Nghiên cứu tách, chiết và xác định hàm lượng một số hợp chất Diterpenoid từ loài kim giao (Nageia Fleuryi (Hick.) De Laubenf)

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ .... Luận văn này tập trung nghiên cứu phân tích cấu trúc và xác định hàm lượng một số hợp chất diterpenoid được phân lập từ

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN DUY HẢI

NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID TỪ

LOÀI KIM GIAO

(NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN DUY HẢI

NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID

TỪ LOÀI KIM GIAO

(NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60 44 01 18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM HẢI YẾN

THÁI NGUYÊN - 2017

Trang 3

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến với TS Phạm Hải Yến

Cô đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Nghiên cứu cấu trúc – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ trang thiết bị cho nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói riêng

và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian tôi học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại Học Thái Nguyên Qua đây, tôi xin cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên của Bộ môn Hóa phân tích đã luôn động viên, tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Thái Nguyên, ngày 18 tháng 05 năm 2017

Học viên

Nguyễn Duy Hải

Trang 4

MỤC LỤC

Mở đầu 1

Nội dung nghiên cứu 2

1.1 Tổng quan về cây Kim Giao 3

1.1.1 Vài nét về thực vật 3

1.1.2 Phân bố và sinh thái 4

1.1.3 Ứng dụng 4

1.1.4 Các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học 4

2.1 Mẫu thực vật 11

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 11

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 11

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 11

2.2.3 Sắc ký cột (CC) 11

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ 11

2.3.1 Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR) 12

2.3.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy - MS) 12

2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 13

2.4 Phương pháp định lượng và đánh giá chất sạch bằng LC/MS 15

2.5 Thực nghiệm 17

2.5.1 Phân lập các hợp chất 17

2.5.2 Hằng số vâ ̣t lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lâ ̣p 18

2.5.3 Định lượng các hợp chất 19

3.1 Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được 21

3.1.1 Hợp chất D1: 21

3.1.2 Hợp chất D2: 25

3.1.3 Hợp chất D3: 29

3.1.4 Hợp chất D4: 32

3.1.5 Hợp chất D5: 36

3.2 Xác định hàm lượng các hợp chất phân lập được bằng phương pháp LC/MS 40 3.2.1 Xác định hàm lượng chất D1 (kí hiệu PE1) 40

3.2.2 Xác định hàm lượng chất D2 (kí hiệu PE2): 42

KẾT LUẬN: 45

Trang 5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Proton Magnenic Rosonance

Spectrocopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

cacbon 13

DEPT Distortionless Enhancement

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Connectivity

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

nhiều liên kết

Single-Quantum Connectiv ity

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Trang 6

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá kim giao 17

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn diclometan của lá kim giao 18

Trang 7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây kim giao - Nageia fleuryi 3

Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất D1 21

Hình 3.2 Phổ 1 H-NMR của D1 22

Hình 3.3 Phổ 13 C-NMR của D1 22

Hình 3.4 Phổ HSQC của D1 24

Hình 3.5 Phổ HMBC của D1 24

Hình 3.6 Phổ NOESY của D1 25

Hình 3.7 Cấu trúc của D2 25

Hình 3.22 Phổ NOESY của D4 36

Hình 3.28 Diện tích pic chất D1 (PE1) trên mẫu tổng 42

Hình 3.29 Diện tích pic chất D2 (PE2) trên mẫu tổng 44

Trang 8

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1.1 Số liệu phổ hợp chất D1 và chất tham khảo 23

Bảng 3.2.1 Kết quả đo phổ LC/MS của mẫu PE1 40

Bảng 3.2.2: Kết quả phân tích phương sai 41

Bảng 3.2.3 Kết quả định lượng của mẫu 1 42

Bảng 3.2.4 Kết quả đo phổ LCMS của mẫu PE2 42

Bảng 3.2.5 Kết quả phân tích phương sai 43

Bảng 3.2.6 Kết quả định lượng của mẫu D2 44

Trang 9

DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1 Phổ 1 H-NMR của D1 1 - PL

Phụ lục 2 Phổ 13 C-NMR của D1 1 - PL

Phụ lục 3 Phổ HSQC của D1 2 - PL Phụ lục 4 Phổ HMBC của D1 2 - PL Phụ lục 5 Phổ NOESY của D1 3 - PL Phụ lục 6 Phổ 1 H-NMR của D2 3 - PL

Phụ lục 8 Phổ HSQC của D2 4 - PL Phụ lục 9 Phổ HMBC của D2 5 - PL Phụ lục 10 Phổ 1 H-NMR của D3 5 - PL

