Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên hai vị thuốc kha tử (fructus terminaliae) và nhục đậu khấu (semen myristicae) đang lưu hành trên địa bàn hà nội

Phân lập các chủng nấm mốc nhiễm trên các mẫu của 2 vị thuốc nghiên cứu.. Khảo sát chất lượng của 36 mẫu hạt tiêu được làm khô bằng ánh nắng mặt trời và bảo quản ở tỉnh Razavi Khorasan,

HÀNH TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

HÀNH TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc đến

TS Trần Trịnh Công – giảng viên bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại

học Dược Hà Nội Thầy là người đã định hướng cho tôi ngay từ những ngày đầu làm khóa luận Trong suốt thời gian làm khóa luận, thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin trân trọng cám ơn các thầy giáo, cô giáo, các chị kỹ thuật viên

và các em làm nghiên cứu khoa học tại bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Nhân đây, tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình tôi, đến các bạn của tôi

Họ là những người luôn bên cạnh khích lệ và giúp đỡ tôi để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Đàm Thu Hiền

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Một vài nét về chi Aspergillus và Penicillium 2

1.1.1 Chi Aspergillus 2

1.1.2 Chi Penicillium 4

1.2 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dược ở ngoài nước 6

1.3 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dược ở trong nước 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Môi trường phân lập và xác định nấm mốc 14

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu 15

2.3.2 Phương pháp phân lập nấm mốc 15

2.3.3 Phương pháp phân loại nấm mốc 16

2.3.4 Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc kha tử 18

3.1.1 Hàm ẩm của các mẫu kha tử nghiên cứu 18

3.1.2 Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu kha tử nghiên cứu 18

3.1.3 Một số ý kiến bàn luận 25

3.2 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc nhục đậu khấu 26

3.2.1 Hàm ẩm của các mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu 26

3.2.2 Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu 27 3.2.3 Một số ý kiến bàn luận 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

1 Kết luận 37

1.1 Vị thuốc kha tử 37

1.2 Vị thuốc nhục đậu khấu 37

2 Đề xuất 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADM : Aspergillus Differentiation Medium Base AFPA : Aspergillus Flavus/ Parasiticus Agar

CFU : Colony-Forming Unit

CREA : Creatine Sucrose Agar

DGM : Dichloran Glycerol Medium Base

DĐVN IV : Dược điển Việt Nam IV

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

LÔ : Phố Lãn Ông

MEA : Malt extract agar

PDA : Potato Dextro Agar

A flavus : Aspergillus flavus

A niger : Aspergillus niger

A fumigatus : Aspergillus fumigatus

A aculeatus : Aspergillus aculeatus

A ustus : Aspergillus ustus

A parasiticus : Aspergillus parasiticus

A tamari : Aspergillus tamari

A corymbifera : Absidia corymbifera

R stolonifer : Rhizopus stolonifer

P marneffei : Penicillium marneffei

P aurantiogiseum : Penicillium aurantiogiseum

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc kha tử nghiên cứu 18

Bảng 3.2 Số lượng các chủng, chi và loài nấm phân lập được

từ 10 mẫu kha tử nghiên cứu

19

Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài quan trọng

phân lập được từ các mẫu kha tử nghiên cứu

20

Bảng 3.4 Đặc điểm vi học của một số loài quan trọng phân

lập được từ các mẫu kha tử nghiên cứu

21

Bảng 3.5 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc nhục đậu khấu

nghiên cứu

27

Bảng 3.6 Số lượng chủng, chi và loài phân lập được từ 10

mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu

27

Bảng 3.7 Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài quan trọng

phân lập được từ các mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu

29

Bảng 3.8 Đặc điểm vi học của một số loài quan trọng phân

lập được từ các mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu

30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc và quá trình sinh conidi của chi Aspergillus 3

Hình 1.2 Cấu trúc sinh conidi dạng chổi của chi Penicillium 5

Hình 3.1 Loài A niger nhiễm trên vị thuốc kha tử 22

Hình 3.2 Loài A fumigatus nhiễm trên vị thuốc kha tử 23

Hình 3.3 Loài A flavus nhiễm trên vị thuốc kha tử 24

Hình 3.4 Loài A niger nhiễm trên vị thuốc nhục đậu khấu 31

Hình 3.5 Loài A fumigatus nhiễm trên vị thuốc nhục đậu khấu 32

Hình 3.6 Loài A flavus nhiễm trên vị thuốc nhục đậu khấu 33

Hình 3.7 Loài A parasiticus nhiễm trên vị thuốc nhục đậu khấu 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dược liệu nói chung và các sản phẩm làm thuốc có nguồn gốc thực vật nói riêng thường dễ bị nấm mốc xâm nhiễm và phát triển, nhất là trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở Việt Nam Khi bị mốc các sản phẩm này ngoài việc bị giảm chất lượng (bị biến đổi thành phần hoá học, biến màu, sinh các mùi vị khó chịu, ) thường bị nhiễm các độc tố nấm (mycotoxin) Các độc tố này có thể gây ra các bệnh cho con người và động vật gọi chung là bệnh do độc

vị thuốc này Để góp phần đảm bảo chất lượng thuốc và an toàn cho người sử dụng dược thảo, nghiên cứu hệ vi nấm trên các sản phẩm này là một bước quan trọng, làm cơ sở để có biện pháp thu hoạch, bảo quản hợp lý, phòng tránh các tác hại nói trên Với mục đích, ý nghĩa đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên hai vị thuốc kha tử (Fructus Terminaliae) và nhục đậu khấu (Semen Myristicae) đang lưu hành trên địa bàn Hà Nội” với hai mục tiêu:

