Nghiên cứu ảnh hưởng của glycerol và nồng độ tinh bột đến cấu trúc và mật độ vi sinh vật lactobacillus acidophillus trong vi nang calci alginat

Đánh giá ảnh hưởng của glycerol đến thể chất và số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô .... Đánh giá ảnh hưởng của glycerol đến thể chất

VẬT Lactobacillus acidophilus TRONG

VI NANG CALCI ALGINAT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

VẬT Lactobacillus acidophilus TRONG

VI NANG CALCI ALGINAT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, ủng hộ từ các thầy cô, gia đình, bạn bè

Trước tiên, với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn

đến TS Đàm Thanh Xuân, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi

điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu tiên cho đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô

giáo, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp Dược trong suốt quá

trình làm đề tài nghiên cứu và thực nghiệm tại bộ môn

Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn Viện Công nghiệp Thực phẩm đã

giúp đỡ em trong các phép đo hoạt độ nước Em cũng xin cảm ơn sự hỗ trợ từ

Phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử và Vi phân tích (BKEMMA), Viện Tiên tiến

Khoa học và Công nghệ (AIST), Đại học Bách khoa Hà Nội (HUST) cho các phép

đo trên hệ SEM

Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu cùng

toàn thể các thầy cô đã dạy dỗ em trong suốt năm năm học tập tại trường Đại học

Dược Hà Nội Cảm ơn thầy cô đã dạy cho em những kiến thức quý báu trong quá trình học tập và rèn luyện cho em những đức tính và đạo đức nghề nghiệp quý giá

Cuối cùng, xin bày tỏ sự cảm ơn những người bạn đã luôn sát cánh, hỗ trợ,

sẻ chia trong mọi cảnh và đặc biệt cảm ơn gia đình thân thương đã luôn ủng hộ,

động viên con suốt cuộc đời

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Vũ Quỳnh Phương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ……… ……….1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về probiotic 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến 2

1.2 Vi khuẩn lactic 3

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 3

1.2.2 Loài Lactobacillus acidophillus 4

1.3 Tổng quan về vi nang hóa probiotic 6

1.3.1 Định nghĩa 6

1.3.2 Đặc điểm của vi nang 6

1.3.3 Các phương pháp vi nang hóa 7

1.3.4 Phương pháp nhỏ giọt đông tụ (Extrusion) 8

1.3.5 Alginat 8

1.4 Đông khô 10

1.4.1 Khái niệm 10

1.4.2 Ưu nhược điểm của quá trình đông khô 11

1.4.3 Các tá dược bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô 12

1.5 Một số nghiên cứu về vi nang calci alginat đông khô chứa L acidophilus 14 Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 15

2.1.1 Chủng vi sinh vật 15

2.1.2 Hóa chất 15

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 15

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Đánh giá ảnh hưởng của glycerol đến thể chất và số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 17

2.2.2 Đánh giả ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến cấu trúc, số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus và độ ổn định trong thời gian bảo quản 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp pha các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 17

2.3.2 Phương pháp tiệt khuẩn 18

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy 18

2.3.4 Phương pháp nhân giống 18

2.3.5 Phương pháp tạo vi nang bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ 19

2.3.6 Phương pháp đông khô 19

2.3.7 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV 20

2.3.8 Phương pháp xác định hoạt độ nước của vi nang 21

2.3.9 Các phương pháp xác định hình ảnh vi nang 22

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23

3.1 Đánh giá ảnh hưởng của glycerol đến thể chất và số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 23

3.2 Đánh giả ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến cấu trúc, số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus và độ ổn định trong thời gian bảo quản 29

3.2.1 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus trước đông khô 29

3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến cấu trúc, số lượng VSV của vi

nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô và độ ổn định trong

thời gian bảo quản 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ATCC American Type Culture Collection

(Trung tâm giữ giống quốc gia Hoa Kỳ) CFU Colony-Forming Units

(Số đơn vị khuẩn lạc)

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

(Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

(Liên minh Quốc tế về Hóa học thuần túy và Hóa học ứng dụng)kl/tt khối lượng/thể tích

LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic)

L acidophilus Lactobacillus acidophilus

MRS de Man, Rogosa, Sharpe

(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic)

MT Môi trường

SEM Scanning Electron Microscope

(Kính hiển vi điện tử quét)

WHO World Health Organization

(Tổ chức Y tế Thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 16 Bảng 3.1 Kết quả cảm quan của vi nang calci alginat – tinh bột 25 Bảng 3.2 Số lượng vi sinh vật trong các mẫu vi nang trước và sau khi đông khô 25 Bảng 3.3 Số lượng vi sinh vật được bao gói trong vi nang calci alginat với các công

thức khác nhau 30

Bảng 3.4 Hoạt độ nước của vi nang calci alginat – glycerol – tinh bột 36

Bảng 3.5 Số lượng tế bào vi khuẩn L acidophilus có trong vi nang calci alginat ở

nồng độ tinh bột khác nhau trong suốt thời gian bảo quản 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 4

