Tiếp tục nghiên cứu bào chế niosome natri diclofenac ứng dụng trong dạng thuốc dùng qua da

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều chế phẩm chứa diclofenac với các đường dùng phong phú như viên nén đường uống, thuốc tiêm đường tiêm, emulgel ngoài da…Và trong điều trị các bệnh v

QUA DA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

QUA DA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS Trần Thị Hải Yến

Nơi thực hiện

Bộ môn Bào chế

Xin cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, những người thầy đã dạy dỗ, dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học tập dưới mái trường Đại học Dược Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên, hỗ trợ và động viên tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt khoá luận này

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017

Trần Ngọc Giang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁCH HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1 Tổng quan về diclofenac natri 2

1.1.1 Công thức hoá học 2

1.1.2 Tính chất vật lý, hoá học 2

1.1.3 Một số thông số dược động học 3

1.1.4 Tác dụng dược lý 3

1.1.5 Chỉ định 4

1.1.6 Tác dụng không mong muốn 4

1.1.7 Chống chỉ định và thận trọng 5

1.1.8 Các dạng bào chế 5

1.1.9 Ưu điểm của chế phẩm natri diclofenac dùng ngoài da trong điều trị các bệnh cơ xương khớp 5

1.2 Tổng quan về hệ tiểu phân nano niosome 6

1.2.1 Khái niệm 6

1.2.2 Phân loại 7

1.2.3 Ứng dụng của niosome trong lĩnh vực dược phẩm 7

1.2.4 Bào chế niosome bằng phương pháp tiêm ethanol 8

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng tạo niosome của chất diện hoạt không ion hoá 12

1.2.6 Ứng dụng hệ vận chuyển niosome vào dạng thuốc dùng ngoài da 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Hoá chất, nguyên liệu, thiết bị và động vật thí nghiệm 16

2.2.1 Hoá chất và nguyên liệu sử dụng 16

2.2.2 Thiết bị 17

2.2.3 Động vật thí nghiệm 18

2.3 Nội dung nghiên cứu 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Bào chế niosome natri diclofenac bằng phương pháp tiêm ethanol 18

2.4.2 Bào chế gel chứa niosome natri diclofenac 1% 19

2.4.3 Bào chế gel natri diclofenac 1% 19

2.4.4 Đánh giá một số đặc tính tiểu phân niosome natri diclofenac 19

2.4.5 Đánh giá sinh khả dụng của gel chứa niosome NaD 1% bằng thử nghiệm ex-vivo 25

2.4.6 Bước đầu đánh giá sinh khả dụng của gel chứa niosome NaD 1% bằng thử nghiệm in-vivo 27

2.4.7 Phương pháp HPLC định lượng NaD trong các thử nghiệm ex-vivo và in-vivo 30

2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Bào chế và đánh giá niosome natri diclofenac 33

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn loại Span 33

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn tỷ lệ mol dược chất/tổng tá dược dầu 35

3.1.3 Đánh giá một số đặc tính của tiểu phân niosome NaD 39

3.2 Đánh giá sinh khả dụng gel chứa niosome natri diclofenac 1% qua thử nghiệm ex-vivo và in-vivo 41

3.2.1 Thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp HPLC định lượng diclofenac natri trong môi trường muối đệm phosphat pH 7,4 41 3.2.3 Đánh giá sinh khả dụng của gel chứa niosome NaD 1% bằng thử nghiệm

ex-vivo 43

3.2.4 Bước đầu đánh giá sinh khả dụng của gel chứa niosome NaD 1% bằng

thử nghiệm in-vivo 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Độ tan natri diclofenac theo pH 3

2 Bảng 1.2 Dược chất sử dụng trong hệ vận chuyển niosome 7

3 Bảng 1.3 Mối quan hệ giữa CPP và cấu trúc hình thành 13

4 Bảng 2.1 Hoá chất và nguyên liệu sử dụng 16

5 Bảng 3.1 Thành phần các công thức khảo sát 33

6 Bảng 3.2 Thành phần các công thức khảo sát 35

7 Bảng 3.3 Thành phần các công thức khảo sát 37

8 Bảng 3.4 Số sóng liên kết O-H, liên kết C-O (nhóm acid), liên kết

-C=O (nhóm este) trong phổ IR các mẫu khảo sát 39

9 Bảng 3.5 Thành phần các mẫu gel đánh giá bào chế theo quy trình

10 Bảng 3.6 Nồng độ dược chất trong máu tại các thời điểm 45

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Công thức phân tử natri diclofenac 2

3 Hình 1.3 Phân loại niosome theo kích thước 7

4 Hình 1.4 Cơ chế hình thành niosome bằng phương pháp tiêm

ethanol

9

7 Hình 1.7 Sơ đồ mô hình bào chế niosome quy mô pilot sử dụng

10 Hình 1.10 Cơ chế vận chuyển thuốc qua da của niosome 15

11 Hình 3.1 Đồ thị KTTP và PDI công thức S1, S2, S3 của Span 60

14 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn hiệu suất nạp và lượng dược chất

(mmol) được nạp khi thay đổi tỷ lệ mol NaD/TDD và cố định tỷ lệ

mol cholesterol/Span 80 4/6

36

15 Hình 3.5 KTTP và PDI các công thức khi thay đổi tỷ lệ mol dược 37

chất/TDD và cố định tỷ lệ mol cholesterol/Span80 5/5

16 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu suất nạp và lượng dược chất

(mmol) được nạp khi thay đổi tỷ lệ mol NaD/TDD và cố định tỷ lệ

mol cholesterol/Span 80 5/5

38

17 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích peak và

nồng độ natri diclofenac trong môi trường muối đệm phosphat pH

7,4

42

18 Hình 3.8 Đồ thị thể hiện khả năng giải phóng dược chất qua da

của các công thức gel M8 1%, gel N8 1%, Voltaren Emulgel1% và

gel NaD 1%

43

19 Hình 3.9 Đồ thị thể hiện lượng dược chất lưu trữ trong da sau 24

giờ của các công thức gel M8 1%, gel N8 1%, Voltaren Emulgel

1% và gel NaD 1%

44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

%EE Hiệu suất nạp (Encapsulation Efficiency)

AUC Diện tích dưới đường cong (Area under the curve)

CDH Chất diện hoạt

CPP Critical Packing Parameter

DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV

DSC Phân tích nhiệt quét vi sai (Differential Scanning Calorimetry) EDTA Acid ethylendiamin tetraacetic

FESEM Kính hiển vi điện tử quét trường phát xạ

(Field Emission Scanning Electron Microscopy) HLB Chỉ số cân bằng dầu nước (Hydrophilic lipophilic balance) KTTP Kích thước tiểu phân

NaD Natri Diclofenac

NSAIDs Các thuốc chống viêm không steroid

(Non-steroidal anti inflammatory drugs) NSX Nhà sản xuất

PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

PTFE Polytetrafluoroethylene

RI Chỉ số khúc xạ (Refractive Index)