Phụ lục 12 Phổ HSQC của D3 6 - PL Phụ lục 13 Phổ HMBC của D3 7 - PL Phụ lục 14 Phổ 1 H-NMR của D4 7 - PL

Phụ lục 16 Phổ HSQC của D4 8 - PL Phụ lục 17 Phổ HMBC của D4 9 - PL Phụ lục 18 Phổ NOESY của D4 9 - PL Phụ lục 19 Phổ 1 H-NMR của D5 10 - PL

Phụ lục 21 Phổ HSQC của D5 11 - PL Phụ lục 22 Phổ HMBC của D5 11 - PL

Trang 10

HV: Nguyễn Duy Hải 1

Mở đầu

Hiện nay, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên đang ngày càng được ưa chuộng do những đặc tính nổi bật của chúng như: ít độc, ít gây phản ứng phụ, dễ hấp thu Từ ngàn xưa ông cha ta đã sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cây cỏ

để chữa bệnh, bồi bổ cơ thể, hay tạo mùi thơm Do đó ngày nay các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thực vật và động vật đang nhận được sự quan tâm rất lớn

từ giới khoa học Trong tương lai, các hợp chất có hoạt tính sinh học sẽ đóng vai trò rất quan trọng, là các yếu tố khởi đầu cho việc tổng hợp nên các loại dược phẩm mới có tác dụng tốt hơn

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới, có khí hậu nóng, độ ẩm cao, lượng mưa lớn, là những điều kiện rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các loài thực vật Với hệ thực vật phong phú và đa dạng khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch, trong đó có tới 4.000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược, điều này là một tiền đề lớn cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị cao của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lí và có hiệu quả có ý nghĩa đặc biệt

quan trọng Kim giao hay còn gọi Kim giao núi đá (danh pháp khoa học Nageia

fleuryi hay Podocarpus fleuryi) là một loài thực vật trong họ Podocarpaceae Lá

loài này được dân gian dùng sắc uống chữa ho ra máu, sưng cuống phổi và dùng làm thuốc giải độc…

Ở Việt Nam, chưa thấy có công bố nào về thành phần hóa học của loài này Trên thế giới, năm 1990 và 1991 nhóm tác giả Xu Ya-ming và cộng sự đã công bố

cấu trúc của 16 hợp chất được phân lập từ loài Podocarpus fleuryi Năm 2013,

Lan-Chun Zhang và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất diterpenoid mới Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thư HL-60, SMMC-772, A-549, MCF-7 và SW480 cho thấy hợp chất fleuryinol B và 19-hydroxyferruginol

có hoạt tính ở mức độ trung bình với giá trị IC50 nằm trong khoảng 14-38 µM Luận văn này tập trung nghiên cứu phân tích cấu trúc và xác định hàm lượng

một số hợp chất diterpenoid được phân lập từ cây Kim giao (Nageia fleuryi), có ý

Trang 11

nghĩa quan trọng giúp làm sáng tỏ thành phần hóa học và tìm kiếm những hợp chất

có hoạt tính sinh học phục vụ cuộc sống

Nội dung nghiên cứu

1, Nghiên cứu phân lập một số hợp chất diterpenoid từ loài Kim giao

2, Phân tích cấu trúc và xác định hàm lượng các hợp chất diterpenoid phân lập được

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Kim Giao

1.1.1 Vài nét về thực vật

Hình 1.1 Cây kim giao - Nageia fleuryi

Chi Kim giao (Nageia) là một chi thực vật nhỏ nằm trong họ Thông tre

(Podocarpaceae) Một vài phân loại khoa học trước đây xếp chi Kim giao vào

chi Thông tre (Podocarpus) Đến năm 1987 thì người ta bắt đầu tách riêng chi Kim giao (Nageia)

Ở Việt Nam, chi Kim giao được ghi nhận có 3 loài là: Kim giao đế mọng

(Nageia wallichiana hay Podocarpus wallichiana), Kim giao hạt to (Nageia fleuryi hay Podocarpus fleuryi) và Kim giao hạt nhỏ (Nageia nagi hay Podocarpus nagi)

Cây kim giao hạt to (Nageia fleuryi) là một loài cây thân gỗ nhỡ cao từ

15-25m Thân thường thẳng và tán cây hình tháp Các cành nhánh của cây thường mọc ngang và rủ xuống Vỏ thân cây màu nâu xám và thường bong mảng Lá cây thường có hình bầu dục hoặc mũi mác, đầu lá hình nhọn, đuôi lá hình nêm Lá dài 15-18cm, rộng 4-5cm Hệ gân lá thuộc dạng đa gân, đặc trưng của thực vật chi Nageia Bề mặt phiến lá thường trơn bóng như chất liệu da Lá đính đơn và đối