Hình 1.2 Cấu trúc của alginat 9

Hình 1.3 Sự hình thành và cấu trúc của calci alginat 10

Hình 1.4 Công thức phân tử của glycerol 12

Hình 1.5 Hình ảnh tinh bột sắn chụp qua SEM 14

Hình 3.1 Alginat – tinh bột 24

Hình 3.2 Alginat – TB – glycerol 24

Hình 3.3 Bề mặt vi nang Alginat – tinh bột 10% 24

Hình 3.4 Bề mặt vi nang Alginat – TB 10% – glycerol 24

Hình 3.5 Mặt cắt ngang vi nang Alginat – tinh bột 10% 24

Hình 3.6 Mặt cắt ngang vi nang Alginat – TB 10% – glycerol 24

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV trong vi nang calci alginat – TB 10% có và không có glycerol 26

Hình 3.8 Số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa L acidophilus trước đông khô ở các công thức khác nhau 31

Hình 3.9 Mặt cắt ngang vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 5% (CT1) 34

Hình 3.10 Mặt cắt ngang vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 10% (CT2) 34

Hình 3.11 Cấu trúc vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 5% (CT1) 35

Hình 3.12 Cấu trúc vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 10% (CT2) 35

Hình 3.13 Hình ảnh L acidophilus trong vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 5% (CT1) 35

Hình 3.14 Hình ảnh L acidophilus trong vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 10% (CT2) 35

Hình 3.15 Kết quả hoạt độ nước của vi nang calci alginat – glycerol – tinh bột 37

Hình 3.16 Số lượng L acidophilus có trong vi nang calci alginat – glycerol – tinh bột sau đông khô và trong thời gian bảo quản ở hai nồng độ tinh bột khác nhau 39

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lactobacillus acidophilus là một vi khuẩn có lợi, được sử dụng nhiều làm

nguyên liệu trong các chế phẩm probiotic Khi đưa vào cơ thể con người, probiotic mang lại tác dụng kích thích tiêu hóa, điều trị rối loạn tiêu hóa, táo bón… [51] Tuy nhiên, trong quá trình chế biến và bảo quản, vi khuẩn dễ bị các tác động của môi trường bên ngoài như độ ẩm, nhiệt độ, áp suất, pH… gây giảm số lượng vi khuẩn sống sót [46] Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm tăng cường khả năng chống chịu của vi khuẩn trước các điều kiện bất lợi của môi trường Phương pháp tạo vi nang calci alginat đông khô là phương pháp đơn giản, được sử dụng phổ biến hiện nay giúp bảo vệ tốt vi khuẩn trong thời gian bảo quản [53] Tuy nhiên quá trình đông khô có các yếu tố tác động lên vi khuẩn và khiến vi khuẩn dễ chết [46] Vì vậy, có thể bổ sung thêm các tá dược bảo vệ vi khuẩn trong quá trình đông khô như glycerol và tinh bột nhằm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn và cải thiện thể chất của vi nang probiotic [47] Bên cạnh đó, việc hiểu rõ cấu trúc của vi nang giúp ta có thể hiểu được mối tương quan giữa cấu trúc và khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang, từ đó tìm ra những hướng phát triển phù hợp

Chính vì những lí do trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của glycerol và

tinh bột đến cấu trúc và mật độ vi sinh vật Lactobacillus acidophilus trong vi

nang calci alginat” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Đánh giá ảnh hưởng của glycerol đến thể chất và số lượng VSV có trong

vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô

2 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến cấu trúc, số lượng VSV có

trong vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus và độ ổn định

trong thời gian bảo quản

2

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về probiotic

1.1.1 Định nghĩa

Thuật ngữ “Probiotic” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, trong đó “biotic” có nghĩa là sự sống và “probiotic” có nghĩa là “dành cho sự sống” Nó được sử dụng đầu tiên bởi Wenner Kollath vào năm 1953 với định nghĩa “probiotic là những hoạt chất cần thiết để cơ thể phát triển khỏe mạnh” [39] Sau đó, thuật ngữ này được phát triển và sử dụng rộng rãi từ những năm 1960, cho đến năm 1989, để nhấn mạnh tác dụng của vi sinh vật, Fuller đã đưa ra định nghĩa “là một loại thức ăn bổ sung chứa

vi sinh vật sống có tác dụng tốt trên vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng đường ruột” [27]

Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra một định nghĩa ngắn gọn và đầy đủ về probiotic như sau:

“Probiotic là những vi sinh vật sống, mà khi đưa vào cơ thể với số lượng đủ lớn sẽ đem lại lợi ích cho vật chủ” [25] Số lượng đủ lớn mà WHO đưa ra đó là vi sinh vật phải ổn định trong chế phẩm trong suốt quá trình bảo quản, duy trì số lượng sống sót ở mức tối thiểu là 106-107 CFU/g [13], [25] Số lượng vi sinh vật vừa đủ đạt kết quả thành công trên các thử nghiệm lâm sàng là từ 107-1011 CFU/ngày [28], [57]

1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến

Tiêu chuẩn để lựa chọn giống probiotic như sau:

- Nguồn gốc rõ ràng (chủng giống phải được lưu giữ tại ngân hàng giống quốc tế)

- Không gây bệnh, không chứa độc tố (chủng phải được đánh giá xác định an toàn và không có độc lực)