1 Phân lập các chủng nấm mốc nhiễm trên các mẫu của 2 vị thuốc nghiên

cứu

2 Phân loại các chủng nấm phân lập được đến cấp chi và loài

bổ sung và được các nhà phân loại học công nhận nên được mang tên

Aspergillus Fries ex Fries

Về mặt phân loại học chi Aspergillus có một số đặc điểm: Khuẩn lạc

thường phát triển nhanh, có thể có màu trắng, vàng, nâu vàng, nâu tới đen, hoặc ngả màu xanh lá cây, chủ yếu được cấu tạo bởi một lớp dày các conidiophore thẳng đứng Conidiophore (thường không phân nhánh) được cấu tạo bởi một giá đỡ (stipe) không phân nhánh, với phần đỉnh phồng to gọi là bọng (vesicle) Thể bình (phialide) được sinh trực tiếp trên bọng được gọi là thể bình một tầng (uniseriate phialide), hoặc trên cuống thể bình (metula) là thể bình hai tầng (biseriate phialide) Bọng, thể bình, cuống thể bình (nếu có mặt) và conidi hình thành một khối conidi (conidial head, hình 1.1) Khối conidi có thể hình thành dạng cột (columnar), dạng phóng xạ (radiate) hoặc dạng cầu (globose) Conidi (conidium) chỉ gồm một tế bào, bề mặt nhẵn hoặc

xù xì, có gai, không màu hoặc có màu Một số loài có thể sinh tế bào Hülle (Hülle cell) có thành nhẵn, dày, đơn độc hoặc thành chuỗi, hạch nấm (sclerotium) là các khối sợi thường có dạng hình cầu, cứng

Các loài của chi Aspergillus thường lây nhiễm phổ biến trên nhiều cơ

chất khác nhau, đặc biệt là trên các loại hạt lương thực, các loại cơ chất chết

có nguồn gốc thực vật [2], [30], [33] Ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,

các loài của chi Aspergillus phổ biến hơn rất nhiều so với các loài của chi

Penicillium

Hình 1.1 Cấu trúc và quá trình sinh conidi của chi Aspergillus

Một số loài của chi nấm này đã thu hút được sự quan tâm đặc biệt do chúng có khả năng gây bệnh ở người và động vật [36] hoặc có khả năng sinh các chất chuyển hóa thứ cấp độc (mycotoxin) [33] Một số loài khác có tầm quan trọng trong lên men các sản phẩm truyền thống phương đông, hoặc các ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid hữu cơ hoặc enzym [30]

Việc phân loại chi Aspergillus chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái

Raper & Fennell (1965) [31] đã chia chi nấm này thành 18 nhóm (group) và

đã chấp nhận 132 loài với 18 thứ Samon (1979, 1992, 1994a & b) đã công bố sưu tập dữ liệu của các loài, thứ đã được mô tả từ 1965 và chỉ ra sợ bất hợp lý của một số taxon đã được công bố Hiện nay số lượng các loài của chi đã được phát hiện lên tới trên 200 loài, trong đó có khoảng trên 70 loài là các trạng thái hữu tính [30]

Nuôi cấy để nhận diện: Các chủng nấm được cấy đơn tại 3 điểm trên

môi trường Czapek và MEA 2% và ủ ở 25oC Đối với các loài nấm ưa khô

như A penicillioides, một số loài khác và trạng thái hữu tính Eurotium có thể

sử dụng các môi trường Czapek và MEA với 20-40% đường kính (sucrose) Nuôi cấy các chủng tại 3 điểm trên các môi trường, sử dụng các đĩa Petri thủy tinh tốt hơn các đĩa Petri bằng chất dẻo Hầu hết các loài hình thành bào tử trong vòng 7 ngày Màu và cấu trúc của khối conidi (dạng cột hoặc phóng xạ)

được quan sát bằng kính hiển vi Do một số loài của chi Aspergillus có thể gây bệnh ở người (đặc biệt là A fumigatus), nên cần có biện pháp phòng tránh

hít phải bào tử [30], [36]

