Nghiên cứu đặc tính xúc tác của enzyme ulvan lyase thu từ động vật thân mềm biển

Do đó mà tôi muốn nghiên cứu về loại enzymecó khả năng phân cắt mạch phân tử ulvan nhằm: - Thứ nhất: sử dụng ulvan lyase như một công cụ góp phần làm sáng tỏ cấu trúc phân tử của polysac

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

-o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME ULVAN LYASE THU TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN

Giảng viên hướng dẫn : Th.s Lê Nhã Uyên

TS Huỳnh Hoàng Như Khánh Sinh viên thực hiện : Võ Thị Như Phương

Mã số sinh viên : 55131398

Khánh Hòa: 2017

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận án tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ quý báu của các thầy cô, ban lãnh đạo và các anh chị đi trước Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học

và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã tận tình giảng dạy, truyền đạt các kĩ năng chuyên ngành cũng như các kiến thức xã hội trong suốt 4 năm em theo học tại trường

Đó là nền tảng vững chắc để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp và cũng là hành trang quý giá để em vượt qua những khó khăn trong tương lai

Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành đến TS Huỳnh Hoàng Như Khánh công tác tại Viện Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang và Ths Lê Nhã Uyên công tác tại trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành đồ án này

Tiếp theo, em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang, trưởng phòng Công Nghệ Sinh Học Biển cùng toàn thể các Cô chú, Anh chị công tác tại đây đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian em thực hiện luận án

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn bạn bè, đặc biệt là gia đình và người thân

đã quan tâm sâu sắc, chia sẻ những khó khăn và động viên, giúp đỡ em về cả tinh thần lẫn vật chất trong suốt quá trình em học tập và thực hiện đồ án tốt nghiệp

Nha Trang, tháng 6 năm 2017

Sinh viên

Võ Thị Như Phương

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

LDL-cholesterol : low-density lipoprotein-cholesterol

HDL-cholesterol :high-density lipoprotein-cholesterol

TG : Triglyceride

TTHĐ : Trung tâm hoạt động

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 RONG BIỂN 3

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển 3

1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển 4

1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển 6

1.2 ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN 7

1.3 ULVAN 8

1.3.1 Giới thiệu chung về ulvan 8

1.3.2 Cấu trúc và tính chất hóa học của ulvan 9

1.3.3 Phương pháp tách chiết ulvan từ rong lục 12

1.3.4 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của ulvan 13

1.4 ULVAN LYASE 17

1.4.1 Giới thiệu chung về enzyme 17

3.1.2 Tình hình nghiên cứu về ulvan lyase trên thế giới 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Hóa chất, thiết bị cơ bản 23

2.1.2 Cơ chất ulvan từ rong Ulva lactuca 24

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT 25

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Phương pháp tách chiết enzyme từ động vật thân mềm biển 26

2.3.2 Phương pháp sắc ký lọc gel 27

2.3.3 Phương pháp kết tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 28

2.3.4 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) 29

2.3.5 Xác định hoạt tính ulvan lyase bằng phương pháp Nelson-Somogyi cải tiến (1989) 29

2.3.6 Phương pháp tách chiết và thu nhận enzyme từ mẫu vọp Geloina cooaxans 31

2.3.7 Phương pháp nghiên cứu đặc tính xúc tác của enzyme 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 KẾT QUẢ DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 34

3.2 KẾT QUẢ DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN D-RHAMNOSE BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NELSON SOMOGYI CẢI TIẾN, 1989 34

3.3 KẾT QUẢ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ULVAN LYASE TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN 35

3.4 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN ENZYME TỪ VỌP Geloina coaxans 42

3.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ULVAN LYSAE TỪ DỊCH CHIẾT GAN TỤY VỌP Geloina coaxans 43

3.5.1 pH tối ưu 43

3.5.2 Nhiệt độ tối ưu 45

3.5.3 Thời gian ủ tối ưu 46

3.5.4 Ảnh hưởng của cation kim loại 47

3.5.5 Độ bền nhiệt 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

KẾT LUẬN 52

KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thống kê hóa chất và thiết bị cơ bản trong nghiên cứu 23 Bảng 3.1: Thông tin về thời gian, địa điểm thu mẫu và hình ảnh của 15 mẫu động vật

thân mềm biển sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ulvan lyase 36

Bảng 3.2: Khối lượng gan tụy và dịch chiết enzyme thô thu được của 15 mẫu động vật

thân mềm biển dùng cho giai đoạn sàng lọc 39

Bảng 3.3: Hàm lượng protein và giá trị OD ở bước sóng 750nm của 15 mẫu động vật

thân mềm biển 40

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các cation kim loại đến hoạt tính ulvan lyase từ vọp Geloina

coaxans 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Tỉ lệ khai thác các chi ngành rong Lục để tách chiết các loại polysaccharide

sulfate hóa 8

Hình 1.2: Cấu trúc các disaccharide chính lặp lại trong phân tử ulvan được tách chiết từ rong Ulva sp 9

Hình 1.3: Phương trình Michaelis- Menten 19

Hình 2.1: Rong Ulva lactuca 24

Hình 2.2: Vọp Geloina coaxans 25

Hình 2.3: Quy trình nghiên cứu tổng quát 25

Hình 2.4: Phương pháp tách chiết enzyme từ động vật thân mềm biển 26

Hình 2.5: Sơ đồ của sắc ký lọc gel 28

Hình 2.6: Phương pháp tách chiết và thu nhận enzyme từ mẫu vọp Geloina cooaxans 31

Hình 3.1: Đồ thị và phương trình đường chuẩn protein (BSA) 34

Hình 3.2: Đồ thị và phương trình đường chuẩn D-rhamnose 35

Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện hoạt tính ulvan lyase 15 mẫu động vật thân mềm biển 41

Hình 3.4: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của ulvan lyase 44

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính xúc tác của ulvan lyase 46

Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian thực hiện phản ứng đến hoạt tính của ulvan lyase. 47

Hình 3.7: Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của ulvan lyase ở 4 o C 49

Hình 3.8: Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của ulvan lyase ở 30 o C 50

Hình 3.9: Độ bền nhiệt của ulvan lyase ở 45 o C 51

Hình 3.10: Độ bền nhiệt của ulvan lyase ở 60 o C 51

MỞ ĐẦU

Đất nước ta sở hữu đường bờ biển dài 3260 km trải dài từ Bắc tới Nam và diện tích biển vô cùng rộng lớn, nhiều đầm phá, vũng vịnh Thêm vào đó, điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa đã giúp Việt Nam trở thành một trong những quốc gia có đa dạng sinh vật biển bật nhất Thế giới Trong đó, không thể không nói đến đa dạng Rong- báu vật

mà thiên nhiên ban tặng bởi có chứa rất nhiều polysaccharide sinh học quý và tính ứng dụng rất cao như alginate, polymanuronic acid, laminaran,fucoidan …, đặc biệt là ulvan.