- Dễ nuôi cấy

- Có đặc tính probiotic

- Phải ổn định trong bảo quản và dễ bảo quản

3

Tuy nhiên, không phải tất cả những vi sinh vật có lợi nào cũng được sử dụng

để sản xuất probiotic Theo WHO và FAO, tiêu chí quan trọng nhất của chủng giống đó là: Có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa, có khả năng phát triển trong ruột

và mang lại hiệu quả có lợi và đáng tin cậy, đã được chứng minh một cách khoa học, thử nghiệm trên động vật và trên người [5]

Hiện nay, các loài vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu

thuộc hai chi Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và Streptococus cũng được sử dụng, nhưng ít hơn [29]

Một số loài tiêu biểu bao gồm L acidophilus, L gasseri, L rhamnosus, B longum, B bifidum Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là probiotic [19]

1.2 Vi khuẩn lactic

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria - LAB) là một nhóm các loài vi khuẩn có trong tự nhiên với ba đặc điểm chung: Gram (+), không hình thành bào tử và chuyển hóa đường bằng quá trình lên men lactic Quá trình lên men acid lactic là một quá trình lên men kỵ khí, khi đó, đường glucose sẽ được chuyển thành acid lactic [42]

Nhóm vi khuẩn lactic có vài trăm loài khác nhau thuộc 5 chi chính, bao gồm:

- Lactobacillus: lên men đồng hình và dị hình

- Lactococcus: chủ yếu là lên men đồng hình

- Streptococcus: lên men đồng hình

- Leuconostoc: lên men dị hình

- Pediococcus: lên men đồng hình [53]

Chi lớn nhất, Lactobacillus, bao gồm khoảng 100 loài Các loài nổi bật dùng

để sản xuất các chế phẩm sữa lên men đó là L acidophilus, L brevis, L casei, L dulbrueckii, L helviticus, L johnsonii, L plantarum, và L rhamnosus [29] Vi

khuẩn thuộc chi này thường phát triển tốt trong điều kiện acid với pH 3,5-5,0

4

Trong môi trường thích hợp của từng loài, chúng có thể phát triển được ở ba mức oxy: (1) kỵ khí, thiếu oxy; (2) vi hiếu khí, đòi hỏi mức oxy thấp; (3) kỵ khí tùy tiện,

có thể chuyển đổi giữa hiếu khí và kỵ khí Lactobacillus là những vi khuẩn chí

thường sống trong đường tiêu hóa của người và các động vật khác [42]

1.2.2 Loài Lactobacillus acidophillus

1.2.2.1 Đặc điểm hình thái

Lactobacillus acidophilus là loài vi khuẩn nằm trong chi Lactobacillus, là chi

lớn nhất của họ vi khuẩn lactic, họ vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm probiotic [32]

L acidophilus có dạng hình roi (hình gậy), rộng 0,6 - 0,9μm, dài 1,5 - 6,0μm,

tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 37ºC, không phát triển trong khoảng 20 - 22ºC hoặc ở nhiệt độ cao hơn 48ºC Tên của loài có nghĩa là “ưa acid”, có thể phát triển ở môi trường pH khoảng 5-6, thời gian từ 24-36 giờ [2]

L acidophilus có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật,

8 ngày trong dịch tràng và có khả năng kháng được 40 loại kháng sinh [30]

Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

1.2.2.2 Vai trò

L acidophilus có thể sinh ra acid lactic, tạo ra môi trường acid yếu, môi

trường này là điều kiện bất lợi cho các vi sinh vật gây hại cho người và động vật

5

Ngoài ra, nó còn có thể sản xuất được các chất diệt khuẩn như lactocidin, bacteriocin giúp ngăn cản sự xâm nhập và ức chế tăng sinh các vi khuẩn gây bệnh Chúng giúp cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy đặc

biệt là tiêu chảy do kháng sinh [45] Hơn nữa, L acidophilus còn có tác dụng ngăn ngừa ung thư nhất là ung thư ruột kết và có ảnh hưởng nhất định đến sự lão hóa [22] Một số nghiên cứu còn chỉ ra tác dụng của L acidophilus trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn Helicobacter pylori, một trong những nguyên nhân gây ra bệnh viêm loét dạ dày tá tràng [62] Ngoài ra, L acidophilus còn có tác dụng hạ

cholesterol huyết thanh, giúp làm giảm 6-10% nguy cơ mắc các bệnh mạch vành [14]

Cũng như các vi khuẩn probiotic khác, L acidophilus cũng dễ bị ảnh hưởng

bởi các yếu tố môi trường trong quá trình sản xuất và bảo quản như pH, nhiệt độ, độ

ẩm, hàm lượng oxy hòa tan… [46]

1.2.2.3 Các chế phẩm hiện nay

Hiện nay trên thị trường, L acidophilus được sử dụng rộng rãi làm chế phẩm

probiotic giúp điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa như:

Chế phẩm men vi sinh Antibio Pro do công ty dược phẩm Han Wha, Hàn

Quốc sản xuất với dạng bào chế gói bột pha hỗn dịch uống Mỗi gói chứa 75mg L acidophilus tương đương với 108 CFU, giúp điều trị trường hợp viêm ruột non, tiêu chảy do nhiễm khuẩn, rối loạn tiêu hóa do ngộ độc thức ăn và dùng kháng sinh lâu ngày