1.1.2 Chi Penicillium

Chi Penicillium thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp nấm bất toàn

trong hệ thống phân loại hình thái Saccardo 1886

Chi Penicillium được đặc trưng bởi các đặc điểm sau: Khuẩn lạc thường

phát triển nhanh, thường ngả màu xanh lá cây, đôi khi có màu trắng, chủ yếu được cấu tạo bởi một lớp dày các conidiophore Conidiophore có thể mọc lên

từ cơ chất, từ các sợi khí sinh, từ các bó sợi bò lan trên mặt thạch, hoặc các bó sợi thẳng đứng chặt hay lỏng Conidiophore không màu, có thành nhẵn hay ráp, có thể đơn độc hoặc kết thành bó, cấu tạo gồm một giá đỡ (stipe) và được kết thúc bằng một vòng của các thể bình (phialide), đây là cấu trúc chổi một vòng (monoverticillate), hoặc kết thúc bằng các chổi đa vòng, gồm các nhánh

và cuống thể bình - metulae (các nhánh gần đoạn cuối mang một vòng phialide) Tất cả các tế bào giữa metulae và stipe được xem như là các nhánh (hình 1.2)

Kiểu phân nhánh: có thể có 1 giai đoạn phân nhánh (biverticillate), 2 giai đoạn phân nhánh (terverticillate) hoặc 3 (quaterverticillate) tới nhiều hơn các giai đoạn phân nhánh

Hình 1.2 Cấu trúc sinh conidi dạng chổi của chi Penicillium

Thể bình thường có hình chai, với phần đáy hình trụ và phần cổ đặc trưng, hoặc dạng mác với phần đáy dẹp nhiều hay ít, thon nhỏ tới một đỉnh khá nhọn (acerose) Conidi sắp xếp thành dạng chuỗi dài, khô, phân ly hay dạng cột, có dạng hình cầu, elip, hình trụ hoặc hình thoi, không màu, hoặc hơi xanh lá cây, thành nhẵn hoặc ráp Một số loài tạo hạch nấm (sclerotium)

Nhiều loài của chi Penicillium là những tác nhân lây nhiễm phổ biến

trên nhiều cơ chất khác nhau và đồng thời tiềm ẩn khả năng sinh các độc tố

Do vậy việc nhận diện chính xác là vấn đề quan trọng khi nghiên cứu khả

năng lây nhiễm do chi Penicillium Việc nhận diện các loài của Penicillium đã

được Raper và Thom (1949) thực hiện, chủ yếu dựa trên các đặc điểm nuôi cấy, nhưng các đặc tính này cũng đã được chứng minh là khá dễ thay đổi Các đặc tính hình thái thuần chủng có thể được dùng cho việc phân loại Ngoài ra, các đặc điểm như tốc độ phát triển, hoạt độ nước (water activity) ở các môi trường và nhiệt độ khác nhau cũng giúp hỗ trợ cho việc xác định loài (Pitt, 1979) Việc sử dụng các dữ liệu về các chất chuyển hóa thứ cấp cũng cho thấy

có giá trị cho việc nhận diện (Frisvad 1981, 1985 ; Frisvad và Filtenbord,

1983 ; Lund & Frisvad, 1994…) Nhiều công trình mô tả chi tiết và các khóa

phân loại của chi Penicillium cũng đã được công bố (Pitt et al 2009) [30]

Một số loài sinh các chất tiết và mùi sẽ giúp nhận ra vị trí phân loại của chúng Tuy nhiên, cần lưu ý là hít phải bào tử và các chất bay hơi có thể bị stress, gây ảnh hưởng tới sức khỏe May mắn là các loài có khả năng gây

bệnh ở người của chi nấm này ít hơn nhiều so với chi Aspergillus và chỉ giới hạn ở loài P marneffei [3], [30]

Nuôi cấy để nhận diện : Samson và Pitt (1985) đề xuất nên cấy các

chủng ở 3 điểm trên môi trường CYA (Czapek yeast Agar) và MEA (2%), ủ ở

25oC, trong môi trường tối hoặc sáng Tuy nhiên, nuôi cấy trên môi trường Czapek cũng cho kết quả hợp lý Một điểm lưu ý rằng sự phát triển không

điển hình và các chất màu của các loài thuộc Penicillium trên các môi trường

CYA và Czapek có thể xuất hiện, thường là do thiếu các vết kim loại nặng, đặc biệt là đồng Khó khăn có thể được giải quyết khi bổ sung thêm dung dịch đồng hoặc kẽm Hầu hết các loài hình thành bào tử sau 5 đến 7 ngày Một số

loài thuộc nhóm chổi 3 vòng (Terverticillate Penicillium), khi sử dụng môi

trường CREA (Creatine Sucrose Agar) cũng rất hiệu quả trong việc phân biệt

các loài có mối quan hệ rất thân thuộc Các loài có chổi 3 vòng (P

aurantiogriseum/ verrucosum complex) rất khó xác định khi chỉ dựa trên các

cấu trúc hình thái của chúng

1.2 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dược ở ngoài nước

Dược thảo thường bị nhiễm các loài nấm sinh độc tố có nguồn gốc từ đất trồng trọt Sự xuất hiện tự nhiên của nhiều độc tố nấm trên các nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc thực vật và các dược thảo truyền thống đã được thông báo từ nhiều nước trên thế giới [15], [20], [34] Các dữ liệu từ Ấn Độ cho thấy các mycotoxin đã được phát hiện ở mức độ cao hơn so với hàm

lượng cho phép trên các thực vật làm thuốc thường gặp ở quốc gia Nam Á này Các nghiên cứu từ Thổ Nhĩ Kỳ cũng cho thấy các loại sản phẩm chế biến

từ quả vả khô (dried figs) đã bị nhiễm mycotoxin ở mức cao như aflatoxin, ochratoxin A và fumonisin B1 Ngoài ra, đây cũng là khu vực có tỷ lệ nhiễm độc tố ochratoxin A cao trên sản phẩm được điều chế từ rễ cây cam thảo Với các thuốc truyền thống của Trung Quốc cũng đã ghi nhận bị nhiễm aflatoxin

và ochratoxin A cao hơn mức cho phép [15]