Ulvan là một polysaccharide tan trong nước được tìm thấy ở thành tế bào rong Lục, chúng chiếm khoảng 8-29% trọng lượng rong khô [43] Thành phần chủ yếu cấu tạo nên phân tử ulvan là các gốc đường rhamnose, xylose, acid iduronic, acid glucuronic,

các gốc sulfate hóa; ngoài ra ở một số loài rong Lục như Codium, người ta còn tìm thấy

một lượng đáng kể sulfate galactan [18] Điều này chứng tỏ cấu trúc của ulvan là hết sức phức tạp và không có cấu trúc chung nào cố định cho ulvan được chiết xuất từ các loại rong khác nhau Mặc dù cấu trúc hóa học hết sức đa dạng và phức tạp, song ulvan lại thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quý như kháng u, kháng ung thư, kích thích miễn dịch, chống đông máu, chống oxi hóa, giảm cholesterol,…[31, 47, 48, 50, 73, 75]

Ngành rong Lục (Chlorophyta) được xem là một ngành lớn, số lượng loài khá đa dạng và phong phú Đến nay, trên toàn Thế giới đã biết khoảng 500 chi và 8000 loài Phần lớn chúng sống ở nước ngọt (chiếm đến 90%) và 10% còn lại sống ở nước mặn [11].Với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 cùng với điều kiện tự nhiên thuận lợi, Việt Nam được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong Lục khá đa dạng và phong phú Tuy nhiênở nước ta, việc khai thác và sản xuất vẫn chưa phát huy được hết tiềm năng, giá trị kinh tế cũng như giá trị dược lý của các polysaccharide có trong những loài rong này, đặc biệt là ulvan Mặc dù có nhiều hoạt tính sinh học quý nhưng chính sự phức tạp cũng như cấu trúc hóa học chưa được nghiên cứu rõ ràng là một trở ngại rất lớn để ulvan được ứng dụng rộng rãi trong y dược Do đó mà tôi muốn nghiên cứu về loại enzymecó khả năng phân cắt mạch phân tử ulvan nhằm:

- Thứ nhất: sử dụng ulvan lyase như một công cụ góp phần làm sáng tỏ cấu trúc phân tử của polysaccharide này

- Thứ hai: sử dụng enzyme để cắt nhỏ phân tử ulvan thành các đoạn mạch ngắn để cấu trúc phân tử bớt cồng kềnh, độ nhớt giảm, tăng khả năng hấp thụ vào tế bào động vật nhưng vẫn bảo toàn hoạt tính sinh học

Chính vì những lí do trên, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu đặc tính xúc tác của ulvan lyase từ động vật thân mềm biển” Thức ăn của hầu hết những loài động vật thuộc nhóm

này chủ yếu là rong biển Mà ulvan lại là một polysaccharide có nguồn gốc rong biển nên khả năng enzyme thủy phân ulvan được tìm thấy và có hoạt tính mạnh là rất lớn

Mục tiêu của đề tài:

Xác định đặc tính của enzyme thủy phân ulvan từ động vật thân mềm biển

Để đạt được mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

- Sàng lọc và khảo sát khả năng thủy phân ulvan bằng ulvan lyase thu được từ dịch chiết gan tụy của một số loài thuộc nhóm động vật thân mềm biển (thực hiện trên khoảng 10-20 đối tượng)

- Chọn đối tượng có khả năng thủy phân ulvan tốt nhất để khảo sát các đặc tính xúc tác (pH, to, độ bền nhiệt, thời gian thủy phân, ảnh hưởng của cation kim loại…)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 RONG BIỂN

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển

Rong biển là những loài thực vật sinh sống ở biển, thuộc nhóm tảo biển Chúng có thể là đơn bào hoặc đa bào sống thành quần thể Hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt Rong biển có thế sống ở cả hai môi trường nước mặn và nước lợ, chúng mọc trên các rạn san hô hoặc trên các vách đá, hoặc

có thể mọc dưới tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn gốc từ rong biển [53, 57]

Rong biển đã được con người phát hiện và sử dụng từ rất sớm Chúng được sử dụng trong bữa ăn từ thời tiền sử và sau đó trở nên phổ biến trên các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc hay Hàn Quốc và một số nước ven biển phương Tây như Scotland, Ireland, Newzealand,…Chính bởi nhu cầu sử dụng rong biển cao đã tạo tiền đề phát triển ngành nuôi trồng rong biển ở các quốc gia này Theo ước tính, sản lượng rong biển nuôi trồng hàng năm toàn thế giới vào khoảng 6 triệu tấn tươi, tương ứng với khoảng 5 tỉ đô la

Mĩ [57].Việt Nam là nước có nguồn lợi rong biển rất đa dạng và phong phú Theo các kết quả nghiên cứu gần đây, nước ta có khoảng 794 loài rong biển, phân bố ở vùng biển miền Bắc 310 loài (các nghiên cứu từ Quảng Bình trở ra), miền Nam 484 loài (các nghiên cứu

từ Đà Nẵng trở vào), 156 loài tìm thấy ở cả hai miền [6] Đến năm 2016, tổng số loài rong được xác định ở Việt Nam tăng lên là 800 loài [3]

Ngoài việc được sử dụng phổ biến làm thực phẩm, rong biển còn được sử dụng làm nguyên liệu chính trong công nghiệp, chẳng hạn như công nghiệp sản xuất agar, carrageenan, alginate, ; sản xuất chất phụ gia (phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định,…); sản xuất phân bón, thức ăn cho gia súc và là nguồn cung cấp năng lượng sinh học thay thế cho năng lượng hóa thạch ở một số quốc gia phát triển trên thế giới Tính đến thời điểm này, rong biển được xem là loại thực phẩm an toàn bởi lịch sử sử dụng lâu dài mà chưa có báo cáo về vấn đề xấu nào đối với sức khỏe người

sử dụng ngoài những tác dụng to lớn mà chúng mang lại Trong các phương pháp dưỡng

sinh của nhiều dân tộc trên thế giới, rong biển được coi là thức ăn tạo sự dẻo dai, khỏe mạnh về thể chất và tinh thần cho con người

1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển

1.1.2.1 Phân loại và phân bố rong biển trên thế giới

Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển có thể được

chia thành 3 ngành rong chính [21]:

1 Ngành rong Lục (Chlorophyta)

2 Ngành rong Đỏ (Rhodophyta)

3 Ngành rong Nâu (Phaeophyta)

Trong số 03 ngành rong trên, rong Lục là ngành có số lượng loài lớn nhất và phân

bố đa dạng với hơn 8000 loài đã được biết đến [11] Tuy nhiên, chỉ có khoảng 10% sống

ở môi trường biển Ulva và Enteromorpha là hai chi phổ biến ở các vùng biển trên Thế

giới với số lượng loài lần lượt là 98 và 23 [12] Nét đặc trưng của những loài rong này

là màu xanh lục do các sắc tố Chlorophyl a và b trong tế bào tạo nên Tuy hiện nay đang tồn tại nhiều hệ thống phân loại của ngành rong Lục,nhưng các tác giả đều nhất trí cho rằng ngành rong Lục là một nhóm lớn, thống nhất, khởi đầu là các loại tảo đơn bào

Chlamydomonas bộ Volvocales Rong Lục được xem là tổ tiên của các loài thực vật trên

cạn bởi sự tiến hoá tiếp theo của chúng dẫn đến việc xuất hiện các thực vật bậc cao trên Trái đất [11]

Trong hơn 20 năm qua, Rong Lục chủ yếu được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học bởi tiềm năng sinh khối lớn cũng như sự phân bố rộng rãi của chúng Bên cạnh

đó, chúng còn được trồng hay thu thập để làm thực phẩm và được biết đến là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, rất tốt cho sức khỏe Tuy nhiên, chúng vẫn chưa được

sử dụng rộng rãi và phổ biển như rong Nâu và rong Đỏ, mãi cho đến những năm gần đây, rong Lục được các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến do phát hiện có nhiều thành phần mang nhiều hoạt tính sinh học quý, điển hình là ulvan [77]

Rong Lục (Chlorophyta) trên thế giới chủ yếu phân bố tập trung tại Philippin, tiếp theo là Hàn Quốc, kế tiếp là Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam với các loài

Caulerpa racemosa, Ulva reticulata, Ulva lactuca Ngoài ra, rong Lục còn phân

bố rải rác ở các nước bao gồm: Achentina, Bangladesh, Canada, Chile, Pháp, Hawaii, Israel, Italy, Kenya, Malaysia, Myanmar, Bồ Đào Nha, Thái Lan… Nhật Bản là quốc gia có trữ lượng rong Lục lớn nhất thế giới vào khoảng 4.000 tấn khô với các chi như

Enteromorpha, Monostroma, Ulva, trong đó nuôi trồng khoảng 2.500 tấn, kế tiếp là Hàn Quốc khoảng 1.000 tấn chi Enteromorpha, Philippines khoảng 800 tấn chi Caulerpa,

gần như toàn bộ do nuôi trồng

Rong Đỏ (Rhodophyta) phân bố nhiều ở Việt Nam,Nhật Bản, Chile, Indonesia, Philippin, Canada, Hàn Quốc Rong Nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ Trong