Trang 13

xứng nhau qua cành Nón đực thường đính thành chùm 3-4, nón cái thường mọc đơn lẻ ở nách lá Quả hình trụ đường kính từ 1,5 - 2,5 cm

Cây ra nón vào tháng 5; nón chín vào tháng 11-12

1.1.2 Phân bố và sinh thái

Kim giao được tìm thấy ở miền nam Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Lào, Campuchia, Việt Nam (hầu hết các tỉnh miền núi có địa chất

đá vôi)

Loài ưa phát triển trên đất đá vôi có độ dày tầng đất lớn, thoát nước tốt Ngoại trừ trường hợp đặc biệt về quần hợp đơn loài ở Vườn quốc gia Cát Bà của Việt Nam thì Kim giao là loài thường phân bố hỗn giao với các loài Sến, Táu và Dẻ ở các khu rừng mưa nhiệt đới và á nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 200 - 1000m

Ở Việt Nam, chi này phân bố khá rộng, từ Cao Bằng, Phú Thọ, Hải Phòng, Ninh Bình đến Quảng Nam, Ninh Thuận, Lâm Đồng

1.1.3 Ứng dụng

Lá Kim giao được dân gian dùng sắc uống chữa ho ra máu, sưng cuống phổi

và dùng làm thuốc giải độc…

Gỗ của Kim giao có màu trắng sáng rất đẹp và bền thường được dùng đóng

đồ nội thất Người Á Đông có cả những kinh nghiệm truyền thống về việc dùng gỗ Kim giao để thử độc thực phẩm

Tán và lá cây đẹp nên cây cũng được dùng nhiều cho kiến trúc cảnh quan, trồng ven đường, các công trình tôn giáo như đình chùa, nhà thờ, các công trình mang lối kiến trúc cổ Đông Á

1.1.4 Các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học

Các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần hóa học chính của các

loài thuộc chi Nageia gồm các hợp chất diterpenoid, flavonoid, biflavonoid,

phenolic, lignan, và steroid Nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài thuộc

chi Nageia đã bắt đầu vào giữa những năm 60 của thế kỉ 20 Năm 1968, Yuji

Hayashi và cộng sự đã công bố phân lập được ba hợp chất norditerpenoid

dilactone: nagilactone A (1), B (2), C (3) và một hợp chất bisnorditerpenoid

dilactone: nagilactone D (4) từ lá và hạt loài P nagi [2] Năm 1977, Yuji Hayashi

Trang 14

tiếp tục nghiên cứu hạt và vỏ rễ loài P nagi và công bố 3 hợp chất diterpeniod

dilactone mới: 15-hydroxy-nagilactone D (5), 3β-hydroxy-nagilactone A (6), 1β,2β-dihydroxy-nagilactone D (7) cùng với 6 hợp chất đã biết: 3β,17-diacetyl- nagilactone D (8), 1β,3β,7β-triacetyl-nagilactone A (9), 1β,2β,3β-triacetyl-

nagilactone D (10), nagilactone A (1), B (2) và D (4) [3] Từ hạt loài P nagi, hai

hợp chất 15-methoxycarbonyl-nagilactone D (11) và nagilactone A (12) được Yuji Hayashi và cộng sự phân lập [4] Tiếp tục các

1-deoxy-2α-hydroxy-nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ rễ loài P nagi nhóm tác giả trên thông

báo cấu trúc ba hợp chất mới diterpenoid dilactone dạng 7,8-epoxy-enolide:

16-hydroxy-podolide (13), 2,3-dihydro-16-16-hydroxy-podolide (14) và

2β,3β-epoxy-podolide (15) [5] Cũng từ vỏ rễ loài P nagi, Bai-Ping Ying và cộng sự đã phân

lập được ba hợp chất norditerpene dilactone: 2,3-dehydro-16-hydroxynagilactone F

(16), nagilactone I (17) và 16-hydroxynagilactone E (18) [6] Năm 1990 và 1991

nhóm tác giả Xu Ya-ming, Fang Sheng-ding và He Qi-min đã công bố cấu trúc của

16 hợp chất được phân lập từ loài P fleuryi: palmitic acid (19), sugiol (20), sitosterol (21), nagilactone A (1), nagilactone B (2), isoginkgetin (22), β-sitosteryl