Men vi sinh Biolactomen do viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam sản xuất dưới dạng lọ bột đông khô pha hỗn dịch uống có chứa khoảng 108 CFU L acidophilus, giúp hỗ trợ điều trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa, ngộ độc thực phẩm,

viêm đại tràng, táo bón

Có thể thấy rằng, mặc dù đã có các chế phẩm chứa L acidophilus nhưng

dạng bào chế còn hạn chế, chủ yếu là dạng thuốc bột, thuốc cốm pha hỗn dịch uống, dạng bột đóng trong viên nang cứng Nhược điểm của dạng bột thuốc chứa VSV là VSV dễ bị các yếu tố bên ngoài môi trường tác động khiến suy giảm số lượng VSV

6

sống, hạn sử dụng ngắn Hiện nay, phương pháp vi nang hóa probiotic đang được nghiên cứu và phát triển nhằm nâng cao khả năng sống sót của VSV có trong sản phẩm

1.3 Tổng quan về vi nang hóa probiotic

1.3.1 Định nghĩa

Vi nang là các tiểu phân kết tụ hình cầu hoặc không xác định, thành phần gồm dược chất (hoặc dược chất và tá dược) được bao trong một màng polyme thiên nhiên hoặc tổng hợp; có kích thước trong khoảng 1 - 5000 μm (trong thực tế thường điều chế vi nang trong khoảng 100 - 2000 μm) [6], [8]

Phương pháp vi nang hóa có thể được định nghĩa là một quá trình bẫy một chất (hoạt chất) trong một chất khác (vật liệu tường), tạo ra các hạt có đường kính

từ vài nm đến vài mm [68] Các chất tạo màng dùng để bẫy có thể là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)… còn chất được bẫy ở đây chính là các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống được bẫy, nhốt và bao gói trong các nang nhỏ [53]

1.3.2 Đặc điểm của vi nang

Vi nang gồm một lớp vỏ là một lớp màng bán thấm bao quanh hoạt chất, từ

đó có thể giải phòng dần dần hoạt chất bằng các cách khác nhau như nhiệt độ, sự solvat hóa, khuếch tán hoặc nhờ áp suất Lớp vỏ của vi nang cũng có thể được thiết

kế để giải phóng dược chất ở những vị trí đích trong cơ thể [13], [53] Có thể sử dụng các vật liệu vỏ có khả năng chịu được acid, và chỉ giải phóng hoạt chất khi đi qua dạ dày, do đó có thể bảo vệ vi sinh vật khỏi ảnh hưởng của acid dạ dày [13]

Độ bền cơ học của lớp vỏ vi nang là một đặc điểm quan trọng Màng phải có

độ bền tương đối để có thể bảo vệ được các tế bào sống, mà không quá bền chắc ảnh hưởng đến khả năng giải phóng tế bào Bên cạnh đó, kích thước hạt, độ bền chắc của hạt và khả năng giải phóng tế bào có quan hệ với nhau Kích thước hạt

7

càng lớn thì độ bền càng cao, khả năng bảo vệ tế bào sống càng cao, nhưng khả năng phóng thích tế bào càng khó Ngoài ra còn một số đặc điểm cần lưu ý như: sự mài mòn của các hạt vi nang do sự va chạm ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt… [8], [49]

Phương pháp vi nang hóa đã góp phần giải quyết những khó khăn trong ngành công nghiệp dược phẩm như: Bao gói các chất lỏng, nhớt thành dạng rắn; che dấu mùi vị khó chịu của dược chất; hạn chế sự bay hơi của một số dược chất dễ bay hơi; tăng khả năng ổn định, sự bền vững của một số hoạt chất; kiểm soát sự giải phóng dược chất, bào chế dạng thuốc giải phóng tại cơ quan đích [6]

Đối với việc sản xuất các chế phẩm probiotic, vi nang hóa đóng một vai trò quan trọng Ưu điểm của vi nang như là một tấm áo choàng giúp cách ly tế bào với môi trường xung quanh, giúp bảo vệ vi sinh vật tránh khỏi các tác hại của nhiệt độ cao, pH thấp, áp suất thẩm thấu cao và khả năng bị oxy hóa trong suốt quá trình chế biến và bảo quản [46], [53] Bên cạnh đó, sự sống sót của vi khuẩn cũng bị ảnh hưởng bởi acid dịch vị và muối mật trong đường tiêu hóa khi chúng được đưa vào trong cơ thể Vi nang hóa là phương pháp giúp cải thiện khả năng sống sót của vi sinh vật trong thời gian bảo quản cũng như bảo vệ chúng khỏi tác động của acid dạ dày trong đường tiêu hóa [26] Lớp vỏ vi nang như một lớp rào chắn hạn chế giải phóng tế bào, giảm thiểu sự nhiễm bẩn, bảo vệ tế bào chống lại tác nhân gây hại Lớp vỏ có thể thiết kế để bảo vệ và giải phóng vi khuẩn ở những điều kiện khác nhau cho phép kiểm soát giải phóng vi khuẩn [49]

Với ưu điểm có thể bảo vệ được vi sinh vật và protein khỏi ảnh hưởng bởi các tác nhân bên ngoài môi trường, acid dịch vị và muối mật, vi nang hóa được ứng dụng nhiều trong việc bao gói vi sinh vật để tạo chế phẩm probiotic và cố định tế bào, cố định enzym [23]

