Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

Xuất phát từ thực tiễn đó, Đề tài nghiên cứu “Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc” được tiến hành với mục tiêu: 1.. Đánh giá sự p

-*** -VŨ ĐỨC ANH

Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

Chuyên ngành : Hóa sinh y học

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS TRẦN HUY THỊNH

HÀ NỘI - 2017

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lờicảm ơn chân thành tới:

TS.BS Trần Huy Thịnh, Phó Trưởng Bộ môn Hoá sinh,Trường Đại học Y Hà Nội, người hướng dẫn khoa học, ngườiThầy đã trực tiếp chỉ bảo, tận tình truyền đạt những kiếnthức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợitrong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thểhoàn thành luận văn này

GS.TS.BS Tạ Thành Văn, Phó Hiệu trưởng Trường Đạihọc Y Hà Nội, Trưởng Bộ môn Hoá sinh, Giám đốc Trung tâmnghiên cứu Gen- Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quátrình học tập tại bộ môn

PGS.TS.BS Phạm Trọng Văn, Trưởng Bộ môn Mắt,Trường Đại học Y Hà Nội, Trưởng Khoa Tạo hình- Thẩm mỹBệnh viện Mắt Trung Ương, chủ nhiệm đề tài cấp bộ

“Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh Unguyên bào võng mạc và xác định yếu tố di truyền bằng kỹthuật sinh học phân tử” đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiệnthuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các Thầy Cô, cán bộgiảng dạy, kỹ thuật viên và y công Bộ môn Hoá sinh TrườngĐại học Y Hà Nội, đã chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quátrình học tập tại bộ môn

Protein, Trường Đại học Y Hà Nội cùng toàn thể cán bộ Trungtâm nghiên cứu Gen- Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đãtận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu,Phòng Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạođiều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các bệnh nhân vàngười tình nguyện đã giúp đỡ để tôi có thể thực hiện đượcnghiên cứu này

Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôidưỡng và tình yêu thương của Cha Mẹ tôi, cũng như sự giúp

đỡ của các anh em trong gia đình, những người đã luôn ởbên tôi, là chỗ dựa vững chắc cho tôi yên tâm học tập vàhoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm

Bác sỹnội trú

VŨ ĐỨCANH

Tôi là: Vũ Đức Anh, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40 Trường Đại học Y HàNội, chuyên ngành Hóa Sinh, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa Thầy: TS.BS Trần Huy Thịnh

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sởnơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật vềnhững cam kết này

Hà Nội, Ngày 16 tháng 9 năm 2017

UNBVM U nguyên bào võng mạc

ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate

EMQN European Molecular Genetics Quality Network

(Mạng lưới Chất lượng Phân tử châu Âu)DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotid-5-triphosphate

IARC International Agency for Research on Cancer

(Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế)PCR Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch

đại chuỗi gen)

UICC Union for International Cancer Control (Liên

minh Kiểm soát Ung thư Quốc tế )WHO World health organization (tổ chức y tế thế

giới)

Bảng 1.1 Khả năng di truyền của UNBVM

Bảng 2.2 Thành phẩn của phản ứng PCR

37

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR

38

Bảng 3.1 Đặc điểm về nhóm tuổi thời điểm phát hiện bệnh của bệnh nhân

UNBVM

41

Bảng 3.2 Đặc điểm về thể bệnh của bệnh nhân UNBVM

42

Bảng 3.3 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA sau tách

chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân 44

Bảng 3.4 Bảng tổng hợp các đột biến tại exon 10, 14 và 20

50

Bảng 4.1 Các phương pháp xác định đột biến gen RB1

Bảng 4.2 Tỷ lệ phát hiện đột biến trên gen RB1 ở các bệnh nhân UNBVM

được báo cáo từ các quốc gia khác nhau 54

Hình 1.6 Gen RB1 21

Hình 1.7 Chức năng của protein RB 22

Hình 1.8 Các bước cơ bản của phản ứng PCR 28

Hình 3.1 Đặc điểm về giới của nhóm bệnh nhân UNBVM 41

Hình 3.2 Kết quả đo quang nồng độ DNA của bệnh nhân mã số (MS)RB75 40

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 10 của gen RB1 42

Hình 3.4 Giải trình tự exon 10 gen RB1 của bệnh nhân RB79 43

Hình 3.5 Giải trình tự exon 14 gen RB1 của bệnh nhân RB57 44

Hình 3.6 Giải trình tự exon 20 gen RB1 của bệnh nhân RB29 44

Hình 3.7 Giải trình tự exon 20 gen RB1 của bệnh nhân RB68 45

Hình 3.8 Số lượng đột biến được phát hiện trên các exon 10, 14, 20 46

Hình 3.9 Phân bố các dạng đột biến trên các exon 10, 14, 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

U nguyên bào võng mạc (Retinoblastoma) là một trong những bệnh lý

ác tính thường gặp nhất trong ổ mắt ở trẻ nhỏ và trẻ sơ sinh [1] Dạng ungthư này phát triển ở võng mạc mắt, tại các mô nhạy cảm đặc biệt với ánhsáng, là những mô nhận biết ánh sáng và màu sắc phía sau của mắt, với tầnsuất thường gặp từ 1/15.000-1/18.000 trẻ sơ sinh sống [1][2] U nguyên bàovõng mạc (UNBVM) chỉ đứng hàng thứ hai sau u ác tính ở hắc mạc về tầnsuất xuất hiện của các khối u trong ổ mắt [3] Bệnh biểu hiện bệnh thườngrất sớm, độ tuổi trung bình được chẩn đoán là 18 tháng, UNBVM thể mộtbên thường được chẩn đoán trên dưới 24 tháng và những trường hợpUNBVM thể hai bên thậm chí thường được chẩn đoán trước 12 tháng [3].Bệnh thường để lại nhiều biến chứng về mắt, phần lớn các trường hợp đượcphát hiện muộn, khi bệnh đã lan rộng hay di căn, phải loại bỏ nhãn cầu, nạovét hốc mắt, làm mất thị lực và đe dọa đến tính mạng của trẻ Nếu không tửvong, xương mặt trẻ cũng bị biến dạng ảnh hưởng đến tinh thần và chấtlượng cuộc sống của trẻ Chẩn đoán sớm và các phương thức điều trị mớigiúp cải thiện tiên lượng sống cho bệnh nhân UNBVM, lên tới 90% [2][5]