đó, họ Sargassaceae là đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong Nâu phân bố chủ yếu

ở vùng cận nhiệt đới cũng như ở Việt Nam [8]

Phân bố về số loài rong biển tuy đã được tổng kết sơ bộ, tuy nhiên, tuỳ theo diện tích lãnh hải, điều kiện môi trường phát triển, kỹ thuật nuôi trồng khác nhau của các nước mà sản lượng rong biển trên thế giới khác với phân bố các loài rong

1.1.2.2 Phân loại và phân bố các loại rong Lục ở Việt Nam:

Ở Việt Nam hiện nay, rong Lục có khoảng 155 loài, 6 biến loài đã được mô tả và phân loại [11] Hầu hết các loài thuộc bộ Ulvales, Siphonales, Siphonocladales đều sống

ở biển, hải đảo, vùng cửa sông và các đầm, phá nước lợ ven biển Rong Lục là ngành có

số lượng loài lớn, tuy nhiên trữ lượng không nhiều cả ở Việt Nam và trên thế giới do ít loài có giá trị về kinh tế cũng như giá trị sử dụng Hiện chưa có con số thống kê cụ thể nào về trữ lượng rong Lục ở Việt Nam, mà đa phần chỉ tập trung vào rong Nâu- loài rong có số lượng loài được nuôi trồng và sử dụng phổ biến bật nhất cả ở Việt Nam và trên thế giới

Rong Lục phân bố trải dài ở hầu hết các vùng biển từ Bắc tới Nam Tại vùng triều ven biển một số tỉnh từ Quảng Ninh đến Quảng Bình đã phát hiện được 45 loài rong biển trong đó có 16 loài thuộc nghành rong Lục, chiếm 35,5% [10] Các nghiên cứu tại

10 đảo thuộc quần đảo Trường Sa (Trường Sa lớn, Nam Yết, Sơn Ca, Song Tử Tây, Phan Vinh, Tốc Tan, Thuyền Chài, Đá Tây, Sinh Tồn và Đá Nam) đã xác định được 255 loài rong biển, trong đó rong Lục có 69 loài, chiếm 27,0% [9] Đảo Phú Quý (Bình Thuận) tìm thấy khoảng 55 loài thuộc nghành rong Lục, chiếm ưu thế thứ 2 chỉ sau ngành rong Đỏ Tại đây, các loài rong Lục đặc biệt phát triển rất mạnh ở gần các khu

vực tập trung dân cư, có nhiều chất thải sinh hoạt làm thành thảm màu xanh bắt đầu từ vùng triều trung bình, có thể nhìn thấy vành đai màu xanh từ rất xa Đa số các loài này

thuộc chi Enteromorpha, Chaetomorpha và nhất là Ulva mọc thành thảm dày [5] Loài U intestinalis phân bố khá rộng rãi theo không gian tại Cần Giờ - Tp Hồ Chí

Minh (6/7 xã thuộc huyện Cần Giờ) [12] Tại Hà Tiên (Kiên Giang) đã tìm thấy khoảng 11 loài thuộc ngành rong Lục Đánh giá theo mùa vụ cho thấy, ngành rong Lục (Chlorophyta) chiếm ưu thế về số lượng loài cũng như sinh khối lớn vào mùa mưa [13]

Nhìn một cách tổng quan, rong Lục phân bố trải dài ven biển từ Bắc tới Nam, chủ yếu tập trung số lượng lớn ở các vùng triều biển, hải đảo, vùng cửa sông và các đầm, phá nước lợ ven biển Các vùng biển phân bố phổ biến rong Lục là Quảng Ninh-Quảng Bình, Khánh Hòa (Vịnh Nha Trang, Quần đảo Trường Sa) và vùng biển phía Nam như Bình Thuận, Thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang…

1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển

Vào nửa thế kỷ 19, người ta đã xác định giá trị dinh dưỡng của thực phẩm là do hàm lượng các chất protein, lipid, glucid, khoáng và vitamin có trong thực phẩm quyết định Rong biển là một nguồn thực phẩm của nhân loại trong tương lai được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu và đề cập đến Chúng có chứa đa dạng các thành phần hoá học, các thành phần này đều rất có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginat, fucoidan và ulvan Trong số các hợp chất polysacaride trên thì ulvan và fucoidan là 2 hợp chất được sulfate hóa, tức là có chứa các gốc sulfate trong cấu trúc của chúng Chính nhờ sự có mặt của những gốc sulfate đã tạo nên rất nhiều hoạt tính sinh học quý của 2 loại polysaccaride này Ulvan là polysaccharide chỉ được tìm thấy ở thành tế bào rong Lục, không có mặt ở rong Đỏ và rong Nâu Gần đây, loại hợp chất này được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do chúng sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quý (kháng u, kháng ung thư, kích thích miễn dịch, chống đông máu, chống oxi hóa, giảm cholesterol,…) với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu [31, 47, 48, 50, 73, 75]

1.2 ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN

Ngành Thân mềm (còn gọi là nhuyễn thể hay thân nhuyễn), danh pháp khoa học

là Mollusca Đây là một ngành trong phân loại sinh học có các đặc điểm như cơ thể mềm, có thể có vỏ đá vôi che chở và nâng đỡ, tùy lối sống mà vỏ và cấu tạo cơ thể có thể thay đổi Ngành Thân mềm có nhiều chủng loại rất đa dạng, phong phú và là nhóm động vật biển lớn nhất chiếm khoảng 23% tổng số các sinh vật biển đã được đặt tên Trong các khu vực nhiệt đới, bao gồm Việt Nam, ngành này có hơn 90 nghìn loài hiện hữu, trong đó có các loài như trai, sò, ốc, hến, ngao, mực, bạch tuộc Chúng phân bố ở các môi trường như biển, sông, suối, ao, hồ và nước lợ Một số sống trên cạn, một số nhỏ chuyển qua lối sống chui rúc, đục ruỗng các vỏ gỗ của tàu thuyền như con hà Chúng

là nghành có độ đa dạng cao, không chỉ về kích thước mà còn về cấu trúc giải phẫu học Ngành này được chia thành 8 lớp, bao gồm:

1.3 ULVAN

1.3.1 Giới thiệu chung về ulvan

Ulvan là một polysaccharide sulfate hóa tan trong nước được tìm thấy ở thành tế bào rong Lục, chúng chiếm khoảng từ 8-29% trọng lượng khô tùy vào loại rong [43] Hợp chất này ban đầu có tên là “ulvin” hay “ulvacin” được phân lập lần đầu tiêntừ rong

Ulva lactuca bởi Kylin vào năm 1913 [42] Thuật ngữ này được đổi lại thành ulvan để

chỉ các polysaccharide sulfate hóa có nguồn gốc từ các chi thuộc bộ Ulvales, chủ yếu là

2 chi Ulva và Enteromorpha [77] Tuy nhiên, mãi cho đến năm 1954 thì cấu trúc của nó

mới được mô tả lần đầu tiên bởi Brading và cộng sự [19] Theo các báo cáo trên thế giới

về việc nghiên cứu các loại polysaccharide sulfate hóa từ rong Lục thời gian gần đây

cho thấy Ulva là chi được khai thác nhiều nhất (38%), tiếp đến là Codium (16%), Enteromorpha (14%) và Monostroma (14%) Ở một số chi khác việc khai thác còn khá

ít Điều đó cho thấy rằng ulvan là loại polysaccharide được các nhà khoa học trên thế giới đặc biệt quan tâm và nghiên cứu thời gian gần đây Biểu đồ dưới đây sẽ thể hiện rõ hơn về điều này [77]

Hình 1.1: Tỉ lệ khai thác các chi ngành rong Lục để tách chiết các loại polysaccharide sulfate hóa

Các polysaccharide sulfate hóa chiết xuất từ rong Lục có cấu trúc đa dạng và không đồng nhất [26, 28], ulvan cũng không ngoại lệ Tùy thuộc vào loài rong, mùa vụ thu hoạch, các phương pháp khai thác và tách chiết khác nhau mà cấu trúc của ulvan sẽ có những sự thay đổi khác nhau[46, 71, 72] tạo nên sự đa dạng về thành phần và cấu trúc của chúng