Dược thảo đang được sử dụng chế biến các phương thuốc gia truyền và cũng là nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp dược ngày một tăng Các bài thuốc (được điều chế từ thảo dược) gia truyền được sử dụng để phòng tránh, trị liệu, điều trị các rối loạn và nhiều bệnh khác nhau từ thời cổ xưa Tuy nhiên, dược thảo sử dụng chưa đáp ứng được các yêu cầu về chất lượng,

độ an toàn và tính hiệu quả Trong quá trình thu hoạch, vận chuyển, bảo quản

và phân phối, các dược thảo có thể bị lây nhiễm nhiều loại nấm mốc khác nhau, và có thể bị hư hỏng và nhiễm mycotoxin Thực vật làm thuốc được sử dụng ngày càng nhiều, trong khi thiếu các nghiên cứu cần thiết về cách sử dụng, hiệu quả, độc tính và chất lượng của các sản phẩm tự nhiên này có thể dẫn đến nguy cơ cho sức khỏe con người Lượng mycotoxin đưa vào cơ thể cũng có thể tăng lên cùng với việc gia tăng sử dụng dược thảo Do đó, việc sử dụng các dược thảo nhiễm mycotoxin có thể tạo ra các vấn đề bất lợi và rủi ro nguy hiểm đến sức khỏe và tính mạng cộng đồng Nhiều nước trên thế giới như Tây Ban Nha, Trung Quốc, Đức, Ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ và các nước Trung Đông cũng đã ghi nhận tình trạng nhiễm các mycotoxin trên các thực vật làm thuốc và các dược thảo truyền thống [15], [20], [34]

Dược thảo được xác định là việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thực vật trong thực hành trị liệu, là một thực tế tồn tại từ ngàn xưa, trước khi thuốc hiện đại phát triển, phổ biến và vẫn được sử dụng cho đến tận ngày nay

Mặc dù thuốc kháng sinh đã được đưa vào sử dụng từ những năm 1940, nhưng vẫn có tới 80% dân số tin dùng các cây thuốc bản địa trong điều trị bệnh [20] Do các dược thảo có nguồn gốc thực vật nên thường bị nhiễm, hư hỏng bởi nấm trước thu hoạch, trong quá trình vận chuyển và bảo quản Trong quá trình phát triển của nấm, nhiều mycotoxin được tạo thành, và là các chất gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng Sự gây hư hỏng cho dược thảo không chỉ gây ra nhiều tác động bất lợi đến cộng đồng người sử dụng, mà còn làm giảm hiệu quả và tiềm năng sử dụng của thuốc Một số nhà nghiên cứu còn nhận xét, nấm mốc và mycotoxin là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây tụt hậu nền công nghiệp dược thảo Ấn Độ (một nước có nền y học cổ truyền lâu đời nhất trên thế giới với thảo dược là nguồn nguyên liệu chính) [20]

Mycotoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của nấm Một số chi nấm

thường có thể tạo ra các mycotoxin là Aspergillus, Penicillium và Fusarium

Hiện nay, đã phát hiện được khoảng 400 mycotoxin, trong đó, các mycotoxin phổ biến nhất là aflatoxin, ochratoxin A, fumonisin, deoxynivalenol, zearalenone Các mycotoxin này đã được thông báo về khả năng gây ung thư, độc với hệ thần kinh, gây quái thai hoặc suy giảm miễn dịch Nhiều thực phẩm và thức ăn như ngô, lúa, gạo, đậu phộng có thể bị nhiễm các mycotoxin

vì chúng có thể được hình thành từ trước thu hoạch, thời gian thu hoạch và làm khô và trong khi bảo quản [18] Hầu hết cây thuốc và các bộ phận của chúng như: lá, rễ, hạt đều có thể bị nhiễm các loại nấm khác nhau trong quá trình bảo quản Khi được bảo quản nhiều ngày, chúng trở nên nhạy cảm với

sự phát triển của nấm mốc và hình thành mycotoxin Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng nhiễm nấm là điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, phương thức thu hoạch, làm khô và bảo quản Ở các điều kiện khác nhau thì

tình trạng nhiễm nấm và hình thành mycotoxin cũng khác nhau Khả năng nhiễm nấm tăng lên ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [15], [20]