U nguyên bào võng mạc có liên quan tới đột biến gen RB1, hiếm hơn là

sự khuếch đại gen ung thư MYCN [4][7] Gen RB1 là một gen ức chế khối

u có chức năng chính điều chỉnh chu kỳ tế bào, nằm ở nhánh dài nhiễm sắcthể 13q14, dài 185 kb, gồm 27 exon mã hóa cho protein RB Protein RBđiều chỉnh chu kỳ tế bào bằng cách hoạt động như một chất ức chế phiên

mã (nhắm vào mục tiêu là các yếu tố phiên mã E2F) Các tế bào phân chiakhông thể xâm nhập vào giai đoạn S của phân bào và quá trình phân bào

không được diễn ra Trẻ mắc UNBVM khi cả hai alen của gen RB1 bị bất

hoạt và protein RB bị mất hoàn toàn chức năng [4][7]

Các nghiên cứu đã công bố có trên 900 đột biến gen RB1 là cơ sở dữ

liệu quan trọng cho tư vấn di truyền và cho biết đặc điểm giữa mối quan hệ

kiểu gen và kiểu hình của bệnh Gần 40% đột biến gen RB1 tái diễn và tập

trung tại 16 điểm bao gồm 12 đột biến vô nghĩa (nonsense), 02 đột biến sainghĩa (missense), 03 đột biến vị trí nối (splicing) Những đột biến còn lại

nằm rải rác trên gen RB1 và tỷ lệ gặp cao nhất ở các exon 9, 10, 14, 17, 18,

20 và 23 [4],[52] Sự hiểu biết về các đặc điểm y học phân tử của bệnhcùng với những tiến bộ của các kỹ thuật y học phân tử có ý nghĩa to lớntrong việc làm sáng tỏ nguyên nhân và cơ chế gây bệnh, góp phần kiểmsoát bệnh [6] Hiệu quả của mô hình chẩn đoán y học phân tử về UNBVMcó thể làm giảm tổng chi phí cho vấn đề chăm sóc người bệnh, tránh đượcnhững nỗi muộn phiền lo âu cho gia đình [8] Mạng lưới Chất lượng Phân

tử châu Âu (EMQN) phát triển “hướng dẫn thực hành tốt nhất cho phântích RB” Theo mô hình này, máu tĩnh mạch ngoại vi được sử dụng để sànglọc tìm đột biến ở bệnh nhân UNBVM thể 2 bên và những người trong giađình với bệnh nhân UNBVM thể một bên, từ đó có những biện pháp quản

lý bệnh nhân và tư vấn di truyền thích hợp nhằm ngăn ngừa và giảm tỷ lệmắc bệnh [9]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến UNBVM còn rất ít, chủ yếu

là các nghiên cứu về lĩnh vực lâm sàng nên số lượng nghiên cứu về gen liênquan tới UNBVM còn chưa nhiều, thông tin còn hạn chế

Xuất phát từ thực tiễn đó, Đề tài nghiên cứu “Xác định đột biến trên

một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc” được tiến hành với mục tiêu:

1. Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc bằng kỹ thuật giải trình tự gen.

2. Đánh giá sự phân bố, tỷ lệ và các dạng đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm bệnh u nguyên bào võng mạc

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh u nguyên bào võng mạc

Năm 1657, Peter Pawlus Amsterdam lần đầu tiên mô tả lâm sàng và giảiphẫu bệnh UNBVM ở trẻ nhỏ có khối u được mô tả “là một chất tương tựnhư mô não trộn lẫn với máu và giống như đá dăm” [10]

Năm 1805, William Hey báo cáo một bệnh án UNBVM hai bên mắt và

sử dụng thuật ngữ “mắt mèo mù” Ông mô tả một khối u ảnh hưởng đếntoàn bộ nhãn cầu và phá hủy tổ chức nhãn cầu [11]

Năm 1809, một nhà phẫu thuật người Scotland tên là James Wardrop đãviết một chuyên khảo, mô tả tập hợp con các ca lâm sàng về khối u sùi loétphân biệt chúng với các trường hợp “ung thư mềm” khác, Sarcom tủyxương, hoặc viêm Ông là người đầu tiên phát hiện ra UNBVM như là mộtkhối u riêng lẻ, phát sinh ban đầu từ võng mạc [12]

Virchow vào năm 1864 đã sử dụng cái tên: u thần kinh đệm võng mạcbởi vì có sự giống nhau giữa các khối UNBVM với các khối u thần kinhđệm nội sọ Verhoeff, năm 1922 đã quan sát nguồn gốc của võng mạc và sựhiện diện của tính chất chưa trưởng thành, những tế bào chưa phát triển này

đã hình thành lên khối u và được gọi là UNBVM (Retinoblastoma) Năm

1926, hội nhãn khoa Mỹ đã chấp nhận thuật ngữ retinoblastoma và cácthuật ngữ cũ để mô tả UNBVM như: khối u thần kinh đệm võng mạc, cáckhối u sùi loét, bị bác bỏ [13]

1.1.2 Dịch tễ U nguyên bào võng mạc

U nguyên bào võng mạc phát triển ở võng mạc mắt, tại các mô nhạycảm đặc biệt với ánh sáng là những mô nhận biết ánh sáng và màu sắc phísau của mắt, với tần suất thường gặp từ 1/15.000-1/18.000 trẻ sơ sinh sống[1],[2] Trên thế giới, 95% bệnh UNBVM gặp ở trẻ dưới 5 tuổi [22] Độtuổi trung bình được chẩn đoán là 18 tháng, UNBVM thể một bên thườngđược chẩn đoán trên dưới 24 tháng và những trường hợp UNBVM thể haibên thường được chẩn đoán trước 12 tháng [3]

U nguyên bào võng mạc chỉ đứng hàng thứ hai sau u ác tính ở hắc mạc

về tần suất xuất hiện của các khối u trong ổ mắt Chưa tìm thấy mối liênquan giữa các yếu tố bẩm sinh về giới và chủng tộc tác động vào U nguyênbào võng mạc [3]

Ở Việt Nam chưa có điều kiện thống kê chính xác các con số, tuy nhiêntrên thực tế số bệnh nhân đến viện điều trị trong những năm gần đây tănghơn nhiều so với các năm trước Năm 1975, Hà Huy Tiến nghiên cứu trongvòng 10 năm (1963 – 1973) trung bình mỗi năm có 18 ca [25] TheoNguyễn Xuân Tịnh trung bình mỗi năm có 31 ca (nghiên cứu trong 5 năm

từ năm 1988 đến năm 1992) [26] UTVM là một bệnh lý hiếm gặp,tuy nhiên số lượng bệnh nhân tới khám và điều trị tại bệnhviện Mắt Trung ương ngày càng tăng, năm 2005 chỉ có 14bệnh nhân trong vòng 1 năm, nhưng tới năm 2013 số lượngbệnh nhân 52 trẻ tới khám và điều trị [24]

1.1.3 Biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh UNBVM

a) Triệu chứng lâm sàng.