β-stearate (23), 3β,5α-dihydroxy-6-stigmastanone (24), 3β-palmitate (25), daucosterol (26), syringin (27) và 5 hợp chất robustaflavone (28-32) [7] Năm 1991, Isao Kubo và cộng sự đã phân lập được hợp chất 2α-

5α-hydroxy-6-stigmastanone-hydroxynagilactone F (33) từ vỏ rễ loài P nagi và kết quả thử nghiệm hoạt tính

kháng nấm cho thấy hợp chất này có hoạt tính đối với chủng nấm S cerevisiae (MIC 800 µg/ml) [8] Từ lá loài P nagi, bảy hợp chất được phân lập: 3-deoxy-2α-

hydroxy-nagilactone E (34), 3-epi-nagilactone C (35), 15-methoxy-nagilactone D (15), sugiol (20), nagilactone A (1), nagilactone C (3), vomifoliol (36) [9] và từ

vỏ rễ loài này, sáu hợp chất: nagilactone J (37), nagilactone C (3), nagilactone D (4), nagilactone I (17), 16-hydroxynagilactone E (18) và vomifoliol (36) đã được

phân lập [10]

Trang 15

Một nghiên cứu khác của Isao Kubo về tác dụng kháng khuẩn, sáu hợp chất

diterpenoid: totarol (38), totaradiol (39), 19-hydroxytotarol (40), totaral (41),

Trang 16

4β-carboxy-19-nortotarol (42), sugiol (20) đã được phân lập và thử tác dụng kháng

khuẩn trên 12 chủng, kết quả cho thấy hợp chất totarol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với các vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn

Propionibacterium acnes Đồng thời, totarol, cũng thể hiện hoạt tính mạnh đới 4

chủng vi khuẩn Gram (+) khác là: Streptococcus mutans, Bacillus subtilis,

Brevibacterium ammoniagenes và Staphylocorrur aureus (đây là những chủng vi

khuẩn kháng penicillin) Hoạt kháng khuẩn của totarol được thể hiện mạnh hơn khi

nó kết hợp với một số hợp chất khác Đáng chú ý, hoạt tính của totarol đối với

chủng vi khuẩn Sta aureus tăng lên gấp tám lần khi kết hợp với axit anacardic

Tác động hiệp đồng của axit anacardic và totarol làm cho nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (MBC) của totarol được giảm xuống trong khoảng từ 1,56-0,2 µg/ml [11] Năm 1993, Isao Kubo tiếp tục nghiên cứu tác dụng kháng nấm của ba hợp chất:

2α-hydroxynagilactone F (43), nagilactone E (44) và nagilactone C (3) trên ba

chủng nấm: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae và Pityrosporum ovale Kết quả cho thấy, nagilactone E thể hiện hoạt tính trung bình trên chủng Pit ovale

và yếu trên 2 chủng còn lại Tuy nhiên, khi kết hợp với các hợp chất phenylpropanoid như anethole và isosafrole thì tác dụng kháng nấm tăng lên đáng

kể [12] Một nghiên cứu khác của nhóm tác giả trên đã tiếp tục công bố cấu

trúc của ba hợp chất khung norditerpene dilactone: 1-deoxynagilactone A (45), 1-deoxy-2,3-dehydronagilactone A (46) và 2,3-dehydronagilactone A (47) Từ

hạt loài P nagi, Li-Jang Xuan và cộng sự đã phân lập được năm hợp chất diterpene

dilactone glycoside, nagilactoside C-E (48-50) [13] và nagilactoside F và G

(51-52) [14] Từ vỏ rễ loài P nagi lần đầu tiên hai hợp chất cyclopeptide được phân

lập, và được đạt tên là nagitide A và B (53-54) [15] Một axit béo không bão hòa

phân lập từ hạt P nagi, sciadionic axit (SCA; 5, 11, 14-20:3) đã được Szu-Jung

Chen thử nghiệm tác dụng kháng viêm kết quả cho thấy SCA làm giảm quá trình sản sinh PGE2 (29%), nitric oxide (NO) (31%), interleukin-6 (IL-6) (34%) và khối

u hoại tử một (TNF-α) (14%) Tác dụng ức chế các chất trung gian gây viêm là do SCA làm giảm biểu hiện của cảm ứng của enzym tổng hợp NO (iNOS) và cyclooxygenase-2 (COX-2) và ức chế yếu tố nhân kappa B (NF-B) của quá trình

Trang 17

chuyển vị và phosphoryl hóa protein mitogen-activated protein kinase (MAPK)