Một nghiên cứu của Matei và cộng sự [29] trên 10 mẫu chè thuốc được bán ở các hiệu thuộc hạt Cluj của Rumani Kết quả cho thấy, 4 mẫu có mức

độ nhiễm nấm cao gồm: chè quả tầm xuân (rosehip tea) với 7.818 khuẩn lạc (CFU)/gam, chè húng quế ngọt (sweet basil tea) phát hiện được 118.636 CFU/g, chè đen (black tea) bị nhiễm ở mức 192.272 CFU/g, và chè common nettle (common nettle tea) có mức nhiễm 204.545 CFU/g Trong đó, các loài

của chi Fusarium nhiễm vượt quá nhiều so với qui định (100 CFU/g) Kết quả

phân tích mycotoxin cho thấy: 7/10 mẫu có lượng aflatoxin toàn phần vượt quá mức qui định cho phép (10 ppb) Trong số 7 mẫu này, có 3 mẫu vượt quá ngưỡng 100 ppb, mẫu nhiễm cao nhất là 437,17 ppb và trung bình của 7 mẫu

bị nhiễm là 109,21 ppb

Nghiên cứu 36 mẫu chè thuốc (Pu-erh tea), có xuất xứ từ tỉnh Yunnan, tây nam Trung Quốc cho thấy: Nấm mốc đã phân lập được ở tất cả các mẫu ở nồng độ 1,0 x 101

- 2,6 x 106 CFU/g Trong đó, 36 loài thuộc 19 chi nấm đã

được nhận diện Các loài phổ biến nhất là Aspergillus acidus và A fumigatus, tiếp sau là nhóm nấm tiếp hợp Zygomycetes và các loài thuộc chi Penicillium

Các độc tố aflatoxin và fumonisin không phát hiện thấy trong các mẫu nghiên cứu Độc tố ochratoxin A đã được phát hiện trong 4/36 (11,1%) mẫu chè nghiên cứu [25]

Nghiên cứu chất lượng thuốc về tiêu chuẩn vi sinh trên 303 mẫu của 3 nhóm dược thảo và gia vị gồm: 11 loại thuộc nhóm sử dụng lá, 6 loại sử dụng quả và 3 loại sử dụng hoa Kết quả xác định và đếm vi sinh vật bằng các môi trường nuôi cấy chuẩn cho thấy: Bên cạnh việc bị nhiễm ở tỷ lệ cao quá qui

định cho phép về vi khuẩn (coliform, tụ cầu vàng, và Salmonella), cả nấm

men và nấm sợi đã phát hiện thấy trong tất cả các mẫu nghiên cứu Trong đó,

Aspergillus và Penicillium là các chi nấm có số loài phân lập được nhiều hơn

so với các chi Alternaria, Absidia, Mucor, Rhizoctonia và Cladosporium Các

mẫu phân tích không phát hiện thấy độc tố aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) Tuy nhiên, các tác giả đã khuyến cáo: các loại dược thảo và gia vị thực vật là những sản phẩm có rủi ro cao, cần có nhiều nghiên cứu để tìm ra các biện pháp chống lây nhiễm [19]

Mahajan và cộng sự [28] đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm trên 15

mẫu dược liệu có nguồn gốc từ 3 cây: Saraca indica Linn (5 mẫu),

Terminalia arjuna (Roxb) Wight & Arn (5 mẫu), và Hemidesmus indicus (L.)

R Br (5 mẫu) được thu thập từ các chợ thuộc vùng Agra và lân cận, Ấn Độ, giai đoạn 2013-2014 Kết quả cho thấy: 93% các mẫu nghiên cứu bị nhiễm các loài nấm khác nhau, với 13 loài được phân lập chủ yếu thuộc 5 chi

Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Rhizopus và Syncephalastrum Trong đó, Aspergillus (71,95%) là chi nấm phổ biến nhất, tiếp sau là Penicillium

(15,44%), Rhizopus (9,51%), Alternaria (1,67%), và Syncephalastrum (1,41%) Hầu hết các loài phân lập được là của các chi Aspergillus,

Penicillium và Alternaria Các loài này đều có khả năng sinh độc tố như

aflatoxin, ochratoxin, citrinin, altertoxin và acid tennuazonic Sự có mặt của nhiều loại nấm bảo quản cho thấy nấm mốc có khả năng lây nhiễm trên thảo dược thô (chưa chế biến) trong quá trình thu hoạch, sau thu hoạch, nhất là trong quá trình làm khô, bảo quản, vận chuyển và chế biến Trên cơ sở kết quả của nghiên cứu này, các tác giả đã kết luận rằng: Sự lây nhiễm nấm trên các nguyên liệu thực vật làm thuốc là đáng báo động, và các nguyên liệu này cần phải được nghiên cứu kỹ trước khi được chuyển đến các nhà máy sản xuất thuốc và cộng đồng sử dụng

Để đánh giá mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên vỏ quế (từ cây quế

