Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động (LV thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-VŨ DUY THANH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ CÓ MẶT CỦA NẤM MỐC VÀ VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG KHÔNG KHÍ MÔI TRƯỜNG

LAO ĐỘNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội - 2014

MỞ ĐẦU

Trong không khí, ngoài bụi là thành phần chính còn có các vi sinh vật như vikhuẩn, nấm mốc, các thành phần này có liên quan mật thiết với nhau như nồng độbụi, bụi hữu cơ càng nhiều thì số lượng vi sinh vật càng nhiều, vi sinh vật trongkhông khí gồm rất nhiều loại khác nhau như cầu khuẩn gây bệnh, trực khuẩn lao,trực khuẩn bạch hầu và các tạp khuẩn khác, quan trắc vi sinh vật trong không khí làmột cách để dự phòng và định hướng những nguy cơ tiểm ẩn gây ra bởi ô nhiễmsinh học trong không khí Điều kiện ngoại cảnh và điều kiện thời tiết có ảnh hưởngrất nhiều tới tình trạng và số lượng vi sinh vật trong không khí, khí hậu Việt Namthuộc vùng khí hậu nhiệt đới ấm và ẩm, trong cả nước Việt Nam có những vùngkhác nhau về khí hậu như ở miền Bắc thì thuộc vùng khí hậu nhiệt đới ấm ẩm, vùngkhí hậu khu vực miền Trung thuộc vùng nhiệt đới gió mùa, vùng khí hậu vùng phíanam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới Xavan (có hai mùa rõ rệt là mùa khô và mùamưa), chính vì sự đa dạng này mà trong các vùng của Việt Nam có sự phân bố sốlượng các vi sinh vật trong không khí cũng khác nhau rất nhiều Tùy theo từng mùa

có sự phát triển từng loại vi khuẩn hay vi nấm gây bệnh phát triển nhanh và gây ranhững bệnh dịch hàng loạt Mùa hè ở khu vực miền Bắc là nắng nóng, kèm theo ẩmcao tạo ra môi trường thuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển, tác nhân gây

ra những bệnh như viêm phổi, cảm cúm và nhiều bệnh khác nữa

Hiện nay khoa học công nghệ sinh học, khoa học y học tiên tiến đã tìm rađược nguồn gốc và tác nhân gây bệnh trên người, động vật đều do các loài vi sinhvật gây lên, chúng có mặt ở khắp mọi nơi trên trái đất, trên cơ thể động vật thực vật,người hay các bộ phận cấp độ nhỏ hơn nữa Chúng có thể phát tán và lây nhiễmthông qua đất, nước, môi trường không khí là con đường phát tán rất nhanh và cóthể lây nhiễm bệnh cho một vùng rộng lớn và rất nhanh chóng nếu trong thành phầnkhông khí có mật độ vi sinh gây dịch bệnh

Việt Nam là nước công nghiệp hóa, hàng năm với số lượng các công ty nướcngoài đặt tại Việt Nam, tận dụng nguồn nhân lực rẻ tại đây, mật độ công nhân làmviệc trong các dây chuyền sản xuất của các công ty này số lượng rất lớn, nguy cơlây truyền bệnh dịch rất cao, trong khi đó nước ta cũng chưa có nhiều hành langpháp lý, điều kiện để phòng ngừa kiểm soát các rủi do đó, việc kiểm soát đo kiểmmôi trường lao động của các công ty này chưa có chuẩn mực cấp quốc gia, chưa cóđược các phương pháp có độ chính xác, độ tin cậy cao khi sử dụng quan trắc môitrường lao động tại Việt Nam, nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá các yếu tố

gây ô nhiễm là việc rất cần thiết, nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu diễn biến môi

trường, nhằm cảnh báo các nguy cơ gây nhiễm bởi các yếu tố sinh học

Nghiên cứu quy trình kỹ thuật phân tích vi sinh vật trong không khí là cầnthiết, hiện nay chưa có một quy trình kỹ thuật nào là chính thức được chứng minh

về độ chính xác và được phổ biến một cách chính thống trong các phòng thí nghiệmtại Việt Nam, hay chứng minh tính chính xác của quy trình kỹ thuật một cách bàibản nhất về quy trình phân tích vi sinh vật trong không khí

Trên cơ sở lý luận khoa học và ý nghĩa thực tiễn được trình bày ở trên, chúng

tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động”, với các mục

tiêu và nội dung chính sau đây:

Mục tiêu cơ bản của đề tài luận văn :

- Đánh giá được tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm trong môi trườngkhông khí lao động

- Có quy trình phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm trong khôngkhí môi trường lao động

Nội dung nghiên cứu :

- Khảo sát chọn lựa môi trường nghiên cứu cũng như khảo sát lấy mẫu khôngkhí

- Quan trắc môi trường không khí lao động

- Đánh giá ô nhiễm chất lượng môi trường không khí tại cơ sở sản xuất thựcphẩm

- Xây dựng quy trình phân tích nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài :

- Đề tài góp phần bổ sung cơ sở lý luận trong việc nghiên cứu sự có mặt của nấm và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động

- Đưa ra một quy trình phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm trong không khí môi trường lao động

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG KHÔNG KHÍ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.1.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật trong không khí trên thế giới

Thế giới đã quan tâm nhiều đến sự tồn tại và phát tán của các vi sinh vậttrong không khí, tuy môi trường không khí không phải là môi trường dinh dưỡng, visinh vật không thể sinh trưởng được, nhưng không vì thế mà môi trường không khíkhông ô nhiễm Sự tồn tại và phân tán của các vi sinh vật trong không khí là mộthiểm họa tiềm tàng gây ra các loại bệnh, có cả những bệnh hiểm nghèo, có thể tạo

đà bùng phát dịch bệnh Viện Nghiên cứu quốc gia về sức khỏe và an toàn lao độngcủa Mỹ (NIOSH) cũng đã đưa ra phương pháp lấy mẫu bioaerosol cho vùng khôngkhí trong nhà (indoor air) từ những năm 1998 (Method NIOSH) Quan trắc vi khuẩn

và nấm mốc trong không khí không chỉ đánh giá chất lượng môi trường không khíkhu vực đó mà còn phát hiện sớm nguồn gốc có nguy cơ nhiễm bệnh, nhằm phòngchống được sự gây bệnh do vi sinh vật và gây nguy cơ ngộ độc thực phẩm do sựphát tán vi khuẩn, nấm và nấm mốc trong không khí [28]

1.1.2 Tình hình nghiên cứuvi sinh vật trong không khí ở Việt Nam

Việt Nam hiện nay chưa có nhiều người quan tâm đến sự ảnh hưởng của visinh không khí, chưa nhìn thấy ảnh hưởng như thế nào đến môi trường cộng đồng.Năm 2003 Từ Hải Bằng ứng dụng kỹ thuật đặt đĩa thạch lấy mẫu không khí đánhgiá chất lượng không khí về mặt sinh học trong phòng thí nghiệm vi sinh kết quả sosánh hai mùa đông và mùa hè, chỉ tiêu đánh giá trung bình mật độ trong không khíTVKHK là 2,6.103 CFU/m3không khí cao hơn mùa hè rất nhiều là 5,13.102 CFU/m3

không khí, tổng số nấm cũng tương tự như vậy lần lượt là 5,2.102CFU/m3 vào mùanóng và mùa lạnh là 4,62.102CFU/m3 [1] Năm 2009 Nguyễn Quốc Tuấn có nghiêncứu đánh giá chất lượng các phòng mổ của 13 bệnh viện quanh thành phố Hồ ChíMinh, kết quả cho thấytỷ lệ phòng mổ, phòng hồi sức đạt mức C theo tiêu chuẩn EUGMP 1997 và WHO 2002 là 6,1%; đạt mức D là 21,2%, tỷ lệ đạt theo tiêu chuẩn

phòng phẫu thuật của Merck 2009 (10 ÷ 200 CFU/m3) là 21,2% Số lượng vi sinhtrong không khí của 13 bệnh viện tại Thành phố Hồ Chí Minh phần lớn tập trungtrong khoảng từ 2.102 ÷ 5.102 CFU/m3 chiếm 70% (23/33 phòng) [9] Năm 2010Trịnh Quỳnh Mai đã có nghiên cứu so sánh hai phương pháp lấy mẫu bằng thiết bị

và lấy mẫu đạt đĩa thạch kết quảdùng thiết bị lấy mẫu có độ đồng đều hơn so vớiphương pháp đặt đĩa thạch [6] Năm 2011 có nhiều nghiên cứu khảo sát mức độnhiễm nấm môi trường không khí phòng không máy lạnh, các dược liệu đang bántại thành phố Hồ Chí Minh, mức ô nhiễm đều vượt qua mức giới hạn cho phép tiêuchuẩn WHO [36]

1.2 SỰ TỒN TẠI CỦA VI SINH VẬT TRONG KHÔNG KHÍ

Môi trường không khí không phải làm môi trường có thành phần dinhdưỡng, vi sinh vật không sinh trưởng trong không khí, vi sinh vật chúng bám vàocác hạt bụi lơ lửng bay trong không khí, đã tìm thấy rất nhiều những loại vi sinh vậtkhác nhau tồn tại trong không khí Qua đó nhiều người đã có những quy định chung

về tên gọi là Bioaerosol Bioaerosol được hiểu là bao gồm các hạt bụi sinh học lơlửng trong không khí trong đó có cả vi khuẩn và nấm, các hạt phấn hay bào tử khác

1.2.1 Vi khuẩn trong không khí

Vi khuẩn không tồn tại độc lập trong môi trường không khí vì vi khuẩn làsinh vật rất nhỏ nó không thể tự phát tán và di chuyển trong không khí được và nóthường bám vào các hạt bụi lơ lửng trong không khí hay các dạng hạt khác có thể dichuyển lơ lửng trong không khí, sự phát tán của vi khuẩn trong không khí là giántiếp nhờ các vật chủ khác có thể bay lơ lửng trong không khí, di chuyển từ nơi nàyđến nơi khác nhờ sự tác động của gió, bão, sự chuyển động trong không khí đưa đẩycác hạt bụi trong không khí

Vi khuẩn không sinh trưởng được trong không khí nhưng hiện nay các nhàkhoa học đã tìm thấy những nguy cơ tiềm ẩn các rủi do có nguồn gốc từ không khí.Nhưng một số loài vi khuẩn vẫn có thể tồn tại vài giờ đến vài tháng trong môitrường không khí được, như vi khuẩn lao chẳng hạn nó có thể tồn tại trong môi

trường tự nhiên khoảng 3 ÷ 4 tháng, vì chúng có thể bám vào các hạt bụi lơ lửng trong không khí.

1.2.1.1 Bacillus trong không khí

Vi khuẩn Bacillus bao gồm những loại vi khuẩn hình que, Gram (+), hiếu khí thuộc họ Bacillaceae, chúng có mặt ở khắp nơi, cả nhưng nơi có điều kiện khắc

nghiệt nhất Điều kiện sống gay go nhất chúng tạo ra bảo tử gần như hình cầu để tựtồn tại ở dạng giống như ngủ đông Đa số các chủng của vi khuẩn này vô hại, chỉ có

hai loài là được xem là quan trọng đó là B anthracis và B cereus thường gây ngộ độc thực phẩm, B anthracis gây bệnh than chết người sử dụng làm vũ khí sinh học tuy nhiên cũng chưa có nghiên cứu nào công bố đã tìm thấy trong không khí, B subtilis là chủng xuất hiện nhiều, chúng có khả năng đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh khác như E.coli, trong ruột người chúng là những vi sinh có ích giúp cải thiện

hệ thống tiêu hóa Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi vi khuẩn B cereus có thể dẫn đến

tiêu chảy do độc tố 3 thành phần được tạo ra bởi chủng vi khuẩn đục thủng và giếtchết tế bào này Độc tố bao gồm ba protein (3 thành phần) là rất hiếm, một trong số

đó là enterotoxin không tán huyết, còn được gọi là Nhe Độc này được cho là độc tố

gây ngộ độc thực phẩm chính do B cereus sản sinh ra Nó được tìm thấy ở tất cả các chủng B cereus gây ngộ độc thực phẩm và trong gần như tất cả các chủng B cereus khác, ba protein trong các độc tố Nhe được gọi là NheA, NheB và NheC.

1.2.1.2 Staphycoccus trong không khí

Staphylococcus là lọai cầu khuẩn, bao gồm cả giống hiếu khí (Micrococcus, Planococcus và Deinococcus), giống kị khí tuỳ nghi (Staphylococcus, Stomacoccus, Streptococcus, Leuconostos, Pediococcus, Aerococcus và Gemella) và giống kị khí (Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Coprococcus và Sarcina) Họ Micrococcaceae gồm bốn giống: Micrococcus, Stomacoccus, Planococcus và Staphylococcus Những đặc tính khác nhau của cầu khuẩn Gram (+) gồm: sự sắp

xếpcủa tế bào, hiếu khí bắt buộc, kị khí tuỳ nghi hay vi hiếu khí, kị kí bắt buộc,phản ứngcatalaza, sự hiện diện cytochrom, sản phẩm lên men từ quá trình kị

khí,peptidoglycan, axit teichoic trong thành tế bào vi khuẩn (Scott E.M và cs,

2000) Staphylococcus là tụ cầu có khả năng gây bệnh rất lớn cho người và động

vật Trên phương diện gây bệnh thì tụ cầu khuẩn được chia làm hai nhóm chính: cómen coalugaza khi xuất hiện trên môi trường thạch máu có màu vàng thì được gọi là

tụ cầu vàng và không có men coagulaza xuất hiện trên môi trường thạch máu cómàu trắng ngà được gọi là tụ cầu trắng Chúng là tác nhân gây nhiều loại bệnh khichúng bám và cư trú các bộ phân của cơ thể như trên da, khoang miệng, gây viêmphổi cấp tính nếu như bị hít phải Trong thực phẩm vi khuẩn chỉ cần 1,0 x 102CFU/

g thức ăn đủ để bị ngộ độc, vi khuẩn này rất nguy hiểm nếu như chúng xuất hiện

trong môi trường không khí Khi bị nhiễm trùng da, mô tế bào, áp xe do vi khuẩn S aureus khi mổ ra chúng tạo thành mủ có màu vàng, đặc, không hôi Chúng còn gây

ra nhiều loại viêm nhiễm khác trong các bộ phận trong cơ thể khi chúng theo cáctuyến dịch hay vết thương hở[10]; [36]

1.2.2 Nấm và nấm mốc trong không khí

Giới nấm (Fungi) là nhóm sinh vật đơn ngành thuộc dạng tế bào nhân thực,

Cơ thể là đơn bào hoặc đa bào dạng sợi, có thành kitin (trừ một số ít có thànhxenluloza), không có lục lạp, Sống dị dưỡng hoại sinh, ký sinh và cộng sinh, sinhsản chủ yếu bằng bào tử, bào tử thường không có lông và có thể có roi Nấm pháttriển trong điều kiện có sẵn chất hữu cơ và ở nhiệt độ từ 25 ÷ 30oC, Ở 0oC thì nấmkhông phát triển được, ở nhiệt độ 100oC giết chết nhiều loại nấm, trong hệ thốngphân loại 5 giới của RH, (Whittaker the five kingdom system) nấm thuộc giới riêng

rẽ được gọi là giới nấm, Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100giống và hơn 50.000 loài đã được mô tả, nhưng ước tính có đến trên 250.000 loàinấm có mặt trên trái đất này

Nấm có nhiều loài như vậy có cả những loài có lợi và có cả những loài cóhại, còn tùy vào sự hiện diện của nó ở đâu, trong điều kiện nào và trên cơ chất gì.Chúng sẽ tạo ra các chất ngoại độc tố và nội độc tố gây hại cho môi trường xung

quanh nó Nấm có các dạng điển hình gồm nấm men và nấm sợi, chúng khác nhau

về nhiều đặc điểm sinh học

Nấm men (Yeast) là sinh vật đơn bào, sinh sản bằng nảy mầm chồi hoặc phân

cắt Hình dạng và cấu trúc của nấm ở thể đơn bào có hình trứng (thường là nấmmen), đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơnbào) Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùytheo từng loài, Đường kính của sợi nấm thường từ 3 ÷ 5 µm, có khi dài đến 10 µm,thậm chí đến 1 mm, Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục cm, các sợi nấm pháttriển theo chiều dài theo kiểu tăng trưởng ngọn

Liên quan đến gây bệnh của nấm thông qua 4 phương thức đó là: ký sinh,gây bệnh với các hiện tượng dị ứng, gây bệnh do ăn phải thực phẩm nhiễm nấm vàđộc tố của chúng, gây bệnh do ăn phải nấm độc Nhiều loài phổ biến hiện nay thuộc

chi Aspergillus và Penicillium chúng phân bố rộng rãi trên trái đất nhiều loại cơ

chất tự nhiên, chúng có mặt khắp nơi trên trái đất Theo E Kister, M Morelet

(2000) thì ước tính số loài đã hiện biết của chi Penicillium là khoảng 233 loài, chi Aspergillus khoảng 185 loài Một số lượng lớn đã được phát hiện những lợi ích

mang lại cũng có nhiều như, chúng tham gia và quá trình sản xuất công nghiệpkháng sinh, công nghệ lên men, nhiều ứng dụng khác có lợi cho người và môitrường cộng đồng Bên cạnh đó có nhiều loài có hại, chất độc do nấm tạo ra gọichung là mycotoxin gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người như các vấn đề dị tậtbẩm sinh, não, gan, thận[4]; [5]; [9]; [11];

1.2.2.1 Aspergillus trong không khí

Nấm Aspergillus là giống có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang và

phát triển chủ yếu trên bề mặt cơ chất, tế bào chất có nhiều nhân và những nhân này

có thể di chuyển qua lại giữa các tế bào với một lỗ nhỏ ở vách ngăn Khuẩn ty và sự

hình thành cọng mang túi bào tử của Aspergillus Chúng sinh sản vô tính bằng sự

hình thành các cọng bào tử từ tế bào chân với túi có cuống (vehicle), thể bình vàbào tử đính (conidia)

1.2.2.2 Penicillium trong không khí

Giống Penicillium có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn giữa 2 tế bào với

một lỗ nhỏ để các phần tử trong tế bào chất thông thường Cọng bào tử phân nhánhvới các thể bình cấp 1, 2 và 3 và tận cùng bằng các đính bào tử trần dễ dàng pháttán trong không khí, đặc biệt đính bào tử có màu xanh lục đặc trưng cho giống

Penicillium.

1.2.2.3 Một số loài nấm khác trong không khí

Một số loài nấm khác thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh trên người, Microsporum gây bệnh trên chó, A fumigatus gây bệnh trên chim; Saprolegnia và Achlya gây bệnh nấm ký sinh trên cá Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora[18].

1.3 ẢNH HƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG KHÔNG KHÍ TỚI SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG

1.3.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn đến môi trường và sức khỏe cộng đồng

Vi khuẩn hiếu khí là vi khuẩn có thể mọc và sống được khi có sự xuất hiệncủa oxy Vi khuẩn hiếu khí bao gồm rất nhiều loài, có những loại gây dị ứng, gâybệnh truyền nhiễm, gây độc, nhóm vi sinh vật tồn tại một số lượng lớn trong môitrường là một hiểm họa tiềm ẩn có thể bùng phát dịch bệnh bất cứ lúc nào, nếu nhưkhi gặp điều kiện môi trường sống thuận lợi những vi sinh vật gây bệnh này bùngphát thành ổ dịch và nếu không kiểm soát kịp thời có thể trở thành đại dịch, nhữngbệnh có thể gặp phổ biến như viêm phổi cấp, lao, tả lỵ, thương hàn đó là nhữngbệnh thường gặp nhất, ngoài ra còn rất nhiều những bệnh khác có thể gặp đối vớinhững người mẫn cảm, hay cơ địa của người đó phù hợp với điều kiện sinh trưởng

và phát triển của loại vi sinh vật gây bệnh này, sự lây truyền bệnh truyền nhiễm gây

ra bởi vi sinh vật thông qua con đường không khí là rất khó kiểm soát, nó có thểphát tán trong một không gian rộng lớn

Trong không khí có rất nhiều loại vi khuẩn có cả những loài có lợi, nhưng

có không ít những loài gây hại cho sức khỏe của sinh vật, động vật và con người Vi

khuẩn chủ yếu gây ra những bệnh như nhiễm trùng khác nhau và tốc độ gây bệnh

rất nhanh có thể gây tử vong nếu không kịp thời điều trị như hô hấp cấp tính (S aureus, và S epidermidis) hay C trachomatis gây ra bệnh mắt hột, Mycoplasma pneumoniae gây ra bệnh viêm phổi Những loài gây ra dịch tả như (Vibrio cholera) Còn rất nhiều những loại bệnh khác, nguyên nhân chính gây ra là do vi

khuẩn[10]; [13]; [14]; [15]; [19]; [24]

1.3.2 Ảnh hưởng của nấm đến môi trường và sức khỏe cộng đồng

, được hình thành khi nấm chuyểnhóa các chất dinh dưỡng có trong thức ăn và nguyên liệu Sự hình thành nấm mốc

và độc tố của chúng có thể bắt đầu từ khi cây còn ở trên đồng, lúc thu hoạch, trongkhi bảo quản hoặc ngay cả trong quá trình chế biến thức ăn cho vật nuôi Như vậy,không nơi nào trên thế giới có thể thoát khỏi nấm mốc và độc tố từ chúng, tác hạicủa chúng là vô cùng to lớn đối với năng suất vật nuôi và sức khỏe con người

Các loại độc tố sinh ra từ các loại nấm mốc điển hình như:

Aflatoxin: Aflatoxin nhiễm nhiều trong khô dầu phộng, khô dầu dừa, bắp,

cám, tấm… do A flavus và A.parasiticus sinh ra, độc tố này gây tổn thương ở gan,

thận, mật , nó cũng làm giảm khả năng tiết sữa, đẻ trứng và sức đề kháng ở gia súc,gia cầm Theo Tổ chức về bệnh ung thư Quốc tế aflatoxin được xếp vào danh sáchnhững tác nhân gây ung thư cho người

Ochatoxin A: do A ochraceus sinh ra, các nguyên liệu dễ nhiễm độc tố này

như cám gạo, lúa mì, bột mì, bắp, đậu nành, cà phê Dư lượng ochratoxin cũng đượctìm thấy trong thịt heo và thịt gia cầm Độc tố này gây hại đến gan và thận động vật.Với nồng độ lớn hơn 1ppm có thể làm giảm sản lượng trứng ở gà đẻ, nồng độ lớnhơn 5ppm có thể gây nên những tổn thương ở gan và ruột Tương tự như aflatoxin,độc tố này cũng gây nên sự giảm sức đề kháng và là tác nhân gây ung thư ở người

Citrinin: Độc tố này do sinh ra bởi nấm P citricum có nhiều trên tấm gạo để

mốc, độc tố này gây hại cho thận, gây hoại tử nhiễm trùng vì thế làm tổn hại đếnchất lượng quầy thịt

Tricothecenes (T2-toxin):do F tricinotum sinh ra thường nhiễm nhiều trong

bắp, tấm gạo bị mốc Ảnh hưởng chính của các độc tố này là làm giảm tính thèm ăn

ở gia súc, kèm theo triệu chứng nôn mửa và làm giảm năng suất của động vật nuôi.Heo là loài gia súc nhạy cảm với độc tố tricothecenes

F2-Toxin(zearlenon): do F roseum sinh ra, theo quan sát thấy nhiều trên

bắp, lúa mạch, lúa mì Heo là loài động vật rất dễ quan sát, khi bị nhiễm độc thì âm

hộ bị sưng đỏ, đôi khi núm vú cũng sưng đỏ, có thể dẫn tới sa trực tràng và âm đạo,

tử cung nở rộng và có hiện tượng thoái hóa buồng trứng Zearalenon gây

,

Zearalenone có tác dụng trực tiếp lên cơ quan sinh dụccái gây sẩy thai, nhưng nó không có tác dụng làm giảm lượng thức ăn ăn vào nhưtricothecenes [17]; [32]

Trong số các độc chất ở trên thì độc tố aflatoxin có mức nguy hiểm lớn nhất.Aflatoxin bao gồm 6 loại khác nhau (B1, B2, G1, G2, M1 và M3), trong đó độc tínhcao nhất là aflatoxin B1 Sự nguy hiểm ở chỗ nó có khả năng gây hại chỉ với liềulượng rất nhỏ, 1 kg thức ăn chỉ cần nhiễm 2 mg cũng đã đủ làm hỏng gan Độc chấtnày lại bền vững với nhiệt, nếu đem đun sôi 100oC ở nồi bình thường hoặc nhiệt độcao hơn ở nồi áp suất, hay nhiệt độ từ máy ép đùn viên thức ăn gia súc thì aflatoxinvẫn không bị phân hủy.Ngoài khả năng tạo ra một số loại độc chất thì có một sốbệnh nguy hiểm đã được tìm thấy nguyên nhân là do các loại nấm gây ra

Bệnh lý về bệnh nấm phổi được phát hiện từ cuối thế kỷ 19 và là bệnh cónguy cơ tử vong rất cao Bệnh Aspergillomas phần lớn gây nhiễm trùng ở phổi vàrất hiếm khí gặp tuy nhiên các nhà khoa học đã phát hiện ra một bệnh nhân tại Ý đã

bị mắc chứng bệnh này, khối nấm trong người bệnh nhân này quá lớn với chiềurộng hơn 7 cm, và bênh nhân này được điều trị tại Bệnh viện Catania ở Ý Nguyên

nhân gây ra chứng bệnh này là do bào tử vi nấm Aspergillus xâm nhập vào phổi qua

đường khí quản và tạo ra một lỗ hổng trong lá phổi, bào tử này cư ngụ ở đây và nẩymầm dẫn đến sưng phổi và bị ho lao nếu như không được phát hiện và điều trị kịpthời Trước đây cho rằng chỉ có tác nhân hóa học mới gây ra ngộ độc cấp tính chocon người, còn các cá nhân sinh học chỉ có thể gián tiếp gây ra các bệnh tật cho conngười Việc phát hiện và phòng chống là rất cần thiết đối với những loại vi nấm cóthể tạo ra nhưng ngoại độc tố tránh được nguy cơ lây nhiễm Việt Nam lại có khíhậu nóng ẩm là điều kiện rất phù hợp với sự sinh trưởng của các loài vi nấm gâybệnh sinh trưởng mạnh, gần như quanh năm độ ẩm luôn ở mức cao 75 ÷ 80% vàocác tháng có độ ẩm tương đối gần 100%, đây là môi trường thuận lợi cho nấm vàcác vi nấm gây bệnh phát triển mạnh, gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người vàtrong môi trường lao động thì gây ảnh hưởng lớn đến người lao động[17]; [22];[25]; [26]; [36].

1.4 PHƯƠNG PHÁP THU MẪU KHÔNG KHÍ

1.4.1 Phương pháp lấy mẫu tại hiện trường

Lấy mẫu là bước quan trọng cho một quy trình phân tích, quyết định sựchính xác quy trình phân tích, khi lấy mẫu trong môi trường không khí là rất khókhăn Đặc biệt trong phân tích vi sinh trong không khí thì việc lấy mẫu lại rất khókhăn, bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố tác động ngoại cảnh, gây nhiễu trong khôngkhí khu vực cần đánh giá Trên thế giới họ thường dùng hai phương pháp chính đểlấy mẫu vi sinh không khí là dựa trên nguyên tắc lắng hạt bụi (đạt đĩa thạch) vàphương pháp sử dụng lực bơm chân không để hút cưỡng bức Mỗi phương pháp nàyđều có ưu và nhược điểm, tùy mục đích sẽ sử dụng phương pháp nào cho phù hợp,

ô nhiễm không khí môi trường lao động rất đa dạng, việc lấy mẫu vi sinh trong khuvực có công nhân làm việc có tính đại diện rất khó Đối với vi sinh vật trong khôngkhí bị ảnh hưởng bởi sự lưu thông trong không khí, có điều kiện lấy nhiều vị trí sẽcho kết quả chính xác nhất[1]; [6]

Qua một số nghiên cứu đã được công bố trên thế giới thì đa phần sử dụngcác thiết bị lấy mẫu như thiết bị lấy mẫu Anderson, Rotorod, Burkard, thiết bị lấy

mẫu Burkard và rotorod thì dựa vào nguyên lý, sử dụng các vật liệu có độ bám dính

và dùng mô tơ quay tròn để các hạt bụi và các hạt sinh học lơ lửng trong không khí

có thể bám dính vào các vật liệu dính, sau đó thu các vật liệu dính này về đưa vàomôi trường nhân nuôi, tuy nhiên phương pháp lấy mẫu này thường kéo dài[6], [28].Các thiết bị ra đời sau này đã được cải tiến rất nhiều và đã được sử dụng trong nhiềunghiên cứu lấy mẫu vi sinh gây bệnh trong không khí đó chính là thiết bị Anderson.Thiết bị này được phân tầng theo kích thước của hạt sinh học lơ lửng, mỗi tầngđược đặt vật liệu giữ lại các hạt sinh học lơ lửng, ở các tầng, đưa các vật liệu nàynuôi ủ phòng thí nghiệm và phân loại vi sinh vật khác nhau Thiết bị Anderson đượcphân thành 6 tầng mỗi tầng có khoảng kích thước khác nhau, tùy mục đích nghiêncứu và sử dụng có thể dùng một tầng trong đó để có kích thước lỗ phù hợp, ngoài racòn có các loại thiết bị lấy mẫu của các hãng khác thiết kế và sản xuất như thiết bịSAS[19]; [28] Thiết bị này có nguyên lý giống với thiết bị lấy mẫu Anderson đóvẫn là lấy mẫu bằng phương thức hút trực tiếp Thiết bị lấy mẫu Spin Air sử dụngnguyên lý này để lấy mẫu vi sinh không khí với kích thước lỗ 0,4 mm và có 400 lỗtrên bề mặt, bốn chế độ quay đĩa, tốc độ là 100 lít/phút, sử dụng đĩa thạch 90 mm

1.4.1.1 Nguyên lý phương pháp hút trực tiếp

Nguyên lý của phương pháplà dùng lực hút chân không để hút không khí đivào thiết bị và được lưu giữ các hạt bụi trong đĩa thạch Tùy từng loại thiết bị sửdụng loại vật liệu lọc khác nhau mà không khí được lọc qua lỗ lọc cho không khí điqua và giữ lại vi sinh vật trên vật liệu đó Thiết bị lấy mẫu được nhiều tác giả sửdụng nhiều nhất hiện nay là dạng thiết bị Anderson, method 0800 của NIOSH cũng

sử dụng thiết bị lấy mẫu Anderson 2 tầng để lấy mẫu Phương pháp lấy mẫuAnderson thì thiết bị lấy mẫu được hút bằng một bơm hút qua các tầng đặt môitrường thạch với những kích thước lỗ khác nhau, thường thời gian lấy mẫu khoảng

5 ÷ 15 phút, đĩa thạch được lấy ra và đưa vào tủ ấm giữ ở nhiệt độ 37 ± 0,5 oC trongthời gian 1 ngày (đối với vi khuẩn) còn 3 ÷ 5 ngày đối với nấm mốc Ưu điểm củaphương pháp này là có thể lấy mẫu ở kích thước nhỏ có thể đi trực tiếp vào phổi (2

÷ 4 µm) và với phương pháp lấy mẫu này cũng có thể lấy được cả những vi khuẩnhiếu khí[6]; [28]; [36] Nhiều thiết bị lấy mẫu có tốc độ rất lớn có thể đạt tới 180 lít/phút và có loại kép hai đầu lấy mẫu vẫn đạt tới 180 lít/phút cho mỗi bên, các thiết bịnày rất phù hợp để lấy mẫu trong khu vực có tốc độ lưu thông không khí lớn, vậntốc chuyển động lớn Nhờ thiết bị hiện đại như vậy việc lấy mẫu sinh học trongkhông khí hiện nay rất dễ dàng và thuận tiện hơn, tuy nhiên chi phí đầu tư thiết bịtăng lên dẫn đến chi phí thực hiện quan trắc môi trường cao.

1.4.1.2 Nguyên lý phương pháp đặt đĩa thạch

Vi sinh vật trong không khí thường bám vào các hạt bụi lơ lửng trong khôngkhí, các hạt bụi này dù rất nhỏ nhưng chúng cũng có trọng lượng nhất định, nên cáchạt bụi này sẽ rơi tự do tương tự như các vật có trọng lượng khác Dựa vào nguyên

lý này nhà vi sinh vật học Robert Koch đã dùng các đĩa thạch môi trường để hứngcác bụi lơ lửng này đưa về phòng thí nghiệm để nuôi cấy phân lập Vì thế phươngpháp này được gọi là phương pháp Koch Phương pháp này kỹ thuật sử dụng đơngiản và tiện lợi không cầu kỳ có thể đạt được ở mọi nơi, thường được sử dụng nhiềutrong các bệnh viện ở thế kỷ 20, chủ yếu để kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện, bác

sỹ mổ và điều trị, nhà sinh học Robert Koch chuyên nghiên cứu về bệnh truyềnnhiễm, ông cho rằng sự lây nhiễm này lây truyền không chỉ ở các dụng cụ và quátrình điều trị và chữa trị trong bệnh viện mà còn có khả năng lây lan qua không khí

và có thể dẫn đến những đại dịch trong một vùng nào đó, nếu như có sự lan truyềncác vi sinh vật gây bệnh này ra cộng đồng, gây nguy hiểm cho môi trường cộngđồng Robert Koch nghĩ rằng với những điều như vậy và dựa trên nguyên tắc trọnglực thì chỉ cần đặt các đĩa thạch mở lắp trong khu vực bệnh viện là có bắt được cáchạt bụi có bào tử vi khuẩn bám trên đó, nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm

sẽ biết được chúng thuộc loài nào Chính những việc này sẽ có biện pháp phòngchống việc lây nhiễm trong bệnh viện bằng con đường không khí, dựa trên cáchđánh giá chất lượng không khí đó có thể giám sát được chất lượng không khí khu

vực phòng mổ nhằm giảm thiểu nguy cơ bị lây nhiễm các vết mổ bởi nhưng vi khuẩn gây bệnh, các vi khuẩn kháng kháng sinh[1].

1.4.1.3 Phương pháp lấy mẫu Impingers

Ngoài các kỹ thuật lấy mẫu trên môi trường rắn và các vật liệu như gelatincòn có một kỹ thuật khác để thực hiện lấy mẫu vào dung dịch môi trường dinhdưỡng lỏng, hay gọi là dung dịch đệm, dụng cụ sử dụng là ống impingers để thựchiện lấy mẫu, nguyên tắc lấy mẫu theo dạng hấp phụ Hiện nay thiết bị chuyên dụngcho việc lấy mẫu sinh học bằng dung dịch được hãng thiết bị thí nghiệm SKC sảnxuất với các loại khác nhau và thiết bị có tốc độ lớn nhất với vận tốc hút mẫu 12 líttrên phút, lấy mẫu trong một thời gian dài Ưu điểm lấy mẫu theo phương pháp này

là có thể lấy trong thời gian dài có tùy theo mục đích của các nghiên cứu, số lượngdung dịch sử dụng khoảng 15 ÷ 20 ml cho mỗi một lần lấy mẫu Đối với phươngpháp này cũng rất thuận tiện cho việc lấy các mẫu sinh học khác như vi khuẩn, vinấm, nấm men, virus, hay các hạt sinh học như hạt phấn, hạt bào tử… các sản phẩmtạo ra các loại nội độc tố và độc tố của nấm mốc Mẫu lấy từ phương pháp này cóthể sử dụng cho các phương pháp hiện đại hiện nay như PCR, phương pháp Elisa,ADN… xác định trực tiếp ra loại gì có nguy cơ gây bệnh như thế nào Tuy nhiênhiện nay tại Việt Nam chưa có nhiều ứng dụng để thực hiện theo phương pháp nàytrong quan trắc môi trường, cũng như những nghiên cứu khác liên quan đến vi sinh,hay mẫu sinh học không khí

Lấy mẫu bằng phương pháp này dung dịch đệm hay trực tiếp là các môitrường lỏng, sau khi lấy mẫu xong được đưa vào ống nghiệm và có thể sử dụng choviệc nuôi cấy, cũng như có thể sử dụng cho các phương pháp test nhanh bằngnhững kỹ thuật hiện đại Đây cũng là phương pháp rất hữu ích cho việc nghiên cứucác mẫu sinh học trong không khí và sử dụng để quan trắc chỉ tiêu sinh học trongkhông khí ở nhưng khu vực có có sự lưu thông không khí nhỏ và vừa phải sẽ rấthiệu quả, đồng thời phù hợp với những nghiên cứu về xác định DNA các mẫu sinhhọc tồn tại trong không khí, sử dụng trong nghiên cứu miễn dịch hay nghiên cứu về

các tác nhân gây dị ứng như bụi phấn hoa, hay ứng dụng trong các mẫu nghiên cứu

về sinh hóa[21]

1.4.2 Phương pháp phân tích tại phòng thí nghiệm

Tại Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu cắt ngang về lĩnh vực phân tích

vi sinh vật tuy nhiên nó vẫn chưa có quy định nào thống nhất sử dụng rộng rãi vẫnchỉ mang tính chất ở cấp độ thường quy của Viện Y học lao động, chưa xây dựngthành tiêu chuẩn quốc gia hay tiêu chuẩn ngành Tuy nhiên trong những năm quacũng có những nghiên cứu về chất lượng không khí của những phòng khám vànhững phòng chức năng trong bệnh viện tại Việt Nam Mới đây nhất vào năm 2009Nguyễn Quốc Tuấn đã sử dụng máy hút MAS 100 của hãng Merck để thực hiệnviệc lấy mẫu vi sinh không khí nuôi ủ và phân loại dựa trên hình thái khuẩn lạc mọctrên môi trường chọn lọc để nghiên cứu khảo sát ô nhiễm vi sinh trong không khíphòng phẫu thuật, phòng hồi sức của 13 bệnh viện khu vực Thành phố Hồ ChíMinh Cũng trong năm này 2010, Nguyễn Quỳnh Mai đã nghiên cứu so sánh giữa 2phương pháp đánh giá chất lượng môi trường không khí là phương pháp đặt đĩathạch và phương pháp hút không khí bằng máy,nhận xét về ưu và nhược điểm củatừng phương pháp, tuy nhiên với bài báo công bố đó chưa thể nói lên được độ chínhxác của phương pháp phân tích Trước đó Từ Hải Bằng và các cộng sự cũng đãbước đầu đánh giá chất lượng môi trường không khí tại các phòng phân tích vi sinh,trong nghiên cứu này nghiên cứu mức độ tập trung và phân tán của vi khuẩn và nấmtrong không khí trong phòng thí nghiệm vi sinh bằng phương pháp đặt đĩa thạch lấymẫu Trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng chothu thập vi khuẩn và thạch Sabouraud để thu thập và nuôi dưỡng nấm Nghiên cứunày tập trung chính vào việc nghiên cứu chất lượng môi trường không khí củaphòng thí nghiệm, cũng đã đưa ra được giả thuyết về chất lượng vi khuẩn và nấmtrong không khí phòng thí nghiệm của mùa đông cao hơn mùa hè và cũng đã chỉ ramức độ sạchtại các phòng thí nghiệm vi sinh hiện nay chưa đạt được tiêu chuẩn khi

so sánh với các tiêu chuẩn hiện có tại các quốc gia khác Qua các nghiên cứu

trêncũng là những cơ sở để tiếp tục các nghiên cứu độ chính xác của phương pháplấy mẫu phân tích vi sinh không khí phục vụ cho lĩnh vực quan trắc môi trường laođộng[1]; [6]; [27].

Hiện nay với sự phát triển nhanh chóng của ngành công nghệ sinh học, sinhhọc phân tử, đã có thể phân lập và định dạng đến loài của các vi sinh vật một cáchnhanh chóng và có độ chính xác rất cao, với phương pháp giải trình tự gen tiên tiếnhiện có thể tìm ra được các gen gây bệnh của vi sinh và gen quy định độc tố của các

vi sinh Qua đây cảnh báo chất lượng môi trường có nguy cơ tiềm ẩn sự nguy hiểmkhi có mặt của những loại vi sinh đó trong không khí

1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử

Hiện nay, bên cạnh những phương pháp định loại vi sinh vật truyền thống, cácnhà khoa học còn sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại dựa trên trình

tự gen Trong lĩnh vực vi sinh vật và vi sinh phân tử việc giải trình tự gen là hết sứcquan trọng, cho phép định danh, phân loại vi sinh vật tới cấp độ phân tử Sử dụngphương pháp sinh học phân tử để khẳng định chủng vi khuẩn tìm thấy trong khôngkhí có độ chính xác rất cao, khẳng định được chính xác vi khuẩn có nguy cơ gâybệnh và nấm mốc có nguy cơ tạo ra chất độc ảnh hưởng tới thực phẩm, các chủnggây bệnh cho người Đối với vi khuẩn và xạ khuẩn xác định trình tự gen 16S rARN

là phương pháp đang được dùng phổ biến Gen này có mặt trong tất cả các tế bào,chứa vùng bảo thủ cao và vùng biến đổi cho phép phân biệt giữa các loài khác nhau.Với nấm mốc trình tự gen 28S rARN là nhiều người sử dụng hiện nay, giải trình tựgen đối với nấm mốc Giải trình tự gen cho thấy đọan gen hay bộ gen có độ tươngđồng là bao nhiêu so sánh gen chủng này trong ngân hàng gen sẽ xác định chính xácchúng thuộc chủng vi sinh nào Sử dụng phương pháp này để xác định vi sinh gâybệnh và ngộ độc thực phẩm đang có mặt trong không khí môi trường lao động, cảnhbáo cho người lao động có biện pháp phòng tránh tiếp xúc với môi trường ônhiễm[30]; [31]; [34]

1.4.4 Phương pháp vận chuyển và bảo quản mẫu

Bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển mẫu lấy từ hiện trường di chuyển

về phòng thí nghiệm luôn đảm bảo không xảy ra sự ảnh hưởng đến mẫu thử trongquá trình vận chuyển, sẽ làm sai khác kết quả quan trắc Đảm bảo chất lượng kếtquả phân tích nấm mốc và TVKHK trong không khí, điều kiện bảo quản phải đảmbảo thùng đựng vô khuẩn (thùng hút chân không là tốt nhất) và nhiệt độ 4oC Mẫubioaerosol ở đây thu thập được là đĩa thạch hoặc các tấm gelatin được hấp phụ đểbám dính các hạt bụi lơ lửng Qua hồi cứu thùng đựng mẫu hầu hết các đĩa mẫuđược đậy lắp ngay sau khi đã lấy mẫu, được gói đĩa thạch lại bằng một giấy bảnmỏng đã được khử trùng hoặc dùng paraffin để phủ kín khe hở giữa hai lắp đĩa Petrihoặc gắn kín các ống nghiệm (đối với việc lấy mẫu dung dịch) và được đưa vàothùng bảo ôn nhiệt (4oC), đảm bảo độ vô trùng Trong quá trình vận chuyển luôn có

sử dụng mẫu trắng vận chuyển đối chứng Tuân thủ áp dụng theo quy trình QA/QCtrong quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu thử về phòng thí nghiệm để đảm bảochất lượng của phép thử có độ chính xác

Năm 2013 ở Việt Nam đưa Thông tư quy định đảm bảo chất lượng và kiểmsoát chất lượng trong quan trắc môi trường, dùng cho các đơn vị quản lý nhà nướctrung ương và địa phương, các trạm quan trắc, các đơn vị tham gia hoạt động tronglĩnh vực môi trường, để có được báo cáo kết quả quan trắc môi trường đảm bảo chấtlượng, độ chính xác cao

1.5 ÁP DỤNG QA/QC TRONG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Bảo đảm chất lượng (QA) trong quan trắc môi trường là một hệ thống quản

lý và kỹ thuật trong một tổ chức nhằm đảm bảo cho hoạt động quan trắc môi trườngđạt được các tiêu chuẩn chất lượng đã quy định

Kiểm soát chất lượng (QC) trong quan trắc môi trường là thực hiện các biệnpháp, theo dõi và kịp thời điều chỉnh để đạt được độ tập trung và độ chính xác củaphép đo nhằm đảm bảo cho hoạt động quan trắc môi trường đạt các tiêu chuẩn chấtlượng theo quy định

Áp dụng QA/QC trong quan trắc môi trường là một trong những tiêu chí rấtquan trọng đảm bảo cho chương trình quan trắc, cũng như các quy trình phân tíchđảm bảo được chất lượng, độ chính xác cao Trong việc xây dựng quy trình hayphương pháp phân tích việc đưa QA/QC vào nghiên cứu, đánh giá, khảo sát độđúng độ chính xác của phương pháp đó trong thực tiễn áp dụng là rất chuẩn xác và

có độ tin cậy cao Áp dụng QA/QC trong từng khâu của một quy trình là mục tiêugiảm thiểu, giám sát tất cả những sai sót trong từng bước thực hiện đó, QA/QCtrong quá trình lấy mẫu cần ngay từ những việc nhỏ nhất đó là thiết lập cỡ mẫu, cólấy mẫu trắng, mẫu đối chứng, lấy mẫu vị trí nào, chiều cao khi lấy mẫu, sau đó đếndụng cụ lấy mẫu, vật liệu hấp phụ, môi trường lấy mẫu, dụng cụ bảo quản sau khilấy mẫu, sổ tay hướng dẫn cho nhân viên thực hiện lấy mẫu luôn bảo đảm theo tiêuchuẩn đặt ra, sổ ghi lại nhật ký lấy mẫu, ký hiệu mẫu để mã hóa và nhận dạng saukhi đưa về phòng thí nghiệm, thiết bị lấy mẫu tại hiện trường đã đảm bảo về độ vôtrùng, bảo dưỡng và hiệu chuẩn trước khi đưa đi lấy mẫu chưa, như vậy tất cả cácbước này luôn luôn phải tuân thủ theo tiêu chuẩn hiện hành yêu cầu, QA/QC ápdụng quá trình lấy mẫu cần phải thiết kế được mẫu trắng cho dụng cụ chứa mẫu,mẫu trắng dụng cụ lấy mẫu, mẫu trắng vận chuyển

Áp dụng QA/QC trong phòng thí nghiệm để phép thử đảm bảo độ chính xáccao, ngoài việc lấy mẫu tại hiện trường đảm bảo chất lượng thì tại phòng thí nghiệmcũng phải đảm bảo chất lượng tương tự như vậy thì mới có được kết quả có độchính xác cao Trong phòng thí nghiệm phải đảm bảo các thiết bị trong phòng thínghiệm đảm bảo là đã thực hiện hiệu chuẩn đầy đủ và tuân thủ quy trình thời gianbảo dưỡng và hiệu chỉnh khi cần thiết Đối với những phép thử vi sinh cần có phânbiệt rõ ràng khu vực chuẩn bị môi trường nuôi cấy, khu vực cấy mẫu đảm bảo độ vôtrùng, khu vực bảo quản môi trường luôn đảm bảo tuân thủ yêu cầu điều kiện môitrường đảm bảo chất lượng hóa chất Khu xử lý mẫu vi sinh sau khi thử nghiệm,chất thải hóa học và môi trưởng nuôi cấy bị hỏng… tất cả nhưng điều kiện như vậy

đã được quy định rõ trong QA/QC Tuân thủ chương trình này để đảm bảo chất lượng cho phép thử.

1.6 SỰ CẦN THIẾT TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH KHÔNG KHÍ

Hiện nay mức độ ô nhiễm môi trường không chỉ ngày một tăng, ô nhiễmnước, ô nhiễm đất, khói bụi rất lớn, bụi vô cơ, bụi lơ lửng, gây ô nhiễm không khínghiêm trọng và mức độ ô nhiễm các hạt bụi sinh học trong không khí cũng là rấtlớn và lại chưa được ai quan tâm nhiều Mức độ ô nhiễm ngày càng lớn như bệnhviện, ở các vùng lân cận và các tòa nhà văn phòng, ảnh hưởng tới người lao động,trong các nhà máy sản xuất thực phẩm, phân bón, bãi rác công cộng Qua hồi cứu vềphương pháp đánh giá chất lượng môi trường không khí ô nhiễm vi sinh, thấy rằng

ở Việt Nam chưa hề có công bố tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn ngành, về phân tíchTVKHK và tổng nấm trong không khí để áp dụng rộng rãi trong cả nước cho côngtác quan trắc và phân tích TVKHK và tổng nấm trong không khí môi trường laođộng cũng như môi trường xung quanh Hiện tại chỉ có một số nghiên cứu đánh giáchất lượng phòng khám bệnh viện và phòng thí nghiệm vi sinh, ngay cả quy chuẩn

áp dụng cũng chư có để so sánh mức độ ô nhiễm vi sinh trong không khí Trong khi

đó ở nước ta, hiện chưa có phương pháp tiêu chuẩn để xác định thông số tổng vikhuẩn hiếu khí và tổng số nấm trong môi trường không khí, dẫn tới việc rất khókhăn để xác định được mức độ ô nhiễm về mặt sinh học trong không khí như thế

nào Vì vậy việc “Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động” là nhiệm vụ cần

thiết phục vụ quan trắc môi trường lao động

1.7 GIỚI HẠN CHO PHÉP MẬT ĐỘ VI SINH TRONG KHÔNG KHÍ

Tại Việt Nam hiện giờ chưa có quy chuẩn bắt buộc áp dụng nào hiện nay ngay

cả áp dụng cho bệnh viện vẫn chưa có quy chuẩn nào, dựa trên các tham khảo cácnước các tổ chức và các quốc gia khác trên thế giới Dưới đây là bảng tiêu chuẩn ápdụng của một số tổ chức và một số quốc gia trên thế giới

Bảng 1.1.Bảng tiêu chuẩn áp dụng giới hạn cho phép vi sinh không khí [19]; [35]

STT Tổ chức, quốc gia Vi khuẩn Nấm (Vi khuẩn + Nấm)Tổng bioaerosols

không thuộc khu công nghiệp.

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng giống vi sinh vật:Chủng chuẩn được sử dụng là vi khuẩn được mọctốt nhất trên môi trường MacConkey Trong nghiên cứu này chủng chuẩn được sử

dụng đối chứng dương cho môi trường vi khuẩn là: E coli ATCC® 25922, E aerogenes ATCC® 13048TM, sử dụng chủng chuẩn S aureus ATCC®25923TM thựchiện đối chứng âm cho các thí nghiệm, đồng thời dùng chủng chuẩn này làm đốichứng dương để đánh giá chất lượng môi trường thạch máu Chủng chuẩn cho môi

trường nấm và nấm men là chủng phổ biến hiện nay đó là A.brasiliensis

Thiết bị trong phòng thí nghiệm bao gồm: Tủ ấm, Đức.Máy khuấy từ IKA,

Ý Kính hiển vi soi nổi Bel, Ý Kính hiển vi sinh học Nikon E100, Nhật Bản.Tủ cấy

vi sinh, hệ thống phòng sạch và an toàn sinh học tại Viện Nghiên cứu KHKT Bảo

hộ lao động Máy đếm khuẩn lạc SC 06 Bibby, Anh

Dụng cụ thí nghiệm: đĩa Petri (90cm và 100 cm), ống đong, bình tamgiác,các dụng cụ để đi hiện trường: chân máy, các đĩa, dụng cụ bảo hộ lao động tiệttrùng tại hiện trường.Thùng đựng môi trường đi hiện trường và thùng đựng mẫu đãlấy ngoài hiện trường.Que cấy vi sinh, đèn cồn.Găng tay giầy ủng, khẩu trang y tếdành cho cấn bộ thực hiện lấy mẫu và phân tích tại phòng thí nghiệm

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm này sử dụng các loại môi trường rắn(môi trường thạch): môi trường MacConkey, môi trường Sabouraud, môi trườngthạch máu, các thành phần môi trường được sử dụng hầu hết là của hãng Merck, cóđầy đủ chứng nhận chất lượng sản phẩm của hãng[1]; [2]; [3]; [6]; [20]

Môi trường MacConkey cơ bản (g/l): Pepton 20; lactoza 10; muối mật 1,5;NaCl 5; thạch 20; nước cất 1.000 ml; pH 6,8 ÷7,0, khử trùng 121oC, 15 phút

Môi trường thạch máu (g/l): Thạch 15; pepton 5; meat extract 3; máu thỏ100ml; nước cất 1.000 ml; điều chỉnh pH 7,4÷7,6, khử trùng121oC,15 phút Để nguội45÷ 50 oC, cho 50ml máu vào quay tròn bình cho máu hòa tan đều trong thạch Màuthạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn Nếu môi trường màu ngả đen là máu đã chín Đểnguội 45÷50 oC đổ 20ml/đĩa

Môi trường Sabouraud (g/l): Pepton 10; glucoza 20; thạch 20; nước cất 1.000ml; pH 5,4 ÷ 5,8 khử trùng 121oC, 15 phút

Môi trường MEA (g/l): Pepton 10; glucoza 20; thạch 20; nước cất 1.000 ml;

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp xây dựng quy trình phân tích

Để xây dựng quy trình phân tích cần có các bước nghiên cứu đánh giá tuần

tự từ các yếu tố ảnh hưởng đến bước lấy mẫu và nuôi cấy trong phòng thí nghiệmluôn đảm bảo độ chính xác Mục tiêu là xây dựng quy trình phân tích dùng phổ biếnhơn trong điều kiện khác nhau của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam, cũng nhưcác điều kiện thực tế Những vị trí cần quan trắc phù hợp với phương pháp lấy mẫunào Qua quá trình hồi cứu, nghiên cứu các tài liệu trong nước và nước ngoài nhưnghiên cứu hướng dẫn của NIOSH, đưa ra được quy trình phân tích vi sinh trongkhông khí được hình thành với sáu bước như sau:

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thiết bị lấy mẫu,dụng cụbảo quản mẫu, môi trường, mẫu trắng và mẫu đối chứng

Hình 2.1.Sơ đồ phân tích tổng nấm và tổng vi khuẩn hiếu khí trong môi trường

không khíCác bước xây dựng quy trình phân tích trong phòng thí nghiệm cần phải xácđịnh được từng bước thực hiện như sau, nghiên cứu khảo sát môi trường chuẩn chonuôi cấy vi khuẩn hiếu khí phù hợp nhất với điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam

Bước 1:Dùng các chủng vi khuẩn E coli ATCC® 25922TM, E aerogenes

ATCC® 13048TM cấy lên các môi trường MacConkey, TSA, NA, để xác định môi

trường này phù hợp với quy trình nghiên cứu Còn với S aureus

ATCC®25923TMsử dụng để cấy lên môi trường thạch máu, đây là loại vi sinh vật

Lấy mẫu hiện trường, sử dụng thiết bị lấy mẫu vi sinhkhông khí, tốc độ lấy mẫu100 lít phút

Chuyển mẫu từ hiện trường về phòng thí nghiệm, đặt mẫu trong thùng kín (thùng hút chân không là tốt nhất) Điều

kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Nuôi ủ tại phòng thí nghiệm, điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, tổng nấm 28 ± 0,5 oC, tổng vi khuẩn hiếu

đặc trưng cho môi trường thạch máu Chủng nấm A.brasiliensis ATCC®16404TM

chọn môi trường phù hợp với quy trình phân tích [2]; [6]; [9]; [21]; [28]

Bước 2: Lấy mẫu tại hiện trường là công việc rất quan trọng, chọn vị trí

chung nhất của khu vực cần lấy mẫu, tránh cản trở các vật dụng xung quanh, vị trílấy mẫu mang tính đại diện cho khu vực Lấy mẫu bằng thiết bị lấy mẫu

Bước 3: Mẫu được lấy tại hiện trường xong cần bọc kỹ bằng giấy bản làm

sạch đặt vào thùng đựng mẫu (thùng đựng mẫu chọn thùng rút chân không là tốtnhất) đặt những viên đá không để đảm bảo điều kiện bảo quản mẫu nhiệt độ thấp.Chuyển ngay về phòng thí nghiệm trong thời gian ngắn nhất không không quá 12giờ sau khi lấy mẫu là tốt nhất

Bước 4: Phân tích tại phòng thí nghiệm, mẫu được chuyển về phòng thí

nghiệm chuyển vào 2 tủ nuôi khác nhau một tủ nuôi điều kiện nhiệt độ 37 oC ± 0,5

o

C và tủ nuôi điều kiện nhiệt độ 28 ± 0,5 oC Thời gian nuôi ủ lần lượt là tổng vikhuẩn hiếu khí là 24 ÷ 48 giờ, nếu không mọc thì mẫu đó âm tính

Bước 5: Đọc kết sau khi nuôi ủ một ngày đối với tổng vi khuẩn hiếu khí,

đếm tất cả khuẩn lạc đã mọc trên bể mặt đĩa thạch, các khuẩn lạc chập vào nhauđược tính làm một khuẩn lạc, có nhận xét phân loại những khuẩn lạc có màu sắcgiống nhau để cảnh báo chất lượng môi trường không khí ở mức ô nhiễm như thếnào có tiếp tục thực hiện đánh giá tiếp theo Sau 3 ngày bỏ tổng nấm ra đếm, tương

tự như đối với vi khuẩn hiếu khí đếm tất cả khuẩn lạc mọc riêng rẽ những khuẩn lạcmọc chập nhau được tính làm một khuẩn lạc (hoặc có thể lật ngược đĩa thạch đếmchân ăn sâu đĩa thạch) Tính kết quả sử dụng công thức 2.2 tình kết quả đối vớiphương pháp lấy mẫu bằng thiết bị định lượng được lượng không khí đã lấy Sửdụng công thức 2.1 cho phương pháp lấy mẫu đặt đĩa thạch tĩnh [16]

Bước 6: Sử dụng khóa phân loại Bergey’s, nhận định vi sinh vật ấy thuộc

loại nào có chủng gây độc, gây bệnh tồn tại trong không khí thực hiện quan sát hìnhthái khuẩn lạc nhận định, dùng các kỹ thuật sinh học để phân loại [20]

Xây dựng quy trình phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm trongkhông khí môi trường lao động Tiến hành lựa chọn các thông số để xác định tínhchính xác của quy trình phân tích này Qua tham khảo cuốn sách thẩm định cácphương phân tích hóa học và vi sinh vật nghiên cứu này đã lựa chọn thông số độ lặplại, độ tái lặp và thông số nữa để chứng minh độ chính xác của quy trình này là độkhông đảm bảo đo [9], [10]

2.2.2 Phương pháp vi sinh vật

Sử dụng các kỹ thuật cấy ria, cấy điểm trên môi trường chọn lọc để phân loại

và định dạng vi sinh vật thu bắt được trong không khí, quan sát đặc điểm hình tháiphân loại vi sinh vật, nhuộm Gram, tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi đặc điểmhình thái bào tử [2]; [3]

- Phương pháp làm tiêu bản vi khuẩn

Làm tiêu bản để quan sát và định dạng vi sinh vật thông qua các đặc điểmnhư hình dạng bào tử, hình dạng sợi Thường làm tiêu bản giọt ép, dùng que cấy lấykhuẩn lạc làm vết bôi lên lam kính và cố dịnh vết bối đặt lamen lên quan sát trựctiếp

- Phương pháp nhuộm Gram

Nhuộm Gram mục đích để định dạng vi sinh vật có khả năng bắt màu khácnhau của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và i ốt mà hìnhthành nên hai loại phức chất khác nhau Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyênmàu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn Vi sinh vật có phứcchất này thuộc loại Gram (+) Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu củathuốc nhuộm nên màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung Visinh vật có phức chất này thuộc loại Gram (-)[2]; [3]

- Định danh theo hệ thống phân loại Bergey’s

Hệ thống khóa phân loại vi khuẩn Bergey’s Chúng có thuộc nhưng loại visinh có độc lực cao hay không Đối với hệ thống khóa phân loại này dùng chủ yếu

để nghiên cứu phân loại chuyên sâu về định dạng và phân loại vi khuẩn [20]

2.2.3 Phương pháp thu mẫu không khí

2.2.3.1 Phương pháp hiện trường

Phương pháp hiện trường chính là các phương pháp lấy mẫu về để phân tích,trong nghiên cứu này sử dụng 2 phương pháp chính là phương pháp đặt đĩa thạch vàphương pháp lấy mẫu bằng máy (phương pháp trực tiếp)

2.2.3.2 Phương pháp hút trực tiếp

Nguyên lý của phương pháp dùng lực hút chân không để hút không khí, Quarất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã công bố, trong thí nghiệm lấy mẫu vi sinhkhông khí để nghiên cứu ảnh hưởng hay đánh giá chất lượng của một khu vực hay

vị trí nào đó, trong phương pháp của họ có sử dụng thiết bị lấy mẫu là các máy hútchân không, trước nhưng năm 2000 nhiều người đã dùng thiết bị phân tầng củaAnderson để lấy mẫu, hiện nay thường sử dụng máy của các hãng chuyên sản xuất

VT03 VT02

VT03 VT04

VT05

VT02 VT01

các thiết bị dành cho quan trắc môi trường như: Merck, Spin Air, SAS, SKC Trongnghiên cứu này sử dụng thiết bị lấy mẫu Spin Air lấy mẫu vi sinh không khí[6];[10]; [21]; [21]

Thiết kế thí nghiệm để xác định độ lặp lại và độ tái lặp của phương phápdùng thiết bị lấy mẫu được lập trong một phòng làm việc khoảng 15 ÷ 20 m2 đượcthiết lập chia đều, chọn 3 vị trí trên mặt phẳng của phòng làm việc, để thực hiện đặtmáy lấy mẫu Thí nghiệm được thực hiện với độ lặp lại của từng vị trí là 5 lần lặplại và khảo sát lượng mẫu lấy từ 50, 100, 150 và 200 lít không khí

Độ tái lặp được thực hiện trong thời gian khác tuy nhiên vẫn sử dụng phònglàm việc này để thực hiện thí nghiệm thêm một lượt nữa để xác định độ tái lặp, quytrình thí nghiệm được lặp lại tương tự như thí nghiệm đối với độ lặp lại, chỉ khácnhau về thời gian lấy mẫu[8]; [16]; [28]

Hình 2.2 Sơ đồ lấy mẫu không khí ba vị trí trong phòng

Hình 2.3 Sơ đồ lấy mẫu không khí năm vị trí trong phòng

Độ lặp lại cũng được thực hiện với 5 lần lặp lại, trong cùng một điều kiệnnhư nhau, được lặp lai trên cả 5 vị trí trong cùng một phòng

2.2.3.4 Phương pháp vận chuyển và bảo quản mẫu

Phương pháp vận chuyển mẫu cũng rất quan trọng, quãng đường từ nơi quantrắc đến phòng thí nghiệm có rất nhiều các yếu tố có thể tác động đến mẫu và có thểảnh hưởng đến sự sai khác mẫu phân tích Vì vậy việc chuẩn bị kỹ lưỡng đảm bảokhông có sự tác động các yếu tố ngoại lai đến mẫu thử, theo nhiều tài liệu đã nghiêncứu cần phải tuân thủ nguyên tắc an toàn là mẫu lấy xong cần là đậy kín lắp đĩaPetri, sau đó được tập hợp lại gói bằng túi nilon sạch và giấy bản khử trùng, sau đóđặt vào trong Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thùng chuyên dụng sạch, cónắp đậy, mát Mẫu sau khi lấy xong được gói lại bởi một loại giấy sạch (có thể dùngcác loại giấy bản đã khử trùng) xếp gọn gàng vào trong thùng bảo quản

Tham gia vào quá trình vận chuyển và bảo quản luôn thực hiện mẫu QA/QCtrong thời gian này để luôn đảm bảo không có sự cố về sai khác kết quả trong quátrình vận chuyển về phòng thí nghiệm

2.2.4 Phương pháp toán thống kê

2.2.4.1 Phương pháp nghiên cứu tính toán độ không đảm bảo đo

Độ không đảm bảo đo chính là thông số gắn với kết quả của phép đo, thông

số này đặc trưng cho mức độ phân tán của các giá trị có thể chấp nhận được quy chođại lượng đo của phép đo Độ không đảm bảo đo nói lên độ tin cậy của phép đo.Các nguồn có thể gây ra độ không đảm bảo đo đối với quy trình phân tích vi sinhkhông khí bao gồm những yếu tố chính là: lấy mẫu, điều kiện vận chuyển mẫu,chuẩn bị môi trường, hóa chất và thành phần môi trường dinh dưỡng và con người.Trong nghiên cứu này sử dụng phương pháp tính toán độ không đảm bảo đo bằngviệc phân tích mẫu thực Qua việc thiết kế thí nghiệm với 10 lần lặp lại và sao đótính toán độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên và sau đó sử dụng công thức 2.6 để tínhthông qua các dữ liệu đầy đủ[8]

i i tb

i 1

(n1)(xx )2

12n (xy )ii 2

khí,

X: Tổng số vi sinh vật trong 1m3 không khí

A: Tổng số vi sinh vật đếm được trong đĩa thạch

S: Diện tích đĩa thạch (tính theo cm3), S = πrr2 (πr = 3,1416, r là đường kính của đĩa thạch)

K = thời gian mở đĩa tính theo hệ số

5 phút = 1 10 phút = 2 15 phút = 3

100: 100 cm3 môi trường có thể hứng được vi khuẩn có trong 10 lít không

100: Hệ số nhân tính ra số lượng vi sinh vật trong 1 m3 không khí

+ Công thức tính dành cho việc lấy mẫu bằng thiết bị (Công thức số 2.2)

Trong đó:

X: Tổng số vi sinh vật trong 1m3 không khí

A: Tổng số vi sinh vật đếm được trong đĩa thạch

1.000: 1 m3 không khí tương đươc với 1.000 lít không khí

xi: Nồng độ chất phân tích ở thí nghiệm thứ i trong điều kiện TN 1

yi: Nồng độ chất phân tích ở thí nghiệm thứ i trong điều kiện TN 2

n: Số lần lặp lại

S

+ Độ lệch chuẩn tương (RSD, %): (Công thức số 2.5)

+ Công thức tính độ không đảm bảo đo (công thức số 2.6)

Trong đó: U : Độ không đảm bảo đo tổng (%)

CV% : Hệ số biến thiên của kết quả đo (%) ,

tα,k : Giá trị t tra bảng với mức ý nghĩa α = 0,05; bậc tự do k = n - 1

n : Số lần phân tích lặp lại

2.2.5 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

2.2.5.1 Xác định trình tự 16S rARN nhóm vi khuẩn hiếu khí đại diện

+ Tách chiết ADN tổng số:Quy trình tách chiết ADN tổng số được tiến hànhtheo Masterson & cộng sự: Nuôi vi khuẩn trong 10 ml môi trường dịch thể (cao thịt

2 g/l, caomen 2 g/lít, pepton 5 g/l, NaCl 8 g/l, pH 7,1) tới gần pha log; ly tâm lạnh1,5 ml huyền phù ở 8.000 vòng/ 5 phút để thu sinh khối; cặn sinh khối được nghiềnvới nitơ lỏng; Bổ sung 50 µl lyzozym, vortex, ủ ở 37 oC/ 30 phút; Bổ sung 30 µlproteaza K, vortex, ủ ở 56 oC/ 1 giờ; Chiết bằng 650 µl hỗn hợp phenol : chloroform: izoamyalcohol (25 : 24 : 1), vortex; Ly tâm 12.000 vòng/ 10 phút thu dịch nổi; Tủabằng 40 µl axetat Na 3 M, pH 5,2 + 1 ml cồn tuyệt đối; Để lạnh ở -20 oC ít nhất 4giờ; Ly tâm 14.000 vòng/ 20 phút, thu cặn; Rửa bằng 500 µl cồn 70 oC, ly tâm12.000 vòng/10 phút, thu cặn; Làm khô trong box vô trùng; Hoà tan cặn trong 40 ÷

60 µl đệm TE - RNAaza, ủ ở 37 oC/ 1 giờ; Kiểm tra độ tinh sạch của AND bằngmáy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm CADN (protein) = A260 (280) x 50 x độpha loãng mẫu Tỉ lệ ADN/protein > 1,8 là mẫu sạch protein; Điện di kiểm tra trêngel agaroza 0,8 %, điện thế 100V Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromit

1 % /10 phút

Nhân bản đoạn ADN thuộc gene 16S rARN bằng PCR

Thu nhận đoạn gene 16S ARN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi

Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT

Phản ứng PCR cho sản phẩm là đoạn gene dài khoảng 1500 kb

PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µl/ mẫu: ADN tổng số (1 µl), 16F(1 µl), 16R (1 µl), dNTPs 10 mM (1 µl), Taq polymeraza (0,25 µl), đệm Taqpolymeraza 10 X, nước khử ion

Chu trình nhiệt: (1) 95 oC - 3 phút, (2) 95 oC - 30 giây, (3) 55 oC - 15 giây,(4) 72 oC - 1 phút Lặp lại 30 lần từ bước 2 ÷ 4; 72 oC - 7 phút Giữ ở 4 oC

Thu nhận ADN gene 16S rARN

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza 0,8%, phân đoạn ADN có độdài ~ 1500 bp được thu nhận, tiến hành thôi gel và tinh sạch sản phẩm bằng kitQiaQuick PCR Purification (Qiagen, Hilden, Đức): (1) Thêm 3 lần thể tích củadung dịch đệm ADB (Agarose Dissolving Buffer) vào mỗi thể tích gel Ủ trong

bể ổn nhiệt 55oC trong 5÷10 phút, đến khi tan hết gel; (2) Chuyển dung dịch gel

đã hoà tan vào cột Zymo-Spin, sau đó ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 ÷ 10giây; (3) Thêm 200µl dung dịch đệm rửa (Wash Buffer) vào cột, ly tâm 12.000vòng/ phút trong 5 ÷ 10 giây, lặp lại bước này hai lần; (4) Thêm trực tiếp 6 ÷ 8µlnước khử ion vào màng của cột, đặt cột vào trong ống 1,5 ml và ly tâm 12.000vòng/ phút trong 1 phút Thu sản phẩm ADN tinh sạch

Xác định trình tự gene 16S rARN

(1) Trình tự ADN được xác định bằng kit Dyedeoxy Terminator CycleSequencing (Applied Biosystems, Weiterstadt, Đức), sản phẩm được phân tíchtrên máy đọc trình tự tự động ABI 377 (Perkin-Elmer, Mỹ)

(2) Chuỗi nucleotit được xử lý bằng chương trình Bioedit;

(3) Truy cập dữ liệu ngân hàng gene EMBL (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

để so sánh bằng chương trình GENDOC 2.5 (Nicholas, 1999)

(4) Sử dụng chương trình phân tích phả hệ và tiến hóa MEGA 2.1 để xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng được phân tích

2.2.5.2 Xác định trình tự 28S rARN nhóm nấm mốc đại diện

Nguyên tắc: Giải trình tự gene 28S rARN và tra cứu trên Blast search để xácđịnh loài nấm mốc

Phương pháp tiến hành: Tách chiết DNA tổng số của nấm mốc theo protocolcủa Sambrook và Russell (2001) và nhân đoạn gene mã hóa 28S rARN bằng kỹthuật PCR Tách chiết DNA tổng số của nấm sợi: DNA tổng số nấm mốc được táchchiết dựa trên phương pháp tách chiết bằng kiềm (alkaline extraction) 100 mg sợinấm đã được rửa sạch, thu từ môi trường nuôi lỏng, được trộn kỹ với 600µl đệmTENS (10mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA; 1N NaOH và 0,5 % SDS) trong ốngEppendorf 1,5 ml và ủ ở 55 oC trong 15 phút Sau khi ủ, đá thủy tinh được thêm vào

để phá vỡ thành tế bào nấm bằng cách vortex bốn lần một phút với thời gian nghỉ 1phút trong đá lạnh giữa các lần Đá thủy tinh được loại bỏ bằng ly tâm Sau đó,chloroform được thêm vào dịch phá tế bào ở trên với tỉ lệ 1:1, để ở nhiệt độ phòng 5phút Hỗn hợp trên được ly tâm 12.500 vòng/phút trong 15 phút ở 4 ºC, dịch nổiđược hút vào ống Eppendorf 1,5 ml mới Tiếp theo, iso - propanol lạnh được thêmvào với tỷ lệ 1: 1, ly tâm với tốc độ 15.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4 ºC, và loại

bỏ dịch nổi Sau đó, kết tủa DNA được rửa 2 ÷ 3 lần bằng 500 µl etanol 70% trướckhi được hòa trong 50µl đệm TE Chất lượng DNA được kiểm tra bằng điện di trêngel agaroza 0,8 % (Sambrook và Russell, 2011)

Quy trình PCR: Quy trình PCR được thực hiện với tổng thể tích 25µl chứa 1µlDNA khuôn; 2,5 µl đệm PCR 10x (100 mM Tris-HCl pH 8; 500 mM KCl; 25 mMMgCl2); 0,5 µl mồi; 1 U Taq polymeraza, và chu trình nhiệt: 95 ºC trong 5 phút (1),

94 ºC trong 30 giây (2), 52 ÷ 56 ºC trong 1 phút 30 giây (3), 72 ºC trong 1 phút 30giây (4) và 35 chu kỳ lặp lại từ (2) ÷ (4); (5) 72 ºC trong 5 phút và sau đó giữ lạnh ở

4 ºC Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza 2,5%.Xác định trình tự đoạn gen

mã hóa 28S rARN theo phương pháp của Sanger, sử dụng máy đọc trình tự tự độngABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 và Sequence Analysis [4] Trình tựcủa đoạn gene mã hóa 28S rARN của mẫu được so sánh với các đoạn gene mã hóa28S rRNA đã được công bố trên Blast Search Sử dụng phần mềm Clustal X,Bioedit để phân loại chủng nấm mốc Số liệu được tính giá trị trung bình và phântích ANA (Duncans test p<0,05) bằng chương trình SAS [5]

===

===

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nghiên cứu xây dụng và thẩm định quy trình phân tích là một trong nhữngnghiên cứu đòi hỏi độ chính xác cao qua đó lựa chọn thông số liên quan để chứngminh độ đúng, độ chính xác và loại bỏ các yếu tố gây nhiễu ảnh hưởng trong quátrình phân tích Qua hồi cứu tài liệu trong và ngoài nước với các nghiên cứu khácnhau về việc đánh giá chất lượng môi trường không khí trong nhà và môi trườngbên ngoài, theo hướng dẫn của Viện Nghiên cứu quốc gia an toàn và sức khỏe(NIOSH), trong thí nghiệm này tập trung nghiên cứu độ chính xác của quy trìnhphân tích tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm thông qua các phương pháp lấy mẫu

là phương pháp đặt đĩa thạch và phương pháp dùng máy lấy mẫu bằng cách hút trựctiếp của hãng Spin Air UIL của Tây Ban Nha Hai phương pháp này đều sử dụngcác đĩa môi trường sẵn có để thực hiện việc lấy mẫu vi sinh trực tiếp vào bề mặt củađĩa thạch sau đó chuyển về phòng thí nghiệm nuôi ủ trong tủ ấm điều nhiệt Sửdụng mẫu đối chứng, mẫu trắng hiện trường và mẫu trắng trong phòng thí nghiệm,trong quá trình thực hiện làm môi trường nuôi cấy và vận chuyển ra ngoài hiệntrường lấy mẫu, cần đánh giá chất lượng môi trường không bị ức chế các loại vikhuẩn và nấm, cần phải lựa chọn mang tính đại chúng, để có độ chính xác cao trongquá trình thực hiện[6]; [8]; [16]; [28]

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHỌN LỰA MÔI TRƯỜNGNGHIÊN CỨU

Kết quả nghiên cứu lựa chọn môi trường phù hợp với những phòng thínghiệm phổ biến tại Việt Nam, đồng thời những môi trường này có tính chọn lọccao để có thể tạo ra được phổ rộng với nhiều loại vi sinh có thể sống và phát triểnđược Trong nghiên cứu này đã tối ưu hóa thông qua các nghiên cứu trước đây đãđưa ra được kết quả lựa chọn nhưng môi trường phù hợp với tiêu chí đặt ra ban đầu

là có phổ rộng với các loại vi sinh vật Nghiên cứu này sử dụng ba chủng chuẩn của

bảo tàng giống chuẩn Mỹ (ATCC) là E coli ATCC® 25922TM, E aerogenes

ATCC® 13048TM, S aureus ATCC®25923TM, cấy lên đĩa thạch MacConkey, TSA,

NA và thạch máu nuôi cấy ở điều kiện môi trường là 37 ± 0,5 oC Vi khuẩn thườngphát triển rất nhanh chỉ trong khoảng 24 ÷ 48 giờ xác định các khuẩn lạc đặc trưng.Kết quả thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 So sánh độ nhạy của môi trường đối với các chủng vi khuẩn chuẩn

STT Chủng vi khuẩn

chuẩn

Đặc điểm khuẩn lạc trên các môi trường nuôi cấy

1 E coli ATCC® Khuẩn lạc Khuẩn lạc Khuẩn lạc Khuẩn lạc

25922TM điển hình, mật điển hình, điển hình, không điển

độ khuẩn lạc mật độ khuẩn mật độ hình 50 ÷trên 75 % so lạc trên 75 % khuẩn lạc 75 % so vớivới mật độ đã so với mật độ trên 75 % mật độ đãbiết đã biết so với mật biết

độ đã biết

ATCC® điển hình, mật điển hình, không điển không điển

13048TM độ khuẩn lạc mật độ khuẩn hình 50 ÷ hình 50 ÷

trên 75 % so lạc trên 75 % 75 % so với 75 % so vớivới mật độ đã so với mật độ mật độ đã mật độ đãbiết đã biết biết biết

ATCC®25923TM không mọc không mọc không mọc điển hình,

trên môi trên môi trên môi mật độtrường trường trường khuẩn lạc

trên 75 % sovới mật độ

khác cấy chủng vi khuẩn E coli ATCC® 25922TM, E aerogenes ATCC® 13048TM

trên ba môi trường MacConkey, TSA và NA kết quả các vi khuẩn này mọc rất tốt

trên các môi trường này Tuy nhiên đặc trưng nhất là vi khuẩn E.coli trên môi

trường MacConkey có màu đỏ và khuẩn lạc tròn trơn Tương tự như vậy chung vi

khuẩn E aerogenes ATCC® 13048TM có màu hồng và kích thước khuẩn lạc nhỏhơn một chút Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường MacConkey có ưu điểm hơn

so với các môi trường khác.Kết quả thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2.So sánh độ nhạy của môi trường đối với chủng nấm chuẩn

Chủng nấm

chuẩn

Nhiệt độnuôi cấy

Đặc điểm khuẩn lạc trên các môi trường nuôi

Khuẩnlạc pháttriểnchậm hơnmộtngày,đườngkính nhỏ

Khuẩn lạcđiển hình,phát triểnnhanhđường kínhđúng tiêuchuẩn

Khuẩn lạcđiển hình,phát triểnnhanhđườngkính đúngtiêu chuẩn

28± 0,5oC

Khuẩn lạcphát triểnchậm hơnmột ngày,đườngkính nhỏ

Khuẩnlạc pháttriểnchậm hơnmộtngày,đườngkính nhỏ

Khuẩn lạcđiển hình,phát triểnnhanhđường kínhđúng tiêuchuẩn

Khuẩn lạcđiển hình,phát triểnnhanhđườngkính đúngtiêu chuẩn

Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 3 ngày cấy chủng A.brasiliensis

ATCC®16404TM lên trên ba môi trường lựa chọn nghiên cứu được nuôi cấy trongđiều kiện 28 ± 0,5 oC thì chỉ có môi trường SA và Czapek là xuất hiện những chấm

trắng đó là khuẩn lạc của nấm A.brasiliensis ATCC®16404TM đã mọc trên bề mặtmôi trường thạch, còn lại hai đĩa thạch PCA và MEA chưa thấy xuất hiện khuẩn lạc.Với điều kiện nuôi cấy 28 ± 0,5 oC thì chỉ 2 ngày khuẩn lạc đã xuất hiện trên môitrường SA và chưa xuất hiện trên hai môi trường còn lại trong nghiên cứu Sau 4ngày theo dõi thí nghiệm kết quả nuôi cấy trong hai điều kiện môi trường, chỉ cótrên môi trường SA và Czapek nấm có kích thước khuẩn lạc đạt tới 0,5 cm đã xuấthiện quả thể và bào tử, các môi trường khác vẫn còn mầu trắng chưa xuất hiện bào

tử, kích thước khuẩn lạc vẫn còn nhỏ Môi trường SA cho thấy rất thích hợp chophân tích nấm trong không khí, nó không bị ức chế đối với các loại nấm, môitrường này phù hợp sử dụng để phân tích tổng nấm trong không khí[1]; [21]; [28]

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT LẤY MẪU KHÔNG KHÍ

3.2.1 Khảo sát lấy mẫu ở các lƣợng khí khác nhau

Như đã nêu trong phần phương pháp nghiên cứu hai phương pháp lấy mẫuphổ biến nhất hiện nay là phương pháp đặt đĩa thạch và phương pháp hút trực tiếp.Với những ưu điểm và nhược điểm của từng phương pháp lấy mẫu đã được các tácgiả đưa ra, cùng với điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, môi trường lao độngrất đa dạng, có nhiều nơi lao động được làm việc trong điều kiện có điều hòa nhiệt

độ, có nhưng nơi chỉ sử dụng quạt điện hay thông gió tự nhiên, nhưng luồng giótrong môi trường lao động rất khác nhau, tạo ra sự hỗn loạn trong không khí Trongnghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp dùng thiết bị húttrực tiếp là chính,nhưng cũng sẽ vẫn dùng phương pháp đặt đĩa để so sánh khi thực hiện nghiên cứunày trong môi trường lao động Tiến hành thực hiện quá trình khảo sát thời gian lấymẫu lý tưởng đối với môi trường lao động được thực hiện ngay tại cơ quan với thờigian lấy mẫu là 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 và 500 lít không khí Với cácloại môi trường khác nhau như môi trường thạch máu(BA), MacConkey, TSA, dịchchiết nấm men và Sabouraud, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3.Khảo sát lượng mẫu không khí cần lấy trong môi trường lao động

Ghi chú: KPH - Không phát hiện

Qua kết quả nghiên cứu khảo sát về thời gian lấy mẫu bằng thiết bị Spin Airtại Phòng Thí nghiệm vi sinh của Trạm Quan trắc và Phân tích môi trường lao động.Với lượng mẫu bắt đầu từ 10 ÷ 500 lít không khí như vậy qua kết quả khảo sát trênnhưng môi trường dinh dưỡng và chọn lọc cho thấy lượng mẫu thích hợp là từ 50 ÷

200 lít không khí Với lượng mẫu lấy 10 lít thì quá ít không phát hiện vi sinh vậttrong không khí, còn đối với lượng không khí lấy từ 300 lít không khí trong môitrường lao động là mật độ khuẩn lạc mọc quá dầy không thể đếm chính xác được,theo ISO 8199 thì những đĩa dầy đặc như vậy là không có ý nghĩa khi tính toán.Còn với 250 lít không khí thì cũng đếm được là trên 2,0 102 khuẩn lạc, tuy nhiênmật độ khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch là quá cao rất nhiều khuẩn lạc mọc chồnglên nhau như vậy không thể đếm được chính xác Khi tính toán kết quả không thểchính xác được khi quan trắc Khảo sát lấy mẫu tại phòng sạch của Phòng Giám sát

và Phân tích môi trường, đối với phòng sạch như vậy khảo sát từ 100 ÷ 1.000 lítkhông khí Trong khi lấy mẫu hệ thống trong phòng hoạt động bình thường, vớiphòng khoảng 10 m2 chỉ đạt một vị trí giữa phòng thí nghiệm Điều kiện môi trườngkhi nghiên cứu là 25 ± 0,5oC và độ ẩm 50 ÷ 70 oC tốc độ gió lưu thông trong phòng

là gần như không cảm nhận được (> 0,1 m/s)

Bảng 3.4.Khảo sát lượng mẫu không khí cần lấy trong môi trường phòng sạch

STT Lượngkhông

khí (lít)

Số lượng tế bào (CFU/đĩa), trên các môi trường nuôi cấy

Ghi chú: KPH - Không phát hiện

Như vậy qua quá trình khảo sát thời gian lấy mẫu đối với môi trường sạchnhư trong phòng thí nghiệm vô khuẩn của các bệnh viện hay các phòng sạch đối vớinhững nơi sản xuất thực phẩm, thuốc men cần phải tăng thời gian lấy mẫu để tăngcường lượng không khí thu được mới có thể biết được nồng độ thực trong khôngkhí là bao nhiêu không thể lấy lượng không khí ít mà kết luận là không có được.Theo tiêu chuẩn quy định của EU cho GMP Guide thì với mức độ A thì phải dưới 1CFU/m3 như vậy lượng không khí cần phải lấy là 1.000 lít không khí [6]; [21]; [28]

3.2.2 Kết quả nghiên cứu đánh giá độ lặp lại của các mẫu

Độ lặp lại thể hiện độ chụm của các kết quả gần nhau, được thực hiện bởimột kiểm nghiệm viên trong khoảng thời gian ngắn Trong nghiên cứu này đượcthực hiện với độ lặp lại 5 lần liên tiếp Lấy mẫu được thực hiện trong khu vựcphòng sản xuất, mọi hoạt động sản xuất không thay đổi trong khoảng thời gian lấymẫu Thiết kế các vị trí lấy mẫu được thực hiện theo nguyên tắc lấy mẫu đại diện.Phương pháp lấy mẫu bằng thiết bị hút cưỡng bức là ba vị trí, được phân bố đềutrong phòng rộng 20 m2, phương pháp đạt đĩa thạch tĩnh cần đặt nhiều điểm hơn để

có được tính đại diện trong phòng sản xuất, cụ thể trong nghiên cứu này đạt đồngđều tại năm vị trí Thời gian lấy mẫu phụ thuộc vào mật độ vi sinh vật trong khôngkhí, mật độ vi sinh vật trong không khí quá lớn, thời gian lấy cần phải nhanh hơn.Thời gian lấy mẫu dài mật độ vi sinh vật phủ kín và chồng chéo lên nhau không thểđếm chính xác được số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa là bao nhiêu, khuẩn lạc mọcquá dầy ức chế các vi sinh vật khác phát triển được, phân tích mật độ vi sinh vậttrong không khí là không đại diện chính xác mật độ vi sinh trong môi trường khôngkhí khu vực sản xuất

3.2.2.1 Lấy mẫu bằng phương pháp hút trực tiếp

Phương pháp hút trực tiếp là phương pháp sử dụng thiết bị hiện đại để thựchiện công việc lấy mẫu không khí tại khu vực cần quan trắc Thiết bị thực hiệntrong nghiên cứu này như đã mô tả ở trên là thiết bị của hãng IUL với tốc độ lấymẫu là 100 lít không khí trong một phút, với thiết bị này có thể định lượng trực tiếpkhối lượng không khí được hút qua bề mặt thạch như vậy có thể tính toán và địnhlượng chính xác trong 1 m3 không khí có nồng độ vi sinh vật là bao nhiêu Thínghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Công ty Proconco với diện tíchphòng là khoảng 15÷ 20 m2 với thiết kế cỡ mẫu là đạt 3 điểm trong khu vực này.Lựa chọn vị trí nghiên cứu khảo sát là một nơi sản xuất công nhân hoạt động bìnhthường với diện tích khoảng 20 m2 Kết quả đếm khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa Petrisau thời gian 2 ngày nuôi ủ trong điều kiện phòng thí nghiệm đối với vi khuẩn hiếukhí và 5 ngày đối với tổng nấm và nấm men, trong thí nghiệm đã có đầy đủ cả mẫutrắng hiện trường và mẫu đối chứng trong quãng đường vận chuyển, tại phòng thínghiệm các đĩa thạch được cấy chủng chuẩn song song với các thí nghiệm thực hiệntại hiện trường

Bảng 3.5.Kết quả lấy mẫu không khí bằng phương pháp trực tiếptrên môi trường

%

CFU(Xtb) Sr CV

%Lần 1 6,0.102 0,088 3,16 5,4.102 0,048 1,78 4,4.102 0,033 1,25 5,5.102 0,067 2,45

Biểu đồ dưới đây biểu diễn độ lệch chuẩn trung bình của 5 lần lặp lại khiphân tích thông số tổng vi khuẩn hiếu khí trong phòng làm việc Như vậy qua cácbảng số liệu nghiên cứu về độ lặp lại của phương pháp lấy mẫu bằng thiết bị lấymẫu có độ lệch chuẩn rất tốt, qua biểu đồ hình 3.1