi sướng từ một chất đầu tiên: glycerol (mà vào thời điểm đó, người ta sử dụng để làm bất động tinh trùng, phục vụ cho việc đánh giá hình thái học tế bào dưới kính hiển vi) Các chất bảo quản đông lạnh với nhiều thành phần các chất và hợp chất hoá học khác nhau, có tính tan trong nước cao, ít ảnh hưởng đến đặc tính

tế bào, cũng như độc tính của chúng phụ thuộc vào nồng độ và nhiệt độ của môi trường chứa chúng Trong quá trình hoà tan trong nước, chúng hình thành các cầu nối liên kết hydro với nước

Có thể phân loại các chất bảo quản đông lạnh bao gồm nhóm chất có khả năng xâm nhập và không xâm nhập tế bào Những dạng ban đầu được sử dụng cho hiệu quả bảo vệ, thường thông qua các hoạt động liên kết yếu Các chất bảo quản thâm nhập sẽ xuyên qua màng vào tế bào và sau đó, chúng tham gia trực tiếp hay gián tiếp việc cố định các protein nội bào Khi nhiệt độ giảm xuống, tế bào có thể vượt qua cái chết (do sự hình thành băng nội bào) và giảm tác động của các chất điện phân (tập trung trong và ngoài tế bào) Như vậy, các tác động có tính gây độc,

do nồng độ cao của các chất tan trong quá trình đông lạnh được giảm xuống rất nhiều Với các chất bảo quản không xâm nhập, nói chung các tác động theo xu hướng bảo vệ của chúng, chủ yếu là do sự khử nước chọn lọc

Các chất bảo quản đông lạnh đặc trưng thường dùng như glycerol, glycol, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) và 1,2 propanol DMSO cho đến nay, chúng được xem như một chất bảo quản đông lạnh tốt hơn glycerol Trọng lượng phân tử của DMSO tương đối thấp (<100) Điều này làm cho chúng dễ dàng thâm nhập qua màng và đi vào bên trong tế bào Những đại phân tử như đường, protein và lipoprotein, cũng như các chất phân cực còn lại ở môi trường ngoài tế bào đóng vai trò như những chất bảo quản đông lạnh không xâm nhập Những chất này hoạt động giống như hydroxyethylstarch vì chúng có khả năng làm giảm số lượng các tinh thể nước trong quá trình đông lạnh