Ba yếu tố chủ yếu quyết định đặc tính hóa lý và sinh học của ulvan là thành phần hóa học, mật độ điện tích và trọng lượng phân tử Chính nhờ sự đa dạng về thành phần cấu trúc mà ulvan sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị [31, 47, 48, 50, 73, 75]

1.3.2 Cấu trúc và tính chất hóa học của ulvan

Như đã nói ở trên, thành phần và cấu trúc phân tử ulvan khá đa dạng Thành phần chủ yếu cấu tạo nên phân tử ulvan là các gốc đường rhamnose, xylose, acid iduronic,

acid glucuronic, các gốc sulfate hóa; ngoài ra ở một số loài rong Lục như Codium, người

ta còn tìm thấy một lượng đáng kể sulfate galactan [18] Cấu trúc ulvan rất phức tạp và

có thể thay đổi, chẳng hạn như số nhóm oligosaccharide lặp lại trong cấu trúc ulvan được chiết tách từ các loại rong khác nhau trong tự nhiên là khác nhau [43] Ulvanobiouronic acid 3-sulfate là loại disaccharide chính có trong phân tử ulvan, chúng chứa acid glucuronic hoặc iduronic, đôi khi 2 gốc acid này được thay thế bằng các gốc đường xylose sulfate hóa tại vị trí O-2 của gốc rhamnose-3-sulfate (Hình 1.2) [44, 46]

Hình 1.2: Cấu trúc các disaccharide chính lặp lại trong phân tử ulvan được tách chiết từ

rong Ulva sp Trong đó: cấu trúc loại A: [→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-L-Rhap3S-(1→]n , cấu trúc loại B [→4)-α-L-Idop-(1→4)-α-L-Rhap3S-(1→]n (a) Ulvanobiouronic acid 3-sulfate loại

A3s chứa glucuronic acid và sulfated rhamnose trong khi B3s chứa iduronic acid và sulfated

rhamnose (b) Ulvanobiose acid, trong đó xylose hoặc sulfate xylose thay thế vị trí của iduronic

acid (tương ứng U3s và U2’s3s) [44, 46]

Các disaccharide lặp lại chính trong cấu trúc ulvan chiết xuất từ các loài Ulva khác

nhau bao gồm hai loại aldobiouronic acid là ulvanobiuronic acid 3-sulfate loại A và loại

B (tương ứng A3s và B3s) Disaccharide A3s chứa glucuronic acid và sulfated rhamose, trong khi B3s gồm iduronic acid và sulfated rhamnose, chúng được liên kết với nhau chủ yếu qua liên kết (1 → 4) glycosidic Các rhamnose chưa liên kếtđược sulfate hóa

chủ yếu ở vị trí C-3 hoặc ở cả hai vị trí C-2 và C-3 Ở một số dịch chiết từ Ulva, người

ta thấy rằng uronic acid trong phân tử ulvanobiuronic acid 3-sulfate đôi khi được thay thế bởi xylose hoặc sulfate xylose Trong trường hợp này, disaccharides được gọi là các ulvanobiose acid, kí hiệu là U3s (ulvanobiose acid 3-sulfate) và U2's3s (ulvanobiose acid 2,3-disulfate) Một lượng nhỏ galactose, glucose và mannose đã được báo cáo trong các nghiên cứu trước đây nhưng sự tích hợp thực sự của chúng trong cấu trúc ulvan vẫn đang là câu hỏi của các nhà nghiên cứu [17, 43, 69]

Nói chung, các gốc đường có trong phân tử ulvan được sulfate hóa tại vị trí các nhóm hydroxyl, hay nói cách khác các nhóm hyroxyl trong phân tử đường sẽ bị thay thế bởi các nhóm sulfate Loại biopolymer này được cấu thành bởi những chuỗi cao phân

tử có độ phức tạp cao, các chuỗi phân tử này phân nhánh liên tục và dường như không

có trục chính nào được xác định hoặc có monomer đơn giản lặp lại; và hầu như cũng không thấy xuất hiện những chuỗi dài đường đơn [27] Các thành phần đường của ulvan thay đổi cực kỳ linh động, những loại đường phổ biến nhất trong thành phần cấu trúc của ulvan là rhamnose (16,8% -45,0%), xylose (2,1% -12,0%), glucose (0,5% -6,4%), glucuronic acid (6.5% -19.0%) và iduronic acid (1.1% -9.1%) Mannose, galactose và

arabinose cũng đã được tìm thấy trong ulvan từ một số loài Ulva [24] Như vậy, việc

xác định trình tự đường chính và đặc trưng trong cấu trúc ulvan là một thách thức rất lớn trong nghiên cứu về ulvan

Sau khi thủy phân bằng các acid nhẹ, các oligosaccharide và các sản phẩm oxy hóa của ulvan được giải phóng, bị biến đổi về mặt tự nhiên và hóa học đã làm nảy sinh ý kiến về sự hiện diện của rhamnose, xylose, glucuronic acid hoặc glucose, tất cả đều có trong cùng một chuỗi Hơn nữa, điều này cũng chỉ ra rằng glucuronic acid có thể xuất hiện ở những nhánh trên phân tử C-2 của rhamnose [43] Thậm chí, thành phần cấu trúc của polysaccharide này có thể phức tạp hơn cả những nhận định trước đó là chịu ảnh hưởng của loài rong, mùa vụ thu hoạch và chế độ bảo quản như thường được mô tả cho

nhiều polysaccharide từ rong biển [70] Thành phần hóa học không đồng nhất của ulvan dẫn đến sự rối loạn về cấu trúc cơ bản của polysaccharide này, gây ra những khó khăn nhất định trong việc nghiên cứu cấu trúc của chúng

Mặc dù cấu trúc không thống nhất nhưng tính ổn định của ulvan lại được tạo nên bởi sự lặp lại của các đơn vị aldobiouronic, chúng được cho là có khả năng hình thành các “vùng nối” (“junction zones”) tạm thời chịu trách nhiệm trong việc hình thành mạng lưới gel yếu của ulvan ở trạng thái tự nhiên [59]

Nhiều đặc điểm và tính chất của ulvan vẫn chưa được rõ ràng trong những điều kiện chiết tách khác nhau, điển hình là tính chất lưu biến và tính kết cấu của chúng Có rất ít các báo cáo về tính chất lưu biến của ulvan được chiết xuất trong những điều kiện riêng biệt Tuy nhiên, gần đây đã có những đánh giá về tác động của các phương pháp chiết tách đối với tính chất hóa học, tính kết cấu và tính lưu biến của các chất chiết xuất

từ Ulva lactuca Các kết quả đã chứng minh rằng phương pháp chiết xuất ảnh hưởng rất

lớn đến tính lưu biến của ulvan.Dịch chiết ulvan thể hiện độ nhớt cao, tuy nhiên độ nhớt

sẽ giảm xuống khi tiến hành cắt mạnh ulvan [81] Hơn nữa, tương tự carrageenan, người

ta quan sát thấy ulvan cũng tạo độ nhớt cho dung dịch khi hòa tan trong nước Nó cũng tạo gel khi có sự hiện diện của ion B+ và Ca2+ ở pH trung tính, bởi một cơ chế chưa rõ ràng; và khả năng tạo gel của chúng phụ thuộc vào sự hiện diện của các cation hóa trị 2 [32, 46]

Năm 1993, Lahaye và Axelos đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH, đệm và hàm lượng ion dương (Ca2+ và B+) đến các đặc tính tạo gel của ulvan được tách chiết bằng nước sôi sau khi xử lý rong với enzyme [45].Theo đó, người ta thấy rằng tính thuận nghịch nhiệt độ (thermal-reversibility) của gel phụ thuộc vào hàm lượng ulvan; sự hình thành gel là một quá trình phụ thuộc vào thời gian và độ nhớt của dung dịch khi có sự hiện diện của ion (pH 7,5) [71] Các nhà nghiên cứu khác cho rằng tính chất lý hoá và