[16] Năm 2013, từ cành và lá loài P fleuryi, Lan-Chun Zhang đã phân lập được ba

hợp chất abietane diterpenoid mới: fleuryinol A-C (55-57), cùng với 14 hợp chất

đã biết: 19-hydroxyferruginol (58), lambertic acid (59), inumakiol D (60), totaradiol (39), 19-hydroxytotarol (40), 3-acetoxy-methyl-5-[(E)-3-acetoxypropen-

1-yl)]-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-methoxy-2,3-dihydrobenzofuran (61), divanillyltetrahydrofuran (62), (+)-pinoresinol (63), ligballinol (64), sitostane- 3β,5α,6β-triol (65), ergosta-7,22-dien-3β,5α,6β-triol (66), stigmast-4-ene-3β,6β- diol (67), stigmast-5-ene-3β,7β-diol (68) và ergosterol peroxide (69) Tám hợp chất (55-62) được đáng giá hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào: HL-60,

SMMC-772, A-549, MCF-7 và SW480 kết quả cho thấy hợp chất fleuryinol B

(56) và 19-hydroxyferruginol (58) có hoạt tính trung bình đối với dòng tế bào

SMMC-7721 và A-549 với giá trị IC50 lần lượt là 38 và 14 µM [17] Một nghiên cứu được công bố vào tháng 01 năm 2016 của các nhà khoa học Trung Quốc về

loài P wallichiana cho thấy đã phân lập được bốn hợp chất: sugiol (20), vanillic axit (70), p-hydroxybenzoic axit (71) và 7-ketositosterol (72) Cấu trúc của chúng

được xác đinh bằng các phương pháp phổ NMR và đây là nghiên cứu hóa học đầu tiên về loài này [18]

Trang 18

Trang 19

Từ kết quả tổng quan các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các nghiên cứu chủ yếu của các nhà khoa học Nhật Bản và Trung Quốc Thành phần hóa học của

các loài thuộc chi Nageia khá đa dạng, đồng thời các nghiên cứu về hoạt tính sinh

học đã phát hiện được nhiều hợp chất có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa và diệt tế bào ung thư

Trang 20

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Mẫu thực vật

Mẫu cành và lá cây Kim giao (Nageia fleuryi (Hick.) de Laubenf) thu tại Hải

Phòng vào tháng 6/2016 Tên khoa học được TS Bùi Văn Thanh, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G

F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp

2.2.3 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240- 430 mesh) Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilica Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.)

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ thường được xác định nhờ vào ứng dụng của các phương pháp phổ kết hợp Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà sử dụng các phương pháp phổ cho phù hợp Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác

Trang 21

định cấu trúc hóa học của hợp chất người ta phải dựa vào các phương pháp phổ

khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với phương pháp sắc kí so sánh…

2.3.1 Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựa vào phổ hồng ngoại

có thể xác định các nhóm đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hyđroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O là khoảng 1700-1750 cm-1, của nhóm NH là khoảng 3100-3500 cm-1.v.v…

2.3.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy - MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân

tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó mà người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh, và dựng lại được cấu trúc các hợp chất Hiện nay có rất nhiều phương pháp phổ khối lượng, những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:

+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là

+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với sự chính xác cao

Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ), LC - MS (sắc kí lỏng - khối

Trang 22

phổ) Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất đặc biệt là đối với phân tích thuốc trong ngành dược.v.v…

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là

sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ 1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau nay được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) Ngoài ra đặc trưng của nhân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling)

Trong phổ 1H - NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0- 14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin mà ta xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất

Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng

ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo phổ 13C - NMR

là ppm, với dải thang độ rộng 0- 230ppm

2.3.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau Trên phổ DEPT cacbon bậc 4 không có tín hiệu, tín hiệu CH và CH3 nằm về một phía và của CH2

nằm về một phía trên phổ DEPT 1350 Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH

2.3.3.4 Phổ 2D - NMR

Đây là kĩ thuật phổ 2 chiều cho phép xác định tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kĩ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:

Trang 23

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ một là trục phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác

HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

- Phổ COSY (Correlation Spectroscopy)

Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phân tử được ghép nối với nhau

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)

Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không

kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử bằng việc đưa vào một xung đúng bằng

từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía vế không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu cộng hưởng với cường độ mạnh hơn

Ngoài ra còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể Nhưng phạm vi sử dụng của nó hạn chế vì yêu cầu tiên quyết của phương pháp này là cần phải có đơn tinh thể Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ

Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ người ta còn sử dụng kết hợp với các phương pháp chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tích so sánh kết hợp khác Đặc biệt với phân tử nhiều mạch chính dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chính xác chiều dài các mạch Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác các loại đường cũng