SPG Shirasu Porous Glass

TDD Tá dược dầu

TKHH Tinh khiết hoá học

XRD Nhiễu xạ tia X (X-ray Diffraction)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) đã được sử dụng từ rất lâu trong điều trị các bệnh cơ xương khớp và giảm các triệu chứng đau trên bệnh nhân viêm cơ xương khớp Đặc biệt là dược chất diclofenac - dẫn chất của acid phenylacetic với các ưu điểm nổi bật như: giảm đau, chống viêm nhanh, mạnh và độc tính thấp Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều chế phẩm chứa diclofenac với các đường dùng phong phú như viên nén (đường uống), thuốc tiêm (đường tiêm), emulgel (ngoài da)…Và trong điều trị các bệnh về cơ xương khớp, dạng gel bôi ngoài da thể hiện nhiều ưu thế hơn cả, bao gồm: thuận tiện sử dụng, tác dụng khu trú tốt tại nơi dùng…

Ngành dược phẩm thế giới đang có một bước tiến lớn với sự phát triển mạnh

mẽ của công nghệ nano trong việc bào chế các dạng thuốc và bước đầu đã đạt được những thành công nhất định Tiểu phân niosome với kích thước tiểu phân nhỏ (từ vài chục nm tới vài chục 𝜇𝑚); có cấu trúc của một hệ vận chuyển thuốc giúp tăng khả năng vận chuyển dược chất tới đích tác dụng, từ đó tăng hiệu quả điều trị; hiệu suất nạp dược chất và độ ổn định cao hoàn toàn có thể ứng dụng trong điều chế dạng thuốc dùng ngoài da Tại bộ môn Bào chế, Lê Thị Giang (2016) [5] đã bước đầu nghiên cứu bào chế niosome natri diclofenac ứng dụng trong dạng thuốc dùng qua da sử dụng Span 60 và đánh giá khả năng giải phóng dược chất qua da của gel chứa niosome natri diclofenac 1% Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Tiếp tục nghiên cứu bào chế niosome natri diclofenac ứng dụng trong dạng thuốc dùng qua da” với các mục tiêu:

1 Bào chế và đánh giá một số đặc tính tiểu phân niosome natri diclofenac

2 Bước đầu đánh giá sinh khả dụng của gel chứa niosome natri diclofenac 1%

bằng các thử nghiệm ex-vivo và in-vivo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1 Tổng quan về diclofenac natri

1.1.1 Công thức hoá học

Hình 1.1 Công thức phân tử natri diclofenac

Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2

Khối lượng phân tử: 318,14 g/mol

Tên khoa học: 2-[(2,6-dichlorophenyl)amino]benzenacetate natri

Tên chung quốc tế: Diclofenac natri

1.1.2 Tính chất vật lý, hoá học

Ø Tính chất vật lý:

- Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần vàng nhạt

- Độ tan: Hơi tan trong nước, độ tan trong nước ở 25℃ thay đổi tuỳ theo giá trị

pH (Bảng 1); tan tốt trong MeOH (24 mg/ml); tan trong EtOH, acetone; thực

tế không tan trong ether

- Nhiệt độ nóng chảy: 283-285℃

- Hệ số phân bố dầu nước logP (n-octanol/ dung dịch đệm pH 7,4): 13,4 [24]

- Cực đại hấp thụ tia UV trong dung môi MeOH: 283 nm; trong đệm phosphat

pH 7,2: 276 nm

Ø Tính chất hoá học:

- Dung dịch 1% có pH khoảng 7 đến 8,5 [34]

3

- Là dẫn chất của anilin, diclofenac có thể bị oxy hoá Dung dịch diclofenac trong MeOH, thêm acid HNO3 đặc cho màu đỏ nâu Dung dịch diclofenac trong EtOH cho phản ứng với dung dịch K3[Fe(CN)6], FeCl3 và acid HCl cho màu xanh và có tủa [1], [2]

Bảng 1.1 Độ tan natri diclofenac theo pH [16]

- Thải trừ: Khoảng 65% liều được thải trừ qua nước tiểu và 35% qua mật Độ thanh thải 15,6 L/h, thời gian bán thải khoảng 1,5 giờ [4]

TW nhóm opiat) không giảm đau sâu trong nội tạng, không ức chế hô hấp và không gây lệ thuộc khi dùng kéo dài [4]

Cơ chế giảm đau: thuốc làm giảm tổng hợp Prostaglandin F2, làm giảm tính cảm thụ của ngọn dây thần kinh cảm giác với các chất gây đau của phản ứng viêm như bradykinin, serotonin…

- Tác dụng chống viêm:

Cơ chế chống viêm: ức chế enzyme cyclooxygenase (COX), ngăn cản tổng hợp prostaglandin- chất trung gian hoá học gây viêm, từ đó làm giảm quá trình viêm Ngoài ra, còn đối kháng với hệ enzym phân huỷ protein, ngăn cản quá trình biến đổi protein làm bền vững màng lysosom và đối kháng tác dụng của các chất trung gian hoá học như bradykinin, histamin, serotonin, ức chế hoá hướng động bạch cầu, ức chế sự di chuyển của bạch cầu tới ổ viêm [4]

1.1.5 Chỉ định

Điều trị các cơn đau cấp, đau bụng kinh, đau sỏi thận, đau dây thần kinh; điều trị viêm khớp, thoái hoá khớp cấp và mạn tính

1.1.6 Tác dụng không mong muốn

Tác dụng không mong muốn chủ yếu liên quan tới tác dụng ức chế tổng hợp prostaglandin [3], [4]

- Trên tiêu hoá: Kích ứng, đau thượng vị, nặng hơn có thể là loét dạ dày tá tràng, xuất huyết tiêu hoá…

- Trên thận: Làm giảm lưu lượng máu qua thận, giảm sức lọc cầu thận, giảm thải dẫn đến ứ nước, tăng kali máu và viêm thận kẽ

- Trên hô hấp: Gây cơn hen giả ở người không bị hen hoặc làm tăng các cơn hen ở người bị hen phế quản

- Trên máu: Kéo dài thời gian chảy máu do ức chế kết tập tiểu cầu, giảm tiểu cầu và giảm prothrombin Hậu quả gây kéo dài thời gian đông máu, mất máu không nhìn thấy qua phân, tăng nguy cơ chảy máu

5

1.1.7 Chống chỉ định và thận trọng

Chống chỉ định: các trường hợp mẫn cảm với diclofenac; loét dạ dày tiến triển hoặc

có tiền sử loét; suy thận, suy gan nặng; người đang dùng thuốc chống đông coumarin, kể cả heparin liều thấp; người bị bệnh chất tạo keo (nguy cơ viêm màng não vô khuẩn) [3]

Thận trọng: người có tiền sử loét, chảy máu hoặc thủng dạ dày; suy gan; suy thận; lupus ban đỏ toàn thân; tăng huyết áp; suy tim; nhiễm khuẩn; tiền sử rối loạn đông máu, chảy máu; cần khám mắt khi bị rối loạn thị giác [3]

