Nghiên cứu phát triển hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin sử dụng co polyme làm chất ức chế kết tinh

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ TRANG MÃ SINH VIÊN: 1201628 NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ TỰ NHŨ HÓA SIÊU BÃO HÒA CHỨA SILYMARIN SỬ DỤNG CO-POLYME LÀM CHẤT ỨC CHẾ KẾT TINH K

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ TRANG

MÃ SINH VIÊN: 1201628

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ

TỰ NHŨ HÓA SIÊU BÃO HÒA CHỨA SILYMARIN SỬ DỤNG CO-POLYME LÀM CHẤT ỨC CHẾ KẾT TINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ TRANG

MÃ SINH VIÊN: 1201628 NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ

TỰ NHŨ HÓA SIÊU BÃO HÒA CHỨA SILYMARIN SỬ DỤNG CO-POLYME

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin được gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo TS Nguyễn Thạch Tùng và TS Trần Cao Sơn đã luôn luôn tận tâm hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em

trong quá trình học tập nghiên cứu cũng như hoàn thành khóa luận này

Em xin được gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, các anh chị đang công tác tại Viện vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn những người bạn

và các anh, chị, em – những người luôn ở bên, quan tâm, giúp đỡ động viên em vượt qua khó khăn trong cuộc sống và học tập, là động lực để em học tập, rèn luyện và nghiên cứu tại Trường Đại học Dược Hà Nội

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017 Sinh viên

Hoàng Thị Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ ……… 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ……… …… 2

1.1 Tổng quan về silymarin 2

1.1.1 Công thức cấu tạo, tính chất hóa lý 2

1.1.2 Cơ chế tác dụng 2

1.1.3 Chỉ định 3

1.1.4 Đặc điểm dược động học của silymarin 3

1.2 Tổng quan về động học kết tinh 4

1.2.1 Cơ chế kết tinh của dược chất 4

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình kết tinh của dược chất 7

1.3 Tổng quan về hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa 10

1.3.1 Định nghĩa 10

1.3.2 Ưu nhược điểm 10

1.3.3 Các nghiên cứu về hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa……… 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 16

2.1 Nguyên vật liêu, thiết bị nghiên cứu 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa 17

2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của poloxame đến quá trình kết tinh của silymarin 17

2.2.3 Đánh giá sinh khả dụng 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp bào chế 18

2.3.2 Phương pháp đánh giá in vitro 18

2.3.3 Phương pháp đánh giá in vivo 23

2.3.4 Xử lý và tính toán kết quả 25

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ……….…… 26

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng 26

3.1.1 Xây dựng đường chuẩn phương pháp định lượng bằng đo quang UV 26

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC detector UV 27

3.2 Đánh giá ảnh hưởng của poloxame tới quá trình kết tinh silymarin 27

3.2.1 Phương pháp tráng phim 27

3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của polyme đến quá trình tái kết tinh bằng phương pháp chuyển dung môi 29

3.2.3 Đánh giá trạng thái của cắn kết tủa bằng công cụ phổ nhiễu xạ tia X và DSC 32

3.2.4 Nghiên cứu tương tác giữa polyme và dược chất bằng công cụ phổ IR và NMR 34

3.3 Bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa 36

3.3.1 Ảnh hưởng của polyme đến quá trình hòa tan khi nhũ hóa hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa vào môi trường pH 6,8 36

3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của polyme đến quá trình khuếch tán dược chất

qua túi thẩm tích trong môi trường đệm phosphate pH 6.8 38

3.4 Đánh giá sinh khả dụng in vivo 41

3.4.1 Khảo sát phương pháp phân tích 41

3.4.2 Đánh giá sinh khả dụng đường uống trên mô hình thỏ 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .……… 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Liquid chromatography tandem-mass spectrometry – Sắc ký lỏng

khối phổ 2 lần

MS/MS Surfactant mixture – Hỗn hợp chất diện hoạt, đồng diện hoạt Smix Surfactant : Cosurfactant – Tỷ lệ chất diện hoạt : đồng diện hoạt S:CoS

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nguyên liệu và các hóa chất nghiên cứu 16Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu 16Bảng 3.1 Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng loại polyme đến quá trình hòa tan 36Bảng 3.2 Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng của lượng tá dược X đến quá trình hòa tan 37Bảng 3.3 Thiết kế thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của polyme đến quá trình khuếch tán dược chất qua túi thẩm tích 39Bảng 3.4 Các ion phân tử và ion con trong phân tích khối phổ 41Bảng 3.5 Thông số dược động học của silybin trên thỏ 41

Bảng PL.3.1 Bảng thiết kế thí nghiệm của phương pháp tráng phim

Bảng PL.5.1 Công thức hệ TNH và TNHSBH (tính cho 1 con thỏ) trong thí nghiệm đánh giá SKD trên thỏ

Bảng PL.7.1 Các thông số kỹ thuật của MS

Bảng PL.8.1 Chương trình dung môi của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của silybin 2

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa silymarin trong cơ thể 4

Hình 1.3 Mô hình mô tả quá trình kết tinh của dược chất 4

Hình 1.4 Hình minh họa cơ chế hấp thu của hệ TNH và TNHSBH 11

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ quang với nồng độ silymarin 26

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ dung dịch chuẩn với tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, detector UV 27

Hình 3.3 Kết quả thí nghiệm tráng phim sau 1 tháng 28

Hình 3.4 Kết quả thí nghiệm tráng phim sau 3 tháng 29

Hình 3.5 Đồ thị nồng độ silymarin theo thời gian trong thí nghiệm chuyển dung môi với các loại polyme khác nhau 30

Hình 3.6 Đồ thị nồng độ silymarin theo thời gian trong thí nghiệm chuyển dung môi với Tá dược Y ở các nồng độ khác nhau 31