1.3.3 Các phương pháp vi nang hóa

Có rất nhiều phương pháp để đóng gói probiotic trong vi nang calci alginat

đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công bố Việc lựa chọn phương pháp chế

8

tạo vi nang phụ thuộc vào điều kiện thực tế như độ tan, tính tương đồng, kích thước

vi nang… [6]

Có thể phân loại các phương pháp vi nang hóa như sau:

- Phương pháp hóa lý: đông tụ (đơn giản, phức hợp); các polyme không tương thích; bốc hơi dung môi, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn…

- Phương pháp vật lý: ly tâm, bao tầng sôi, xát hạt tầng sôi máy quay tròn, nồi bao viên thông thường, phun sấy…

- Phương pháp hóa học: polyme hóa (tương tác các polyme, polyme hóa bề mặt…) [24]

1.3.4 Phương pháp nhỏ giọt đông tụ (Extrusion)

Đây là kỹ thuật lâu đời và phổ biến nhất để sản xuất vi nang Phương pháp này bao gồm việc chuẩn bị một dung dịch chất keo thân nước (ví dụ như alginat, carrageenan), bổ sung thêm VSV rồi được đùn (nhỏ giọt) qua một hệ thống kim tiêm, để rơi tự do vào một dung dịch hóa rắn (ví dụ như calci clorid), hình thành nên các hạt vi nang Bản chất của quá trình này là khi nhỏ dung dịch keo thân nước vào dung dịch hóa rắn, trong đó có các cation hóa trị cao khiến cho dung dịch keo thay đổi cấu trúc, xảy ra hiện tượng đông tụ, hóa rắn tạo vi nang [56]

Kích cỡ và hình dạng của vi nang thu được phụ thuộc vào đường kính của đầu kim tiêm và khoảng cách giữa đầu kim tiêm và dung dịch hóa rắn [54] Ưu điểm của phương pháp này là quy trình thực hiện đơn giản, tiết kiệm chi phí, quá trình thực hiện không gây ảnh hưởng nhiều đến sự sống sót của vi khuẩn như phương pháp khác ví dụ phương pháp phun sấy [23] Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là khả năng bao gói còn thấp [33]

1.3.5 Alginat

1.3.5.1 Tính chất

Acid alginic là một polysaccharid mạch thẳng ưa nước cấu tạo từ hai gốc acid uronic là acid β-D-mannuronic (M) và một lượng dư acid α-L-guluronic (G)

9

[16] Hai acid này liên kết với nhau qua liên kết 1-4-glycosid, tùy từng nguồn gốc alginat mà tỷ lệ có mặt hai loại acid này khác nhau Các đơn vị monome liên kết với nhau theo chuỗi, tạo thành các khối; các khối này có thể chỉ chứa đồng vị MM hoặc

GG và có thể gồm hỗn hợp các đơn vị M và G liên kết với nhau Tập hợp các khối này tạo nên cấu trúc của acid alginic và muối alginat [13]

Natri alginat được chiết xuất từ rong biển, với tính chất không độc, không tương thích sinh học, giá thành rẻ, do đó được sử dụng rộng rãi, an toàn và là muối alginat có tính thương mại nhất trong ngành thực phẩm [31], [49] Khi tiếp xúc với nước, natri alginat sẽ tạo thành dung dịch nhớt, được ứng dụng trong ngành dược phẩm để làm chất mang các dạng thuốc giải phóng có kiểm soát [13] Natri alginat

có thể chuyển từ trạng thái sol sang dạng hygrogel với hàm lượng nước lên đến 95%, có thể được sử dụng như một chất làm ổn định hệ gel [49]

Hình 1.2 Cấu trúc của alginat

1.3.5.2 Cấu trúc vi nang calci alginat

Khi có mặt của các ion hóa trị hai như Ca++, Ba++, Sr++, các khối GG có trong thành phần của alginat có các vị trí tương thích giúp tạo liên kết ion với các ion hóa trị hai này, tạo nên cấu trúc ‘hộp trứng’, hình thành cấu trúc một mạng gel ba chiều

và xảy ra hiện tượng đông rắn [16], [31], [49] Quá trình gel hóa này giúp cho tế bào được nhốt trong các mạng lưới alginat mà vẫn duy trì chức năng sinh học [31] Khi tạo vi nang calci alginat bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ, nhỏ dung dịch natri alginat vào dung dịch Ca++, ban đầu calci alginat sẽ hình thành vào tạo nên sự hóa rắn bề mặt Tiếp theo, ion Ca++ sẽ thấm dần vào lớp alginat, tạo gel và cứng dần [13] Kích thước của vi nang thường phụ thuộc vào độ nhớt của dung dịch polyme,

10

đường kính kim nhỏ giọt và khoảng cách giữa kim nhỏ giọt và dung dịch đông tụ [54]

Hình 1.3 Sự hình thành và cấu trúc của calci alginat [17]