Gần đây, các chế phẩm NSAIDs dùng ngoài da được tập trung nghiên cứu gắn với

hệ vận chuyển thuốc đích nhằm giảm hấp thu toàn thân, giảm độc tính mà không ảnh hưởng tới hiệu quả điều trị tại chỗ [30] Để đạt hiệu quả tối ưu, các NSAIDs phải xâm nhập tới mô viêm ở nồng độ thích hợp để kích hoạt cơ chế chống viêm Các nghiên cứu về hiệu quả điều trị bệnh viêm khớp của chế phẩm bôi ngoài da diclofenac đã được tiến hành như: gel natri diclofenac 1%, gel diethylamin diclofenac 1,16%, gel MIKA diclofenac 4% dạng xịt, lotion diclofenac DMSO và miếng dán diclofenac epolamin Trong một nghiên cứu so sánh sinh khả dụng của gel bôi natri diclofenac 1% với natri diclofenac đường uống trên người tình nguyện khoẻ mạnh, Kienzler đã chứng minh rằng mức độ hấp thu toàn thân của dạng bôi ngoài da thấp hơn 5-17 lần so với dạng uống [12] Đồng thời, dạng bôi ngoài da

cũng đạt nồng độ cao hơn tại các tổ chức cơ và mô mỡ lân cận [25], [39] Tuy nhiên, nồng độ tại dịch ổ khớp thấp hơn đường uống [39]

Về hiệu quả điều trị bệnh viêm khớp gối, 10 thử nghiệm lâm sàng có đối chứng, ngẫu nhiên, mù đôi được tiến hành trên các dạng bào chế khác nhau như miếng dán, dung dịch hay gel [8], [10], [11], [21], [29], với các tiêu chí đánh giá: mức độ đau, hoạt động thể chất, đánh giá của bệnh nhân về tình trạng bệnh và mức độ hiệu quả điều trị bệnh Kết quả cho thấy mức độ đau giảm đáng kể và họat động thể chất của bệnh nhân được cải thiện so với nhóm chứng placebo ở ngày thứ 7 và ngày thứ 14 [21] Các tác dụng phụ ghi nhận được chủ yếu xảy ra tại nơi dùng thuốc: khô da, mẩn ngứa [8], [10], [11], [21], [29] hoặc tỷ lệ xuất hiện rất thấp trên đường tiêu hoá: đau bụng, buồn nôn và được đánh giá là giảm các tác dụng phụ toàn thân so với đường uống Tổ chức quốc tế nghiên cứu về viêm xương khớp (OARSI- Osteoarthritis Research International) khuyến cáo phác đồ điều trị gồm NSAIDs bôi tại chỗ điều trị thay thế hoặc hỗ trợ điều trị viêm khớp gối [17]

1.2 Tổng quan về hệ tiểu phân nano niosome

1.2.1 Khái niệm

Niosome là tiểu phân dạng nang gồm một khoang nước ở giữa được bao bọc bởi một lớp vỏ chất diện hoạt không ion hoá (gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có thể được ổn định bằng cholesterol…), kích thước từ hàng chục nm đến hàng chục 𝜇𝑚 Các niosome có thể mang dược chất thân nước, dược chất thân dầu và dược chất lưỡng thân do cấu trúc độc đáo của mình [5]

Hình 1.2 Cấu trúc niosome

7

1.2.2 Phân loại

Dựa vào kích thước, có thể chia niosome thành 3 loại:

- Loại nhỏ đơn lớp (SUV-Small Unilamellar Vesicle): đường kính từ 10-100

nm

- Loại lớn đơn lớp (LUV- Large Unilamellar Vesicle): đường kính từ

100-3000 nm

- Loại đa lớp (MLV-Multilamellar Vesicle): đường kính >1000 nm

Hình 1.3 Phân loại niosome theo kích thước

(từ trái qua phải: SUV, LUV và MLV)

1.2.3 Ứng dụng của niosome trong lĩnh vực dược phẩm

Trong lĩnh vực dược phẩm, niosome được dùng với nhiều hoạt chất điều trị và chẩn đoán như: chất chống lão hoá, chống ung thư, chống viêm, chống nhiễm khuẩn, điều trị Alzheimer…[23] với các đường dùng: tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, đường uống, nhỏ mắt, bôi ngoài da…

Bảng 1.2 Dược chất sử dụng trong hệ vận chuyển niosome [18], [28], [35]

Tiêm tĩnh mạch Doxorubicin, methotrexate, vincristin, diclofenac natri,

indomethacin, tretinoin, amphotericin B Nhỏ mắt Timolol maleate, cyclopentolate

Bôi ngoài da Piroxicam, estradiol, ketoconazol, ketorolac, enoxacin,

Flurbiprofen Nhỏ mũi Sumatriptan, vaccin virus cúm

Xông hít Các dạng chuyển hoá của vitamin A

Đường uống DNA vaccin, protein, peptid, ciprofloxacin, norfloxacin,

insulin

1.2.4 Bào chế niosome bằng phương pháp tiêm ethanol

Kể từ báo cáo đầu tiên về khả năng tự nang hoá của chất diện hoạt không ion hoá đến từ một sáng chế trong lĩnh vực mỹ phẩm của hãng L’Oreal, mô hình đưa dược chất vào niosome để tăng hiệu quả vận chuyển tới đích tác dụng nhận được sự đồng thuận rộng rãi trong giới nghiên cứu khoa học Có rất nhiều phương pháp bào chế niosome đã được nghiên cứu và phát triển cho tới ngày nay như: phương pháp hydrat hoá màng film, phương pháp bốc hơi pha đảo, phương pháp vi dòng chảy…Hiện nay, phương pháp tiêm ethanol được ứng dụng quy mô lớn do quy trình bào chế đơn giản, thực hiện dễ dàng hơn các phương pháp khác; tính lặp lại cao, dễ đồng nhất lô mẻ Ngoài ra, phương pháp này còn có một số ưu điểm như: niosome thu được là loại SUV mà không cần thêm các phương pháp làm giảm KTTP; không

sử dụng dung môi hữu cơ độc hại với sức khoẻ con người như methanol, chloroform và lượng nhỏ ethanol trong hỗn dịch thu được có thể giúp bảo quản chế phẩm Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số nhược điểm như: hỗn dịch niosome thu được có nồng độ thấp; hiệu suất nạp dược chất thấp, đặc biệt với các dược chất tan trong nước

a Quy trình thực hiện:

Chất diện hoạt và các thành phần tạo màng được hoà tan trong ethanol, sau đó tiêm vào pha nước ở nhiệt độ thích hợp, kết hợp khuấy trộn hoặc siêu âm làm giảm kích thước tiểu phân Dược chất có thể được hoà tan vào pha nước hoặc trong ethanol

9

tuỳ độ tan Khuấy từ qua đêm hoặc cất quay để loại dung môi hữu cơ Sau đó, tiến hành thêm các phương pháp loại dược chất tự do

b Cơ chế tạo niosome bằng phương pháp tiêm ethanol

Đến nay, cơ chế hình thành niosome bằng phương pháp này chưa thực sự rõ ràng nhưng có thể giải thích theo các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Các phân tử chất diện hoạt hoà tan trong ethanol, tồn tại ở trạng thái tự

do

Giai đoạn 2: Khi tiêm pha ethanol vào nước, ethanol bị pha loãng ngay lập tức và

có một phần bay hơi làm các phân tử chất diện hoạt giảm độ tan (do thay đổi dung môi), tập hợp thành các mảng kép có các đuôi thân dầu hướng vào nhau, các đầu thân nước hướng ra ngoài môi trường nước