Hình 3.7 Đồ thị nồng độ silymarin theo thời gian trong thí nghiệm chuyển dung môi với Tá dược X ở các nồng độ khác nhau 31

Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc giữa cường độ nhiễu xạ và góc 2-theta 33

Hình 3.9 Đồ thị phân tích nhiệt vi sai của cắn kết tủa 34

Hình 3.10 Hình ảnh phổ hồng ngoại của các mẫu bào chế 35

Hình 3.11.Phổ 1H-NMR 36

Hình 3.12 Ảnh hưởng của loại poloxame đến nồng độ silymarin theo thời gian 37 Hình 3.13 Ảnh hưởng của lượng tá dược X đến nồng độ silymarin theo thời gian 38

Hình 3.14 Tỷ lệ khuếch tán dược chất qua túi tẩm tích trong môi trường đệm phosphat 6,8 + Tween 1% a Silybin A b Silybin B 40Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc nồng độ silybin và isosilybin trong huyết tương thỏ theo thời gian của hệ TNH và hệ TNHSBH chứa silymarin 42 Hình PL.1.1 Hình ảnh nguyên liệu silymarin trên kính hiển vi quang học

Hình PL.2.1 Hình ảnh phổ nhiễu xạ tia X của nguyên liệu silymarin

Hình PL.4.1 Kết quả đo kích thước tiểu phân và PDI trong thí nghiệm hòa tan

Hình PL.6.1 Hình ảnh a silybin b quercetin trên sắc ký đồ

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Silymarin, một hỗn hợp flavonoid được chiết xuất từ cây kế sữa (Silybum marianum),

đã được chứng minh trên lâm sàng có hiệu quả để điều trị một loạt các rối loạn và các bệnh về gan [34] Tuy nhiên, hiệu quả điều trị của silymarin bị hạn chế do độ tan trong nước kém (0,04 mg/ml [18]), khả năng thấm trong đường tiêu hóa kém (20 - 50% [34]), sinh khả dụng thấp khi sử dụng đường uống

Gần đây, hệ tự nhũ hóa đã được sử dụng rộng rãi để tăng sinh khả dụng đường uống của các hợp chất ít tan trong nước,có tính thân dầu cao như cyclosporin A, simvastatin [19], [23] nhờ khả năng tự nhũ hóa trong dạ dày tạo thành các giọt nhũ tương [5] đồng thời trong công thức hệ tự nhũ hóa chứa lipid tổng hợp hay tự nhiên có tác dụng tối ưu

hóa hấp thu qua đường tiêu hóa in vivo [20] Tuy nhiên, trong quá trình bảo quản và sử

dụng, dược chất có thể tách ra khỏi các giọt nhũ tương dầu/nước do pha loãng với dịch tiêu hóa Chính vì thế, dược chất bị kết tinh dẫn tới làm giảm hiệu quả cải thiện sinh khả dụng của hệ tự nhũ hóa Vì thế, cần thiết phải tìm những chất ức chế quá trình kết tinh của dược chất Hiện nay, polyme là một chất được sử dụng rộng rãi trong bào chế để giải quyết vấn đề này [8], [27]

Trong nghiên cứu trước đó [1], tá dược Z được lựa chọn làm chất ức chế kết tinh Tuy nhiên, polyme này lại có nhược điểm bị tách lớp trong quá tình bảo quản và sinh khả dụng của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa tá dược Z không khác biệt so với hệ tự nhũ

hóa Chính vì thế, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát triển hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin sử dụng poloxame làm chất ức chế kết tinh” nhằm

mục tiêu sau:

1 Bào chế và đánh giá hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin sử dụng

Tá dược X làm chất ức chế kết tinh

2 Đánh giá sinh khả dụng đường uống trên thỏ của hệ TNH, hệ TNHSBH

và chế phẩm đối chiếu trên thị trường (Legalon)

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về silymarin

1.1.1.1 Công thức cấu tạo

Silymarin là một hỗn hợp gồm các thành phần: silybin (A, B), isosilybin (A, B), silydianin, silychristin, trong đó silybin là thành phần chính có tác dụng sinh học [32]

 Công thức cấu tạo của silybin

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của silybin

 Tên khoa học: 3,5,7-trihydroxy-2-[3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2- (hydroxymethyl)-1,4-benzodioxan-6-yl]-4-chromanon [7]

 Tên khác: silibinina; silibinine; silibininum; silybum substance E6; sylibinina [7]

 Công thức phân tử: C25H22O10 [7]

1.1.1.2 Tính chất hóa lý

 Tính chất vật lý: là chất bột đồng nhất màu vàng đế nâu, vị hơi đắng, có mùi thơm nhẹ Rất khó tan trong nước (độ tan 0,04 mg/ml), tan tốt trong một số dung môi hữu cơ như ethylacetat, ethanol…[3]

 Tính chất hóa học: silymarin có một số phản ứng đặc trưng của flavonoid như phản ứng với FeCl3,với kiềm, với H2SO4 đậm đặc…[2]

1.1.2 Cơ chế tác dụng

Cơ chế tác dụng của silymarin trên gan bao gồm: Ổn định tế bào gan bằng cách ức chế các chất độc với gan liên kết với receptor trên màng tế bào gan Giảm quá trình oxy hóa glutathion nên tăng nồng độ glutathion trong gan và ruột Hoạt tính chống oxy hóa

3

Kích thích ARN polymerase của ribosom và kích thích tổng hợp protein, do đó làm tăng

sự tái tạo của tế bào gan [34]