Cinamomum zeylanicum Blume), 50 mẫu dược liệu này được thu thập từ các

hiệu bán lẻ ở khu vực miền đông của Arập Xeut Tổng số 1.126 chủng nấm

thuộc 8 loài của 2 chi Aspergillus, Penicillium đã được phân lập và nhận diện

từ 50 mẫu nghiên cứu Các chủng nấm đã phân lập được từ tất cả các mẫu vỏ,

thuộc các loài Aspergillus terreus, A glaucus, A flavus, A fumigatus, A

clavatus, A niger, Penicillium restrectum và Penicillium sp Phân tích

mycotoxin trên các mẫu vỏ cho thấy: các aflatoxin B1, B2 và G1 được phát hiện ở nồng độ thấp (không vượt quá 4,67 µg/kg) từ 62% các mẫu nghiên cứu, và 17 mẫu không phát hiện thấy các aflatoxin này [14]

Khati [26] đã khảo sát mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên 10 mẫu thảo dược thô của 10 cây thuốc, được bảo quản ở các địa điểm khác nhau, thuộc bang Haridwar, Ấn Độ Kết quả cho thấy: Tất cả các mẫu đã bị nhiễm

một hoặc nhiều chi nấm gồm: Alternaria, Aspergillus, Fusarium,

Chaetomium, Cladosporium, Curvularia, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Rhizoctonia và Verticillium Trong số các chủng nấm phân lập được, loài Aspergillus flavus xuất hiện với tần số cao nhất (23,6%), tiếp sau là loài A niger (19,2%) Kết quả phân tích aflatoxin cho thấy: 2/10 mẫu đã bị nhiễm

aflatoxin B1 Từ kết quả phân tích nấm mốc và độc tố cho thấy: Các thảo dược có thể tiềm ẩn rủi ro đối với sức khỏe của người tiêu dùng Đồng thời cho thấy sự cần thiết phải kiểm tra chặt chẽ các thảo dược trước khi cho phép đưa vào sử dụng trong cộng đồng

Khảo sát chất lượng của 36 mẫu hạt tiêu (được làm khô bằng ánh nắng mặt trời và bảo quản ở tỉnh Razavi Khorasan, Iran, trong khoảng thời gian cuối hè đầu mùa thu) về tiêu chuẩn vi sinh và mycotoxin bằng các phương pháp phân tích và xác định chuẩn cho thấy: Bên cạnh tiêu chuẩn vi khuẩn, tất

cả các mẫu nghiên cứu đã bị nhiễm nấm dao động trong khoảng 2,4 x 103

– 4,6 x 106 CFU/g Trong đó, các chi nấm phân lập được nhiều nhất là

Aspergillus, Penicillium và Rhizopus Đánh giá kết quả phân tích vi sinh thu

được cho thấy: Các mẫu hạt tiêu đã bị nhiễm vi sinh ở mức cao, chỉ có 2 mẫu (6%) là đạt tiêu chuẩn qui định của EU (2004/24/EC) Về kết quả phân tích độc tố: 69% và 17% các mẫu nghiên cứu bị nhiễm lần lượt aflatoxin toàn phần và ochratoxin A, có thể gây nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng Kết quả của nghiên cứu này là một cảnh báo về tiêu chuẩn vi sinh trên nguồn nguyên liệu thảo dược và gia vị sau thu hoạch [32]

Nghiên cứu hệ vi nấm và mycotoxin trên 25 mẫu quả thô (chưa chế biến) bảo quản sau khi được phơi khô bằng ánh nắng mặt trời và 25 mẫu dạng

bột (đã qua chế biến) từ 3 cây thuốc Emblica offinalis, Terminalia bellirica và

Terminilia chebula, được thu thập từ các chợ của thành phố Gwalor, Ấn Độ

Kết quả thu được cho thấy: Khoảng 88% các mẫu quả và bột thảo dược bị

nhiễm nấm với 1.199 chủng phân lập được thuộc các chi Aspergillus,

Penicillium, Helminthosporium, Rhizopus, Syncephalastrum, Alternaria, và Curvularia Trong đó, 11 loài thuộc 5 chi được phân lập từ các mẫu quả, và 9

loài thuộc 5 chi được phân lập từ các mẫu dạng bột Khoảng 25% các mẫu quả và 12,5% các mẫu bột đã bị nhiễm các độc tố như aflatoxin, citrinin, và sterigmatocystin Sự có mặt của các loài nấm sinh độc tố và mycotoxin, có thể biến các thảo dược thô cũng như dạng bột trở nên nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng Do vậy, trước khi sử dụng, các dạng thảo dược này cần được kiểm soát chất lượng chặt chẽ và chống lây nhiễm [22]

Bokhari và cộng sự [17] đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và độc tố fumonisin trên 47 mẫu của 15 loại chè thuốc được thu thập từ các siêu thị và các phố chợ ở Jeddah (Arập Xêut) kết quả cho thấy: Hệ vi nấm khá phong phú với 25 loài thuộc 13 chi đã phân lập được từ các mẫu nghiên cứu Trong

số đó, Aspergillus, Penicillium, và Fusarium là các chi có khả năng sinh nhiều

độc tố và phân lập được nhiều nhất Kết quả phân tích fumonisin bằng HPLC cho thấy: lượng độc đố phát hiện được dao động trong khoảng 0-260 µg/kg