Giai đoạn 3: Dưới điều kiện có sự phân tán năng lượng đồng nhất trong môi trường bằng khuấy trộn hoặc siêu âm, các màng kép có xu hướng giảm diện tích tiếp xúc với môi trường nước nhằm bảo toàn năng lượng tự do bề mặt Vì thế, các màng kép lớn dần lên và cầu hoá tạo thành niosome

Hình 1.4 Cơ chế hình thành niosome bằng phương pháp tiêm ethanol

c Những cải tiến của phương pháp tiêm ethanol

Dựa trên phương pháp được mô tả lần đầu bởi Batzi và Korn năm 1973, tới nay, đã

có một số nghiên cứu cải tiến nhằm tối ưu hoá quy trình, tăng hiệu suất nạp và nâng quy mô áp dụng

Kỹ thuật tiêm chéo dòng (crossflow injection technique) do các nhà khoa học

Áo phát minh (2001) có thể tích bào chế lớn trong khoảng 100-2400ml, độ lặp lại

cao giữa các lô mẻ Kim phun được thiết kế gồm 2 thanh thép không rỉ hàn vuông góc chữ thập Tại điểm kết nối, các phần được khoan một lỗ phun có kích thước 150

và 250nm Pha nước được bơm nhu động bơm liên tục từ (2) sang (3) hoặc lại quay trở lại (2) Khi pha nước đi qua hệ thống kim phun, pha ethanol được tiêm vào pha nước dưới áp lực của (5) qua đầu kim phun [37]

Hình 1.5 Sơ đồ mô hình tiêm chéo dòng

Chú thích: 1- Hệ thống kim phun; 2,3- Pha nước; 4- Pha ethanol; 5- Thiết bị nén

khí N 2 ; 6- Bơm nhu động

Phương pháp sử dụng màng tiếp xúc được Jaafar-Maalej.C cùng các cộng sự của mình đưa ra năm 2010 Theo đó, pha nước được bơm thành dòng trong lòng màng trong khi pha ethanol được nén thành các tia nhỏ đi qua lỗ xốp của màng Các tiểu phân được tạo ra ngay khi pha ethanol tiếp xúc với pha nước Hỗn dịch niosome tạo thành được khuấy từ trong 15 phút Mô hình này tạo ra các tiểu phân

đa lớp, kích thước 50-160nm, quy mô lớn [22]

11

Hình 1.6 Sơ đồ mô hình màng tiếp xúc

Năm 2014, một nhóm các nhà khoa học người Pháp tiến hành nghiên cứu mô hình nâng cấp lên quy mô pilot với thể tích hỗn dịch thu được lên tới 10 lít sử dụng ống tiêm đường kính trong 5 mm hoặc màng SPG như hình 1.7 và 1.8 dưới đây [15]:

Hình 1.7 Sơ đồ mô hình bào chế niosome quy mô pilot sử dụng ống tiêm

Đối với mô hình sử dụng ống tiêm, pha ethanol và pha nước được gia nhiệt trong bình 2 vỏ tới 50℃ Pha ethanol được tiêm vào pha nước bằng bơm nhu động và ống tiêm cắm ngập trong pha nước Sau đó, hỗn dịch niosome thu được khuấy tiếp tục

15 phút Loại ethanol trực tiếp trên hệ thống với các điều kiện: tốc độ cánh khuấy

250 vòng/phút, thời gian khuấy 90 phút ở nhiệt độ 50℃, áp suất 140 mbar

1 Bình khí nén

2 Pha ethanol

3 Pha nước

4 Màng tiếp xúc 5.Hỗn dịch niosome

Hình 1.8 Sơ đồ mô hình bào chế niosome quy mô pilot sử dụng màng SPG

Đối với mô hình sử dụng màng SPG, pha ethanol được chứa trong bình thuỷ tinh, trong khi pha nước và hỗn dịch niosome chứa trong các bình 2 vỏ có điều nhiệt Pha ethanol được bơm qua các khe của màng trong khi pha nước tuần hoàn trong lòng màng Tốc độ dòng pha ethanol và pha nước được điều chỉnh sao cho 2 pha gặp nhau đồng thời Hỗn dịch niosome thu được trong mô hình này cũng được khuấy và bốc hơi loại ethanol trong các điều kiện như mô hình sử dụng ống tiêm

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng tạo niosome của chất diện hoạt không ion hoá

a Chất diện hoạt không ion hoá

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh các chất diện hoạt không ion hoá có khả năng tự cầu hoá với cấu trúc đuôi thân dầu gồm một, hai chuỗi alkyl; nhóm perfluoroalkyl hoặc một nhân steroid (đuôi alkyl từ C12-C18 và perfluoroalkyl khoảng C10) Trong khi đó, cấu trúc đầu thân nước lại đa dạng hơn rất nhiều so với cấu trúc đầu thân dầu 2 phần cấu trúc liên kết với nhau qua các liên kết ether, amid hoặc ester Năm 1985, Israelachvili đã chỉ ra rằng chỉ số CPP của chất diện hoạt có vai trò quan trọng trong việc dự báo khả năng tự cầu hoá của chúng

13

CPP = 𝜐/lcao

Trong đó, 𝜐, 𝑙c

, 𝑎o lần lượt là thể tích nhóm thân dầu, chiều dài nhóm thân dầu và

diện tích bề mặt đầu thân nước

>1 Micell đảo, đuôi thân dầu hướng ra ngoài

Bên cạnh đó, chỉ số cân bằng dầu- nước (HLB) cũng là một thông số tốt dự báo khả năng cầu hoá của các chất hiện hoạt Các Span có HLB từ 4-8 được chứng minh là

có khả năng tự cầu hoá Tuy nhiên, thực nghiệm cho thấy mặc dù Span 20 (HLB=16,7) tan được trong nước vẫn có khả năng cầu hoá với sự hỗ trợ của cholesterol

Lớp màng kép CDH được hình thành khi tăng nhiệt độ trên nhiệt độ chuyển pha Tc

của CDH (tại Tc, CDH chuyển từ trạng thái gel sang trạng thái tinh thể lỏng) Tc của

Hình 1.9 Chỉ số CPP

CDH phụ thuộc vào độ dài, mức độ no của chuỗi hydrocacbon và mức độ phân cực của đầu thân nước Niosome sử dụng trong điều trị cần ổn định trong điều kiện sinh

lý, vì vậy thường chọn các CDH có Tc >37℃

b Chất ổn định màng

Cholesterol tương tác với phân tử chất diện hoạt bằng các liên kết hydro, qua đó làm tăng độ cứng cơ học của màng Hiệu quả này đã được chứng minh bằng thử nghiệm đo áp suất bề mặt của hỗn hợp cholesterol và chất diện hoạt đơn lớp [26]

Sự có mặt của cholesterol làm giảm chuyển động quay của các chuỗi hydrocacbon, làm cho các phân tử chất diện hoạt sắp xếp có trật tự, tạo lớp màng kép cứng chắc Đồng thời làm nới rộng khoảng nhiệt chuyển pha, giảm enthalpy chuyển pha gel-tinh thể lỏng của lớp màng, tăng độ bền vững của các niosome Nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ tối ưu giữa CDH và cholesterol đảm bảo độ ổn định vật lý của niosome là 1:1

Ngoài ra, các phân tử tích điện cũng thường được thêm vào niosome với nồng độ rất nhỏ (khoảng 2,5-5% mol) để ngăn cản sự kết tụ nhờ lực đẩy tĩnh điện, qua đó làm tăng độ ổn định của hệ như: phosphat diacetyl (DCP), acid phosphotidic, stearyl pyridinium (STR)

1.2.6 Ứng dụng hệ vận chuyển niosome vào dạng thuốc dùng ngoài da

Các nghiên cứu gần đây ứng dụng niosome vào dạng thuốc dùng ngoài da như:

- Niosome lidocain hydroclorid ứng dụng gây tê tại chỗ, khắc phục khả năng thấm qua da kém của dược chất [13]

- Gel niosome methotrexat ứng dụng điều trị bệnh vảy nến, hạn chế tác dụng phụ toàn thân so với đường uống [33]

- Niosome N-acetyl glucosamin và niosome acid gallic ứng dụng điều trị sạm

da, ngăn ngừa lão hoá da do tăng giữ ẩm cho da [9]

- Niosome benzoyl peroxid trong gel HPMC ứng dụng điều trị mụn trứng cá hạn chế tác dụng gây ngứa da, mẩn đỏ của benzoyl peroxid do tăng khả năng

- Niosome thấm qua lỗ chân lông hoặc tuyến mồ hôi

- Hấp phụ và/ hoặc hoà màng niosome trên bề mặt da (được chứng minh bằng kính hiển vi điện tử tách mẫu kết đông và tán xạ tia X góc nhỏ) làm tăng gradient nhiệt động lực học của dược chất trên bề mặt, từ đó tăng tính thấm qua da của dược chất Niosome hấp thụ lên bề mặt tế bào nhờ lực hấp dẫn vật

lý hoặc bằng các liên kết đặc biệt giữa receptor và lớp màng niosome rồi đưa dược chất trực tiếp tới da Hoặc, niosome có thể hoà màng với màng tế bào, trộn lẫn các thành phần trong niosome với tế bào chất Sau đó, lysozym tế bào sẽ phân huỷ hoặc tiêu hoá lớp màng niosome, giải phóng dược chất nạp

Hình 1.10 Cơ chế vận chuyển thuốc qua da của niosome

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Niosome natri diclofenac

Gel chứa niosome natri diclofenac 1%

2.2 Hoá chất, nguyên liệu, thiết bị và động vật thí nghiệm

2.2.1 Hoá chất và nguyên liệu sử dụng

Bảng 2.1 Hoá chất và nguyên liệu sử dụng

17

2.2.2 Thiết bị

- Kim tiêm 1 ml/cc, đầu kim 27G x 3-// (Vinahankook-Việt Nam)

- Màng lọc siêu ly tâm Amicon® Ultra-4 (Merck Millipore-Mỹ)

- Bể siêu âm Wise Clean (Hàn Quốc)

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-WERKE (Đức)

- Hệ thống cất quay Rovapor R-210 (Buchi-Đức); bình cầu NS 29/32 dung tích

1000 ml (Buchi-Đức)

- Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90, Malvern (Anh)

- Máy đo quang Hitachi U-1800 (Nhật Bản)

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Ạnh)

- Thiết bị đánh giá giải phóng qua màng Hanson Research

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent HPLC 1260 (Mỹ), cột 5C18-MS-II Cosmosil 4.6ID x 250mm (Nhật Bản)

- Hệ thống sấy chân không LABTECH (DAIHANLABTECH, Hàn Quốc)

- Máy lọc nén Sartorius SM 16249 (Đức)

- Máy cất nước 2 lần Hamilton WSC/4D (Anh)

- Tủ lạnh sâu HAIER DW86W420 (Trung Quốc)

- Máy đông khô Christ Alpha (Đức)

- Máy phân tích nhiệt quét vi sai Mettle Toledo AB 204S (Thuỵ Sĩ)

- Máy đo phổ nhiễu xạ tia X D8 Advance, Brucker (Đức)

- Máy đo quang phổ hồng ngoại FT/IR-6700, Jasco (Nhật Bản)

- Máy đo FESEM S-4800, Hitachi (Nhật Bản)

- Máy nghiền đồng thể Wisestir HS-30E (Mỹ)

Chuột sau khi mua về được nuôi ổn định 1 tuần với các điều kiện phòng thí nghiệm

bộ môn Dược lực, ăn thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp và uống nước tự do

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Bào chế niosome natri diclofenac

- Đánh giá một số đặc tính tiểu phân niosome natri diclofenac

- Bào chế gel chứa niosome natri diclofenac 1%

- Đánh giá sinh khả dụng của gel chứa niosome NaD 1% bằng thử nghiệm ex-vivo

- Bước đầu đánh giá sinh khả dụng của gel chứa niosome NaD 1% bằng thử nghiệm

in-vivo

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Bào chế niosome natri diclofenac bằng phương pháp tiêm ethanol

Tham khảo quy trình của Lê Thị Giang [5], tiến hành như sau:

- Pha nước: 100 ml nước tinh khiết được đun nóng đến 60-65℃

- Pha ethanol: cân chính xác các thành phần span, cholesterol, NaD; hoà tan hoàn toàn trong 10ml ethanol 96% Đun nóng đến 60-65℃

- Phối hợp 2 pha: dùng kim tiêm 1 ml/cc tiêm 10ml pha ethanol vào 100ml pha nước ở 60-65℃, khuấy từ 1000 vòng/phút trong khoảng 3 phút

- Tiếp tục cất quay loại ethanol trong bình cầu dung tích 1000 ml với các điều kiện: tốc độ quay 150 vòng/phút, 45℃, áp suất 0,08-0,1 MPa trong 20 phút

19

- Bổ sung thể tích vừa đủ 100 ml bằng nước tinh khiết cho hỗn dịch thu được sau khi cất quay, đóng lọ, nút kín, bảo quản ở 2-8℃

2.4.2 Bào chế gel chứa niosome natri diclofenac 1%

Tham khảo quy trình của Lê Thị Giang [5], tiến hành bào chế gel như sau:

- Cất quay 100 ml hỗn dịch chứa niosome về khoảng 10 ml Bổ sung thể tích vừa đủ 10,0 ml bằng nước tinh khiết

- Hút chính xác 1 ml hỗn dịch niosome vừa bào chế được, định lượng lại dược chất toàn phần có trong hệ theo quy trình 2.4.4

- Cân chính xác các thành phần glycerin, nipagin, NaCMC, hỗn dịch niosome, nước tinh khiết vừa đủ rồi phối hợp theo trình tự như sau:

• Hoà tan nipagin trong glycerin

• Tiếp tục phối hợp hỗn dịch chứa niosome, nước tinh khiết, tạo hỗn dịch đồng nhất

• Thêm từ từ NaCMC, khuấy nhẹ một chiều, ngâm trương nở qua đêm

• Khuấy nhẹ một chiều tạo gel đồng nhất sau khi ngâm trương nở

2.4.3 Bào chế gel natri diclofenac 1%

Gel NaD 1% được bào chế bằng phương pháp hoà tan theo quy trình sau:

Cân chính xác các thành phần glycerin, nipagin, NaCMC, dược chất, nước tinh khiết vừa đủ rồi phối hợp theo trình tự sau:

• Hoà tan nipagin trong glycerin

• Hoà tan hoàn toàn dược chất trong nước tinh khiết

• Phối hợp dung dịch glycerin và dung dịch NaD, khuấy nhẹ đến đồng nhất

• Thêm từ từ NaCMC, ngâm trương nở qua đêm

• Khuấy nhẹ một chiều tạo gel đồng nhất

2.4.4 Đánh giá một số đặc tính tiểu phân niosome natri diclofenac

Ø Hình thức hỗn dịch niosome:

Hỗn dịch niosome tạo thành phải là hỗn dịch màu trắng đục, đồng nhất, không có các tiểu phân kích thước lớn quan sát được bằng mắt thường

Ø KTTP và chỉ số đa phân tán (PDI):

Phân tán hỗn dịch niosome thu được vào nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm sao cho số lượng photon được phát hiện mỗi giây (count rate) đạt giá trị 200-400 (Kcps) Tiến hành đo KTTP, chỉ số đa phân tán PDI của hỗn dịch niosome bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90, cuvet nhựa trong suốt, RIspan60 = 1,496

a Xây dựng phương pháp định lượng

- Quét phổ hấp thụ của NaD trong môi trường nước:

Cân chính xác khoảng 0,01 g NaD, hoà tan hoàn toàn trong nước tinh khiết, bổ sung vừa đủ 500,0 ml, quét phổ trên dải bước sóng từ 200-600 nm, chọn bước sóng cực đại (𝜆 max) mà tại đó độ hấp thụ A lớn nhất

- Khảo sát mối tương quan giữa nồng độ NaD và độ hấp thụ A:

Cân chính xác khoảng 0,01 g NaD, hoà tan hoàn toàn trong nước tinh khiết, bổ sung vừa đủ 50,0 ml thu được dung dịch NaD gốc khoảng 200 µg/ml Sử dụng dung dịch gốc, pipet chính xác và bình định mức pha loãng để được dãy dung dịch chuẩn gồm

6 nồng độ thích hợp

Đo độ hấp thụ A của dãy dung dịch chuẩn trên tại 𝜆 max vừa quét được

Lập đường chuẩn tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ NaD

b Định lượng dược chất toàn phần có trong hỗn dịch niosome

- Mẫu thử: Hút chính xác 1ml hỗn dịch niosome bào chế được, cho vào bình định mức 10 ml, thêm ethanol tuyệt đối vừa đủ 10,0 ml, siêu âm 30 phút để

Mẫu thử, mẫu trắng, mẫu chuẩn được lọc qua giấy lọc rồi đo quang ở 𝜆 max quét được, ghi lại giá trị A tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn Từ đó tính ra nồng độ của mẫu thử theo công thức:

Ct = 334

5´ 𝐶7´ 8

89

Trong đó:

At, Ac: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn

Ct, Cc: nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn (µg/ml)

k, k’: hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn

c Định lượng dược chất tự do trong hỗn dịch niosome

Để định lượng dược chất tự do trong hỗn dịch niosome, trước hết phải tách riêng phần dược chất tự do (chưa được nạp vào niosome) ra khỏi niosome bằng sử dụng

màng lọc ly tâm Amicon® Ultra-4 10kDa MWCO như quy trình chuẩn bị mẫu thử

dưới đây:

- Mẫu thử: hút khoảng 4 ml hỗn dịch niosome vừa bào chế được, cho vào màng

lọc ly tâm Amicon® Ultra-4 10kDa MWCO Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15

phút ở 25℃ Hút phần dịch trong đi qua màng lọc (phần dịch chứa dược chất tự do), pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng nước tinh khiết

- Mẫu trắng: nước tinh khiết

- Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,01 g dược chất, hoà tan hoàn toàn trong nước tinh khiết rồi thêm nước tinh khiết vừa đủ 100,0 ml Pha loãng bằng nước tinh khiết tới nồng độ thích hợp

Mẫu thử, mẫu chuẩn được lọc qua giấy lọc rồi đo quang ở 𝜆 max quét được, ghi lại giá trị A tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn Từ đó tính ra nồng độ của mẫu thử theo công thức:

𝐶:9= 34;

359´ 𝐶79´ 8:

87

Trong đó:

At’, Ac’: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn

Ct’, Cc’: nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn (µg/ml)

kt, kc: hệ số pha loãng của mẫu thử, mẫu chuẩn

%EE: hiệu suất nạp dược chất

Ct’, Ct: nồng độ dược chất tự do và toàn phần tương ứng (µg/ml)

- Lượng dược chất được nạp (mmol) tính theo công thức:

n= N ´ QQ%

-RR

Trong đó:

N: lượng NaD toàn phần (mmol)

n: lượng NaD được nạp vào niosome (mmol)

EE%: hiệu suất nạp dược chất (%)

Ø Hình thái tiểu phân niosome NaD

Sử dụng kính hiển vi điện tử quét trường phát xạ (FESEM)

23

Nguyên tắc: Trong cột chân không (𝑝 = 1 ´ 10TU 𝑃𝑎), các điện tử sơ cấp được tập trung lại và điều chỉnh hướng bằng các ống kính điện tử để tạo ra một chùm tia hẹp bắn phá vật liệu Tại các điểm bị bắn phá phát ra các điện tử thứ cấp Tốc độ và góc của các điện tử thứ cấp đại diện cho cấu trúc vật liệu được một dectector ghi lại và tạo thành một tín hiệu điện tử Tín hiệu này tiếp tục được khuếch đại và biến đổi thành video hình ảnh quét hoặc một hình ảnh kỹ thuật số

Mục đích: Quan sát hình thái tiểu phân niosome NaD

Chuẩn bị mẫu: Cất quay giảm thể tích 100 ml hỗn dịch niosome bào chế được theo

quy trình 2.4.1 về khoảng 10ml Hút 4 ml hỗn dịch vào màng lọc Amicon® Ultra-4,

ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút để loại dược chất tự do Lấy phần hỗn dịch trong phễu lọc, pha loãng tới nồng độ thích hợp Mẫu được gắn trên giá đo và phủ một lớp Pt để tăng độ dẫn diện rồi đưa vào buồng chứa mẫu

Ø Đánh giá bằng phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai, phổ hồng

ngoại, nhiễu xạ tia X

Tham khảo [27], tiến hành như sau:

Chuẩn bị mẫu niosome NaD: Cất quay giảm thể tích 100 ml hỗn dịch niosome bào

chế được theo quy trình 2.4.1về khoảng 10 ml Hút khoảng 4 ml hỗn dịch cho vào

màng lọc Amicon® Ultra-4, ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút để loại

dược chất tự do Lấy phần hỗn dịch phía trên phễu lọc, đông lạnh ở -70℃ trong 24 giờ, đông khô ở -50℃ trong 24 giờ thu được niosome dạng bột khô

- Phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai (DSC):

Nguyên tắc: Mẫu chuẩn và mẫu thử được đặt trong buồng mẫu và gia nhiệt để

chúng có cùng nhiệt độ Sự chênh lệch nhiệt lượng cần thiết để duy trì nhiệt độ 2 mẫu bằng nhau cho biết thông tin về quá trình nhiệt của mẫu thử xảy ra trong thời gian quét Nhiệt lượng chênh lệch này được xác định như một hàm của sự chênh lệch nhiệt độ tức thời giữa 2 mẫu Khi dược chất và tá dược có tương tác với nhau

sẽ làm các quá trình nhiệt bị thay đổi, điều đó được thể hiện bằng những thay đổi trên phổ đồ DSC

Mục đích: Phân tích các thay đổi trên phổ đồ DSC, ta có thể chứng minh được sau

khi tạo thành phức hợp, có sự thay đổi về nhiệt chuyển pha của niosome và mức độ kết tinh của dược chất trong niosome

Tiến hành với các công thức niosome NaD, dược chất và cholesterol Cân chính xác khoảng 3-8 mg mẫu dạng bột khô (đối với niosome thì chuẩn bị mẫu như quá trình trên) cho vào chén nhôm chuẩn, đậy nắp và hàn vành nắp Dùng kẹp đưa chén nhôm vào buồng máy có mẫu trắng là một chén nhôm được xử lý như mẫu thử Tốc

độ gia nhiệt 10℃/phút trong khoảng nhiệt độ quét từ -20℃ đến 200℃, lưu lượng dòng khí N2 50ml/phút

- Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR):

Nguyên tắc: Trong phân tử, các nguyên tử ở mỗi liên kết dao động với một tần số

đặc trưng nằm trong vùng hồng ngoại Khi bị chiếu một chùm tia bức xạ, liên kết đó hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên tử của liên kết Các nhóm có cấu tạo khác nhau sẽ dao động ở những số sóng khác nhau và đặc trưng cho nhóm đó

Mục đích: Sau khi quét phổ, phân tích sự thay đổi số sóng của các nhóm chức đặc

trưng trên phổ đồ để xác định tương tác dược chất, tá dược

Tiến hành với các công thức của niosome NaD, dược chất, cholesterol và span Nghiền nhỏ KBr và mẫu cho tới khi đồng nhất, nén bằng dụng cụ chuyên biệt rồi quét phổ hồng ngoại với dải bước sóng 4000-400 𝑐𝑚T-, độ phân giải 0,4 𝑐𝑚T-

- Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD):

Nguyên tắc: Sử dụng một chùm tia X song song hẹp, đơn sắc, chiếu vào mẫu với

góc tới 𝜃 Do tinh thể có tính chất tuần hoàn, các mặt tinh thể đóng vai trò như các cách tử nhiễu xạ; tia X bị tán xạ, các tia tán xạ giao thoa tăng cường với nhau tạo nên hiện tượng nhiễu xạ tia X Nguồn phát tia X được giữ cố định, trong khi đó, mẫu và detector thu chùm tia nhiễu xạ được quay trên đường tròn đồng tâm ghi lại cường độ chùm tia phản xạ và phổ nhiễu xạ- sự phụ thuộc của cường độ nhiễu xạ vào 2𝜃

25

Mục đích: Phổ nhiễu xạ tia X được sử dụng để phân tích sự thay đổi về cấu trúc tinh

thể của natri diclofenac trong niosome khi so sánh với phổ nhiễu xạ tia X của dược chất natri diclofenac Phổ nhiễu xạ tia X của một hợp chất dạng tinh thể có nhiều peak hẹp trong khi dạng vô định hình có peak rộng

Tiến hành với dược chất chuẩn và công thức niosome NaD Mẫu được giữ trong khay nhựa, đưa vào máy nhiễu xạ D8 Advance Ống phát làm anot Cu làm việc tại hiệu điện thế 40kV, cường độ 40 mA Bức xạ Cu 𝐾𝛽 được hấp thụ bởi tấm lọc Ni còn bức xạ phân tích Cu 𝐾𝛼 có bước sóng 𝜆 = 0,15406 𝑛𝑚 Detector bán dẫn SOL-X Quét góc 2𝜃 từ 1°-70°, nhiệt độ 25℃

2.4.5 Đánh giá sinh khả dụng của gel chứa niosome NaD 1% bằng thử nghiệm ex-vivo

Lượng dược chất giải phóng qua da trong 8 giờ, lưu trữ trong da sau 24 giờ được đánh giá bằng màng da lưng chuột nhắt Thiết kế thí nghiệm nhằm so sánh khả năng giải phóng dược chất qua da trong 8 giờ, lưu trữ trong da sau 24 giờ của các chế phẩm: Votaren Emulgel 1%, gel chứa niosome NaD 1%, gel NaD 1%

a Đánh giá khả năng giải phóng dược chất

Qua tham khảo tài liệu [5], [20], thử nghiệm được tiến hành ở các điều kiện sau:

Ø Điều kiện thử:

- Thiết bị: hệ thống thử giải phóng qua màng Hanson Research

- Màng khuếch tán: da lưng chuột nhắt đực, khoẻ mạnh, khối lượng từ 25-30g được loại lông, tách riêng, làm sạch lớp mỡ dưới da bằng dao và kéo phẫu thuật, rửa bằng nước muối sinh lý để loại sạch lông và tạp bẩn, bảo quản ở 2-8℃ trong vòng 2 ngày Trước khi thử, màng da lưng được hoạt hoá bằng môi trường thử giải phóng trong 30 phút

- Môi trường khuếch tán: dung dịch muối đệm phosphat pH 7,4 gồm: 8,01 g NaCl, 0,2 g KCl, 3,58 g Na2HPO4.12H2O, 0,27 g KH2PO4, nước tinh khiết vừa đủ 1000ml

- Thể tích môi trường thử: 7 ml; diện tích thử 1,767 𝑐𝑚/

Mẫu chuẩn: cân chính xác một lượng dược chất, hoà tan hoàn toàn bằng dung dịch muối đệm phosphat pH 7,4 rồi pha loãng tới nồng độ thích hợp Định lượng dược chất thấm qua da bằng phương pháp HPLC, so sánh diện tích peak mẫu thử với mẫu chuẩn có nồng độ xác định Từ đó, xây dựng đồ thị thể hiện % lượng dược chất thấm qua da theo thời gian

Ø Công thức tính % lượng dược chất thấm qua da tại thời điểm t:

%DCgp: % dược chất giải phóng so với lượng dược chất trong gel đem thử (%)

Ct, Ci: nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t và i (µg/ml) v: thể tích mẫu lấy tại từng thời điểm (ml)

mgel: lượng NaD có trong mẫu gel đem thử (µg)

b Đánh giá lượng dược chất lưu trữ trong da:

Tham khảo tài liệu [6] lượng dược chất lưu trữ trong da sau 24h được xác định như sau:

Ø Cách tiến hành:

Phần da chuột đóng vai trò màng khuếch tán giữa ngăn cho và ngăn nhận của hệ thống thử giải phóng qua màng Hanson Research sau thử nghiệm 24 giờ được lấy ra chính xác bằng kéo, banh phẫu thuật Sau đó, rửa sạch bằng đệm pH 7,4, nước tinh

27

khiết, rồi thấm khô miếng da Dùng kéo cắt nhỏ miếng da, cho vào ống ly tâm, thêm chính xác 5 ml ethanol tuyệt đối, đậy nắp kín, siêu âm 2 lần, mỗi lần 30 phút Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 10 phút Hút lấy phần dịch trong, lọc qua màng PTFE 0,45µm Hút chính xác 1ml dịch sau lọc, cho vào lọ chứa mẫu, sấy áp suất giảm ở 45℃ trong 12 giờ để loại hết ethanol, thu lấy cắn Hoà tan cắn thu được bằng đệm phosphat pH 7,4, pha loãng tới nồng độ thích hợp (hệ số pha loãng k) Mẫu chuẩn: cân chính xác một lượng dược chất, hoà tan hoàn toàn trong muối đệm phosphat pH 7,4, pha loãng tới nồng độ thích hợp

Mẫu thử, mẫu chuẩn được lọc qua màng lọc PTFE 0,45µm, dịch lọc thu được đem chạy HPLC rồi so sánh diện tích peak mẫu thử với mẫu chuẩn đã biết nồng độ, từ

đó tính được lượng dược chất lưu trữ trên da

Ø Công thức tính:

𝑚 = 𝑆:´ 𝐶7´ 𝑘´ 5

𝑆7´ 1,767Trong đó:

m: lượng dược chất lưu trữ trên da (𝜇𝑔/𝑐𝑚/)

St, Sc: diện tích peak mẫu thử, mẫu chuẩn (mAu.s)

Cc: nồng độ dung dịch chuẩn (𝜇𝑔/𝑚𝑙)

k: hệ số pha loãng

1,767: diện tích da lưu trữ dược chất (𝑐𝑚/)

5: thể tích ethanol tuyệt đối dùng để chiết dược chất ban đầu (ml)

2.4.6 Bước đầu đánh giá sinh khả dụng của gel chứa niosome NaD 1% bằng thử nghiệm in-vivo

Sau thử nghiệm ex-vivo, lựa chọn ra công thức gel chứa niosome NaD 1% tối ưu nhất để tiến hành thử nghiệm in-vivo Sử dụng chuột cống trắng làm động vật thí

nghiệm, tiến hành định lượng nồng độ dược chất trong máu và trong cơ, so sánh với chế phẩm Voltaren Emulgel 1% lưu hành trên thị trường

a Định lượng dược chất trong máu:

Ø Điều kiện thử:

- Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng, khoẻ mạnh, giống đực, cân nặng 200-250 g, được nuôi dưỡng và chăm sóc đầy đủ trong điều kiện thí nghiệm

- Liều dùng: 50mg dược chất/kg cân nặng

- Vị trí dùng thuốc: một đùi chân sau đã làm sạch lông

Ø Tiến hành:

Bôi thuốc: Chuột cống trắng được gây mê bằng ether rồi cố định vào 1 ván gỗ

Dùng thiết bị cắt lông chuyên dụng, làm sạch lông đùi chân sau rồi bôi thuốc

Lấy mẫu: Lấy 2- 3ml máu tĩnh mạch đuôi mắt vào ống lấy máu có EDTA tại các

thời điểm 30 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút, 3 giờ, 5 giờ và 8 giờ Sau đó, tương ứng với

mỗi lượng máu lấy ra tại các thời điểm, bù lại một thể tích tương ứng dịch truyền

NaCl 0,9% bằng tiêm dưới màng bụng

Xử lý mẫu: Ly tâm mẫu máu với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút, hút chính

xác 1ml huyết tương rồi tiến hành quá trình chiết tách Tham khảo phương pháp

chiết lỏng-lỏng để tách NaD của tài liệu [32] kết hợp với điều kiện thực tế, thực

hiện như sau:

Với mỗi 1ml huyết tương, thêm 1 ml acid H3PO4 1M, lắc xoáy 2 phút Tiếp tục

thêm 1ml acteone để phá huỷ protein, lắc xoáy 2 phút Thêm 5ml n-hexan, đậy nắp,

lắc xoáy 5 phút Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút Hút toàn bộ lớp n-hexan

thêm vào một ống ly tâm (có nắp đậy) chứa 1ml NaHCO3 0,08M, lắc xoáy 2 phút

Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút Loại bỏ hoàn toàn lớp n-hexan, thêm 1ml

acid H3PO4 1M, lắc xoáy 2 phút Thêm tiếp 5ml n-hexan, lắc xoáy 5 phút, ly tâm

5500 vòng/phút trong 10 phút Thu lấy lớp n-hexan, bốc hơi tới cắn trong tủ sấy

chân không ở điều kiện 45℃ trong 36 giờ

Mẫu chuẩn: cân chính xác một lượng dược chất chuẩn, hoà tan hoàn toàn bằng dung

dịch muối đệm phosphat pH 7,4, bổ sung thể tích vừa đủ tới nồng độ xác định Hút

1 ml dung dịch chuẩn, trộn vào 1 ml huyết tương trắng, lắc xoáy 2 phút, để yên

trong 2 giờ rồi tiến hành chiết tách dược chất như đối với mẫu thử

29

Cắn thu được của mẫu thử, mẫu chuẩn được hoà tan bằng dung dịch muối đệm phosphat pH 7,4 rồi pha loãng tới nồng độ thích hợp, lọc qua màng lọc PTFE 0,45µm và tiến hành chạy sắc ký, so sánh diện tích peak của mẫu thử và mẫu chuẩn

đã biết nồng độ Từ đó, tính được nồng độ dược chất của mẫu thử Nồng độ dược chất trong máu tại các thời điểm tiếp tục được xử lý bằng phần mềm PHOENIX NLME để tính toán thông số dược động học AUC theo mô hình dược động học không ngăn

Công thức tính nồng độ dược chất tại thời điểm t trong máu:

Cc: nồng độ dung dịch chuẩn trong đệm pH 7,4

k: hệ số pha loãng mẫu thử

b Định lượng dược chất trong cơ:

Căn cứ trên kết quả định lượng nồng độ dược chất trong máu, xác định thời điểm nồng độ thuốc trong máu cao nhất (Tmax) Từ đó, tiến hành thử nghiệm đánh giá nồng độ thuốc trong cơ tại Tmax của gel niosome NaD 1% và so sánh với Voltaren Emulgel 1%