độ lưu biến của ulvan có sự ảnh hưởng khi xử lí Ulva rotundata bằng phương pháp xử

lý thông thường (làm đông, đông khô, sấy với không khí ở nhiệt độ cao, ướp và sấy muối, phơi khô) so với khi tách chiết bằng oxalat natri, sau đó là ly trích bằng nước [71] Nhìn chung, gel ulvan có tính thuận nghịch nhiệt độ và khi nồng độ ion cao hoặc thấp, hay có sự biến đổi pH cũng có thể ảnh hưởng đến cấu trúc ulvan cũng như sự tạo thành gel

Các dạng khác nhau của ulvan khác nhau về độ nhớt nội tại, trọng lượng phân tử

và sự phân bố trọng lượng phân tử Bằng phương pháp xác định khối lượng bằng đồng

vị phóng xạ, người ta ước tính trọng lượng phân tử dao động từ 530 kDa đến 3,6x103

kDa đối với ulvan thu được từ các loài U pertusa, U conglobata và E prolifera Loại

có khối lượng lớn nhất là ulvan chiết xuất từ U conclobata Sự khác nhau về khối lượng

phân tử phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ tách chiết Những ulvan có trọng lượng phân

tử khác nhau có thể thu được bằng cách thay đổi nhiệt độ tách chiết Nhiệt độ cao là điều kiện cần thiết để chiết xuất ulvan có trọng lượng phân tử lớn [43] Tuy nhiên điều này nàylại tỏ ra không hiệu quả khi muốn thu những ulvan có trọng lượng phân tử thấp (28,2-151,7 kDa) Trong trường hợp này, rong sẽ được xử lí với H2O2 [35]

Ulvan còn được xem là chất có mật độ điện tích cao tức khả năng hòa tan trong nước mạnh Tuy nhiên, sự có mặt của một lượng lớn nhóm methyl trong phân tử đường rhamnose cũng làm cho chúng có tính chất kỵ nước nhất định Một nghiên cứu phân tích siêu cấu trúc được tiến hành đã cho thấy rằng, khi ở trong dung dịch, ulvan kết tụ với nhau tạo thành những khối hình cầu Là một polymer phân cực nên nồng độ ion và pH của dung môi ảnh hưởng rất lớn đến tính tan và hình thái của ulvan trong dung dịch, ngay cả loại phản ứng và số lượng phản ứng trong dung dịch cũng góp phần làm kết tụ loại biopolymer này [72] Vì vậy, cần phải hết sức lưu ý đến tính chất phân cực để điều chỉnh điều kiện tách chiết cũng như sử dụng cho phù hợp với những mục đích khác nhau

1.3.3 Phương pháp tách chiết ulvan từ rong lục

Sau khi ulvan được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1913, các nhà nghiên cứu đã phải vật lộn với việc xây dựng quy trình tách chiết cũng như phân tích thành phần cấu trúc của ulvan Quá trình tách chiết ulvan từ rong lục bắt đầu bằng việc lựa chọn, thu thập và định danh nguồn nguyên liệu thô Tiếp đó là bước ổn định và xay rong Thông thường, bước ổn định này sẽ được thực hiện bằng các phương pháp như đông lạnh, sấy khô, ngâm và sấy muối Việc lựa chọn phương pháp ổn định rong cũng có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu nhận sản phẩm [71] Ulvan chủ yếu được tách chiết với nước nóng [49, 61] và có thể được cải tiến bằng việc thêm vào các tác nhân ức chế như canxi [34], dung dịch axit hoặc kiềm [20]

Để thu được ulvan tinh khiết người ta phải tiến hành quá trình tinh chế Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn cùng với việc sử dụng các dung môi hữu cơ, thường là ethanol để loại bỏ các sắc tố, chất béo, các acid amin và peptid còn lẫn trong dịch chiết,

từ đó làm tăng độ tinh khiết của sản phẩm sau tách chiết [24]

Cuối cùng, dịch chiết ulvan được cô đặc trong thiết bị cô quay hoặc sấy bằng phương pháp đông khô hay không khí nóng Việc loại bỏ các tạp chất và làm khô cũng

có thể dẫn đến sự thay đổi cấu hình polysaccharide và tính chất của ulvan [24] Năm

2005, Huimin Q và cộng sự ghi nhận những ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến

sự thoái biến của ulvan Theo nghiên cứu này, nhiệt độ là yếu tố chính ảnh hưởng đến

tỷ lệ đề polymer hóa [35] Bên cạnh đó, việc sử dụng các dung môi khác nhau để chiết xuất ulvan cũng sẽ dẫn đến sự khác nhau về thành phần dư chất có trong dịch chiết, dẫn đến sự khác nhau về một số đặc tính sinh học và hoá lý của chúng [71]

1.3.4 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của ulvan

1.3.4.1 Hoạt tính chống oxi hóa

Ulvan là một polysaccharide sulfate hóa gần đây nổi lên như là một ứng cử viên tiềm năng về hiệu quả, tính không độc cùng với hoạt tính chống oxi hóa mạnh Chúng hoạt động bằng việc ức chế và đào thải các gốc tự do Các polysaccharide sulfate hóa

phân lập từ Codium, Caulerpa, Bryopsis, Ulva và Enteromorpha đã được chứng minh

là có nhiều hiệu ứng tiềm năng chống oxy hóa trên mô hình in vitro Những hiệu ứng này bao gồm việc bắt giữ các gốc tự do như superoxide, gốc hydroxyl, DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), khả năng giảm năng lượng bẻ gãy các liên kết tạo các gốc

tự do và khả năng tạo phức chelat với các ion sắt (ngăn phản ứng Fenton tạo các gốc tự do)[24]

Khả năng chống oxy hoá ulvan phụ thuộc rất nhiều vào thành phần và cấu trúc hóa học của chúng [64, 66, 67] Một số yếu tố cấu trúc như trọng lượng phân tử, số lượng gốc sulfate có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động chống oxy hoá của ulvan Một số báo cáo chỉ ra rằng hoạt động chống oxy hoá của các polysaccharide sulfate hóa có thể được tăng cường bằng cách giảm trọng lượng phân tử của chúng [48, 67] bởi vì các polysaccharide có trọng lượng thấp có thể kết hợp vào tế bào và nhường proton hiệu quả hơn so với các polysaccharide có trọng lượng cao [67]

Ảnh hưởng của hàm lượng các nhóm sulfate lên hoạt tính chống oxy hoá của ulvan đang là một vấn đề gây nhiều tranh cãi Năm 2013, Li B và cộng sự [48] đã phân lập

ulvan từ U fasciata với độ sulfate hóa khác nhau và sử dụng chúng để kiểm tra các hoạt

động chống oxy hóa mô hình invitro Kết quả cho thấy ulvan có độ sulfat hóa thấp hơn thể hiện các hoạt tính chống oxi hóa cao hơn Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Wang X

và cộng sự thì lại có kết quả đối lập Theo nghiên cứu này, khi phân lập ulvan từ E linza

và cho chúng phản ứng với axit chlorosulfuric trong formamide để tăng độ sulfate hóa,

họ thấy rằng các polysaccharide có hàm lượng sulfate cao hơn thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ hơn [78] Tương tự, một nghiên cứu khác cũng cho rằng dẫn xuất

sulfate hóa của ulvan từ E linza thể hiện hoạt động mạnh mẽ hơn trong việc bắt giữ các

gốc tự do superoxide, hydroxyl, và DPPH so với các mẫu polysaccharide sulfate hóa tự nhiên [83]

Nhìn chung, tuy còn gây nhiều tranh cãi nhưng ulvan thể hiện là chất chống oxi hóa

tự nhiên có tiềm năng rất lớn trong việc ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do