Ở trẻ nhỏ có tiền sử gia đình, bệnh có thể phát hiện ở giai đoạn rất sớmnhờ thăm khám đáy mặt sàng lọc khi mê Ở những trẻ không có tiền sử giađình, dấu hiệu phổ biến đưa bệnh nhân đến khám là đồng tử trắng và lác

- Đồng tử trắng hay dấu hiệu “phản xạ mắt mèo”, “mắt mèo mù” là dấuhiệu kinh điển ánh phản chiếu màu trắng của khối u qua đồng tử.

- Lác là triệu chứng hay gặp thứ hai sau dấu hiệu đồng tử trắng

- Dị sắc mống mắt cũng là một biểu hiện khá hay gặp, có thể do biến đổisắc tố nhưng thường là do tân mạch ở mống mắt gây ra mống mắt có màu

đỏ, khi tân mạch vỡ sẽ gây xuất huyết tiền phòng

- Ít khi bệnh nhân được đưa đến vì một rung giật nhãn cầu hoặc nhãncầu phình dãn dạng mắt trâu

- Với những trường hợp đến muộn thường có biểu hiện giả viêm nhưmắt đỏ, giác mạc phù, giả mù tiền phòng, tăng nhãn áp, thậm chí là lồi mắthoặc u đã xuất ngoại vào hốc mắt

Hình 1.3 Đồng tử màu trắng trong UNBVM

b) Cận lâm sàng

- Siêu âm: có thể phát hiện được hình ảnh khối u không đều, có âm vangmạnh hơn dịch kính và có những chấm canxi hóa (giúp phân biệt khối u vớinhững tổn thương khác) Siêu âm có thể phát hiện được hiện tượng xâm lầnvào trong dịch kính hay ra ngoài vào khoang dưới võng mạc, khu trú vị trí

và đánh giá được kích thước khối u, tuy nhiên do độ phân giải kém nênsiêu âm không phân biệt được hiện tượng thâm nhiễm hắc mạc hay thị thầnkinh, vết canxi lớn cũng có thể gây trở ngại cho việc đánh giá đĩa thị

- Chụp cắt lớp vi tính (CT): chỉ xác định hiện tượng canxi hóa mà khôngxác định thâm nhiễm hắc mạc, củng mạc hay thị thần kinh Ngày nay, mọitrung tâm u bướu trên thế giới đều thống nhất rằng, UNBVM đặc biệt là thể

di truyền dễ có nguy cơ ung thư thứ phát nếu lạm dụng tia X

- Chụp cộng hưởng từ (MRI): MRI không có tính đặc hiệu cho chẩnđoán UNBVM vì không nhạy với ổ lắng đọng canxi Tuy nhiên có ý nghĩaquan trọng chẩn đoán nguy cơ xấm lấn để có chiến lược điều trị phù hợp vàthường an toàn hơn CT

- Giải phẫu bệnh: UNBVM là khối u nguyên bào thần kinh ác tính kémbiệt hóa, nhiều hình ảnh phân bào Các tế bào biệt hóa xếp thành hình ống(hoa Flexner Wintersteiner) và lòng ống có nhiều tua sợi thần kinh Khối ukhi phát triển mạnh thường thiếu máu gây hoại tử Có trường hợp u tự thoáitriển do hoại tử, tắc động mạch và teo nhãn cầu Hiện tượng tế bào chết lậptrình khá phổ biến Canxi hóa là dấu hiệu đặc thù nhưng không rõ nguyênnhân

+ Với những trường hợp đến muộn có thể có các triệu chứng như mắt

đỏ, giác mạc phù, giả mù tiền phòng, giả viêm màng bồ đào có nốt u hạthoặc lồi mắt

- Cận lâm sàng:

+ Siêu âm, CT scanner, MRI: hình ảnh u nội nhãn, hình ảnh vôi hóa.+ Giải phẫu bệnh có vai trò khẳng định chẩn đoán đánh giá nguy cơxấm lấn của khối u

b) Chẩn đoán giai đoạn:

* Để đánh giá mức độ tiến triển của u người ta chia quá trình phát triểncủa u thành nhiều giai đoạn Theo Resse – Ellsworth phân chia UNBVM ralàm 5 giai đoạn [29]

- Giai đoạn I: Một hoặc nhiều khối u dưới 4 đường kính gai thị ởxích đạo hoặc sau xích đạo

- Giai đoạn II: Một hoặc nhiều khối u có kích thước từ 4 – 10 đườngkính gai thị ở xích đạo hoặc sau xích đạo

- Giai đoạn III: U đơn độc trên 10 đường kính gai thị ở sau xích đạo

- Giai đoạn IV: Nhiều u rải rác, một số trên 10 đường kính gai thị,mọi tổn thương lan ra trước tới vùng Ora Serrata

- Giai đoạn V: U lan tỏa, chiếm hơn một nửa võng mạc U xâm lấnvào dịch kính

* Ở Việt Nam, tại bệnh viện Mắt Trung Ương thường sử dụng phânloại của Knapp chia UNBVM làm 4 giai đoạn [4]

- Giai đoạn I: U còn nhỏ, khu trú ở võng mạc

- Giai đoạn II: U đã to, xâm chiếm buồng dịch kính hoặc lan rộng ra

cả màng bồ đào, có thể tăng nhãn áp, thoái hóa mống mắt, kích thích phầntrước nhưng u vẫn còn trong nội nhãn

- Giai đoạn III: Tế bào ung thư phá vỡ thành nhãn cầu lan vào hốcmắt, thị thần kinh.

- Giai đoạn IV: Tế bào ung thư di căn đến hạch trước tai, hạch dướihàm, vào thành xương hốc mắt hoặc các bộ phận trong cơ thể

c) Chẩn đoán thể lâm sàng:

* Thể viêm màng bồ đào:

Phần lớn các viêm màng bồ đào trong UNBVM thường xuất hiện vàogiai đoạn muộn Khi khối u đã lớn, u bị hoại tử, giải phóng các chất độcgây nên một viêm màng bồ đào dị ứng Tuy nhiên trong y văn đã báo cáonhiều trường hợp UNBVM có biểu hiện như một viêm màng bồ đào ngay

từ đầu và chẩn đoán thường bị nhầm [30]

* Thể UNBVM ở người lớn:

U nguyên bào võng mạc xuất hiện ở người lớn là một ngoại lệ hiếmgặp, tuy vậy năm 1919 Maghy đã báo cáo một trường hợp UNBVM ở bệnhnhân nữ 20 tuổi Đến nay có khoảng 22 trường hợp UNBVM xuất hiện ởbệnh nhân trên 20 tuổi [31] Ở viện mắt năm 1975, Hà Huy Tiến đã báo cáomột bệnh nhân UNBVM 21 tuổi [25] Bệnh nhân này bị chẩn đoán nhầm làviêm màng bồ đào tăng nhãn áp và chỉ được xác định nhờ xét nghiệm giảiphẫu bệnh nhãn cầu sau khi cắt bỏ