1.1.3 Chỉ định

 Điều trị viêm gan cấp và mạn tính, suy gan, gan nhiễm mỡ

 Bảo vệ tế bào gan và phục hồi chức năng gan cho những người uống rượu, bia, bị ngộ độc thực phẩm, hóa chất, những người đang sử dụng các thuốc có hại tới tế bào gan như thuốc điều trị bệnh lao, ung thư, đái tháo đường, các thuốc tác động đến thần kinh, thuốc chống viêm không steroid…, những người có rối loạn chức năng gan với biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, ăn khó tiêu, vàng da, dị ứng, bí tiểu tiện, táo bón…

 Phòng và điều trị hỗ trợ xơ gan và ung thư gan

1.1.4 Đặc điểm dược động học của silymarin

Nhìn chung, silymarin sau khi uống được hấp thu nhanh chóng với tmax khoảng 2 - 4 giờ và t1/2 là 6 giờ Tuy nhiên, chỉ 20 - 50% silymarin đường uống được hấp thu từ đường tiêu hóa sau khi uống và bị chuyển hóa mạnh bởi gan 80% được bài tiết qua mật do liên hợp với glucoronic và sulfate, và chỉ 3 - 8% được bài tiết qua nước tiểu Nồng độ silybin liên hợp trong mật cao gấp 60 lần trong huyết tương [34] Silymarin bị chuyển hóa pha

1 bởi CYP450-2C8 và pha 2 bởi các phản ứng liên hợp với glucuronid, sulfat ở gan, minh họa ở hình 1.2

Sinh khả dụng của silymarin rất thấp Nguyên nhân chủ yếu do: silymarin bị chuyển hóa mạnh ở pha 2, khả năng thấm kém qua tế bào biểu mô ruột, độ tan trong nước thấp

và bị thải trừ nhanh chóng [18]

4

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa silymarin trong cơ thể [34]

1.2 Tổng quan về động học kết tinh

1.2.1 Cơ chế kết tinh của dược chất

Quá trình kết tinh của dược chất từ dung dịch bao gồm 2 con đường: kết tinh qua cốt

và kết tinh trung gian qua dung dịch chứa tinh thể [24]

Hình 1.3 Mô hình mô tả quá trình kết tinh của dược chất [24]

5

1.2.1.1 Kết tinh qua cốt polyme

Quá trình hòa tan hệ chứa dược chất phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tỷ lệ dược chất – polyme, độ tan và độ nhớt của polyme, độ tan của dược chất (phụ thuộc vào dược chất tồn tại ở dạng tinh thể hay vô định hình), cũng như các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hòa tan của dược chất như diện tích bề mặt Khi lượng dược chất sử dụng cao hơn polyme, thì tốc độ giải phóng thường được kiểm soát bởi dược chất, còn khi lượng dược chất sử dụng ít hơn polyme thì tốc độ giải phóng thường được kiểm soát bởi polyme

1.2.1.2 Kết tinh qua trung gian dung dịch

Trường hợp dược chất được giải phóng vào dung dịch nhanh hơn quá trình kết tinh

từ cốt polyme, thì sẽ tạo ra dung dịch quá bão hòa, khi đó cần đánh giá tác động của polyme tới quá trình ức chế kết tinh của dược chất trong dung dịch quá bão hòa Quá trình kết tinh bao gồm hai giai đoạn: quá trình tạo mầm tinh thể từ những hạt nhỏ và quá trình phát triển tinh thể từ mầm thành tinh thể (2 giai đoạn này có thể xảy ra đồng thời) Mỗi quá trình này sẽ được mô tả sau đây

• Quá trình tạo mầm tinh thể

Quá trình tạo mầm tinh thể: các phân tử tự tập hợp lại với nhau, khi đạt tới một giới hạn nhất định thì sẽ xuất hiện mầm tinh thể Quá trình này xảy ra trong dung dịch quá bão hòa Số lượng phân tử có thể từ mười cho tới vài nghìn Các phân tử (A) có thể tập hợp lại với nhau như mô hình sau [16]:

Cứ như vậy, ion hay phân tử trong dung dịch tương tác với nhau tạo thành những khối tồn tại trong thời gian ngắn, hoặc những lớp hay thậm chí có thể tạo ra mạng lưới tinh thể Quá trình này xảy ra nhanh chóng và chỉ có ở những phần dung dịch có trạng thái quá bão hòa Sau đó những mầm tinh thể này có thể bị hòa tan trở lại do nó rất kém ổn định Tuy nhiên, một khi những mầm tinh thể này đạt tới một kích thước nhất định thì những hạt đó sẽ ổn định và tiếp tục phát triển tạo thành mầm tinh thể, rồi phát triển thành tinh thể

6

Mầm tinh thể có thể chia làm 2 loại: mầm sơ cấp và mầm thứ cấp [16]

Mầm sơ cấp xuất hiện trong những hệ mà trong đó không có bất kỳ một loại tinh thể nào, mầm thứ cấp thì hình thành xung quanh những tinh thể đã có sẵn trong hệ, thường

là những dung dịch có sẵn tinh thể trong đó Mầm sơ cấp có thể xảy ra một cách tự phát hoặc là do sự tác động của những chất khác chẳng hạn như tạp chất xuất hiện trong dung dịch

Tốc độ tạo mầm J, được tính theo công thức sau [16]:

Công thức trên cho thấy:

Các hạt nhân cần đạt được một bán kính nhất định thì mới có thể phát triển tiếp để tạo mầm Tốc độ tạo mầm phụ thuộc vào nhiệt độ, khi mức chênh lệch (Tm - T) tăng thì tốc

độ tạo mầm tăng và tăng đến một giá trị cực đại sau đó giảm Điều này được cho là do khi giảm nhiệt độ thì tính linh động của phân tử giảm, độ nhớt tăng Như vậy có thể thấy, tốc độ tạo mầm phụ thuộc vào nhiều yếu tố gồm: nhiệt động học (độ tan, nhiệt độ,…), động học (trạng thái quá bão hòa, tính linh động của phân tử,…), cấu trúc (liên kết hydro,…) Ngoài ra, liên quan đến quá trình tạo mầm còn có thời gian mầm xuất hiện,