Vi nang calci alginat có các ưu điểm như sau : (1) calci alginat không độc khi

sử dụng theo đường uống và có tác dụng bảo vệ niêm mạc của đường tiêu hóa trên; (2) cấu trúc của calci alginat là màng gel bán thẩm thấu, giúp làm lá chắn chống lại các tác nhân bất lợi bên ngoài môi trường và giải phóng vi sinh vật một cách có kiểm soát; (3) sự trương nở của calci alginat phụ thuộc vào pH, do đó có thể bảo vệ

vi sinh vật khỏi tác động của acid dạ dày [16], [49] Nhờ những ưu điểm của mình, alginat là một trong những nguyên liệu rất phù hợp trong việc bào chế vi nang

1.4 Đông khô

1.4.1 Khái niệm

Đông khô (lyophilozation, freeze-drying) là quá trình làm bay hơi nước đã được đông lạnh ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutecti của dung dịch, dung môi được

11

loại trực tiếp từ pha rắn không qua pha lỏng dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm khô

Một chu trình đông khô gồm ba giai đoạn chính:

- Giai đoạn đông lạnh (tiền đông): Vật liệu được đóng băng dưới tác dụng của nhiệt độ thấp, thấp hơn nhiệt độ eutecti của dung dịch

- Giai đoạn thăng hoa (làm khô sơ cấp): Vật liệu được đặt trong điều kiện chân không Nước được chuyển từ trạng thái rắn sang dạng hơi mà không cần qua dạng lỏng

- Giai đoạn phản hấp phụ (làm khô thứ cấp): Sử dụng nhiệt độ cao hơn giai đoạn thăng hoa (phải phù hợp với độ nhạy nhiệt của chế phẩm), sấy loại bỏ nước liên kết [35]

1.4.2 Ưu nhược điểm của quá trình đông khô

Chế phẩm trong quá trình đông khô được sấy khô trong điều kiện nhiệt độ thấp, giúp không bị ảnh hưởng bởi nhiệt và vẫn giữ được hương vị, màu sắc, cấu trúc vốn có Đối với chế phẩm probiotic, đông khô giúp giữ được đặc tính probiotic của vi sinh vật và không làm biến tính protein Đông khô còn là một kỹ thuật thích hợp để giữ giống vi sinh vật, vì quá trình đông khô giúp tăng khả năng sống sót của

vi sinh vật trong quá trình bảo quản và vật liệu khô có thể bảo quản ở nhiệt độ môi trường xung quanh, dễ vận chuyển [20], [36], [47]

Tuy nhiên, đông khô là một trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic Đặc biệt, giai đoạn tiền đông có thể gây những áp lực cơ học lớn đối với vi sinh vật do sự giãn nở thể tích

Sự hình thành phân tử đá nội bào có thể là nguyên nhân gây phá vỡ màng tế bào [35] Phân tử đá được hình thành ở ngoài màng tế bào, dẫn đến việc làm tăng áp suất thẩm thấu của tế bào, khiến tế bào vi khuẩn mất nước [46] Quá trình sấy còn làm cho thể chất của lipid và protein màng thay đổi, làm giảm khả năng sống của tế bào Có nghiên cứu chỉ ra rằng sự oxy hóa lipid của màng tế bào là nguyên nhân gây chết vi sinh vật dựa trên việc thay đổi tỷ lệ acid béo no và không no trước và sau quá trình đông khô [20], [36]

12

1.4.3 Các tá dược bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô

Do quá trình đông khô làm giảm khả năng sống sót của vi sinh vật nên người

ta thường cho thêm các chất bảo vệ vi sinh vật (cryoprotectants) vào sinh khối trước khi đông khô Việc kết hợp các chất bảo vệ trước khi đông khô giúp tế bào vi sinh vật thích ứng khi môi trường thay đổi Các chất này từ từ tích lũy bên trong tế bào

vi khuẩn, giúp giảm sự chênh lệch áp suất thẩm thấu trong và ngoài màng tế bào, làm tăng tỷ lệ sống sót [38]

Các tá dược thường được sử dụng làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô bao gồm các nhóm sau:

- Nhóm carbohydrat: sucrose, trehalose, lactose, maltose, glucose…

- Nhóm protein: skim milk, trypsin, pepton, trypton…

- Nhóm các polyme: gelatin, gôm xanthan, tinh bột, polyethylen glycol…

- Nhóm các polyol: manitol, glycerol, sorbitol…

- Nhóm amino acid: natri glutamat, proline, glutamat…

- Nhóm chống oxy hóa: natri thiosulfat, acid ascorbic…

- Nhóm khác: mật ong, natri acetat…[47]

1.4.3.1 Glycerol

Glycerol hay còn gọi là glycerin, là một hợp chất rượu đa chức, gồm 3 nhóm -OH gắn vào gốc hydrocarbon C3H5 Công thức hóa học là C3H5(OH)3 Danh pháp theo IUPAC là propan-1,2,3-triol Là chất lỏng sánh, trong suốt, không màu, không mùi, vị nóng và ngọt, hút ẩm mạnh, thân nước, trộn lẫn được với nước và ethanol 96% [1] Nhiệt độ nóng chảy là 17,8oC, bay hơi ở 290oC kèm phân hủy Khối lượng riêng 1,2636 g/cm3 ở 20oC [55] Nhiệt độ đông đặc của dung dịch glycerol trong nước ở nồng độ 10%, 15%, 20% (kl/kl) lần lượt là -1,6oC, -3,1 oC và -4,8 oC [41]