Một số ý kiến cho rằng UNBVM ở người lớn có thể là sự tái hoạt củamột UNBVM đã thoái triển Năm 1975, Hà Huy Tiến đã nhận định:UNBVM ở người lớn tuổi vốn là một UNBVM bẩm sinh nhưng tiến triểnchậm và bộc lộ rõ khi có thêm những điều kiện thuận lợi khác (như viêmmàng bồ đào…) [25]

* Thể UNBVM ba bên:

Là thể UNBVM hai mắt kết hợp với u tuyến tùng [32] Nghiên cứucho thấy kết quả mô học của tuyến tùng tương đồng với UNBVM và khối utuyến tùng phát triển độc lập với UNBVM [33]

* UNBVM thoái triển tự nhiên:

U nguyên bào võng mạc thoái triển tự nhiên được cho là xảy ra khimột phần hoặc hoàn toàn khối u ác tính biến mất mà không cần điều trịhoặc liệu pháp điều trị không đủ để gây ảnh hưởng đến khối u [34] Bệnhhiếm gặp, mỗi năm trên thế giới có khoảng 20 trường hợp được báo cáotrong y văn [35],[36] Cho đến nay cơ chế gây ra UNBVM thoái triển vẫnchưa rõ ràng, có người cho rằng do hiện tượng miễn dịch hoặc do thiếumáu tưới tổ chức u

d) Chẩn đoán phân biệt: Cần phân biệt U nguyên bào võng mạc với

một số bệnh mắt trẻ em khác cũng có dấu hiệu đồng tử trắng

- Bệnh Coats: những biến đổi mạch máu (giãn mạch) ở ngoại vi võng mạc,dịch dưới võng mạc nhiều, không có can xi, thường ở hai mắt, không cóyếu tố di truyền

- Bệnh võng mạc trẻ đẻ non: gặp ở trẻ đẻ non có cân nặng khi sinh thấp vàđược điều trị bổ sung oxy Tăng sinh xơ mạch và bong võng mạc làm chođồng tử có màu trắng

- Tồn lưu tăng sinh dịch kính nguyên thủy: tăng sinh mạch và thần kinh đệmtrong dịch kính, nhãn cầu nhỏ, đục thể thủy tinh, các nếp thể bị bị kéo dài

ra (thấy rõ khi giãn đồng tử), glôcôm, bong võng mạc

- Viêm màng bồ đào bẩm sinh: thường có dính bờ đồng tử, có thể kèm theođục thể thủy tinh

- Đục thể thủy tinh bẩm sinh: đục ngay sau mống mắt, có thể kèm theo lác,rung giật nhãn cầu

- Bệnh giun toxocara: có hình ảnh một u hạt trong võng mạc hoặc một viêmnội nhãn, các dải xơ co kéo trong dịch kính có thể gây bong võng mạc

e) Điều trị:

Có nhiều phương pháp áp dụng điều trị UNBVM, tùy thuộc vàoUNBVM một bên hay hai bên, giai đoạn nào của bệnh Nguyên tắc phải

điều trị kết hợp phẫu thuật, hóa trị liệu và vật lý trị liệu, phối hợp đa chuyênngành để đạt hiệu quả tối đa cho bệnh nhân.

- Nếu khối u lớn và đe dọa sinh mạng thì cần phẫu thuật cắt bỏ nhãn cầu vớithị thần kinh dài Tiên lượng tốt nếu u chưa phát triển ra ngoài qua thị thầnkinh

- Nếu u còn nhỏ thì có thể điều trị bảo tồn bằng một trong các phương pháp:Lạnh đông: chỉ định cho khối u nhỏ và ở phía trước Quang đông hồ quangxenon hoặc laser (argon và krypton): chỉ định cho u nhỏ và ở phía sau Tiaxạ: chiếu từ xa (chỉ định cho u lớn và ở phía sau) hoặc dùng tấm đồng vịphóng xạ (thường dùng cobalt-60, iodine-125, ruthenium-106, và iridium-192) cố định trên củng mạc tại vị trí khối u (chỉ định cho u kích thước trungbình)

- Liệu pháp hóa học: dùng cho những trường hợp đã di căn hoặc có nhiềunguy cơ di căn toàn thân Những thuốc thường dùng là Vincristine sulfate(Oncovin), Doxorubicine (Adriamycin), Cyclophosphamite (Cytoxane),Carboplatin (Paraplatin)

1.1.5 Đặc điểm di truyền, nguồn gốc tế bào U nguyên bào võng mạc

a) Đặc điểm di truyền

Tư vấn về mặt di truyền của UNBVM sẽ cung cấp nhữngthông tin hữu ích cho bệnh nhân và gia đình về những đặcđiểm của bệnh, đặc tính về di truyền qua các thế hệ, nguy

cơ đối với các thành viên trong gia đình, và thậm chí có thểgợi ý cho kế hoạch sinh con

Cả hai alen của gen RB1 phải bị đột biến là điều kiệnhình thành nên khối UNBVM từ những tế bào võng mạcđang phát triển Tuy nhiên đột biến gen RB1 có đặc điểm

giống như là một gen trội, bởi vì các đột biến gen RB1 ở các

cá thể mang đột biến dị hợp tử sẽ luôn luôn “mất” alen thứhai và phát triển thành UNBVM [7], [22]

Phần lớn các trường hợp các khối u (90%) là rải rác(sporadic: gia đình không có tiền sử bị UNBVM), tồn tạitrong các mô của proband (bệnh nhân phát hiện bệnh lầnđầu mà tiền sử gia đình trước đó chưa từng phát hiện aimắc bệnh) hoặc trong các tế bào giao tử của bố mẹ Nếuđột biến RB1 ban đầu phát sinh trong một tế bào mầmtrước khi thụ thai hoặc trong phôi sớm Những người này sẽ

có khả năng di truyền alen mang bệnh cho thế hệ sau Nếu

cả hai đột biến gen RB1 đều là đột biến khảm xuất hiện ởcác tế bào đang phát triển ở võng mạc sẽ dẫn tới UNBVM,nhưng các tế bào sinh sản không bị ảnh hưởng và thường có

xu hướng là không di truyền UNBVM thể rải rác hay không

di truyền thường hay xuất hiện chỉ ở một mắt (unilateral).Tuy nhiên nó cũng có thể ảnh hưởng tới cả hai mắt(bilaterial) Các khối u không di truyền thường có thể khutrú một ổ (unifocal) tại một ổ mắt, tuy nhiên đa ổ(multifocal) cũng đã được phát hiện trong trường hợp trên

Do đó phải cẩn thận để khẳng định rằng, những khối u đa ổphát hiện có phải là những khối UNBVM mới hay là các khối

u tái phát hoặc di căn từ nơi khác tới Những vấn đề trênảnh hưởng tới khả năng xuất hiện những tế bào mầm mangđột biến của proband [7], [23], [27], [28]