đó là khoảng thời gian từ khi hệ bào chế được cho vào dung dịch cho tới khi xuất hiện mầm tinh thể: t = kc1-p

• Quá trình phát triển tạo tinh thể

Khi tồn tại các mầm kết tinh trong dung dịch, các phân tử trong dung dịch sẽ chuyển dần tới bề mặt các mầm này và phát triển lớn dần tạo thành các tinh thể Jackson đã đưa

ra mô hình lý thuyết tính toán tốc độ phát triển tinh thể như sau:

v = 6𝑎𝐷

ʌ 2 𝑓𝑒𝑥𝑝 (−∆𝑆

𝑘) [1 − exp (−∆𝐺

𝑘𝑇)]

Trong đó: a: đường kính phân tử, D: hệ số khuếch tán, ʌ: khoảng cách khuếch tán; f:

tỷ lệ vùng bề mặt lớn lên; ∆S: sự chênh lệch entropy giữa 2 pha; k: hằng số khí Boltzmann, ∆G: chênh lệch năng lượng tự do giữa 2 pha, T: nhiệt độ

Tốc độ phát triển, trước tiên sẽ tăng khi nhiệt độ giảm, do sự tăng của lực nhiệt động học, và sau đó sẽ giảm do giảm tính linh động của phân tử Do đó, tốc độ phát triển từ mầm thành tinh thể sẽ có một giá trị cực đại

Nhìn chung, động học quá trình kết tinh: phụ thuộc vào tốc độ tạo mầm, tạo tinh thể, thời gian để mầm hình thành Nếu không có những yếu tố ảnh hưởng chẳng hạn như tạp chất trong dung dịch thì thời gian để hình thành mầm là tương đối lớn

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình kết tinh của dược chất

1.2.2.1 Yếu tố về dược chất

• Yếu tố vể cấu trúc

Đặc tính cấu trúc thường được sử dụng để mô tả đặc điểm nhiệt động học của trạng thái vô định hình so với dạng tinh thể Đặc tính này bao gồm: entropy cấu trúc (Sconf), biến thiên entropy (∆Sm), enthalpy cấu trúc (Hconf), năng lượng tự do cấu trúc (Gconf), nhiệt dung cấu trúc (Cp, conf) Zhou [37] chỉ ra rằng những hợp chất có Sconf cao nhất và tính linh động thấp nhất thì biểu hiện xu hướng kết tinh thấp nhất Trong nghiên

8

cứu so sánh độ ổn định vật lý của hệ phân tán rắn chứa felodipin và nifedipin, Marsac [21] đã chỉ ra rằng nifedipin kết tinh dễ dàng hơn felodipin do lực thúc đẩy nhiệt động học cho quá trình kết tinh của nifedipin là cao hơn so với felodipin (Gconf)

• Tính linh động của phân tử

Quá trình kết tinh bị ảnh hưởng mạnh bởi sự chuyển động của các phân tử [33] Thông thường, tốc độ kết tinh sẽ tăng nếu như tính linh động của phân tử tăng, tất cả các yếu tố khác được giữ cố định Trong nhiều yếu tố làm tăng tính linh động của phân tử thì nhiệt độ và độ ẩm là quan trọng nhất

Tính linh động của phân tử thay đổi theo nhiệt độ Tính linh động ảnh hưởng khác nhau tới quá trình tạo mầm và quá trình tạo tinh thể Tốc độ tạo mầm tối đa thường xảy

ra ở nhiệt độ thấp hơn so với tốc độ tạo tinh thể [21]

Andronis chỉ ra rằng khi tăng độ ẩm bảo quản hệ phân tán indomethacin thì cũng làm tăng độ ẩm hấp thụ vào hệ, dẫn đến làm giảm Tg và làm tăng tốc độ kết tinh [31] Trong nghiên cứu về ảnh hưởng của độ ẩm tới quá trình kết tinh của felodipin và nifedipin [25], Marsac [21] cho thấy tốc độ tạo mầm tinh thể của cả 2 dược chất này như một hàm của độ ẩm Khi tăng độ ẩm từ 0% tới 75%, tốc độ tạo mầm của hệ chứa nifedipin tăng từ 2000/m3/s lên tới 400000/m3/s, còn với hệ chứa felodipin thì tốc độ tăng chậm hơn, từ 300/m3/s lên tới 2000/m3/s

Ngoài nhiệt độ, độ nhớt cũng là một yếu tố tác động tới tính linh động của phân tử

1.2.2.2 Yếu tố về tá dược

Những hệ vô định hình đơn thành phần, dược chất sẽ kết tinh nhanh hơn hạn sử dụng mong muốn của sản phẩm, vì vậy cần thiết phải đưa thêm vào những chất ức chế kết tinh Từ nhiều năm nay, đã biết tới việc kết hợp dược chất với polyme để cải thiện kết tinh trong suốt quá trình bảo quản cũng như tăng cường khả năng hòa tan Những chất khác thêm vào có thể là chất diện hoạt, nó thường được thêm vào để cải thiện phương pháp bào chế hoặc đặc tính giải phóng thuốc Trong nội dung của khóa luận, chủ yếu bàn về ảnh hưởng của polyme đến quá trình kết tinh của dược chất

9

Tốc độ kết tinh của dược chất rất phức tạp và phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm

xu hướng kết tinh của bản thân dược chất [24], nhiệt độ bảo quản [29], hàm lượng nước [23], lượng và loại polyme sử dụng Giả định rằng polyme được trộn lẫn với dược chất