Như vậy, sự có mặt của các loài nấm sinh độc tố đã đưa đến rủi ro nhiễm mycotoxin tiềm tàng Trong khi mức độ sử dụng nguồn dược thảo trên thế giới ngày càng tăng, cho thấy sự cần thiết phải có các qui định về chỉ tiêu nấm mốc và mycotoxin trong các loại thảo dược thô để giảm rủi ro về sức khỏe của người tiêu dùng

1.3 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dược ở trong nước

Trong nước, trong khoảng 10-15 năm trở lại đây các công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược không nhiều Một số công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố trên một

số vị thuốc (được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược) bằng phương pháp đặt trực tiếp trên môi trường PDA [1], [3], [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [13] Trong các công trình này, phương pháp phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái vi học trên môi trường chuẩn Czapek Dox Bên cạnh phương pháp hình thái, phương pháp sinh hóa (sử dụng môi trường AFPA) để nhận

diện 2 loài A flavus và A.parasiticus cũng được áp dụng Kết quả phân lập và

phân loại cho thấy, các chủng nấm phân lập được chủ yếu thuộc chi

Aspergillus, tiếp sau là chi Penicillium và nhóm nấm tiếp hợp với các chi Rhizopus, Absidia và Mucor Trong đó, các loài có khả năng sinh độc tố như

A flavus, A niger thường chiếm tỷ lệ cao [3], [8], [9] Kết quả phân tích độc

tố cho thấy, một số vị thuốc dạng quả, hạt (hạt sen, ý dĩ) bị nhiễm aflatoxin quá mức cho phép của ngành y tế [3]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

10 mẫu kha tử và 10 mẫu nhục đậu khấu được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn Hà Nội (phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm), được chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập và phân loại nấm

2.1.2 Môi trường phân lập và xác định nấm mốc

Môi trường PDA (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Khoai tây gọt vỏ: 200; Glucose: 20; Thạch: 15; pH cuối cùng (25o

C) 5,6 ±0,2

Môi trường Dichloran Glycerol Medium Base - DGM (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Peptone: 5; Glucose: 10; KH2PO4: 1; MgSO4: 0,5; Dichloran: 0,002; Chloramphenicol: 0,1; Thạch: 15; pH cuối cùng (25o

C): 5,6

± 0,2

Môi trường xác định 2 loài A flavus và A parasiticus: Aspergillus

Differentiation Medium Base - ADM (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Peptone: 10; Cao nấm men: 20; Ferric amonium citrate: 0,5; Dichloran: 0,002; Thạch: 15; pH cuối cùng (25o

C): 6,3 ± 0,2

Môi trường Czapek Dox Agar (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Đường kính: 30; NaNO3: 2,0; KCl: 0,5; K2HPO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,5; FeSO4.7H2O: 0,01; Thạch: 15; pH cuối cùng (25o

C): 7,3 ± 0,2

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

Kính hiển vi Axiostar plus, Carl Zeiss (Đức), gắn máy chụp ảnh kỹ thuật

Nồi hấp tiệt trùng Hiclave HVE - 25, Hirayama (Nhật Bản)

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Xác định hàm ẩm, xử lý các mẫu dược liệu của 2 vị thuốc nghiên cứu, đặt lên các đĩa Petri chứa môi trường phân lập (PDA hoặc DGM) đã được chuẩn bị và ủ ở 27ºC trong 5-7 ngày

 Phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu dược liệu nghiên cứu

 Nuôi cấy các chủng nấm phân lập được trên môi trường Czapek Dox Agar

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu

Hàm ẩm các mẫu dược liệu được xác định bằng phương pháp "Mất khối lượng do làm khô" (Phụ lục 9.6, DĐVN IV) Cách tiến hành: Dược liệu được nghiền thô, thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm Cân một lượng mẫu thử (m), tiến hành làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 105C trong vòng 5 giờ với kha tử, và đến khối lượng không đổi với nhục đậu khấu Sau khi sấy, làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm rồi cân ngay (m’)

Tính kết quả hàm ẩm theo công thức sau:

trùng hệ vi nấm bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorid 1% mới pha trong 2 phút Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất đã khử trùng Để ráo nước, cắt thành các mảnh nhỏ kích thước 1-1,5 cm và đặt nhanh vào các đĩa Petri đã có môi trường PDA (hoặc DGM) bằng kẹp vô trùng (thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

Ủ ở nhiệt độ 27°C, sau 5-7 ngày tiến hành phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu dược liệu nghiên cứu

2.3.3 Phương pháp phân loại nấm mốc

 Phân loại các chi nấm theo khóa phân loại của Barnet và Hunter [16]