1.3.4.2 Hoạt tính giảm lipid và chống cao huyết áp

Các polysaccharides sulfate hóa từ rong biển có thể làm giảm lipid và các tính chất

có lợi khác trong mô hình động vật bị béo phì [60, 76] Khi cho chuột ăn với khẩu phần

có hàm lượng cholesterol cao trong 21 ngày, sau đó bổ sung ulvan từ U pertusa vào các

bữa ăn đã làm giảm cholesterol tổng số và LDL-cholesterol nhưng không làm thay đổi đáng kể triglyceride huyết thanh [60] Hiệu quả của ulvan thay đổi khi nó được thủy phân thành phân tử có trọng lượng thấp hơn Dẫn xuất ulvan có trọng lượng phân tử và

độ nhớt nội tại thấp hơn không làm giảm cholesterol huyết thanh nhưng đã làm bình thường hóa chứng tăng triglycerid máu và làm tăng HDL-cholesterol ở động vật Cơ chế

cơ bản của hoạt tính này chưa rõ ràng nhưng dường như nó không liên quan đến sự hấp thụ axit mật vì ulvan và dẫn xuất có trọng lượng phân tử thấp hơn của nó làm tăng bài tiết mật so với mức bình thường [38]

Các dẫn xuất khác của ulvan từ U pertusa, như ulvan acetylate (AUs) và ulvan có

hàm lượng sulfate cao (HUs) cũng được kiểm tra để xác định hoạt tính chống cao huyết

áp của chúng bằng cách theo dõi mức triglixeride (TG) và LDL-cholesterol trong mô hình chuột bị chứng tăng lipid Cả AUs và HUs đều cho thấy hoạt tính chống cao huyết

áp cao hơn so với các ulvan tự nhiên Khi cho chuột ăn HUs ở liều 250 mg/kg có thể

làm giảm đáng kể TG vàLDL-cholesterol xuống lần lượt là 28,1% và 28,4% Như vậy, hàm lượng sulfate và acetylate trong các phân tử ulvan có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động chống cao huyết áp của chúng [63, 65]

1.3.4.3 Hoạt tính chống đông tụ

Về cơ bản, hoạt tính này vẫn chưa hoàn toàn được hiểu rõ Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho rằng có nhiều hơn một cơ chế cho hoạt tính này bao gồm việc tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến thrombin qua việc hoạt hoá các yếu tố ức chế antithrombin

và heparin cofactor II [30, 51, 62]

Theo Mao và cộng sự, ulvan từ U conglobata với hàm lượng rhamnose cao và

35% sulfate este có khả năng kéo dài thời gian đông tụ máu qua việc ức chế trực tiếp thrombin và sự điều hòa của các heparin cofactor II [50] Hayakawa và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính chống đông máu của sulfate polysaccharides từ 23 loài rong Lục phát hiện thấy một polysaccharide sulfate hóa có chứa hàm lượng rhamnose cao được cho là

ulvan từ Monostroma nitidum, có hoạt tính chống đông tụ mạnh hơn so với heparin

chuẩn[33]

1.3.4.4 Hoạt tính điều hòa miễn dịch và kháng u

Hoạt động điều hòa miễn dịch của ulvan có tiềm năng lớn trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch hoặc kiểm soát hoạt động của tế bào miễn dịch để giảm thiểu các phản ứng liên kết gây ra những hiệu ứng tiêu cực, chẳng hạn như viêm Leiro J.M và cộng sự cho rằng ulvans làm tăng biểu hiện của một số tín hiệu chemokine, interleukin (IL) -6 và thụ thể IL-12 β-1 lên gấp hai lần Hiệu ứng này giảm đáng kể sau khi ulvan trải qua phản ứng khử gốc sulfate Điều đó cho thấy, các nhóm sulfate là yếu tố cần thiết cho khả năng kích thích miễn dịch của các phân tử này [47] Hoạt tính kích thích miễn dịch và khả năng kích thích đại thực bào của ulvan cũng đã được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới công bố [68, 74]

Các polysaccharide sunfate hóa như ulvan có thể giảm thiểu sự tiến triển khối u và

di căn Kaeffer và cộng sự (1999) đã chứng minh rằng ulvan có trọng lượng thấp từ U lactuca và dẫn xuất khử gốc sulfate của nó có khả năng chống ung thư vì chúng có thể

ức chế sự gia tăng tế bào Caco-2 gây ung thư mà không gây ảnh hưởng đến các tế bào bình thường [39]

Shao và cộng sự khẳng định rằng các polysaccharide sulfate hóa từ U fasciata

trong đó có ulvan, là chất chống oxy hóa tuyệt vời và có hoạt tính kháng u đáng kể Chúng có thể ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày MKN45 trong các thử nghiệm in vitro [73] Năm 2014, Osama R.A và Rasha R.A đã đánh giá hiệu quả của ulvan lên các dòng tế bào ung thư gan (HepG2) và ung thư ruột kết (HCT116)được cấy ghépở chuột Kết quả là ulvan ức chế sự tăng sinh và gây ra các phản ứng gây độc các dòng tế bào ung thư HepG2, HCT116 Đánh giá này đã được thử nghiệm trên cả mô hình invitro và invivo [58]

1.2.4.5 Kháng virus

Hoạt tính kháng virus của ulvan cũng được khá nhiều nhà khoa học quan tâm Ivanova và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng virus invitro chống lại một số virus cúm người và cúm gia cầm Họ cho rằng ulvan được phân lập từ rong Lục có tác dụng

ức chế tốt đối với virus cúm A, tác dụng ức chế này phụ thuộc vào liều và tính đặc hiệu của chủng [37] Ulvan cũng đã được chứng minh là có hoạt tính kháng mạnh và đặc hiệu đối virus HPV (herpes simplex virus) [22]

Hoạt tính kháng virus của ulvan được nghiên cứu bởi Aguilar-Briseño và cộng sự (2015) Ở nồng độ ức chế IC50 là 0,1μg/mL, ulvan ức chế sự kết hợp giữa các tế bào (cell-cell) trong quá trình nguyên bào, và hiệu quả của nó còn tốt hơn so với fucoidan

đã được nghiên cứu trước đó Gần đây, ulvan được xem là nguồn hợp chất tự nhiên có tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm kháng virus

1.3.4.5 Các ứng dụng của ulvan

Là một polymer phân cực, ulvan có thể hình thành các tương tác ion với cation, theo cách này có thể tương tác với thuốc hoặc polymer khác để tạo thành các dạng phức hợp khác nhau Khả năng này đã được ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học [14, 23]

Ulvan đã được ứng dụng trong trao đổi ion [40] và trong kĩ thuật mô [25] Năm

2012, Alves A và cộng sự đã sử dụng ulvan trong sản xuất hydrogel ứng dụng trong kĩ thuật giải phóng thuốc không trúng đích Họ cho ulvan liên kết chéo với 1,4-butanediol diglycidy ete để hình thành một cấu trúc 2D và được nạp vào dexamethasone (một loại thuốc mô hình) Giai đoạn đầu, việc giải phóng thuốc khá ổn định (49% trong 8h), sau

đó tốc độ giải phóng thuốc chậm hơn và kéo dài đến 14 ngày [15] Sau đó, nhóm nghiên

cứu này cũng báo cáo về việc chuẩn bị các hạt ulvan kết hợp với hydrogel polylactic acid trong chiến lược về kỹ thuật xương

Mặc dù có nhiều hoạt tính sinh học quý nhưng chính sự phức tạp cũng như cấu trúc hóa học chưa được nghiên cứu rõ ràng là một trở ngại rất lớn để ulvan được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược nói riêng và các lĩnh vực liên quan khác nói chung Các thông tin về việc ứng dụng ulvan được tìm thấy khá ít ỏi và và nếu có thì việc ứng dụng chúng vẫn chưa phổ biến Điều này vừa là thách thức và cũng là động lực để các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm nghiên cứu về loại polysaccharide có nhiều hoạt tính thú vị này