ở mức độ phân tử, thì người ta phải xem xét tới hiệu quả ức chế kết tinh của những polyme được thêm vào Polyme được chứng minh có khả năng làm giảm xu hướng kết tinh của dược chất và tăng độ ổn định của hệ, bao gồm giảm tính linh động phân tử, phá

vỡ tương tác dược chất – dược chất [22], [35], và hình thành tương tác đặc trưng dược chất – polyme [16], [17]

Zhang et al [36] đã nghiên cứu ảnh hưởng của polyme đến quá trình kết tinh dược chất từ hệ tự nhũ hóa có chứa carbamazepin ở trong nước Kết quả cho thấy công thức

hệ tự nhũ hóa chứa PVP K90 2% ức chế kết tinh hiệu quả trong 24 giờ Thêm vào công thức hệ tự nhũ hóa PVP K30 2% hoặc PVP K60 kéo dài khả năng ức chế kết tinh đến 4 giờ

Tuy nhiên, khả năng ổn định hệ của từng loại polyme xuất hiện cũng phụ thuộc vào

xu hướng kết tinh vốn có của nguyên liệu dược chất tinh khiết Quan sát thấy rằng hệ ketoconazol không tái kết tinh khi làm nóng lại tới điểm chảy, nhưng chỉ bằng cách thêm vào những hạt tinh thể có thể khởi động quá trình tái kết tinh của dạng tinh thể [14] Trong hệ có PVP, quá trình tái kết tinh của dược chất, thậm chí là khi có hạt tinh thể, vẫn không quan sát thấy cho tới 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng và RH 52% Trong

ví dụ này, không có tương tác dược chất - polyme đặc biệt nào được phát hiện, vì vậy sự

ổn định của hệ vô định hình ketoconazol được cho là do sự ổn định của hệ vô định hình tinh khiết [15]

Như vậy, những nghiên cứu này chỉ ra rằng polyme có nhiều hiệu quả ổn định với những dược chất mà bản chất của chúng ổn định trong trạng thái tinh thể

Trong hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa, polyme ức chế kết tinh đóng vai trò quan trọng nhất

do tạo ra và duy trì trạng thái siêu bão hòa sau khi pha loãng hệ với dịch tiêu hóa mà không cần dùng đến nồng độ chất diện hoạt cao để ức chế kết tủa, từ đó tăng tốc độ và mức độ hấp thu so với hệ tự nhũ hóa thông thường đồng thời hạn chế tác dụng phụ của

10

chất diện hoạt trên đường tiêu hóa [33] Các polyme ức chế kết tinh thường sử dụng là: PVP [31], polyme dẫn xuất của cellulose tan trong nước, sử dụng nhiều nhất là HPMC [8], poloxame [30] Cơ chế ức chế kết tinh chủ yếu của polyme là ức chế sự tạo mầm tinh thể và ức chế sự lớn lên của tinh thể bằng cách hấp phụ lên trên bề mặt mầm tinh thể, dựa trên tương tác giữa polyme và dược chất thông qua các liên kết hóa học, thường

là liên kết hydro [25] Việc hiểu tường tận về cơ chế ức chế kết tinh của polyme có thể giúp sự lựa chọn polyme hiệu quả hơn

1.3 Tổng quan về hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa

1.3.1 Định nghĩa

Hệ tự nhũ hóa (TNH) là một hỗn hợp chứa các thành phần: dược chất, dầu, chất diện hoạt, đồng diện hoạt Hệ TNH là hệ lỏng, thường được đóng vào nang mềm hay nang cứng để phân liều Hệ có đặc điểm khi được pha loãng với nước dưới sự khuấy trộn nhẹ nhàng sẽ tự nhũ hóa tạo ra nhũ tương [6], [12], [26]

Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa (TNHSBH) là công thức được thay đổi từ hệ TNH thông thường, có chứa lượng chất diện hoạt giảm đi và có thêm polyme ức chế kết tinh nhằm mục đích duy trì trạng thái siêu bão hòa của dược chất khi nhũ hóa với nước [9] Ở trạng thái siêu bão hòa, nồng độ dược chất trong nhũ tương cao hơn đáng kể giới hạn độ tan bão hòa và do đó, cho phép tăng tốc độ và mức độ hấp thu dược chất [33]

1.3.2 Ưu nhược điểm

11

= 227 ± 104 ng/ml cao hơn 17 lần so với hệ tự nhũ hóa thông thường (Cmax =13,1 ± 14,2 ng/ml), qua đó có thể thấy ưu điểm về mặt hấp thu đường uống của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa so với hệ tự nhũ hóa thông thường

Trước hết ta nói về cơ chế tăng hấp thu của hệ tự nhũ hóa và tự nhũ hóa siêu bão hòa

Sự hấp thu dược chất qua đường uống của 2 hệ tăng lên nhờ tăng cường đưa dược chất đến tế bào hấp thu ở ruột (enterocyte) Hình 1.3 minh họa các con đường đưa dược chất đến tế bào hấp thu ruột: Thứ nhất, con đường vi nhũ tương: hệ tự nhũ hóa/tự nhũ hóa siêu bão hòa sau khi pha loãng với nước, tạo thành các giọt nhũ tương/vi nhũ tương, hấp thu trực tiếp vào tế bào hấp thu ruột; thứ 2, con đường khuếch tán thụ động trong pha nước: dược chất ở dạng tự do trong pha nước, nhờ sự chênh lệch nồng độ giữa 2 bên màng nên khuếch tán thụ động vào trong tế bào hấp thu ruột; thứ 3, con đường phân bố vào micell với acid mật: dược chất tự do được phân bố vào trong micell của acid mật và nhờ micell vận chuyển tới tế bào hấp thu ruột [9] Sau khi thấm vào tế bào hấp thu ruột, dược chất có thể được khuếch tán trực tiếp hoặc phân bố vào các chylomicron và được vận chuyển tới hệ bạch huyết hoặc vào tĩnh mạch, đi vào vòng tuần hoàn [13]

Hình 1.4 Hình minh họa cơ chế hấp thu của hệ TNH và TNHSBH [11]

12

So với hệ tự nhũ hóa, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa không những cũng tăng sự hấp thu dược chất tới tế bào ruột bằng con đường hấp thu trực tiếp từ nhũ tương hoặc vi nhũ tương, mà hơn nữa với sự có mặt của polyme ức chế kết tinh, trạng thái siêu bão hòa được tạo ra và ổn định, do đó nồng độ dược chất tự do cao hơn so với khi pha loãng hệ

tự nhũ hóa Nồng độ dược chất tự do cao hơn có thể giúp dược chất khuếch tán trực tiếp tới tế bào hấp thu ruột nhiều hơn (do chênh lệch gradient nồng độ lớn hơn), hoặc phân

bố nhiều hơn vào micell của acid mật và cũng được vận chuyển nhiều hơn tới tế bào hấp thu ruột Tóm lại, nhờ tạo ra và duy trì trạng thái siêu bão hòa sau khi pha loãng bởi dịch tiêu hóa, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa đạt nồng độ dược chất tự do cao hơn, do đó tăng vận chuyển dược chất đến tế bào hấp thu ruột bằng con đường khuếch tán thụ động trong nước hoặc phân bố vào micell với acid mật, và kết quả là tăng sự hấp thu dược chất đường uống [9]

- Hệ TNHSBH giảm lượng chất diện hoạt so với hệ TNH, do đó an toàn hơn trên đường tiêu hóa Bởi vì hệ tự nhũ hóa thường gặp vấn đề: dược chất có thể bị tủa lại khi

hệ TNH bị pha loãng bởi dịch tiêu hóa Xu hướng dược chất bị tủa lại khi pha loãng sẽ tăng lên nếu dịch pha loãng là các dung môi thân nước Việc tủa lại dược chất sẽ mất đi những ưu điểm của hệ TNH về hấp thu dược chất [4], [26] Vì vậy, phải sử dụng nồng

độ cao chất diện hoạt để ngăn cản hiện tượng kết tủa này, tuy nhiên lại tăng nguy cơ tác dụng phụ trên đường tiêu hóa [28], [32] Ngược lại, hệ TNHSBH giảm lượng chất diện hoạt trong công thức nên có thể giảm tối thiểu tác dụng phụ trên đường tiêu hóa Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa có chứa một polyme ngăn cản hoặc làm giảm tối thiểu hiện tượng kết tủa [33], do đó có thể giảm lượng chất diện hoạt mà không làm ảnh hưởng đến ưu điểm về mặt hấp thu của hệ

- So với hệ TNH, hệ TNHSBH có thể nạp vào lượng dược chất lớn hơn Do hệ TNH gặp phải khó khăn khi nạp lượng dược chất quá cao, dẫn đến khi pha loãng bởi dịch tiêu hóa, dược chất đạt trạng thái siêu bão hòa không bền dẫn đến hiện tượng kết tủa, vì vậy

để đảm bảo hiệu quả của hệ tự nhũ hóa chỉ có thể nạp lượng dược chất đến một giới hạn

- Độ ổn định: do cấu trúc hóa lý của hệ TNHSBH là dạng hỗn dịch có pha phân tán là polyme (ví dụ ở nghiên cứu bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa paclitaxel [10], HPMC được phân tán dưới dạng hỗn dịch) nên không ổn định về mặt nhiệt động học bằng hệ TNH (cấu trúc hóa lý dạng dung dịch vì các thành phần tan hoàn toàn vào nhau) Trong thời gian bảo quản thực tế, polyme có thể bị tách ra, vón cục lại khó phân tán, do

đó khi pha loãng hệ với nước, polyme khó hòa tan hơn làm giảm hiệu quả ức chế kết tinh, giảm ưu điểm của hệ so với hệ TNH

- Cũng như hệ tự nhũ hóa, các lipid sử dụng trong công thức có thể bị oxy hóa, vì thế

để đảm bảo độ ổn định nên có thêm chất chống oxy hóa tan trong dầu ở trong công thức [12], [26]

1.4 Các nghiên cứu về hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa

Trong những năm gần đây, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa đã và đang được nghiên cứu cũng như ứng dụng nhằm mục tiêu nâng cao sinh khả dụng của thuốc, đặc biệt là các thuốc tan kém trong nước Các nghiên cứu nổi bật như:

a Phát triển công thức TNHSBH của paclitaxel nhằm tăng SKD đường uống

Với các thành phần Paclitaxel, Ethanol, PEG 400, Cremophor EL, Glyceryl dioleat, HPMC-E5LV [10] được bào chế theo phương pháp: hòa tan dược chất với hỗn hợp đồng

14

diện hoạt ở 50-600C, để nguội, thêm pha dầu, diện hoạt, tiếp tục lắc đến khi đồng nhất, sau đó phối hợp polyme vào, trộn đều đến khi thu được hỗn dịch HPMC đồng nhất Kết quả:

 In vitro: Nồng độ paclitaxel theo thời gian trong hệ TNHSBH chứa HPMC cao

hơn đáng kể so với hệ TNH không có HPMC

 In vivo: Trên mô hình chuột: hệ TNHSBH cho nồng độ Cmax cao gấp khoảng 10 lần và SKD (F ~ 9,5%) cao hơn so với công thức Taxol đường uống (F ~ 2%) và công thức TNH (F ~ 1%)

b Nâng cao sinh khả dụng đường uống của PNU-91325, một dược chất kém tan trong nước bằng công thức siêu bão hòa

Thành phần của hệ: PNU-91325, PEG 400, Cremophor EL, DMA, Pluronic-L44, GDO/ GMO, HPMC E50LV [8] được bào chế theo phương pháp: hòa tan dược chất trong các thành phần dầu, diện hoạt, đồng diện hoạt, phối hợp HPMC vào và lắc xoáy thu được hỗn dịch đồng nhất

Kết quả:

 In vitro: Nồng độ dược chất theo thời gian của hệ TNH siêu bão hòa ở mức cao

hơn so với dạng bào chế khác (dung dịch dược chất trong PEG 400, Tween 80…)

 In vivo: Trên mô hình chó: SKD đường uống ~ 76%, cao hơn dung dung dịch PEG

Kết quả:

15

 In vitro: Nồng độ thuốc theo thời gian của hệ TNHSBH chứa HPMC cao hơn rõ

ràng so với hệ TNHSBH chứa PVP hay hệ TNH không có polyme

 In vivo: Trên mô hình khỉ: Cmax trung bình và AUC cao hơn 30% khi so sánh với hỗn dịch trong nước ở liều 12,5 mg

16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liêu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Nguyên liệu và các hóa chất nghiên cứu

Hạn sử dụng: 31/7/2021

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu

17

7 Kính hiển vi quang học Nikon Eclipse Ci-L/Camera

DS-Fi2-U3

Nhật

15 Cân phân tích, cân kỹ thuật

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa

 Sàng lọc, lựa chọn polyme ức chế kết tinh tốt silymarin, bào chế được hệ TNHSBH chứa silymarin

2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của poloxame đến quá trình kết tinh của silymarin

 Đánh giá ảnh hưởng của poloxame đến quá trình kết tinh của hệ bằng các công

cụ hóa lý

 Đánh giá và so sánh khả năng khuếch tán dược chất ra khỏi túi thẩm tích của 4 công thức: TNH, TNHSBH chứa tá dược Z, TNHSBH chứa tá dược X, chế phẩm đối chiếu trên thị trường (Legalon)

18

2.2.3 Đánh giá sinh khả dụng

 Tiến hành đánh giá và so sánh sinh khả dụng đường uống của 3 công thức TNH

và TNHSBH và chế phẩm đối chiếu trên thị trường (Legalon) chứa silymarin trên mô hình thỏ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

2.3.1.1 Phương pháp bào chế hệ tự nhũ hóa chứa silymarin

Cân các thành phần của hệ theo công thức Trộn đều pha dầu và hỗn hợp Smix, sau

đó phối hợp silymarin vào Hỗn hợp được đặt trên bể điều nhiệt ở 70oC và khuấy trộn liên tục bằng đũa thủy tinh khoảng 30 phút đến khi tạo thành 1 hệ trong suốt, đồng nhất

2.3.1.3 Phương pháp bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin với tá dược

Z

Cân các thành phần của hệ theo công thức, tiến hành bào chế hệ tự nhũ hóa chứa silymarin như đã mô tả phần trên Sau đó phân tán tá dược Z vào hệ tự nhũ hóa vừa bào chế theo phương pháp phân tán tạo thành một hỗn dịch đồng nhất

2.3.2 Phương pháp đánh giá in vitro

2.3.2.1 Phương pháp định lượng bằng phương pháp đo quang UV

Phát triển phương pháp định lượng silymarin trong dung môi hòa tan methanol, methanol: diclomethan (tỷ lệ 1:1)

Mẫu chuẩn:

Mẫu thử: pha loãng mẫu thử bằng dung môi ở tỉ lệ nhất định để được nồng độ dung

dịch thử trong khoảng 5 - 20 μg/ml Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn tại bước sóng 288 nm Xây dựng đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ độ hấp thụ và nồng độ silymarin để tính toán kết quả

2.3.2.2 Phương pháp định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

µm, siêu âm đuổi bọt trong 30 phút

 Dung dịch chuẩn: Hòa tan silybinin trong pha động để có dung dịch có nồng độ khoảng 10 g/ml

 Điều kiện cột:

 Cột thép không gỉ Agilent (250 mm x 4 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 m)

 Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 288 nm

20

Mẫu đánh giá là nhũ tương thu được từ các thí nghiệm hòa tan hệ TNH, hệ TNHSBH

và hỗn dịch thu được từ thí nghiệm hòa tan trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 Sử dụng cuvet nhựa, chỉ số khúc xạ RI là 1,36 và độ hấp thụ là 0,001 Tốc độ đếm tiểu phân

(count rate) nằm trong khoảng 200-400 kcps

2.3.2.4 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của polyme đến quá trình kết tinh

a Phương pháp tráng phim

Tham khảo nghiên cứu Parikh và cộng sự [18] và căn cứ vào điều kiện hiện tại của bộ môn, tiến hành phương pháp tráng phim như sau: Hòa tan 0,2 g hỗn hợp silymarin và polyme với các tỷ lệ khác nhau trong 2 ml methanol:diclomethan (1:1) bằng cách lắc xoáy và siêu âm đến khi dược chất và polyme tan hoàn toàn Tiến hành tráng một lớp mỏng dung dịch vừa chuẩn bị lên phiến kính, độ dày lớp phim mới tráng khoảng 0,2

mm Để bay hơi ở điều kiện thường 24 giờ, sau đó mang đi soi trên kính hiển vi quang học, độ phóng đại 10x, 40x Sau khi soi xong, bảo quản trong tủ vi khí hậu ở điều kiện nhiệt độ 400C, độ ẩm 75% và theo dõi sự xuất hiện tinh thể bằng kính hiển vi quang học sau các thời gian khác nhau

Tiến hành với 2 loại polyme: tá dược Z và tá dược X với tỷ lệ silymarin:polyme = 4:6; 5:5; 6:4; 7:3; 8:2 để so sánh ảnh hưởng của loại và lượng polyme đến quá trình kết tinh

b Phương pháp chuyển dung môi

Phương pháp tiến hành được tham khảo từ nghiên cứu của Konno và các cộng sự [4]

để đánh giá khả năng ức chế kết tinh của polyme từ dung dịch siêu bão hòa dược chất tạo ra nhờ phương pháp chuyển dung môi, tiến hành như sau:

+ Thiết bị cánh khuấy

+ Điều kiện thử: tốc độ quay: 100 vòng/phút, môi trường thử: 500 ml môi trường đệm phosphat pH 6,8 (có hoặc không hòa tan polyme), nhiệt độ môi trường thử: 37 ± 0,5ºC + Tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu: hòa tan 1 g silymarin trong 5 ml hỗn hợp dung môi DMF và methanol (tỷ lệ 3:7)

21

- Tiến hành thử và lấy mẫu: cho mẫu vào môi trường đệm phosphat pH 6,8 Sau các khoảng thời gian: 5 phút; 15 phút; 30 phút; 45 phút; 60 phút; 1,5 giờ; 2 giờ; 4 giờ hút khoảng 3 ml dịch trong cốc (chú ý không bù lại dịch)

- Xử lý dịch: ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút, thời gian 3 phút, sau đó hút lấy lớp dịch phía trên, lọc qua màng lọc 0,2 µm, rồi pha loãng bằng methanol và đo quang ở bước sóng 288 nm

Tiến hành thí nghiệm với 2 loại polyme: tá dược X và tá dược Y với 4 nồng độ khác nhau của poloxame: 2; 1; 0,4; 0,2 mg/ml

2.3.2.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của polyme đến quá trình hòa tan hệ tự

nhũ hóa siêu bão hòa

Cách tiến hành như sau:

- Xử lý dịch: ly tâm tốc độ 11000 vòng/phút, thời gian 3 phút, sau đó hút lấy lớp dịch phía trên, lọc qua màng lọc 0,2 µm, rồi pha loãng bằng methanol: diclomethan (1:1) và

đo quang ở bước sóng 288 nm

Tiến hành thí nghiệm với 2 loại tá dược X và 188 với các lượng poloxame khác nhau trong công thức

- Định lượng: Dịch được đem đi định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao, detector UV ở bước sóng 288 nm

2.3.2.7 Phương pháp đánh giá trạng thái của cắn kết tủa bằng công cụ phổ DSC và nhiễu xạ tia X

Hòa tan 0,1 g silymarin trong hỗn hợp 0,5 ml DMF và MeOH (tỷ lệ 3:7) Cho từ từ vào cốc có mỏ chứa 50 ml đệm phosphat pH 6,8 (có hòa tan polyme) đặt trên máy khuấy

từ, tốc độ khuấy 1500 vòng/phút Sau 60 phút, lấy toàn bộ dịch trong cốc đem ly tâm thu được cắn kết tủa Sấy tủa ở nhiệt độ 40oC trong 6 giờ trong thiết bị tủ sấy chân không Tiến hành đánh giá cắn kết tủa bằng các công cụ phổ sau:

• Phổ DSC: cân khoảng từ 5 đến 10 mg mẫu vào 1 đĩa nhôm DSC trên cân phân tích (lớp chất rắn phẳng và cao khoảng 2 mm là tốt nhất) Sau đó đậy nắp lên và dùng lực dập để dính chặt nắp vào đĩa Để không khí bên trong có thể giãn nở nắp đĩa được đục sẵn 1 lỗ nhỏ Sử dụng một đĩa nhôm trắng để làm mẫu so sánh và nắp được đục 2 lỗ để phân biệt Dùng kẹp để 2 đĩa nhôm vào buồng gia nhiệt, bắt

Mẫu được chuẩn bị như sau: Cho mẫu vào thiết bị chứa mẫu, san nhẹ để bề mặt mẫu đồng phẳng với bề mặt của thiết bị chứa mẫu Sau đó tiến hành chạy máy với các thông

số như sau: điện thế của anod Cu 40kV, góc quét 2-theta biến đổi từ 3 đến 80 độ, gia tốc góc 0,020

2.3.2.8 Nghiên cứu tương tác giữa silymarin và polyme

• Phổ hồng ngoại (IR): Để xác định tương tác giữa silymarin và polyme, tiến hành quét phổ hồng ngoại với các mẫu: chất chuẩn silybin, tá dược X, hệ phân tán rắn chứa silybin – tá dược X (1:1)

Chuẩn bị mẫu: Nghiền khoảng 1 - 2 mg mẫu với 300 - 400 mg KBr, khi được hỗn hợp đồng nhất đem dập thành viên nén hình dẹt Tiến hành quét phổ với viên nén thu được với số sóng từ 650 đến 4000 cm-1

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR): Tiến hành với các mẫu: chất chuẩn silybin, tá dược X, hệ phân tán rắn chứa silybin – tá dược X (1:1)

Chuẩn bị mẫu: hòa tan mẫu trong CDCl3. Cho dung dịch vào một ống thủy tinh chuyên dụng sao cho độ cao của mực chất lỏng khoảng 4,5 đến 5 cm sau đó đậy nắp kín lại Đặt ống thủy tinh vào buồng đo và tiến hành quét phổ ở tần số 500 MHz

2.3.3 Phương pháp đánh giá in vi vivo

2.3.3.1 Thiết kế mô hình đánh giá SKD trên thỏ

+ Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 12 thỏ trưởng thành có trọng lượng 2 - 3 kg được nuôi trong phòng Dược lý Đại học Dược Hà Nội Cho thỏ nhịn ăn và uống trong vòng

24 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm

+ Chuẩn bị mẫu thuốc: hệ TNH, hệ TNHSBH đã được nhũ hóa trong 10 ml nước