Phần còn lại là các trường hợp UNBVM thể di truyền hay

có tiền sử gia đình (familial), được thừa hưởng từ bố mẹ bị

bệnh hoặc bố mẹ người lành mang gen đột biến Các bệnhnhân mắc UNBVM thể di truyền thường sẽ thừa kế lại chongười con, vì đột biến gen RB1 đầu tiên xuất hiện trong tấy

cả các tế bào của người bố hoặc mẹ bao gồm cả những tếbào sinh sản Kết quả là, các trường hợp di truyền thường bịhai mắt và đa ổ, mặc dù một số trường hợp một mắt đãđược quan sát [7], [23]

Bảng 1.1 Khả năng di truyền của UNBVM [7]

Biểu hiện

lâm sàng ở

proband

% bệnh nhân UNBVM

Cơ chế di truyền Đượcthừa

kế

Di truyền cho đời sau Familial 10% Thừa kế alen gen RB1 bị

Sporadic

bilateral 30% - 88% đột biến mới xuấthiện trong tế bào mầm

của cha (>90%) hoặc mẹ (<10%)

- 12% đột biến dạng khảm

Khôn g

Khôn g

Có (Có) *

Sporadic

unilateral 60% - 85% đột biến khảm ở cả2 alen gen RB1

- 15% đột biến mới xuất hiện trong tế bào mầm

Khôn g

Khôn g

Không Có

(*) Đột biến khảm ở tế bào mầm chỉ tìm thấy ở nam giới (Sippel và cộng sự 1998)

Bảng 1.2 Xác xuất proband mang đột biến gen RB1 ở

Thể một mắt Hai mắtĐơn ổ Đa ổ

Có

+

100% 100% 100% Không

b) Nguồn gốc tế bào UNBVM

Tế bào nào sinh ra UNBVM là vấn đề được tranh cãi từ lâu Điều này có

ý nghĩa nhằm tìm hiểu tại sao tế bào đó thay đổi khi mất RB1 và khi điềutrị sinh học phân tử cần nhắm vào tế bào nào

* Tế bào sinh u.

Nếu UNBVM xuất phát từ một loại tế bào đặc biệt trong quá trìnhphát triển võng mạc, hiểu biết về cơ chế điều hòa giúp định hướng điều trịsinh học phân tử Giống như hiện nay các tác giả đã phát hiện ra yếu tố ứcchế chu trình tăng sinh tế bào của bệnh u nguyên bào tủy

* Các loại tế bào

Có tối thiểu bốn loại tế bào là nguồn gốc của UNBVM:

- Tế bào gốc võng mạc

- Nơ ron hay tế bào thần kinh đệm chưa biệt hóa

- Tế bào sinh ra tế bào võng mạc

- Tế bào sau phân bào biệt hóa nhầm

Tế bào gốc võng mạc

Nghiên cứu cho thấy không có tế bào gốc ở võng mạc

Nơron hay tế bào thần kinh đệm đã biệt hóa

Nơ ron hay tế bào thần kinh đệm đã biệt hóa không thể tạo thànhUNBVM vì quá trình này chỉ xảy ra trong một thời gian rất ngắn của thời

kỳ bào thai trước khi võng mạc đã trưởng thành [7]

ra, gây bất hoạt p53 và nuôi cấy riêng rẽ thì sẽ phát triển thành UNBVM.Nghiên cứu cũng cho thấy gây bất hoạt protein RB1 ở võng mạc chuộtkhông có p107, tế bào mầm dễ bị phân bào lệch hướng hơn các tế bào đãhoàn tất quá trình phân bào [7]

Tế bào vừa mới hoàn tất giai đoạn phân bào

Có một cách xác định tế bào nào là nguồn gốc là sử dụng marker biệthóa Đó là tế bào có mang protein của khối u hay bộc lộ là tế bào thủ phạm

- Phương pháp phân tích các markers biệt hóa: UNBVM biểu hiệncác gen đặc hiệu cho tế bào cảm quang ở võng mạc Nhưng nghiên cứu chothấy khối u võng mạc người có biểu hiện nhiều markers tế bào đặc hiệukhác Điều đó có nghĩa là tế bào u xuất phát từ nhiều loại tế bào hay từ mộtloại tế bào mầm mang nhiều markers khác nhau ở một thời điểm của quátrình Mất RB1 có thể gây ra nhiều thay đổi biểu hiện gen trong UNBVM,phản ánh một chương trình phát triển tế bào bị rối loạn và không đặc hiệu

Ở chuột, UNBVM ở chuột bị mất gen bộc lộ các marker của tế bào mầmvõng mạc và các tế bào amacrine Nhưng chuột không giống như người

- Phát hiện bằng chứng hỗ trợ: Phát hiện tế bào mầm vừa qua giaiđoạn phân bào có thể là thủ phạm cũng dựa trên biểu hiện marker Việcphát hiện ra khối u có mang các marker của tế bào amacrine chứng tỏ tếbào amacrine vừa phân bào đã bị mất RB1 và p107 Có thể tìm thấy các tếbào này ở giai đoạn đầu của quá trình phát triển Bình thường, tổng hợpDNA (pha S) xảy ra ở tế bào mầm ở lớp nền (basal) của võng mạc Pha Mxảy ra ở lớp đỉnh (apical) và pha G1, G2 xảy ra ở các lớp trung gian Thực

tế thấy chuột bị mất RB/p107 không có phân bào ở bề mặt lớp đỉnh võngmạc và tăng số lượng tế bào pha S ở các vùng võng mạc biệt hóa chứng tỏ

tế bào mới qua phân bào là thủ phạm sinh u Nghiên cứu cũng nhận thấygây biến đổi di truyền làm cho rối loạn quá trình phân lớp của võng mạc và

vị trí các tế bào mầm và tế bào mới qua phân bào ở võng mạc trưởng thành.Với bằng chứng đó, các tác giả hiện nay đã thu hẹp nghiên cứu của mìnhchỉ nhắm vào một loại tế bào (Hình 1.4 và 1.5) [7]

Hình 1.4 Các loại tế bào gây ra U nguyên bào võng mạc

(Nguồn: Ophthalmic oncology)

U nguyên bào võng mạc có thể có nguồn gốc từ bốn loại tế bào khác nhau Đầu tiên là tế bào mầm võng mạc đang tăng sinh Các tế bào mầm đa chức năng này sẽ di chuyển nhân khi chúng chuyển đổi qua chu trình tế bào RB bị bất hoạt trong giai đoạn tăng sinh DNA Protein này không cần để ngăn cản quá trình tăng sinh đang bị rối loạn Nếu u bắt nguồn từ các tế bào này sẽ có các marker tế bào mầm và các marker biệt hóa Khả năng thứ hai là các tế bào sau khi phân bào nhưng không thể biệt hóa được Khi có tế bào u sẽ

có những markers đặc hiệu của loại tế bào này Có thể các tế bào võng mạc đã biệt hóa trưởng thành hơn phát triển thành u do chúng quay trở lại chu trình tế bào Ở vùng võng mạc sát thể mi có tễ bào mầm nhưng lại không có ở lớp võng mạc thần kinh.