1.4 ULVAN LYASE

1.4.1 Giới thiệu chung về enzyme

1.4.1.1 Cấu tạo của enzyme

Hầu hết các enzyme đều có bản chất là protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học, là các chất xúc tác sinh học Đến nay các nhà khoa học đã biết và phân loại được 3500 enzyme có bản chất là protein Phần lớn các enzyme có dạng hạt,

có khối lượng phân tử lớn trong khoảng từ 20000-90000 cho đến vài trăm nghìn Dalton, một số có khối lượng phân tử lên đến một triệu hoặc hơn.Chúng được cấu tạo từ các L-α-amino acid kết hợp với nhau thông qua liên kết peptide

Về cấu tạo, enzyme bao gồm 2 nhóm chính: nhóm enzyme một thành phần và enzyme 2 thành phần Enzyme một thành phần là enzyme mà trong thành phần phân tử chỉ có protein Enzyme 2 thành phần ngoài protein ra, trong cấu tạo còn có các thành phần “phi protein” Các phần “phi protein” này có thể là các co-enzyme hoặc các nhóm ngoại Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme được quyết định bởi phần có bản chất protein, còn phần “phi protein” quyết định kiểu phản ứng của enzyme

1.4.1.2 Trung tâm hoạt động của enzyme

Bản chất hóa học của hầu hết enzyme là protein, do đó cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử có vai trò quan trọng đối với hoạt tính của enzyme Tuy nhiên, có một phần nhỏ của phân tử enzyme chứa các nhóm chức trực tiếp kết hợp với cơ chất, tham gia vào quá trình hình thành, cắt đứt các liên kết… để tạo thành sản phẩm phản ứng, gọi

là trung tâm hoạt động (TTHĐ) của enzyme

TTHĐ của enzyme chỉ chiếm một tỉ lệ thể tích tương đối nhỏ trong phân tử enzyme.Chúng bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau của amino acid, phân tử nước liên tiếp và trong nhiều trường hợp còn có các ion kim loại, các nhóm chức của coenzyme TTHĐ có cấu trúc không gian xác định được giữ vững nhờ mạng liên kết hydro, tuy nhiên mạng lưới hydro này cũng đủ linh động để có thể dễ dàng thay đổi cấu tạo của nó khi tương tác với cơ chất cũng như các chất khác

Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa TTHĐ và cơ chất được hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất Theo quan niệm trước đây (Emi Fisher, 1890) thì TTHĐ của enzyme vốn có cấu trúc không gian tương ứng với cấu trúc phân tử cơ chất cũng giống như tương ứng giữa ổ khóa và chìa khóa Quan niệm này đã nêu được một hình ảnh khá rõ ràng về sự tương ứng hình thể giữa enzyme và cơ chất đã được thừa nhận trong một thời gian dài Tuy nhiên, hiện nay đã có nhiều dẫn liệu thực nghiệm chứng minh cấu trúc không gian của enzyme cũng như protein không cứng nhắc mà mềm dẻo, linh động Theo quan niệm hiện nay, khi enzyme tương tác với cơ chất, các nhóm chức ở trong phần TTHĐ của phân tử enzyme sẽ thay đổi vị trí trong không gian, tạo thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất, gọi là sự khớp cảm ứng

1.4.1.3 Tính đặc hiệu của enzyme

Tính đặc hiệu cao của enzyme là một trong những sai khác chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo kiểu phản ứng nhất định Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme bao gồm đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ chất Đặc hiệu kiểu phản ứng thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một trong các kiiểu phản ứng chuyển hóa một chất nhất định Mức độ đặc hiệu cơ chất của enzyme không giống nhau, nên người ta thường phân biệt thành các mức như sau:

- Đặc hiệu tuyệt đối: enzyme chỉ tác dụng lên một chất nhất định và hầu như không có tác dụng với một chất nào khác

- Đặc hiệu nhóm tuyệt đối: các enzyme này chỉ tác dụng lên những chất có cùng kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử ở gần liên kết chịu tác dụng

- Đặc hiệu nhóm tương đối: mức độ đặc hiệu kém hơn nhóm trên ở chỗ enzyme không có những đòi hỏi gì nghiêm ngặt đối với nhóm ở gần liên kết bị phân giải

Phần lớn các enzyme đều có tính đặc hiệu lập thể nghĩa là enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian (D hoặc L) của các chất

1.4.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme [7]

a Nồng độ enzyme

Nói chung, trong điều kiện thếu cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme : v = k [E]

Trong đó: v là vận tốc phản ứng, [E] là nồng độ enzyme

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

b Nồng độ cơ chất

Nồng độ cơ chất cũng có liên quan trực tiếp đến hoạt tính xúc tác của enzyme và tuân theo mô hình Michaelis-Menten năm 1993

Hình 1.3: Phương trình Michaelis- Menten

Với [S] là nồng độ cơ chất, vmax là tốc độ phản ứng cực đại, v là tốc độ phản ứng của phản ứng, Km là hằng số Michaelis- Menten mà tại đó v= ½ vmax

Theo phương trình trên, sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng v vào nồng độ cơ chất [S] sẽ xảy ra theo 3 trường hợp:

- Nếu [S] << Km , v= [S]/Km : ởnồngđộ cơ chất thấp, v phụ thuộc tuyến tính vào [S]

- Nếu [S] >> Km , v = vmax : khi nồng độ cơ chất quá lớn, tốc độ phản ứng đạt cực đại Nếu [S] đã đủ lớn đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], v cũng không tăng theo

- Nếu [S] = Km , v= ½ vmax : tốc độ phản ứng bằng một nữa tốc độ cực đại

Ở một số trường hợp, khi nồng độ cơ chất quá cao chẳng những không làm tăng tốc độ phản ứng mà ngược lại, điều này có thể ức chế phản ứng sảy ra Chính vì vậy cần phải tính toán nồng độ cơ chất hợp lí cho từng phản ứng để đảm bảo tốc độ phản ứng đạt tối ưu và mà vẫn không lãng phí nguồn cơ chất

c Nhiệt độ

Khi tăng nhiệt độ, tốc độ của phản ứng enzyme-cơ chất tăng do tốc độ va chạm giữa chúng tăng Tuy nhiên, tốc độ phản ứng này chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn xác định mà ở đó enzyme vẫn còn bền và chưa bị biến tính

Đa số enzyme có nhiệt độ phản ứng xúc tác tối ưu nằm trong khoảng 37-45oC [2] Tuy nhiên cũng có những thay đổi tùy vào cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng… Nhiệt độ enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn, thường vào khoảng trên 60-70oC Khi đã bị biến tính thì enzyme ít có khả năng phục hồi là hoạt độ Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0oC, hoạt độ enzyme có thể bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường

d Độ pH

pH ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt độ enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ tích điện của enzyme, độ ion hóa cơ chất, và ảnh hưởng đến độ bền của protein enzyme Độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có cơ chất, coenzyme, Ca2+. Giá trị pH optimum là giá trị pH tại đó enzyme hoạt động tốt nhất Giá trị này thường khác nhau ở mỗi nhóm enzyme khác nhau Đối với nhóm enzyme có nguồn gốc từ sinh vật biển, pH optimum thường dao động trong khoảng từ 5-7 [2]

e Các chất kìm hãm

Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất có bản chất hóa học khác nhau Các chất này có thể là những anion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả các protein Các chất gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu enzyme Nhiều chất khác không làm biến tính protein nhưng vẫn làm giảm hoạt độ xúc

tác của nó theo cơ chế khác Có hai loại chất kìm hãm là kìm hãm cạnh tranh và kìm

hãm không cạnh tranh

Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu

trúc tương tự với cấu trúc của cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt

động của enzyme chiếm chỗ kết hợp của cơ chất

Các chất kìm hãm không cạnh tranh: các chất này kết hợp với enzyme ở chỗ khác

với trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, do đó

làm giảm tốc độ phản ứng xúc tác

f Các chất kích hoạt

Các chất kích hoạt làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme thường có bản chất hóa

học khác nhau, có thể là các anion, cation hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp hơn

Các chất này kết hợp với các trung tâm dị lập thể làm biến đổi cấu hình không gian của

trung tâm hoạt động theo hướng có lợi cho việc liên kết cơ chất Ngoài ra các chất này

cũng làm tăng hoạt độ enzyme bằng việc loại trừ các chất ức chế và làm tăng sự hình

thành phức enzyme-cơ chất, từ đó làm tăng hoạt tính enzyme.