Hình 1.4 Công thức phân tử của glycerol

13

Glycerol là tá dược được sử dụng trong nhiều công thức dược phẩm, bao gồm cả thuốc uống, thuốc nhỏ mắt, các chế phẩm tại chỗ… Trong công thức thuốc nhỏ mắt và mỹ phẩm, glycerol thường được dùng bởi tính chất giữ ẩm và làm mềm của nó Với tính chất thân nước và có 3 nhóm OH, glycerol hay được sử dụng làm dung môi, đồng dung môi trong các dung dịch uống và cả trong kem và nhũ tương Glycerol còn được sử dụng làm chất hóa dẻo gelatin trong sản xuất viên nang mềm gelatin [55]

Bên cạnh đó, glycerol còn là một tá dược bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô Cơ chế bảo vệ của glycerol là làm giảm liên kết của nước với các protein trong màng vi sinh vật, giúp cho quá trình đông lạnh ít ảnh hưởng đến sự thay đổi

áp suất thẩm thấu giữa trong và ngoài màng tế bào, giúp tế bào không bị vỡ gây chết vi sinh vật [47]

1.4.3.2 Tinh bột

Tinh bột có cấu tạo từ Amylose (Am) và Amylopectin (Ap) Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ α-D glucose Các gốc glucose trong Am kết hợp với nhau qua liên kết α-1,4-glucosid tạo nên chuỗi dài khoảng 500-2.000 đơn vị glucose, phân tử lượng trung bình 10.000-300.000 Dalton Ap có cấu trúc phân nhánh, ngoài liên kết α-1,4-glucosid còn có các liên kết α-1,6-glucosid ở điểm phân nhánh Cấu trúc phân tử gồm một nhánh trung tâm, từ các nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose, phân tử lượng Ap khoảng 5×105 - 106Dalton Trong những nguyên liệu khác nhau thì hàm lượng Am và Ap cũng không giống nhau, nhưng thường tỉ lệ Am và Ap của các tinh bột bằng 1/4 [55]

Tinh bột là một tá dược được sử dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm với nhiều vai trò khác nhau: tá dược độn, tá dược dính… Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch, giá thành rẻ [43] Ngoài ra, tinh bột là tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô theo cơ chế giảm lượng tinh thể nước gắn với màng tế bào trong mẫu [47] Khi tạo vi nang calci alginat, bổ sung thêm tinh bột giúp cải thiện thể chất

14

của vi nang [11] Bên cạnh đó, L acidophilus không có khả năng tiêu thụ tinh bột,

vì vậy tinh bột có thể được lựa chọn trong vi nang hóa L acidophilus

Hình 1.5 Hình ảnh tinh bột sắn chụp qua SEM [64]

1.5 Một số nghiên cứu về vi nang calci alginat đông khô chứa L acidophilus

Đã có nhiều nghiên cứu tiến hành thực hiện bao gói vi khuẩn L acidophilus

trong vi nang calci algnat như: Ortakci và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng việc tạo vi

nang calci alginat chứa L acidophilus sẽ cho khả năng sống sót qua đường tiêu hóa

tốt hơn so với sử dụng tế bào tự do [52] Jiang và các cộng sự (2016) nghiên cứu về

việc tạo vi nang calci alginat chứa L acidophilus, sử dụng whey protein làm chất

độn giúp duy trì khả năng sống sót của vi khuẩn [37]

Tại Trường Đại học Dược Hà Nội, Nguyễn Mai Hương (2014) đã tiến hành

tạo vi nang calci alginat chứa L acidophilus có bổ sung thêm tinh bột thu được kết

quả tinh bột giúp cải thiện thể chất và số lượng VSV sống sót có trong vi nang [4] Bùi Thị Lệ Quyên (2015) bổ sung thêm tinh bột và sữa gầy vào công thức của vi nang calci alginat giúp bảo vệ VSV tốt qua môi trường acid dạ dày [10] Đàm Thanh Xuân và cộng sự (2016) đã nghiên cứu tạo vi nang calci alginat bằng phương pháp đông tụ với sự bổ sung thêm chitosan, glycerol, tinh bột cho khả năng sống sót

của L acidophilus trong môi trường dạ dày và trong thời gian bảo quản tốt hơn [11]

Glucose Trung Quốc Triamoni citrat Trung Quốc

MgSO4.7H2O Trung Quốc Tinh bột sắn Việt Nam

MnSO4.4H2O Trung Quốc Thạch (Agar) Việt Nam

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Natri acetat

K2HPO4MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O Nước máy vừa đủ

pH

5g 2g 0,2 g 0,05 g 1.000 ml 6,8-7,0

 Môi trường MRS thạch (MT2):

MT2 = MT1 + thạch (20g thạch/1.000ml môi trường)

16

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ

 Thiết bị:

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Camera + Kính lúp soi nổi + Máy tính Nhật (Nikon)

Máy đo hoạt độ nước Thụy Sỹ (Hygrolab) Kính hiển vi điện tử quét (SEM) Mỹ (Jeol JSM-7600F)

 Dụng cụ:

Bình nón 250, 1.000ml

Cốc có mỏ

Ống đong Ống li tâm Đĩa petri đường kính 9cm

Giá rửa hạt Ống nghiệm Pipet chia vạch Pipet tip (Đầu côn) Pipetman (Pipet Eppendorf)