Trang 24

như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến

2.4 Phương pháp định lượng và đánh giá chất sạch bằng LC/MS/MS

Phương pháp này có ưu điểm là nhận diện rất rõ ràng cả về định tính và định lượng, đồng thời các phương pháp này rất nhạy và thích hợp cho việc đánh giá độ sạch của hợp chất

- Thiết lập thông số cho sắc lý lỏng

Các hệ dung môi: acetonitrile/nước (25:75, v/v)

- Thiết lập chương trình chạy

Chạy gradien: hệ thống sắc ký phân tích được thử nghiệm ban đầu với hệ dung môi hữu cơ, tỷ lệ dung môi được lựa chọn qua các bước tối ưu hóa

- Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng

 Bước đầu thiết lập các thông số:

- Cột sắc ký được lựa chọn Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm

- Hệ dung môi hữu cơ ban đầu là nước và ACN, thành phần của pha động bao gồm kênh A : H2O (0,1% axit focmic), kênh B : Acetonitrile

- Detector PDA : bước sóng 225 nm Thể tích mẫu bơm vào máy 5µl

Thông số của detector MS:

Trang 25

- Sử dụng nguồn ion hóa ESI: thông số nhiệt độ khí nito của nguồn 2800C, áp suất khí 30psi, lưu lượng khí 8lit/phút, điện áp của nguồn 4,5Kv, Mod đo negative với các ion định lượng được phân mảnh với năng lượng va chạm (CID) của khí heli trong Trap là 0,7 -1,0 Ampl

- Chuẩn bị mẫu phân tích:

 Cân chính xác mẫu khô (3 lần)

 Chiết siêu âm (3 lần, mỗi lần 30 phút)

 Cô quay thu được cao chiết tổng, cân khối lượng

 Pha cao chiết tổng trong metanol

- Xây dựng đường chuẩn:

Về nguyên tắc phân tích, khi đã định tính được pic nào trên sắc ký đồ tương ứng với chất nào và đã có sắc ký đồ của các mẫu chuẩn với những nồng độ khác nhau thì ta có thể tính ra nồng độ của chất phân tích bằng phương pháp đường chuẩn, cách thức làm như sau:

 Vẽ đồ thị của diện tích pic theo nồng độ, từ đó dùng chương trình bình phương tối thiểu để tìm ra đường hồi quy tuyến tính

 Từ phương trình đường hồi quy dạng A = a + bC trong đó A là diện tích pic;

C là nồng độ của chất phân tích; a, b là hệ số hồi quy Căn cứ vào sắc ký đồ của mẫu, ta có được A của chất cần phân tích, dựa vào phương trình này ta

sẽ suy ra nồng độ của chất cần phân tích trên đường chuẩn

 Từ nồng độ này, căn cứ vào khối lượng hay thể tích mẫu (dịch chiết) cũng như các thể tích pha loãng thì sẽ suy ra hàm lượng của chất cần phân tích trong mẫu

 Trên cơ sở đó, từ chất chuẩn ban đầu với nồng độ tương ứng được pha để tạo dung dịch gốc stock (A1) Từ dung dịch gốc này tiến hành pha một dãy các nồng độ khác nhau (B1  B4) để tiến hành xây dựng đường chuẩn

 Các nồng độ chất chuẩn đã được đo lặp lại 3 lần

 Kết quả phân tích mẫu chất chuẩn ở các nồng độ khác nhau thu được sẽ tiến hành xây dựng đường chuẩn

Trang 26

2.5 Thực nghiệm

2.5.1 Tách, chiết các hợp chất

Bột khô lá cây Kim giao (5 kg) được chiết ngâm 3 lần bằng methanol ngâm chiết với metanol ba lần, thu được 300,0 g cặn chiết metanol Cặn metanol được

hoà tan vào 2 lít nước cất và chiết lần lượt bằng n-hexan, diclometan và etyl axetat

Sau khi loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn n-hexan (50,0 g), diclometan

(90,0 g), etyl axetat (75,0 g) và nước (65,0 g)

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá kim giao

Cặn CH2Cl2 (90 g) được đưa lên cột silica gel chạy gradient với hệ dung môi

rửa giải là n-hexan/axeton (25/1, 10/1, 5/1 và 100 axeton) thu được các phân đoạn

Phân đoạn F8 (15,0 g) lần lượt tiến hành sắc ký cột silicagel pha thường với

hệ dung môi rửa giải là n-hexan/ethyl axetat (8/1, v/v) và sắc ký cột pha đảo YMC

Lớp nước

Cặn EtOAc (75 g)

Cặn nước (65 g) Cặn CH 2 Cl 2 (90 g)

Trang 27

RP 18 hệ dung môi axeton /nước (3/2, v/v) thu được hợp chất D3 (25 mg) và D4

(16 mg)

Phân đoạn F9 (100% axeton, 20 g) lần lượt tiến hành sắc ký cột silicagel pha

thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/ethyl axetat (4/1, v/v) và sắc ký cột

silicagel pha đảo YMC RP 18 hệ dung môi axeton /nước (1/1, v/v) thu được hợp

chất D5 (15 mg)

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn diclometan của lá kim giao

2.5.2 Thông số vâ ̣t lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập

2.5.2.1 12(R),13-dihydroxylabda-8(17),14-dien-19-oic acid (D1): tinh thể màu

trắng Công thức phân tử C20H32O4, M = 336

1H-NMR (500 MHz, DMSO) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO): xem bảng 3.1.1

2.5.2.2 12-oxo-15-hydroxylabda-8(17),13(E)-dien-19-oic acid (D2): tinh thể màu

2.5.2.3 14,15-dihydroxylabda-8(17),12(E)-dien-19-oic acid (D3): tinh thể màu

1 Silica gel CC

n-hexan/ethyl axetat: 4/1

2 YMC RP-18 CC axetone/H 2 O: 1/1

D5

Trang 28

2.5.2.4 16-methyl-12,15-epoxy-8(17),13-labdadien-19-oic acid (D4): tinh thể màu

2.5.2.5 Nagilactone C (D5): tinh thể màu trắng Công thức phân tử C19H22O7, M = 362

2.5.3 Định lượng các hợp chất

2.5.3.2 Xác định hàm lượng chất D1 (kí hiệu PE1)

Mẫu D1 được cân chính xác 10,0 mg cho vào bình định mức (10 ml) sau đó

định mức đến vạch bằng MeOH ta được dung dịch gốc (1mg/ml) Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ: 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 và 0,2 mg/ml, sau

đó chạy lần lượt các dung dịch có nồng độ trên qua hệ thống LC/MS với cột phân tích: Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm

Detector PDA : bước sóng 225 nm Thể tích mẫu bơm vào máy 5µl

Thông số của detector MS :

Sử dụng nguồn ion hóa ESI: thông số nhiệt độ khí nito của nguồn 2800C, áp suất khí 30psi, lưu lượng khí 8lit/phút, điện áp của nguồn 4,5Kv, Mod đo negative

với các ion định lượng được phân mảnh từ m/z 335 và m/z 263 với năng lượng va

chạm (CID) của khí heli trong Trap là 1,0 Ampl

Các nồng độ mẫu D1 chuẩn đã được đo lặp lại 3 lần, kết quả thu được có sự

ổn định rất cao về giá trị tích phân (diê ̣n tích pic), và thời gian lưu (RT) Điều này

Trang 29

chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp mà chúng tôi đã lựa chọn cho

hệ thống LC/MS là phù hợp cho việc phân tích định lượng mẫu D1

2.5.3.2 Xác định hàm lượng chất D2 (kí hiệu PE2)

Chuẩn bị mẫu :

Xây dựng đường chuẩn :

Mẫu D2 được cân chính xác 10,0 mg cho vào bình định mức (10 ml) sau đó

định mức đến vạch bằng MeOH ta được dung dịch gốc (1mg/ml) Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ: 0,01, 0,05, 0,1 và 0,2 mg/ml, sau đó chạy lần lượt các dung dịch có nồng độ trên qua hệ thống LC/MS với cột phân tích: Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm

Detector PDA : bước sóng 225 nm Thể tích mẫu bơm vào máy 5µl

Thông số của detector MS :

Sử dụng nguồn ion hóa ESI: thông số nhiệt độ khí nito của nguồn 2800C, áp suất khí 30psi, lưu lượng khí 8lit/phút, điện áp của nguồn 4,5Kv, Mod đo negative

với các ion định lượng được phân mảnh từ m/z 333 và m/z 271 với năng lượng va

chạm (CID) của khí heli trong Trap là 0,9 Ampl

Các nồng độ mẫu D2 chuẩn đã được đo lặp lại 3 lần, kết quả thu được có sự

ổn định rất cao về giá trị tích phân (diê ̣n tích pic), và thời gian lưu (RT) Điều này chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp mà chúng tôi đã lựa chọn cho

hệ thống LC/MS là phù hợp cho việc phân tích định lượng mẫu D2

Trang 30

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được

3.1.1 Hợp chất D1:

Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất D1

Hợp chất D1 phân lập được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng Trên phổ

1H-NMR của D1 xuất hiện tín hiệu 3 nhóm metyl bậc 3 dưới dạng singlet tại  0,53

(3H, s), 1,10 (3H, s) và 1,12 (3H, s); tín hiệu 3 proton olefin của một nối đôi bị thế

mono cũng được xác định tại  5,93 (1H, dd, J=11,0 Hz và 17,5 Hz), 5,16 (1H, dd,

J=2,0 Hz và 17,5 Hz) và 4,97 (1H, dd, J=2,0 Hz và 11,0 Hz) Bên cạnh đó, tín hiệu

2 proton olefin xuất hiện tại  4,48 (1H, s) và 4,78 (1H, s) được xác định của một nối đôi bị thế hai nguyên tử hidro cùng phía và một proton oximetin xuất hiện tại

3,16 (1H, dd, J = 10,0 Hz và 17,5 Hz) Phổ 13C-NMR và DEPT của D1 xuất hiện

tín hiệu 20 nguyên tử carbon, trong đó có 3 nhóm metyl, 8 nhóm metilen, 4 nhóm metin và 5 nguyên tử không liên kết với hidro (bảng 3.1.1) Các dữ kiện phổ NMR

trên cho thấy D1 có cấu trúc dạng bicyclic-labdane diterpenoid skeleton với một

nhóm allylic hydroxy (CH2=CH-C(OH) So sánh số liệu 13C NMR của D1 với

12,13-dihydroxy-8(17),14-labdadien-19-oic acid [23] cho thấy hoàn toàn tương

đồng ở tất cả các vị trí Thêm vào đó, cấu trúc phân tử của D1 còn được xác định

bằng các tín hiệu trên phổ HSQC, COSY và HMBC (Hình 3.1) Trên phổ HMBC, tương tác giữa H-18 ( 1,10) với cacbon C-3 ( 37,9)/C-4 ( 43,4)/C-5 ( 55,5)/C-

19 ( 179,0) và H-20 ( 0,53) với cacbon C-1 ( 39,2)/C-5 ( 55,5)/C-9 (

51,0)/C-10 ( 39,9) cho phép xác định nhóm COOH tại C-19; tương tác HMBC giữa H-17 ( 4,48/4,78) với cacbon C-6 ( 25,9)/C-8 ( 148,8)/C-9 ( 51,0) khẳng định tồn tại

Trang 31

nối đôi giữa C-8 và C-17; tương tác HMBC giữa proton H-15 ( 4,97/5,16) với cacbon C-13 ( 74,8)/C-14 ( 144,7), giữa H-14 ( 5,93) với cacbon C-13 ( 74,8)/C-16 ( 28,8) và giữa H-16 ( 1,12) với cacbon C-12 ( 74,80)/C-14 ( 144,7) cho phép khẳng định có hai nhóm hydoxyl liên kết tại C-12, C-13 và nối đôi

tại C-14, C-15

Trang 32

Bảng 3.1.1 Số liệu phổ hợp chất D1 và chất tham khảo

Position ≠C C a,b DEPT H a, c Mult (J= Hz) HMBC (HC)

1 39.3 39.2 CH 2 1.88 */2.31 (d, 12.5)

1.40 (brd, 13.5) 1.78 (brd, 12.0)

a Đo trong DMSO-d6; b 125 MHz, c 500 MHz; ≠C số liệu của

12(R),13(S)-dihydroxylabda-8(17),14-dien-19-oic acid trong CDCl3 [23]

Trang 33

Hình 3.4 Phổ HSQC của D1

Hình 3.5 Phổ HMBC của D1

Trên phổ NOESY của D1, tín hiệu tương tác giữa H-5 và H-18 cho biết cấu

hình α của H-18 Cấu hình α của H-16 được xác định dựa vào tương tác giữa H-9 và

H-16 Cấu hình tuyệt đối của D1 tại C-12 được xác định dựa vào so sánh số liệu

Trang 34

phổ 1H-NMR với các hợp chất đã được tổng Tại C-17 hai proton olefin  4,48 (Ha17) và 4,78 (Hb-17) có =0,3 ppm thì C-12 được xác định là 12(R) (nếu 0,2 ppm thì C-12 được xác định là 12(S)) [24, 26, 27] Từ những phân tích dữ kiện phổ

-trên, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo hợp chất D1 được xác định là

12(R),13-dihydroxylabda-8(17),14-dien-19-oic acid, có công thức phân tử là

C20H32O4, M=336

Hình 3.6 Phổ NOESY của D1

3.1.2 Hợp chất D2:

Hình 3.7 Cấu trúc của D2

Định dạng
Số trang	68
Dung lượng	3,49 MB