 Phân loại các chủng nấm đến cấp loài thuộc các chi khác (Aspergillus,

Penicillium,…) dựa trên mô tả đặc điểm khuẩn lạc, vi học các loài của

Samson và cộng sự 1995 [33], Raper và Fennell 1965 [31], Pitt và Hocking

2009 [30] Nguyên lý của phương pháp là dựa trên sự so sánh đặc điểm khuẩn lạc (đường kính khuẩn lạc, màu sắc mặt trước và sau của khuẩn lạc, các chất tiết trên khuẩn lạc …) và đặc điểm vi học (chủ yếu là cấu trúc sinh conidi, kích thước, màu sắc của cấu trúc sinh conidi và conidi,…) của các chủng khi được nuôi cấy trên môi trường chuẩn (Czapek Dox), trong cùng điều kiện (nhiệt độ, thời gian…)

 Xác định 2 loài A flavus, A parasiticus theo phương pháp sinh hóa của Pitt và Hocking [30] Nguyên lý của phương pháp là các chủng của 2 loài A

flavus, A parasiticus khi nuôi cấy trên môi trường ADM, ủ ở nhiệt độ 30°C

sau 42-48 giờ sẽ xuất hiện màu vàng cam sáng ở mặt trái (mặt sau) khuẩn lạc

2.3.4 Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm

Mức độ nhiễm các loài (hoặc chi) được tính theo 2 chỉ số:

 Chỉ số có mặt hay tần suất xuất hiện loài (hoặc chi) trên các mẫu nghiên cứu: FQ (isolation frequency, %) = số mẫu có mặt loài (hoặc chi)/ tổng số mẫu nghiên cứu x 100% [24]

 Chỉ số có nhiều hay mật độ loài (hoặc chi): RD (relative fungal density, %) = số chủng có mặt của loài (hoặc chi)/ tổng số chủng nấm phân lập được x 100% [24]

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc kha tử

3.1.1 Hàm ẩm của các mẫu kha tử nghiên cứu

Trong các yếu tố sinh thái ảnh hưởng đến sự lây nhiễm và phát triển của nấm mốc trên các cơ chất nói chung và kha tử nói riêng, hàm ẩm của cơ chất là một yếu tố quan trọng Do vậy, các mẫu của vị thuốc này trước khi tiến hành phân lập nấm, được xác định hàm ẩm và kết quả được liệt kê trong bảng 3.1 dưới đây

Bảng 3.1 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc kha tử nghiên cứu

3.1.2 Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu kha tử nghiên cứu

a) Kết quả phân lập và phân loại

Kết quả phân lập và phân loại các chủng nấm nhiễm trên 10 mẫu của vị thuốc kha tử nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Số lượng các chủng, chi và loài nấm phân lập được từ 10 mẫu kha tử nghiên cứu

Kết quả thu được từ bảng 3.2 cho thấy: Từ 10 mẫu kha tử nghiên cứu

đã phân lập được 248 chủng nấm thuộc 8 loài của 4 chi (Aspergillus,

Penicillium, Rhizopus và Absidia) Trong đó, chi Aspergillus có 5 loài gồm:

A niger (hình 3.1) chiếm tỷ lệ cao nhất về chỉ số có nhiều là 57,66%

(143/248) và có mặt trên 100% (10/10) số mẫu nghiên cứu Xếp thứ 2 là loài

A fumigatus (hình 3.2) có chỉ số có nhiều là 13,31% (33/248), và có mặt trên

40% (4/10) số mẫu nghiên cứu Xếp thứ 3 là loài A flavus (hình 3.3), với chỉ

số có nhiều và chỉ số có mặt lần lượt là 9,68% (24/248) và 60% (6/10) Các

loài A aculeatus và A ustus đều xếp thứ 4 với chỉ số có nhiều và chỉ số có

mặt đều là 2,02% (5/248) và 30% (3/10) Các chi nấm tiếp hợp có 2 loài phân

lập được là R Stolonifer và Absidia corymbifera với chỉ số có nhiều và chỉ số

Chi & loài 69

có mặt lần lượt là 8,47% (21/248) và 50% (5/10); 4,44% (11/248) và 30%

(3/10) Chi Penicillium với 6 chủng phân lập (thuộc một loài chưa được xác

định), chiếm tỷ lệ chủng phân lập được là 2,42% và xuất hiện trên 3 mẫu nghiên cứu

b) Đặc điểm khuẩn lạc, vi học của một số loài phân lập được từ 10 mẫu kha

tử nghiên cứu

Đặc điểm khuẩn lạc và vi học của các chủng nấm được khảo sát khi nuôi cấy đơn tại 3 điểm trên các đĩa Petri chứa môi trường chuẩn Czapek Dox Agar và ủ ở 25oC sau 5 ngày Bảng 3.3 dưới đây trình bày đặc điểm khuẩn lạc của một số loài quan trọng phân lập được từ các mẫu kha tử nghiên cứu

Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài quan trọng

phân lập được từ các mẫu kha tử nghiên cứu (môi trường Czapek Dox, 25oC, 5 ngày tuổi)

A fumigatus Xanh xám Không màu 4,5-5,5

A aculeatus Nâu tím Không màu 4,5-6

A ustus Màu kem Không màu 4,0-5,5

Đặc điểm vi học của một số loài quan trọng phân lập được từ các mẫu kha tử nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.4