Hình 1.5 Hình ảnh hiển vi điện tử UNBVM

(Nguồn: Ophthalmic oncology) Bằng chứng cho thấy các xi náp tế bào amacrine và tế bào bắc ngang (horizontal)

trong u nguyên bào võng mạc

Hình 1.6 Phân tích các dòng tế bào UNBVM giai đoạn sớm.

(Nguồn: Ophthalmic oncology)

A Tế bào mầm tăng sinh ở lớp nguyên bào thần kinh phía ngoài và sinh ra các tế bào trung gian sau phân bào (màu vàng), các tế bào này di chuyển đến đúng lớp của nó và biệt hóa B Nếu tế bào mầm là tế bào sinh u thì lớp tế bào tạo ra sẽ đồng nhất và có các tế bào tăng sinh và tế bào amacrine C Nếu tế bào chuyển tiếp là tế bào sinh u thì các dòng tế bào luân chuyển tiếp theo sẽ tạo tế bào amacrine và tế bào hai cực bình

thường (màu tím) và tế bào Muller được sinh ra từ tế bào mầm.

1.1.6 Bệnh học phân tử bệnh U nguyên bào võng mạc

Cơ chế gây bệnh.

U nguyên bào võng mạc gây nên bởi đột biến hoặc không biểu hiện gen

ức chế khối u (gen RB1) Giả thuyết kinh điển của Alfred Knudson đã dự

đoán hiện tượng “hai cú hích” đã giới hạn tỷ lệ đối với bệnh (Knudson1971), và thực sự sau đó các nhà khoa học đã chỉ ra rằng mất cả hai alen

(M1 và M2) của gen RB1 là điều kiện cần nhưng chưa đủ cho sự phát triển

của UNBVM Sự mất alen M1 có thể di truyền hoặc phát sinh mới ở những

tế bào võng mạc nhạy cảm, trong khi M2 luôn luôn là đột biến khảm Đột

biến mất gen RB1 ở các tế bào võng mạc nhạy cảm dẫn tới các khối u lành

tính, còn gọi là retinoma, trong khi một số lượng các sự đột biến xảy ra sauđó (M3-Mn) cuối cùng dẫn tới UNBVM [7]

Hình 1.7 Các sự kiện đột biến gen RB1 trong quá trình phát sinh

UNBVM

(Nguồn: Pediatric oncology)

Vai trò và chức năng của gen RB1 và protein retinoblastoma (pRB).

Gen RB1 nằm trên vùng dài 183kB trên NST 13q14 Vùng promoter của

gen thiếu hụt vị trí gắn TATA hoặc CAAT l, và được thay thế bởi vị trí gắncho yếu tố phiên mã Sp1 và ATF Vùng 5’ của gen, đảo CpG thường xuyên

không được methyl hóa Gen RB1 gồm 27 exon, mã hoá cho protein pRB

gồm 928 acid amin [7]

Hình 1.8 Gen RB1

(nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/RB1 )

Hai vùng có tính bảo tồn cao, gọi là vùng A và vùng B, tạo nên vị trí đểgắn protein với các trình tự acid amin liên ứng LxCxE (x là bất kì acidamin nào) Protein với trình tự này bao gồm yếu tố phiên mã thuộc họ E2Fgiống như oncoprotein ở vi rút, như là vi rút 40 kháng nguyên T lớn ở khỉ

và adenovi rút E1A Những vị trí này cũng thường được tìm thấy ở p107 vàp130, cùng với pRB tạo thành họ protein RB [7]

Hình 1.9 Chức năng của protein RB

Protein RB sau khi dịch mã được hoàn thiện bằng sự phosphoryl hóa.Phosphoryl hóa pRB là một chu trình điều hòa tế bào và tiến hành bởi cácenzym phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinases: CKDS), là nhữngenzym gắn và được hoạt hóa bởi cyclin Vùng C tận cùng của pRB chứacác vùng gắn với phức hợp Cyclin-cdk pRB được phosphoryl ở phachuyển đổi G1 đến S bởi các phức hợp cdk 4/6, Cyclin D hoặc cdk 2 vàcyclin E Protein này tăng cường phosphoryl hóa ở các vị trí khác nhau,như giai đoạn trung gian tế bào, đầu tiên được phosphoryl bởi cdk2-cyclin

A từ pha S tới G2, sau đó cdk2-cyclin B ở pha M Sự khử phosphoryl củapRB thực hiện qua trung gian phosphoprotein phosphatase 1 (PP1), tạo ramột pRB có tỉ lệ phosphoryl thấp, có mặt trong pha G0 và G1 [7]

Tình trạng phosphoryl hóa ảnh hưởng đến sự tương tác vật lý giữa pRB

và các protein E2F Họ protein E2F hoạt hóa các gen tham gia vào quá trìnhchuyển đổi pha G1-S, do đó chúng thúc đẩy sự tiến triển chu kì tế bào pRBphosphoryl hóa tỉ lệ thấp có thể gắn với các protein E2F và do đó ức chếchức năng này để ngăn chặn chu kì tế bào Khi pRB bị phosphoryl hóa, nómất đi khả năng gắn với các protein E2F, cho phép chúng hoạt hóa các genkiểm soát chu kì tế bào Tương tự như vậy, trong UNBVM, đột biến genRB1 dẫn tới pRB không còn chức năng hoặc vắng mặt sẽ dẫn tới hậu quảhoạt động của các protein E2F và sự kích thích liên tục của chu kì tế bào, làmột tính năng có lợi cho sự phát triển khối u [7]

Thêm vào đó, chức năng của pRB bao gồm quá trình chết theo chu trìnhcủa tế bào và sự khác biệt, và thường qua trung gian thông qua sự tương táccủa pRB với những “đối tác” gắn đa dạng và phong phú với nó Loại bỏ sựchết của tế bào hoặc sự khác biệt con đường bình thường được điều khiểnbởi RB1 cũng có thể là một yếu tố quan trọng hình thành nên UNBVM [7]

Đột biến gen RB1 đã được phát hiện.

Fung et al (1987) đã sử dụng một cDNA dò để xác định tổn thươngDNA ở bệnh nhân UNBVM Trong 16 của 40 bệnh nhân UNBVM nghiêncứu với một cDNA dò (1987), sự thay đổi trong cấu trúc gen RB đã đượcnhận diện, bao gồm: trong một số trường hợp, xóa đồng hợp tử tương ứngvới giảm khả năng phiên mã Một trường hợp u xương ác tính cũng có xóađồng hợp tử với sự giảm khả năng phiên mã Các điểm nóng có thể bị xóađược xác định trong các locus gen RB Trong số những khối u không cóthay đổi về cấu trúc đã biết, có hoặc không có sự phiên mã RB hoặc biểuhiện bất thường của phiên mã RB [47].

Bookstein và cs (1988) đã xác định ít nhất 20 exon trong các dòng ditruyền của gen RB và tạm thời đánh số chúng Với một đầu dò trình tự duynhất từ intron 1, họ đã phát hiện xóa dị hợp tử trong DNA từ 3 dòng tế bào

RB và sắp xếp lại gen trong nguyên bào sợi từ 2 bệnh nhân UNBVM ditruyền, đã chỉ ra rằng intron 1 bao gồm một vị trí thường xuyên cho các độtbiến có khuynh hướng tiến triển UNBVM Làm sáng tỏ xóa exon 2-6 củaDNA từ 1 alen RB, cũng như làm sáng tỏ những xóa bỏ những exon khác,giải thích nguồn gốc của giảm phiên mã RB mRNA [48]

Dunn et al (1989) mở rộng các đặc điểm của các đột biến ở RB1 sửdụng bảo vệ RNase phiên mã RB1 để xác định vị trí đột biến có thể xảy ra,tiếp theo là phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để khuếch đại và giải trình

tự các alen đột biến Đột biến đã được xác định ở 15 trong số 21 khối uUNBVM; trong 8 khối u, các lỗi chính xác trong trình tự nucleotide đãđược mô tả Mỗi 4 đột biến dòng mầm bao gồm một xóa nhỏ hoặc đột biếnlặp, trong khi 3 đột biến xôma là đột biến điểm dẫn tới những biến đổi tại

vị trí ghép nối và mất của một exon từ mRNA RB1 trưởng thành Bằng kỹthuật PCR, Yandell et al (1989) đã chứng minh sự thay đổi nucleotide duynhất trong khối u của 7 bệnh nhân bị UNBVM (không có tiền sử gia đìnhcủa bệnh) 4 bệnh nhân trong số này, đột biến chỉ tham gia các tế bào khối

u, và 3 trong đó liên quan đến tế bào soma bình thường cũng như các tế bàokhối u nhưng không tìm thấy trong cha hoặc mẹ Do đó, các đại diện 3 độtbiến mầm mới (3 đột biến còn lại) Tất cả 3 đột biến đã chuyển C thành Ttrong chuỗi mã hóa trong gen UNBVM Hai trong số 3 diễn ra ở cặp CpG.

Kể từ đột biến mầm mới của gen UNBVM có nhiều khả năng xảy ra trêncác alen thuộc về người cha (Dryja et al., 1989), tình trạng biểu hiện ra củaquá trình chuyển đổi C thành T có lẽ là kết quả của các quá trình xảy ratrong giao tử đực Trực tiếp phân tích các đột biến gây bệnh đặc biệt ápdụng đối với các bệnh đặc trưng bởi một tỷ lệ cao của các đột biến mới.Cách tiếp cận này đã được sử dụng thành công với hội chứng Lesch-Nyhan(300.322) và bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (310.200), liên quan tới tần sốcao của đột biến điểm mới và xóa mới, tương ứng Phân tích DNA của hệgen ngăn ngừa được sự khó khăn của sự phiên mã RNA hoặc sản phẩm genprotein để phân tích và cho phép phát hiện các đột biến có thể xảy ra tại cácđiểm nối hoặc các trình tự khác được loại trừ khỏi sự phiên mã RNA.Trong số 10 đột biến (7 khối u UNBVM cộng với 3 khối u khác), 5 độtbiến xảy ra trong exon 21-24 khu vực mà chỉ chiếm 15% của chuỗi mã hóacủa gen UNBVM Người ta đã tìm thấy rằng các protein bất thường từ cácaxit amin được mã hoá bởi các exon đã bị xóa thiếu hoạt gắn với cácadenovi rút E1A protein biến đổi chi phối [49]

Bất hoạt hoàn toàn gen RB ở người được cho là một bước thiết yếutrong tìm hiểu quá trình tiến triển ung thư của nhiều loại ung thư khácnhau Cung cấp bộ khung cho sự hiểu biết về cơ chế bất hoạt, cấu trúc củagen RB đã được mô tả Gen RB mã hóa cho 27 exon, rải rác khắp chiều dàiDNA Xóa đoạn ở các exon 13 – 17 được quan sát với tần xuất thườngxuyên hơn trong rất nhiều loại khối u khác nhau, bao gồm cả UNBVM, ungthư vú, sarcome xương và hiện diện như một “điểm nóng” tiềm năng liênquan tới vùng được dự đoán [50]

Blanquet et al (1995) đã thực hiện một cuộc khảo sát đột biến của genRB1 trong 232 bệnh nhân UNBVM di truyền và không di truyền Họ tìmhiểu một cách hệ thống tất cả 27 exon và trình tự bên, cũng như các vùnghoạt hóa Tất cả các loại đột biến điểm đã được mô tả và tìm thấy đượcphân bố không đều theo trình tự gen RB1 Trong các nghiên cứu tập hợp,exon 3, 8, 18, và 19 được ưu tiên thay đổi Mối tương quan giữa sự biểuhiện kiểu hình và các biến đổi phân tử rất khó để phân biệt, nhất là trongđột biến sai nghĩa và đột biến bảo tổn khung đọc Tuy nhiên, Blanquet et al.(1995) quan sát thấy rằng một số bệnh nhân mang đột biến ở exon 19 cũngphát triển các khối u không thuộc về mắt như pineoblastoma, fibrosarcoma,hoặc u xương ác tính Đột biến dòng mầm đã được phát hiện trong 36% của

25 trường hợp gia đình, trong 20,5% các trường hợp 2 bên, và trong 7,1%các trường hợp một bên Bởi vì mức độ thấp của phát hiện các đột biếndòng mầm trong trường hợp di truyền, họ lý luận rằng các cơ chế khác của

sự bất hoạt của RB1 phải có [51]

Một nghiên cứu dựa trên cơ sở dữ liệu đã có sẵn đã được xây dựng với

932 đột biến gen RB1 đã được công bố năm 2005 Hình ảnh của những độtbiến này đã được phân tích với các kết quả: 1) protein RB thường xuyên bịbất hoạt bởi đột biến mất đoạn hoặc đột biến vô nghĩa trong khi đột biến sainghĩa chủ yếu gặp trong các sự kiện bất hoạt trong phần lớn các bệnh vềgen 2) gần 40% đột biến gen RB1 tái diễn và quy tụ tại 16 điểm nóng, baogồm 12 đột biến vô nghĩa, 2 đột biến sai nghĩa và 3 đột biến tại vị trí nốigiữa intron và exon (splicing site) Những đột biến còn lại phân bố rải ráctrên gen RB1 với tần suất thường gặp ở các exon 9, 10, 14, 17, 18, 20, 23.3) phân tích các đột biến gen RB1 bằng các nhóm bệnh nhân có nguồn gốc

từ các nước xác định hai nhóm, trong đó tỷ lệ đột biến vô nghĩa và đột biếnvùng ghép nối gen (splicing site) cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa, từ đógợi ý rằng có sự tham gia nguyên nhân nền liên quan đến nguồn gốc chủngtộc 4) một sự liên quan có ý nghĩa giữa lứa tuổi chẩn đoán muộn với độtbiến vùng nối ở bệnh nhân UNBVM thể hai bên đã cho thấy sự xuất hiện

của một kiểu gen trì hoãn khởi phát 5) hầu hết các đột biến đã được báocáo trong các đột biến có tính gia đình, có độ thâm nhập thấp chia làm banhóm [52].

Do đó trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiêu 3 exon: 10,

14, 20 trong số những exon thường gặp để tiến hành giải trình tự tìm cácđột biến

Những biến đổi về gen liên quan tới UNBVM

Quá trình phát triển từ tế bào võng mạc tới giai đoạn tế bào U nguyênbào võng mạc bắt đầu với sự đột biến hoặc mất đi sự biểu hiện của gen ứcchế khối U nguyên bào võng mạc (RB1) Sự tiến triển từ tế bào võng mạcbình thường tới khối u ác tính thực sự bao gồm một quá trình tích lũy từ từtăng dần các biến đổi ở mức độ phân tử về gen, liên quan tới các giai đoạntrên lâm sàng và bệnh học của khối u Sự bất ổn định về gen góp phần thamgia vào sự tiến triển của retinoma lành tính sang dạng UNBVM ác tính[14],[15],[16] Ở người, sự tiến triển này được đặc trưng bởi sự mất của cảhai bản sao của gen RB1 trong retinoma, theo sau đó bởi những thay đổitrong số lượng bản sao của gen gây ung thư như MYCN (2p24.3), E2F3 vàDEK (6p22), KLF14 (7q32), và MDM4 (1q32) cũng như các gen ức chếkhối u CDH11 (16q21) và p75NTR (17q21) Nó cũng đã được chỉ ra rằngkhi RB1 và TP53 bị bất hoạt ở chuột, sự phát triển UNBVM xảy ra [17],[18] Nhìn chung, những quan sát này chỉ ra rằng ngoài bất hoạt hai alencủa RB1, thêm vào đó "cú hích" cần phải có cho sự phát triển của các khối

u RB ở người và chuột [19],[20],[21]

1.2 Các phương pháp phát hiện đột biến gen RB1

Kỹ thuật PCR được dùng để khuếch đại 27 exon của gen RB1 trước khitiến hành giải trình tự gen xác định đột biến Kỹ thuật này đòi hỏi phải tối

ưu điều kiện PCR để có thể đưa ra sản phẩm PCR đặc hiệu, không có sảnphẩm phụ, vạch rõ nét, giúp giải trình tự gen thu được kết quả tốt và không

bị nhiễu

1.2 1 Kỹ thuật PCR

PCR là kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm Nguyên tắc của phảnứng PCR dựa trên đặc điểm của quá trình tự sao chép DNA trong tế bào:cần có DNA ở dạng sợi đơn, cần các đoạn mồi và các loại enzym xúc tác,[37],[38],[39],[40],[41],[42],[43],[44]

Kỹ thuật PCR sử dụng Taq polymerase (enzym chịu nhiệt) tổng hợp mộtmạch DNA mới từ mạch DNA đơn làm khuôn với nguyên liệu là bốn loạinucleotid Phản ứng đòi hỏi phải có mặt của cặp mồi đặc hiệu (mồi xuôi,mồi ngược) có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn

PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giaiđoạn nhiệt độ khác nhau

- Giai đoạn 1 (biến tính): DNA khuôn sẽ được biến tính ở nhiệt độ cao (caohơn nhiệt độ Tm) 94oC ÷ 95oC trong vòng từ 30 ÷ 60 giây

- Giai đoạn 2 (bắt cặp): nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy Tm(temperature melting) của các mồi khoảng 40oC ÷ 70oC khoảng 30 ÷ 60giây

- Giai đoạn 3 (kéo dài): nhiệt độ tăng lên 72oC

Hình 1.10 Các bước cơ bản của phản ứng PCR

(Nguồn: Andy Vierstraete, 1999)

1.2.2 Phương pháp giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắpxếp của các nucleotid trong phân tử DNA Phân tử DNA là một chuỗi xoắnkép gồm hai mạch đơn được cấu tạo từ bốn loại nucletid khác nhau đó là: A(adenin), C (cytosin), G (guanin) và T (thymin) Các nucleotid này liên kếtvới nhau theo một thứ tự xác định Giải trình tự gen tức là phát hiện đượcthứ tự sắp xếp của bốn nucleotid này trên phân tử DNA

Vào giữa thập kỷ 70, có hai quy trình giải trình tự như sau được đưa ragần như cùng một lúc:

Phương pháp của Maxam và Gilbert (1977) cắt đứt sợi đôi DNA tại các

vị trí đặc biệt bằng các phản ứng hoá học

Phương pháp Sanger (1977) dùng enzym xúc tác sợi bổ sung tương ứngcủa một chuỗi DNA cần xác định trình tự, những sản phẩm tổng hợp bịchấm dứt tại một điểm đặc biệt nào đó

Hiện nay phương pháp của Sanger được sử dụng phổ biến ở Việt Nam

và thế giới Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP(dideoxyribonucleotide triphosphate) là các đồng phân của dNTP(deoxyribonucleotide triphosphate), còn được gọi là “terminator” Cấu trúcddNTP tương tự dNTP chỉ có một điểm khác biệt duy nhất là ddNTP khôngcó gốc OH ở vị trí carbon 3 của deoxyribose, là vị trí để các dNTP tiếp theogắn vào Do đó, phản ứng tổng hợp DNA sẽ được dừng lại tại ngay vị trí

mà ddNTP được gắn ngẫu nhiên vào thay cho dNTP [45],[46]

Các phòng xét nghiệm hiện nay hầu hết đều giải trình tự bằng phản ứngenzym, nhưng khi làm giải trình tự thì dùng máy tự động chứ không dùng

kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây nữa Tóm lại, sự ra đời của kỹ thuậtPCR đã giúp cho kỹ thuật giải trình tự có những tiến bộ vượt bậc về kỹthuật cũng như phạm vi áp dụng, cho phép xác định trực tiếp trình tự củamột DNA khuếch đại bằng PCR mà không qua tạo dòng