17

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá ảnh hưởng của glycerol đến thể chất và số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô

2.2.2 Đánh giả ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến cấu trúc, số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus và độ ổn định trong thời gian bảo quản

 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến số lượng VSV có trong vi

nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus trước đông khô

 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến cấu trúc, số lượng VSV của vi

nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô và độ ổn

định trong thời gian bảo quản

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp pha các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

- Dung dịch natri alginat 3%: cân chính xác 3g natri alginat, phân tán đều trong 100ml nước cất, ngâm trương nở và gia nhiệt 40oC

- Dung dịch natri alginat 3% + glycerol 15%: cân chính xác 3g natri alginat, ngâm trong 90ml nước cất cho trương nở hoàn toàn Cân 15g glycerol cho vào dung dịch đã trương nở

- Dung dịch natri citrat 2%: cân chính xác 2g natri citrat, hòa tan hoàn toàn trong 100ml nước cất

- Dung dịch CaCl2 2%: cân chính xác 2g CaCl2, hòa tan hoàn toàn trong 100ml nước cất

- Dung dịch NaCl 0,9%: cân chính xác 0,9g NaCl, hòa tan hoàn toàn trong 100ml nước cất

Tất cả các dung dịch trên đều được tiệt khuẩn ở 115oC trong 20 phút

18

2.3.2 Phương pháp tiệt khuẩn

2.3.2.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Chế phẩm cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón và đậy kín bằng nút bông Chuyển các bình trên vào nồi hấp (Auto clave), cài đặt ở chế độ 115oC; 0,6atm (chênh lệch áp suất giữa máy và khí quyển) trong 20 phút [7]

2.3.2.2 Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall

Chế phẩm cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón và đậy kín bằng nút bông Chuyển bình trên vào nồi đun cách thủy cài đặt ở chế độ 70oC trong 1h Sau đó, đem ủ bình trong tủ 37oC trong 24h Lặp lại các bước 2 lần tương tự (thực hiện trong 3 ngày liên tiếp) thu được chế phẩm tiệt khuẩn [15]

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan, phân tán hết các thành phần Phân chia môi trường vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng Đậy kín nắp ống bằng nắp ống nghiệm Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn, sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C Cấy giống vào những ống nghiệm trên Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ

ở 37±1°C

2.3.4 Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan, phân tán hết các thành phần Đong 100ml môi trường vào bình nón dung tích phù hợp Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước) Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C Cấy giống từ ống nghiệm vào những bình nón trên, mỗi bình 1 ống giống 10ml Ủ các bình nón đã được cấy giống trong

tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở 37±1°C

19

2.3.5 Phương pháp tạo vi nang bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ

 Thu sinh khối VSV:

Dịch nuôi cấy VSV cho vào ống ly tâm đã hấp tiệt khuẩn, li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút Bỏ dịch trong, thu lấy phần sinh khối bằng máy lắc (Vortex)

Tạo hỗn dịch natri alginat – glycerol – tinh bột chứa VSV: Pha dung dịch natri alginat 3% + glycerol 15% (cách pha như được nêu ở mục 2.3.1), hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, để nguội.Phân tán tinh bột đã tiệt khuẩn (tiệt khuẩn theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.2), sấy khô và sinh khối vào dung dịch natri alginat - glycerol, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 15 phút

 Chuẩn bị dung dịch hóa rắn:

Pha dung dịch calci clorid 2% (cách pha như được nêu ở mục 2.3.1), hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, để nguội

 Tạo vi nang calci aginat:

Hỗn dịch gel chứa vi sinh vật được nhỏ qua một kim tiêm, kích thước đầu kim (đường kính trong 900μm, đường kính ngoài 1400μm) xuống dung dịch calci clorid 2% (kl/tt) tạo thành các hạt hình cầu Để yên 30 phút cho hạt ổn định, sau đó vớt lấy hạt, rửa hạt ba lần bằng dung dịch NaCl 0,9% đã hấp tiệt trùng và làm nguội

2.3.6 Phương pháp đông khô

Tiền đông: vi nang calci alginat được đựng trong đĩa petri hoặc lọ thủy tinh

đã rửa sạch và tiệt khuẩn, sau đó được làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu ở -80oC trong 24h cho đông rắn hoàn toàn

2.3.7 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV

 Chuẩn bị

Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS đặc (nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp Đậy kín bằng nút bông Hấp tiệt khuẩn ở

115oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín

Chuẩn bị các ống nghiệm sạch mỗi ống chứa 9ml nước cất, đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37-40oC

 Xác định số lượng VSV trong 1g vi nang

Mẫu vi nang phải được thực hiện thao tác phá hạt: Chuẩn bị bình nón chứa 100ml dung dịch natri citrat 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội Cân chính xác khoảng 1,00g hạt vi nang cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút trong khoảng 20 phút ở nhiệt độ phòng đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất

Hút chính xác 1,00ml dịch chứa vi khuẩn cần đếm số lượng tế bào, pha loãng vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng thứ nhất, lắc đều Sau

đó lại hút chính xác 1,00ml dịch đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ hai, lắc đều Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ pha loãng cuối cùng Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,2ml dịch trong các ống của 3 nồng độ pha loãng cuối cùng, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở