Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô nano artesunat poly (acid lactic co glycolic)

Một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả bào chế hệ nano là poly acid lactic-co-glycolic PLGA do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thíc

POLY (ACID LACTIC-CO-GLYCOLIC)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI 2017

POLY (ACID LACTIC-CO-GLYCOLIC)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn khoa học:

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn

Ngọc Chiến, người thầy giàu kinh nghiệm, nhiệt huyết đã tận tình chỉ bảo, hướng

dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS NCS Hồ Hoàng Nhân, người anh đã hỗ

trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa lý, Bộ môn Bào chế, Bộ môn Công nghiệp Dược, cùng toàn thể các cán bộ công nhân viên Viện công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Nhân dịp này, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các cán bộ, giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội – Những người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập dưới mái trường này

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới cha mẹ, người thân, bạn bè đã luôn động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận này

Hà Nội, tháng 03 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Sao

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về artesunat………2

1.1.1 Công thức 2

1.1.2 Tính chất 2

1.1.3 Định tính 2

1.1.4 Định lượng 2

1.1.5 Dược động học 3

1.1.6 Tác dụng dược lý 3

1.2 Tổng quan về nano polyme……… 3

1.2.1 Đặc điểm 3

1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme 4

1.2.3 Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch 5

1.2.4 Vài nét về chất mang PLGA 6

1.3 Kỹ thuật đông khô………7

1.3.1 Khái niệm 7

1.3.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô 8

1.4 Thuốc tiêm đông khô……… 9

1.4.1 Khái niệm 9

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nanopolyme đông khô 9

1.5 Các nghiên cứu về hệ nano PLGA và thuốc tiêm đông khô nano ART-PLGA……….11

1.5.1 Các nghiên cứu về hệ nano ART-PLGA 11

1.5.2 Các nghiên cứu về thuốc tiêm hỗn dịch nano và liposome trong nước 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu……… 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu……… 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu………16

2.3.1 Phương pháp bào chế 16

2.3.2 Phương pháp đánh giá 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ artesunat……… 24

3.2 Kết quả bào chế hỗn dịch nano ART-PLGA……….25

3.2.1 Ảnh hưởng công suất máy siêu âm đến các đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA 25

3.2.2 Ảnh hưởng của thiết bị tinh chế đến đặc tính của nano ART-PLGA 25

3.3 Kết quả bào chế bột đông khô nano ART-PLGA……… 27

3.3.1 Kết quả lựa chọn tá dược và tỷ lệ tá dược 27

3.3.2 Kết quả ảnh hưởng 1 số thông số quy trình bào chế 29

3.4 Kết quả đánh giá tương tác dược chất-tá dược và trạng thái vật lý của dược chất trong bột đông khô nano ART-PLGA………31

3.4.1 Kết quả đánh giá sự tương tác giữa dược chất và các tá dược 31

3.4.2 Kết quả đánh giá trạng thái vật lý của dược chất trong bột đông khô nano ART-PLGA 32

3.5 Kết quả đánh giá sơ bộ độ ổn định của bột đông khô nano ART-PLGA sau 1 tháng bảo quản……… 33

3.6 Kết quả đánh giá độ ổn định của hỗn dịch nano ART-PLGA sau khi pha…35

3.6.1 Trong vòng 8 giờ bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8 o C 35 3.6.2 Sau 1 tuần bảo quản 36

3.7 Đề xuất chỉ tiêu chất lƣợng thuốc tiêm đông khô nano ART-PLGA….……36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

HPLC High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao) KLPT Khối lượng phân tử

KTTP Kích thước tiểu phân

PDI Polydispersity index (chỉ số đa phân tán)

PEG Polyethylen glycol

PGA Poly acid glycolic

PLA Poly acid lactic

PLGA Poly (acid lactic-co-glycolic)

Sf /Si Là tỉ lệ giữa KTTP sau thử nghiệm – Sf và KTTP trước khi thử

nghiệm – Si

TB Trung bình

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.1 Danh mục nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng 15 Bảng 3.1 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART 25 Bảng 3.2 KTTP, PDI nano ART-PLGA với công suất máy khác nhau 26 Bảng 3.3 Kết quả tinh chế hỗn dịch nano ART-PLGA 27 Bảng 3.4 Kết quả lựa chọn tá dược và tỷ lệ tá dược 28 Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng 1 số thông số quy trình bào chế 30 Bảng 3.6 Kết quả độ ổn định của bột đông khô nano ART-PLGA sau 1 tháng 34 Bảng 3.7 Độ ổn định của hỗn dịch nano ART-PLGA trong vòng 8 giờ sau

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.2 Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang 4 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA 6 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA 17 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến 18 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

ART

25

Hình 3.2 Phổ hồng ngoại của ART, PLGA, saccarose và bột đông khô 31

Hình 3.4 Hình ảnh phổ nhiễu xạ tia X của bột đông khô 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Artesunat (ART) cũng như các dẫn chất khác của artemisinin được sử dụng

phổ biến trong điều trị bệnh sốt rét, đặc biệt là sốt rét thể não do Plasmodium

falciparum Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng

chống ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như bạch cầu, đại tràng, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt… [12], [15], [20] Nhằm làm tăng sinh khả dụng

và tác dụng chống ung thư, công nghệ nano với việc sử dụng các chất mang polyme

đã và đang được nghiên cứu … [16],[22] Một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả bào chế hệ nano là poly (acid lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [19], [25]…

Tuy nhiên, độ ổn định của tiểu phân nano ART vẫn là mối quan tâm lớn do

sự thay đổi KTTP, PDI, hàm lượng dược chất khi bảo quản trong thời gian dài Nhằm khắc phục nhược điểm trên chúng tôi tiến hành chuyển thuốc từ dạng hỗn dịch sang dạng đông khô

Kỹ thuật đông khô là một giải pháp công nghệ của ngành dược, cho phép làm khô các thuốc và chế phẩm sinh học nhạy cảm với nhiệt độ và độ ẩm Đồng thời tạo sản phẩm có tốc độ hòa tan, phân tán nhanh Dược chất ổn định, bền vững, và kéo dài tuổi thọ sản phẩm Kỹ thuật đông khô đã được ứng dụng để sản xuất các loại kháng sinh, vaccin, vitamin, thuốc chống viêm…

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi bước đầu tiến hành đề tài

―Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô nano artesunat-poly (acid

lactic-co-glycolic)‖ với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô nano PLGA

ART-2 Đề xuất một số chỉ tiêu chất lượng thuốc tiêm đông khô nano ART-PLGA

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về artesunat

Bột kết tinh trắng, mịn Rất khó tan trong nước (khoảng 56,2 mg/L ở 25°C),

dễ tan trong dicloromethan, rất dễ tan trong aceton và ethanol 96% [1], [18] Artesunat rất dễ bị thủy phân do có nhóm chức lacton và ester (muối natri của ester hemisuccinat của artemisinin) Tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và mức độ kiềm Do có nhóm carboxylic trong phân tử nên artesunat có tính acid yếu với pKa ~ 4,35 [1], [18]

1.1.3 Định tính

- Phương pháp đo quang: phổ hồng ngoại [1]

- Phương pháp tạo màu [1]

- Phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao [1],[28]

Tiến hành thủy phân trong môi trường kiềm rồi đo độ hấp thụ của dung dịch thu được trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± 1 nm trong cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là dung dịch natri hydroxyd 0,1 N [1]

1.1.5 Dược động học

Sau khi sử dụng artesunat (ART) bị thủy phân nhanh chóng thành chất chuyển hóa có hoạt tính là dihydroartemisinin (DHA) Vì vậy, nồng độ ART trong máu rất thấp Thời gian bán thải khi tiêm tĩnh mạch của ART là khoảng 2,3 đến 4,3 phút, của DHA là 40 đến 64 phút [14]

1.1.6 Tác dụng dược lý

ART có hoạt tính diệt ký sinh trùng sốt rét gấp 5 lần artemisinin ART không

có tác dụng diệt giao bào và không có tác dụng lên giai đoạn ngoại hồng cầu, hơn nữa thời gian tác dụng ngắn nên không dùng làm thuốc dự phòng và không dùng chống tái phát [2] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng chống ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như bạch cầu, đại tràng, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt… [12], [15], [20]

1.2 Tổng quan về nano polyme

1.2.1 Đặc điểm

Các tiểu phân nano polyme (PNPs) được bào chế từ các polyme tương thích hoặc phân hủy sinh học có kích thước từ 1-1000 nm tại đó dược chất được hòa tan, bẫy, đóng gói hoặc phân tán đều trong cốt của tiểu phân nano Tùy theo phương pháp bào chế mà thu được siêu vi cầu (nanospheres) hoặc siêu vi nang (nanocapsules) Siêu vi nang có cấu trúc nhân vỏ như vi nang, còn siêu vi cầu có

cấu trúc cốt (matrix) đồng nhất như vi cầu [9], [21]

Hình 1.2 Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang

Tiểu phân polyme mang thuốc có đặc điểm chung là dùng polyme làm giá mang dược chất với mục đích che chở, bảo vệ dược chất, kéo dài tác dụng của dược chất và hướng dược chất tới đích tác dụng

Theo cơ chế mang dược chất có thể chia làm 3 nhóm [9]:

- Hệ cốt: tiểu phân nano được phân tán trong giá mang polyme: siêu vi cầu, tiểu phân nano lipid rắn

- Hệ màng bao: polyme bao ngoài tiểu phân nano dược chất: siêu vi nang, liposome, micell, dendrime, ống carbon…

- Hệ liên kết: polyme gắn trực tiếp với phân tử dược chất qua các cầu liên kết

hóa học

1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme

Dựa trên quy trình bào chế, có thể chia các phương pháp bào chế nano polyme làm 2 loại: 1 giai đoạn và 2 giai đoạn

Phương pháp 1 giai đoạn dựa trên sự kết tủa của polyme từ một dung dịch hoặc dựa trên sự kết tập tự phát của các đại phân tử để hình thành các nanogel hoặc các phức hợp của các chất đa điện phân (polyelectrolyte)

Phương pháp 2 giai đoạn gồm giai đoạn đầu chung cho các phương pháp là bào chế một nhũ tương và giai đoạn 2 là giai đoạn hình thành nên tiểu phân nano

Giai đoạn 2 có thể được thực hiện dựa trên phản ứng polyme hóa các monome hoặc các quá trình kết tủa, gel hóa của các polyme [29]

Các polyme được sử dụng có thể là polyme tự nhiên, polyme tổng hợp, có sẵn hoặc được tạo thành từ các monome Yêu cầu chung của tiểu phân polyme mang thuốc là tương thích sinh học cao với cơ thể, không độc, khả năng nạp dược chất cao và giải phóng dược chất theo ý đồ thiết kế của từng nghiên cứu [9]

Các phương pháp sau thường được sử dụng trong điều chế tiểu phân nano polyme từ các polyme tổng hợp có sẵn [9]:

- Bốc hơi dung môi từ nhũ tương

- Polyme hóa

- Đun chảy

- Phun sấy

1.2.3 Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch

Sau khi tiêm tĩnh mạch, sự phân bố của tiểu phân nano có thể xảy ra theo 2 hướng [9]:

- Thanh thải bằng thực bào

Hệ thống thực bào trong cơ thể coi tiểu phân như một vật thể lạ và tiến hành thanh thải theo cơ chế bảo vệ của cơ thể Các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 500

nm dễ bị thanh thải hơn cả Sau khi thực bào, tiểu phân được đưa về gan, lách…

Như vậy có thể lợi dụng cơ chế thực bào để chủ động đưa thuốc tới gan, lách, phổi… và tăng cường ái lực với receptor trên thực bào đơn nhân bằng các ligand có

ái lực Mặt khác, tổ chức u, viêm là những nơi có quá trình thực bào xảy ra mạnh nhất, trở thành cơ quan đích của tiểu phân

- Phân bố đến cơ quan, tổ chức

Các tiểu phân không bị thực bào dễ dàng đi qua thành mạch mao quản để phân bố tiếp đến các cơ quan, tổ chức trong cơ thể đặc biệt là các tổ chức u, viêm do tính thấm tăng lên Các tiểu phân nhỏ hơn 200 nm dễ qua thành mạch, tránh được

thực bào [17]

Sau khi qua thành mạch, tùy theo cấu trúc và kích thước, hệ nano được phân

bố ở 3 mức độ khác nhau:

 Tới cơ quan đích: gan, lách, phổi…

 Tới nhóm tế bào đặc biệt (viêm, ung thư, đại thực bào…)

 Tới nội bào: Do có kích thước ở mức độ gần phân tử, nhỏ hơn khe hở liên bào và nhiều liên kết lỏng lẻo trên màng tế bào nên hệ nano có khả năng xuyên qua khe hở màng tế bào vào nội bào Nếu kích thước lớn hơn, hệ được vận chuyển bằng

cơ chế thực bào hoặc tương hợp với màng tế bào (liposome)

1.2.4 Vài nét về chất mang PLGA

1.2.4.1 Cấu trúc

Poly (acid lactic-co-glycolic) (PLGA) là một copolyme được tổng hợp bằng phương pháp đồng polyme hóa mở vòng ngẫu nhiên của 2 monome khác nhau, dime vòng (1,4-dioxan-2,5-dion) của acid glycolic và acid lactic Các PLGA khác nhau bởi tỷ lệ các monome sử dụng và khối lượng phân tử (KLPT), ví dụ PLGA 75:25 chứa 75% acid lactic và 25% acid glycolic [19], [25]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA

1.2.4.2 Tính chất, ứng dụng

PLGA là một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào, ngoài ra nano PLGA đang được nghiên cứu ứng dụng trong liệu pháp chẩn đoán hình ảnh và trong điều trị ung thư PLGA đã được chấp nhận bởi FDA và EMA trong nhiều hệ đưa thuốc ở người PLGA phân hủy sinh học bằng thủy phân liên kết ester tạo thành acid lactic và acid glycolic Cả hai được chuyển hóa qua chu trình Krebs thành CO2 và nước rồi đào thải ra ngoài nên độc tính thấp [19], [25]

Trong PLGA thì phần PLA (poly acid lactic) có cấu trúc kỵ nước hơn PGA (poly acid glycolic) Do đó, nếu PLGA có tỷ lệ PLA cao hơn thì ít thân nước hơn và thủy phân chậm hơn Điều này ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất Ngoài ra, sự phân hủy sinh học của PLGA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như trạng thái kết tinh, hình dạng bề mặt và kích thước, pH, khối lượng phân tử trung bình, hàm lượng

dược chất, loại dược chất [19]

1.3.1 Khái niệm

Đông khô là quá trình làm khô chế phẩm trong các điều kiện đặc biệt, trong

đó chế phẩm được đông lạnh, sau đó dung môi sẽ được thăng hoa trực tiếp (giai đoạn làm khô sơ cấp) rồi giải hấp phụ (giai đoạn làm khô thứ cấp) để ngăn chặn phản ứng hóa học và sự phát triển của vi sinh học

Mục tiêu quan trọng nhất khi bào chế một chế phẩm đông khô là đảm bảo chất lượng không chỉ ban đầu mà còn trong hạn dùng của sản phẩm, đảm bảo sản phẩm giữ nguyên về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học ban đầu sau khi hòa tan lại, đồng thời phải hòa tan nhanh và hoàn toàn, hình thức khối cơ chất khô chấp nhận được [8]

- Dễ đạt yêu cầu đồng nhất về hàm lượng, giảm thiểu sự nhiễm chéo

- Giảm thiểu sự oxy hóa – khử dược chất

Nhược điểm:

- Thời gian tiến hành kéo dài, giá thành sản phẩm cao, thiết bị phức tạp

- Nhiều loại thuốc có bản chất protein dễ bị mất hoạt tính hoặc phá hủy trong quá trình đông lạnh

- Nếu quá trình đông khô tạo ra chất rắn vô định hình và dạng này không ổn định thì sản phẩm sẽ không đạt được chất lượng như mong muốn [6]

1.3.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô

Quá trình đông khô có thể được chia thành 3 giai đoạn: đông lạnh, sấy khô sơ cấp, sấy khô thứ cấp

1.3.2.1 Giai đoạn đông lạnh

Đông lạnh là một giai đoạn quan trọng nhất trong quá trình đông khô, sản phẩm được đông lạnh tới nhiệt độ đủ thấp để đông cứng toàn bộ thuốc chứa trong mỗi lọ [8] Thông thường các thiết bị đông khô duy trì nhiệt độ đông lạnh trong khoảng -70oC đến -40oC (bởi vì đây là nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutecti của phần lớn các chất kết tinh hoặc nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh của phân lớn các chất vô định hình)

1.3.2.2 Giai đoạn sấy khô sơ cấp

Quá trình sấy khô có đặc điểm là ranh giới nước đá trong lọ bị giảm xuống Điều kiện để nước đá thăng hoa trong sấy khô sơ cấp là sự chênh lệch áp suất hơi đá

ở bề mặt thăng hoa và áp suất riêng phần của nước trong buồng đông lạnh Nước đá

sẽ được thăng hoa trực tiếp từ pha rắn sang pha hơi bằng cách hạ áp suất của buồng đông khô xuống thấp hơn áp suất hơi bão hòa của nó

Các yếu tố ảnh hưởng đến thuốc tiêm đông khô trong quá trình này là:

- Áp suất buồng đông khô càng thấp, tốc độ thăng hoa của dung môi càng nhanh nhưng áp suất quá thấp có thể gây nhiễm các tạp dễ bay hơi từ bao bì và thiết bị vào chế phẩm Áp suất buồng đông khô càng cao, hiệu suất quá trình làm khô càng giảm

- Nhiệt độ làm khô càng cao thì hiệu suất quá trình sấy khô sơ cấp càng tăng Tuy nhiên, nếu nhiệt độ làm khô lớn hơn nhiệt độ chuyển kính Tg’ (hệ vô định hình) hoặc nhiệt độ eutectic Teu (hệ kết tinh) sẽ dẫn tới hiện tượng vỡ cấu trúc của hệ Kết quả là hàm ẩm tăng và giảm độ ổn định của chế phẩm

- Thời gian làm khô không đủ để loại phần dung môi không liên kết cũng dẫn tới phá vỡ cấu trúc của hệ khi chuyển sang giai đoạn làm khô thứ cấp [4]

Tuy nhiên, mỗi chế phẩm có bản chất khác nhau nên nhiệt độ và thời gian sấy cũng khác nhau Với các dược chất không bền với nhiệt cần để nhiệt độ thấp nhưng thời gian sấy sẽ kéo dài hơn, ngược lại với các dược chất bền hơn thì có thể nhiệt độ sấy khô thứ cấp cao hơn, khi đó thời gian sấy sẽ ngắn hơn Thể tích thuốc đem đông khô và các thành phần khác có trong công thức cũng ảnh hưởng đến nhiệt độ và thời gian đông khô, ví dụ như, việc sử dụng các disacarid sẽ làm giảm nhiệt độ phá vỡ cấu trúc của chế phẩm, do đó, nhiệt độ quá trình đông khô sẽ giảm và kéo dài thời gian đông khô Hoặc đông khô với thể tích lớn thì khi làm khô sẽ tạo ra sự cản trở lớn đối với quá trình thăng hoa hơi nước do đó quá trình đông khô sẽ kéo dài hơn [7]

1.3.2.3 Giai đoạn sấy khô thứ cấp

Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, hấp thụ trong khối bột sẽ được loại bỏ bằng cách tiếp tục nâng nhiệt độ của buồng đông khô trong điều kiện

áp suất thấp để làm giảm hàm ẩm còn lại tới mức tối ưu, đảm bảo độ ổn định của chế phẩm trong quá trình bảo quản Chính vì vậy giai đoạn này đòi hỏi thời gian tương đối dài trong quá trình đông khô

1.4 Thuốc tiêm đông khô

1.4.1 Khái niệm

Thuốc tiêm đông khô là thuốc tiêm ở dạng bột vô khuẩn, được bào chế bằng phương pháp đông khô và được pha thành dung dịch hoặc hỗn dịch ngay trước khi tiêm

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nanopolyme đông khô

Thuốc tiêm đông khô phải có các đặc tính mong muốn nhất định:

- Duy trì được đặc tính vật lý và hóa học gốc của sản phẩm ban đầu (bánh hình thức đẹp; thời gian phân tán lại ngắn; kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân và hiệu suất mang thuốc thay đổi không đáng kể)

- Độ ẩm tương đối chấp nhận được

- Sự ổn định lâu dài [10]

 Yếu tố thuộc về công thức

- Dược chất: Cũng như các dạng thuốc khác, dược chất là thành phần chính trong

thuốc tiêm, có tác dụng điều trị hay phòng bệnh Yêu cầu chung đối với dược chất cũng như các thành phần khác là phải có độ tinh khiết cao và đạt tiêu chuẩn của Dược điển quy định dùng để pha thuốc tiêm

tiêm, bởi nhiều ưu điểm như: không độc, an toàn, dễ hóa hơi, rẻ tiền, do đó tiết kiệm trong sản xuất [6]

đệm có pH thay đổi ít nhất trong đông lạnh như citrat, citris [11]

- Tá dược tạo khung: Mục đích của nhóm tá dược này là tạo khuôn cho chế phẩm

Các tá dược dạng độn kết tinh (manitol, glycin ) tạo ra bánh đông khô có hình thức đẹp, độ bền cơ học tốt, tuy nhiên không hiệu quả trong việc ổn định một số chế phẩm như nhũ tương, protein, liposome…[11] Trong đông khô, manitol được sử dụng rộng rãi bởi ngoài vai trò là tá dược độn, tạo khung manitol còn có tác dụng làm tăng độ ổn định của nhiều hoạt chất do kết tinh trong quá trình đông khô, nhưng rất dễ gây vỡ lọ nếu dùng với nồng độ cao [8]

Các tá dược độn dạng vô định hình cũng có thể được dùng làm tác nhân độn, nhưng hầu hết có nhiệt độ phá vỡ cấu trúc thấp, đòi hỏi nhiệt độ làm khô thấp và thời gian làm khô kéo dài Sorbitol có nhiệt độ phá vỡ cấu trúc thấp (-45oC), lactose

và saccarose có nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh cao hơn (-32oC) Nên khi sử dụng chúng cần lưu ý yếu tố nhiệt độ trong quá trình đông khô và bảo quản cần thấp hơn nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh của hệ

- Tá dược bảo vệ: Ngoài tá dược tạo khung; các đường glucose, saccarose còn

được chứng minh là có hiệu quả nhất trong việc ổn định các sản phẩm như liposome, protein và các hoạt chất dễ bị phân hủy trong quá trình đông khô Trong

đó, saccarose được sử dụng nhiều trong việc ổn định công thức liposome, protein và virut [11], [13]

đòi hỏi phải đẳng trương nhằm hạn chế đau, tổn thương, hoặc hoại tử tổ chức tại nơi

tiêm, người ta có thể sử dụng một số chất điều chỉnh đẳng trương như: manitol, natri clorid, saccarose… Chất điều chỉnh đẳng trương thường được cho vào dung môi hòa tan trở lại thuốc tiêm đông khô [7], [8]

- Chất diện hoạt: Chất diện hoạt được cho vào thuốc tiêm nhằm làm tăng khả

năng hòa tan, phân tán của dược chất, hạn chế sự hấp phụ bề bề mặt của thuốc đóng liều thấp, tăng ổn định cho protein trong quá trình đông khô [7], [8] Hầu hết chất diện hoạt được sử dụng là loại không ion hóa, phổ biến là tween 80 với nồng độ 0,01-0,1%[23]

 Yếu tố thuộc về kỹ thuật

- Tốc độ làm lạnh chậm (0,5oC/phút) cho hàm lượng dược chất được giữ lại cao hơn [26]

- Trong quá trình làm khô sơ cấp, nhiệt độ sản phẩm phải được điều chỉnh xuống dưới nhiệt độ phá vỡ cấu trúc của hệ [10]

- Thời gian và nhiệt độ của các giai đoạn là hai thông số quan trọng ảnh hưởng lớn đến hình thức, độ ẩm và độ ổn định của chế phẩm thuốc

1.5 Các nghiên cứu về hệ nano ART-PLGA và thuốc tiêm hỗn dịch nano,

liposome trong nước

1.5.1 Các nghiên cứu về hệ nano ART-PLGA

Bên cạnh tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng chống ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác như như bạch cầu, đại tràng, ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt, u não, ung thư tế bào thận Cơ chế chống ung thư có thể do ART ức chế sự tăng sinh, sự di căn,

sự hình thành thành mạch ung thư dẫn đến giảm khối lượng và sự tiến triển của ung thư [12], [15], [20]

Năm 2001, Efferth T và cộng sự đã chứng minh tác dụng chống ung thư của ART trên 55 dòng tế bào ung thư ở người Kết quả cho thấy ART có tác dụng mạnh nhất với dòng tế bào ung thư bạch cầu và đại tràng GI50 (growth inhibition cells – nồng độ ức chế sự phát triển của 50% các tế bào) là 1,11 ± 0,56 µM và 2,13 ± 0,74

µM tương ứng Giá trị GI50 cao nhất (25,62 ± 14,95 µM) ở dòng tế bào ung thư

phổi không tế bào nhỏ cho thấy sự kém nhạy cảm nhất với ART Giá trị GI50 trung bình có được ở các dòng tế bào ung thư hắc tố da, ung thư vú, buồng trứng, tuyến tiền liệt, hệ thần kinh trung ương và thận So sánh với một số thuốc khác đang dùng

để điều trị ung thư cho thấy ART có hiệu quả cao và độc tính thấp hơn như carboplatin, cisplatin, cyclophosphamid… [15]

Với mục đích sử dụng chất mang PLGA bào chế hệ nano chứa ART có tác

dụng chống ung thư in vitro trên một số dòng tế bào ung thư người, Nguyễn Hạnh

Thủy và cộng sự (năm 2014) đã sử dụng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương dầu/nước Polyme và ART được hòa tan trong 5 ml dicloromethan (DCM), sau đó nhỏ vào pha nước có chứa chất nhũ hóa Nhũ tương dầu/nước được đồng nhất sử dụng đầu siêu âm ở 100 W trong 5 phút rồi khuấy từ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng để loại dung môi, ly tâm, rửa với nước để loại chất nhũ hóa, sau đó đông khô thu sản phẩm Kết quả cho KTTP nano khoảng 170 nm, hiệu suất mang thuốc 83,40%, thời gian giải phóng có thể kéo dài đến 48 giờ Tiểu phân nano ART-PLGA có khả năng ức chế tốt hơn dạng ART tự do ở tất cả các dòng tế bào ung thư [22]

Tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu trên, Hồ Hoàng Nhân và cộng sự (năm 2015) đã tiến hành tối ưu hóa công thức và đánh giá các đặc điểm của tiểu phân nano ART-PLGA bao chitosan (CS) Hỗn dịch nano ART-PLGA sau khi tạo thành được thêm vào dung dịch CS trong acid acetic 1% (tt/tt), trong điều kiện có khuấy

từ Tiến hành tối ưu hóa với các biến đầu vào là tỷ lệ CS/PLGA, nhiệt độ phối hợp,

pH của dung dịch CS; các biến đầu ra là KTTP, PDI, thế zeta Kết quả cho công thức tối ưu với tỷ lệ CS/PLGA là 0,4; nhiệt độ là 21,5°C; pH dung dịch CS là 3,2 Các tiểu phân nano ART-PLGA-CS bào chế theo công thức tối ưu có KTTP khoảng

190 nm, thế zeta chuyển từ âm sang dương (36,2 ± 1,04 mV); hiệu suất mang thuốc

77,30%; khả năng nạp thuốc 19,97% Về khả năng giải phóng dược chất in vitro,

nano ART-PLGA-CS có khả năng hạn chế sự giải phóng dược chất ồ ạt trong 24 giờ đầu Kết quả đánh giá độc tính trên tế bào MCF-7 và A549 cho thấy tiểu phân

nano ART-PLGA-CS có độc tính trên tế bào ung thư lớn hơn so với tiểu phân nano ART-PLGA [16]

Để cải thiện khả năng kiểm soát giải phóng dược chất và hướng đích tác dụng trong việc chống lại các tế bào ung thư biểu hiện qua thụ thể CD44, Trần Tuấn Hiệp và cộng sự (năm 2016) đã tiến hành bào chế và đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-HA Trong nghiên cứu này, các tiểu phân nano ART-PLGA được bào chế sau đó được bao acid hyaluronic (HA) sau khi đổi ngược điện tích bằng cách sử dụng một chất hoạt động bề mặt cation hóa didodecyldimethylammonium bromid (DDAB) Tiểu phân nano ART-PLGA-HA khắc phục được độ hòa tan kém và độ ổn định kém, hơn nữa còn giúp cải thiện tác dụng so với dạng tự do Độc tính trên các dòng tế bào SCC-7, MCF-7 cho thấy tiểu phân nano ART-PLGA-HA có độc tính trên tế bào ung thư lớn hơn so với ART-PLGA Tiểu phân nano ART-PLGA-HA cho thấy khả năng chống lại sự phát triển của tế bào ung thư cũng như cảm ứng gây chết tế bào theo chương trình tăng lên so với ART tự do và nano ART-PLGA, có thể giải thích do HA có ái lực lớn với thụ thể CD44 Điều đó cho thấy tiềm năng lớn trong việc sử dụng nano ART-PLGA-

HA hướng đích điều trị ung thư Ngoài ra tiểu phân nano ART-PLGA-HA còn giảm

sự giải phóng dược chất ―ồ ạt‖ ở giai đoạn đầu từ 60,1% xuống 52,5% trong 8 giờ đầu khi so với nano ART-PLGA Sau đó sự giải phóng thuốc gần như duy trì đến 48 giờ với 60% dược chất được giải phóng [27]

Hoàng Thị Hương và cộng sự (năm 2016) đã sử dụng PEG làm thay đổi đặc tính bề mặt của tiểu phân nano polyme PLGA, chuỗi PEG đóng vai trò như một đám mây thân nước làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của hệ nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất Tiến hành bào chế tiểu phân nano ART-PLGA-PEG sử dụng hệ PLGA-PEG bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi, công thức tối ưu như sau: tỷ lệ PLGA-PEG là 55%; tỷ lệ dược chất/polyme là 46%; tỷ lệ tween 80 là 1,85%; tỷ lệ pha hữu cơ/nước là 0,15; tổng lượng PLGA sử dụng là 50 mg/5 mL DCM Kết quả thu được

tiểu phân có hình cầu; KTTP khoảng 176,5 ± 2,35 nm; tương đối đồng đều (PDI = 0,189 ± 0,002); thế zeta bằng -22,80 ± 0,17 mV; hiệu suất mang thuốc khá cao (92,48 ± 0,80%); khả năng nạp thuốc tương đối tốt (27,96 ± 0,19%); khả năng giải phóng dược chất kéo dài (thời điểm 48h phần trăm giải phóng là 87,87 ± 4,62%) [3]

1.5.2 Các nghiên cứu về thuốc tiêm hỗn dịch nano và liposome trong nước

Nguyễn Văn Lâm và cộng sự (năm 2012) đã tiến hành bào chế và đánh giá các đặc tính của thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa màng film lipid và

sử dụng máy siêu âm Labsonic (tần số 30 kHz, biên độ 100%, trong 10 phút mỗi lần siêu âm 10 ml) làm giảm kích thước dưới 200 nm Gắn doxorubicin vào hỗn dịch liposome đã đổi hệ đệm (bằng thiết bị lọc tiếp tuyến PS 50 kDa) để đạt hàm lượng 2 mg/ml, ủ ở 50oC trong 15 phút, sau đó bảo quản mẫu ở nhiệt độ 2-8oC; đạt hiệu suất liposome hóa trên 80% Sau 10 ngày bảo quản quá trình vận chuyển doxorubicin đã đạt cân bằng và lấy mẫu để đánh giá các chỉ tiêu Kết quả đánh giá sơ bộ độ ổn định sau 2 tháng bảo quản ở 2-8oC thuốc tiêm liposome doxorubicin vẫn đạt các yêu cầu chất lượng của tiêu chuẩn cơ sở [5]

Nguyễn Hạnh Thủy và cộng sự (năm 2014) đã bước đầu xây dựng công thức bột đông khô nano ART-PLGA Tiến hành khảo sát các đường bảo vệ (manitol, saccarose, trehalose), kết quả cho thấy kích thước tiểu phân tăng nhẹ khi sử dụng manitol hay saccarose trong khi với trehalose kích thước tăng lên đáng kể Nghiên cứu đã lựa chọn manitol 5% làm tá dược bảo vệ tiểu phân nano ART-PLGA Bước đầu đánh giá độ ổn định bột đông khô và hỗn dịch sau khi pha sau 1 tháng bảo quản

ở 2-8oC và điều kiện phòng; kết quả cho thấy kích thước tiểu phân gần như không thay đổi ở cả hai điều kiện, hàm lượng dược chất trong bột đông khô khá ổn định ở điều kiện phòng đạt trên 97%, trong khi mẫu hỗn dịch hàm lượng dược chất giảm đáng kể dưới 83% [22]

Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về bột đông khô nano PLGA ở Việt Nam được công bố

ART-CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Danh mục nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

2

Poly (acid lactic-co-glycolic ) 50:50,

KLPT 7000-17000 Dalton Evonik (Đức) Nhà sản xuất

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer NanoZS90 Malvern (Anh)

- Máy khuấy từ WiseStir (Hàn Quốc)

- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 (Hoa Kỳ)

- Máy ly tâm lạnh Hermle Labortechnik GmbH (Đức)

- Máy siêu âm Sonics & Materials, Inc (Mỹ)

- Máy đo pH Sartorius Mettle Toledo (Mỹ)

- Cân kỹ thuật Ohaus (Đức)

- Cân phân tích Sartorius TE214S (Đức)

- Cột lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules,Polysulfone (PS) 50 kDa (Mỹ)

- Ống ly tâm chứa màng siêu lọc 10 kDa, Millipore, Billerica, MA (USA)

- Tủ lạnh sâu Unicryo (Mỹ)

- Máy đông khô Christ Alpha 1-LD (Đức)

- Máy chiếu xạ tia X D8 Advance (BRUCKER, Đức)

- Máy bơm nhu động Flocon 1003 (Đức)

- Máy đo phổ hồng ngoại FT/IR-6700 (JASCO, Nhật)

- Nồi hấp tiệt trùng ALP (Nhật)

- Tủ an toàn sinh học Top Safe 1.5 (Italia)

- Tủ vi khí hậu Deayang ETS TH-180S (Hàn Quốc)

- Một số thiết bị, dụng cụ khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nâng cấp quy trình bào chế hỗn dịch nano ART-PLGA dựa trên kết quả đề tài:

―Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat‖ của tác giả Nguyễn Hạnh Thủy

- Xây dựng công thức và quy trình bào chế bột đông khô nano ART-PLGA 10 mg/lọ

- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng thuốc tiêm đông khô nano ART-PLGA

- Bước đầu đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng bột đông khô nano ART-PLGA

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

2.3.1.1 Phương pháp bào chế hỗn dịch nano ART-PLGA

Qua tham khảo tài liệu ―Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat‖ của tác giả Nguyễn Hạnh Thủy, tiến hành bào chế tiểu phân nano ART-PLGA bằng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi từ nhũ tương dầu/nước

Cố định thông số:

Pha nước

Tween 80/Nước

Nhũ tương

Hỗn dịch chứa nano ART-PLGA

Siêu âm, đồng nhất hóa Pha dầu

ART, PLGA/DCM

Bốc hơi dung môi

- Pha dầu: dung dịch DCM chứa ART 0,4% và PLGA 1%

- Pha nước: dung dịch tween 80 1,5% trong nước

- Tỷ lệ dầu/nước là 1:10

- Thời gian bốc hơi dung môi là 4 giờ

Thay đổi các thông số:

- Nâng cấp quy mô bào chế (tăng lên 4 lần)

- Công suất máy siêu âm (100 W, 125 W, 150 W, 175 W, 200 W)

Quy trình bào chế hỗn dịch nano ART-PLGA cụ thể như sau:

Hòa tan 200,0 mg PLGA và 80,0 mg ART trong 20 ml dung môi hữu cơ dicloromethan (DCM), sau đó dung dịch này được phối hợp nhỏ giọt từ từ bằng micropipet vào 200 ml dung dịch tween 80 1,5% Đồng nhất bằng máy siêu âm trong 20 phút (chia thành 5 lần, 4 phút/lần, mỗi lần cách nhau 2 phút, phối hợp 4 ml pha dầu/lần để ổn định nhiệt độ trong quá trình phối hợp) và duy trì nhiệt độ 5 -

10oC bằng nước đá kết hợp khuấy từ Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng để loại hết dung môi hữu cơ Quy trình bào chế được

mô tả như sau:

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA

2.3.1.2 Phương pháp tinh chế hỗn dịch nano ART-PLGA

Mục đích quá trình tinh chế (loại bớt nước, ART dạng tự do, tween 80) là giảm thể tích (1/10 so với thể tích ban đầu) và làm sạch hỗn dịch trước khi đông khô Tiến hành tinh chế hỗn dịch bằng 2 phương pháp

Phương pháp 1: Sử dụng ống ly tâm với màng siêu lọc kích thước 10 kDa, tốc độ ly tâm 5.000 vòng/phút trong 30 phút, nhiệt độ 10oC, mỗi lần sử dụng 6 ống (4 ml hỗn dịch/ống) Lực ly tâm sẽ đẩy nước kéo theo các chất tan qua màng lọc, nano ART-PLGA không qua được bám trên bề mặt màng lọc Phần hỗn dịch đặc được thu lại và tiếp tục tinh chế lần hai

Phương pháp 2: Sử dụng cột lọc tiếp tuyến có màng lọc kích thước 50 kDa Hỗn dịch được bơm tuần hoàn với tốc độ 60 vòng/phút qua cột, kết hợp điều chỉnh

áp suất cột bằng cách di chuyển con lăn Áp suất trong lòng cột sẽ đẩy nước kéo các chất tan thấm qua màng lọc theo chiều vuông góc với dòng chảy, nano ART-PLGA không đi qua màng sẽ liên tục chạy qua cột Quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến được mô tả như sau:

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến

Kết thúc quá trình tinh chế thu được 20-25 ml hỗn dịch đặc Sau đó xác định hàm lượng ART trong hỗn dịch sau tinh chế bằng phương pháp HPLC Phân tán hỗn dịch đặc và hòa tan tá dược bảo vệ vào một lượng nước pha tiêm thích hợp

2.3.1.3 Phương pháp đông khô tiểu phân nano ART-PLGA

Đóng 5-7 ml hỗn dịch nano ART-PLGA đã được tinh chế tương ứng 10 mg ART vào lọ thủy tinh dung tích 25 ml, đậy hờ bằng nút cao su có rãnh ở phía dưới của nút, lọ được đặt trên khay inox

Chuyển khay vào buồng đông lạnh để dung dịch đóng băng ở -70oC

Khi sản phẩm đã đông lạnh hoàn toàn, tiến hành cho sản phẩm vào buồng đông khô, hút chân không để giảm áp suất hơi của nước đá và cung cấp nhiệt cho giá để tạo năng lượng cần thiết cho sự thăng hoa Nước sẽ bay hơi trực tiếp từ trạng thái rắn, tạo ra sản phẩm khô, xốp Khi đó phần lớn dung môi được loại đi và hình thành một bánh thuốc Giai đoạn sấy khô này có nhiệt độ -48 ± 2oC, áp suất 0,120 ± 0,02 mbar

Khi sản phẩm đã khô hoàn toàn, các lọ sẽ được đóng kín bằng nút cao su, nắp nhôm và hoàn thiện sản phẩm

Nghiên cứu bào chế bột đông khô nano ART-PLGA bằng cách thay đổi các yếu tố công thức và các thông số kỹ thuật trong quá trình đông khô:

+ Các yếu tố thuộc về công thức: Tá dược và tỉ lệ tá dược

+ Các thông số kỹ thuật trong quá trình đông khô: Thời gian đông lạnh và thời

gian sấy khô

Từ đó tìm ra công thức và qui trình bào chế thích hợp

2.3.2 Phương pháp đánh giá

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá tiểu phân nano ART-PLGA

- Đánh giá KTTP và phân bố KTTP

Nguyên tắc: KTTP được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động Chiếu 1 chùm tia laser vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán

xạ ánh sáng khác nhau Bằng cách đo cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định

được KTTP Chỉ số khúc xạ của artesunat là 1,543

Tiến hành: Tiểu phân nano sau khi tinh chế được pha loãng 10 lần với nước pha tiêm sao cho chỉ số đếm (count rates) nằm trong khoảng 200-400 kcps Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer NanoZS90, sử dụng cuvet nhựa

- Đánh giá thế zeta

Nguyên tắc: Khi đặt 1 điện trường lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỷ lệ với thế zeta Tốc độ này được xác định dựa vào việc phân tích chuyển động của tiểu phân thông qua ánh sáng tán xạ Thế zeta được xác định dựa vào độ nhớt môi trường và định luật Smoluchowski - Huckel

Tiến hành: tương tự như phương pháp xác định kích thước tiểu phân với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng

Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác khoảng 25,0 mg ART cho vào bình định mức

25 ml, thêm ACN hòa tan hoàn toàn, bổ sung ACN cho đủ thể tích được dung dịch

có nồng độ 1000 μg/ml (dung dịch A) Từ dung dịch A pha loãng bằng ACN tinh khiết đến nồng độ 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800 (μg/ml)

Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch trên, xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ ART

Yêu cầu: Hệ số tương quan tuyến tính (R2) phải ≥ 0,99 Xây dựng mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART

Các dung dịch tiêm sắc ký

 Dung dịch chuẩn

Cân chính xác khoảng 10,0 mg ART chuẩn cho vào bình định mức 10 ml, thêm ACN hòa tan hoàn toàn, bổ sung ACN đủ thể tích Hút chính xác 1 ml dung dịch này, pha loãng với ACN thành 10 ml Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

 Dung dịch thử

Mẫu thử 1: Hút chính xác 1 ml hỗn dịch sau khi tinh chế cho vào bình định mức 10 ml Thêm 6 ml ACN, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 2 phút Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Mẫu thử 2: Cân chính xác một lượng bột đông khô tương ứng khoảng 10,0

mg ART cho vào bình định mức 10 ml, thêm 8 ml ACN, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 2 phút Bổ sung nước vừa đủ đến vạch Hút chính xác 1 ml dung dịch này, pha loãng với ACN : nước (4:1) thành 10 ml Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Tiến hành sắc ký và ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn ART

Cc: Nồng độ ART (mg/ml) trong dung dịch chuẩn

Ct1: Nồng độ ART (mg/ml) trong dung dịch thử 1

Clt: Nồng độ ART (mg/ml) trong dung dịch thử 2 theo lý thuyết

Sc: Diện tích pic đáp ứng (mAU.s) của dung dịch chuẩn

St1, St2: Diện tích pic đáp ứng (mAU.s) của dung dịch thử 1, 2

Vhd: Thể tích hỗn dịch sau khi tinh chế (ml)

mART: Khối lượng ART trong hỗn dịch trước khi tinh chế (mg)

h: hệ số pha loãng

2.3.2.2 Phương pháp đánh giá bột đông khô nano ART-PLGA

- Hình thức: Thử bằng cảm quan Yêu cầu bánh thuốc màu trắng, xốp, mịn

- Thời gian phân tán lại: Hút chính xác 5 ml nước cất pha tiêm cho vào mỗi lọ

đông khô rồi quan sát, 10 giây thì quan sát 1 lần Yêu cầu không được quá 30 giây

- Hình thức cảm quan sau khi pha: Thử bằng cảm quan Yêu cầu hỗn dịch màu

trắng đục, không lắng cặn, đồng nhất

- KTTP và PDI sau khi pha: Tiến hành như mục 2.3.2.1 Yêu cầu KTTP nhỏ hơn

200 nm và PDI không quá 0,3

- Hàm lượng ART: Xác định hàm lượng ART trong hỗn dịch bằng phương pháp

sắc ký đã được trình bày ở mục 2.3.2.1 Yêu cầu hàm lượng ART phải từ 90,0 đến 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn

- Đánh giá tương tác dược chất-tá dược và trạng thái vật lý của dược chất trong

bột đông khô nano ART-PLGA

Để bước đầu đánh giá tương tác giữa ART với các tá dược trong mẫu bột đông khô, tiến hành đo phổ hồng ngoại các mẫu gồm: ART, PLGA, saccarose, bột đông khô

Tiến hành: Lấy khoảng 5-10 mg các mẫu ART, PLGA, saccarose, bột đông khô, trộn đều và nghiền mịn với kali bromat, ép thành viên mỏng rồi tiến hành đo phổ hồng ngoại