3.1.2 Tình hình nghiên cứu về ulvan lyase trên thế giới

Ulvan lyase là loại enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết giữa 3-sulfated

rhamnose và D-glucuronic acid (hoặc L-iduronic acid) trong phân tử ulvan Trong phân

loại enzyme, ulvan lyase thuộc họ 14, thuộc nhóm polysaccharide lyase [80], tức là chỉ xúc tác các phản ứng thủy phân polysacccharide trong kiều kiện có H2O

Chúngđóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa thức ăn ở các loài mà nguồn

thức ăn chính là rong biển Loại enzyme này được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của các

loài sinh vật biển như: động vật thân mềm, vi khuẩn và gần đây chúng còn được tìm

thấy trong một số loài nấm biển Năm 2011, thành viên đầu tiên của họ enzyme ulvan

lyase là ulvan lysae tách chiết từ vi khuẩn biển Flavobacteria Persicivirga ulvanivorans

được báo cáo bởi Nyvall Collen P và cộng sự Kết quả nghiên cứu cho thấy, ulvan lysae

tách chiết từ loài vi khuẩn này thuộc nhóm endo (cắt nội mạch phân tử) và cắt liên kết

glycosidic giữa rhamnose sulfate và axit glucuronic hoặc iduronic [56] tạo thành các

oligosaccharide có giá trị về mặt trị liệu [31, 47, 48, 50, 73, 75]

Nằm cùng nhóm với ulvan lyase là các enzyme thủy phân các polysaccharide có nguồn gốc sinh vật biển như alginate lyase, polymanuronic lyase, rhamnogalactoronan lyase, Các loại enzyme này gần đây được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới đặc biệt quan tâm thể hiện qua các công bố nghiên cứu về chúng ngày càng nhiều [36,

54, 79].Tuy nhiên, thông tin về ulvan lyase lại khá hiếm hoi, phần lớn các nghiên cứu chỉ tập trung vào cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của ulvan Nếu có, chủ yếu là các nghiên cứu về ulvan lyase có nguồn gốc vi sinh vật mà chưa hề có một công trình nào đề cập đến ulvan lyase tách chiết từ động vật biển- nguồn tách chiết enzyme rất tiềm năng

Ngày nay, nhu cầu về việc sử dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên

là rất lớn Ulvan là một polysaccharide từ rong biển có nhiều hoạt tính sinh học quý và tiềm năng ứng dụng lớn trong y dược Tuy nhiên, để một chất có thể được ứng dụng trong y dược thì cấu trúc phân tử phải sáng tỏ là điều kiện tiên quyết Chính vì vậy, việc nghiên cứu về loại enzyme có khả năng phân cắt mạch phân tử ulvan là rất cần thiết Việc tìm ra những loại enzyme mới sẽ góp phần làm sáng tỏ cấu trúc phân tử ulvan; đồng thời ứng dụng enzyme cắt nhỏ phân tử ulvan thành các đoạn mạch ngắn để cấu trúc phân tử bớt cồng kềnh, độ nhớt giảm, tăng khả năng hấp thụ vào tế bào động vật

mà vẫn bảo toàn được các hoạt tính sinh học của ulvan và an toàn hơn so với các phương pháp khác

Là một loại enzym hoàn toàn mới nhưng ulvan lyase tách chiết từ động vật thân mềm biển cũng nằm trong nhóm các chất xúc tác sinh học biển Chính bởi trong môi trường sống khắc nghiệt về ánh sáng, độ mặn, nhiệt độ, áp lực … mà các chất xúc tác phân lập từ môi trường biển cũng chứa đựng nhiều đặc tính thú vị mà các hợp chất trên cạn không có được Tuy có nguồn gốc từ các loài sinh vật biển khác nhau nhưng do đều xuất xứ từ môi trường biển nên hầu hết chúng đều mang những đặc điểm chung nhất định Ulvan lyase cũng là một chất xúc tác sinh học biển nên chúng cũng sẽ mang một

số đặc tính chung của các loại enzyme nằm trong nhóm này như chịu mặn, chịu lạnh, chịu áp lực cao, độ bền nhiệt cao, tính mới về cấu trúc hóa học [2]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm trong đề tài này được tiến hành tại phòng Công nghệ sinh học biển, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang Dưới đây là những thiết bị, hóa

chất cần có và các phương pháp nghiên cứu được sử dụng

2.1.1 Hóa chất, thiết bị cơ bản

Bảng 2.1: Thống kê hóa chất và thiết bị cơ bản trong nghiên cứu

Tên hoá chất Xuất sứ Thiết bị và dụng cụ Xuất sứ

Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc

Nhựa sắc ký Sephadex 25

G-Cột sắc ký G-25 Dụng cụ thủy tinh Màng thẩm tách cellophane Pipet tự động

Máy votex Cân kĩ thuật Máy li tâm Máy đo OD

Tủ ấm 37oC

Tủ lạnh 4oC

Tủ đông Máy khuấy từ

Mỹ Đức Trung Quốc Nhật Nhật Nhật Nhật Nhật Nhật Nhật Nhật Nhật Nhật

2.1.2 Cơ chất ulvan từ rong Ulva lactuca

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cơ chất ulvan dạng bột từ rong Ulva

lactuca được cung cấp bởi viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang

Phân loại học Ulva lactuca:

Loài : Ulva lactuca

Hình 2.1: Rong Ulva lactuca

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Động vật thân mềm biển sử dụng rong biển và một vài sinh vật biển khác làm

nguồn thức ăn chính Vì vậy, bộ phận tiêu hóa của nhóm đối tượng này chắc chắn là

nguồn dồi dào các enzyme có khả năng thủy phân polysaccharide từ rong biển nói

chung và ulvan nói riêng Do đó, chúng tôi chọn động vật thân mềm biển bao gồm

lớp Chân bụng Gastropoda và lớp hai mảnh vỏ Bivalvia để làm đối tượng cho nghiên

cứu này

15 mẫu động vật thân mềm biển Mollusca gồm 11 mẫu thuộc lớp Hai mảnh vỏ

Bivalvia và 4 mẫu thuộc lớp Chân bụng Gastropoda đã được thu thập tại vùng biển Nha

Trang, tỉnh Khánh Hòa Mẫu thu được xử lí sơ bộ, phân loại và bảo quản lạnh (4oC)

nhanh chóng đem về phòng thí ngiệm Các mẫu được định danh khoa học trước khi thu

nhận bộ phận tiêu hóa (gan tụy) và bảo quản ở -20oC cho đến khi tiến hành tách chiết

enzyme và khảo sát khả năng thủy phân ulvan từ rong Ulva lactuca

Trong số 15 mẫu động vật thân mềm biển sau khi được sàng lọc hoạt tính ulvan

lyase, chúng tôi đã chọn đối tượng vọp Geloina coaxans để tách chiết, thu nhận và khảo

sát đặc tính xúc tác của enzyme

Phân loại học vọp Geloina coaxans:

2.2 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT

Dựa vào các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme có nguồn gốc từ động vật không xương biển[1, 2], chúng tôi xây dựng quy trình nghiên cứu như sau:

Hình 2.3: Quy trình nghiên cứu tổng quát

Thu mẫu

Xử lý mẫu, thu dịch chiết enzyme

Khảo sát hoạt tính ulvan lyase bằng phương pháp Nelson Somogyi cải tiến, 1989 Xác định hàm lượng protein tổng số

Chọn lọc đối tượng có hoạt tính thủy phân

ulvan mạnh

Khảo sát các đặc tính xúc tác của enzyme

thủy phân

Ảnh hưởng của cation kim loại

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tách chiết enzyme từ động vật thân mềm biển

Dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu có liên quan [1, 2], trong nghiên cứu này,

chúng tôi sử dụng phương pháp nghiền cơ học các mẫu nghiên cứu (gan tụy) trong

cối chày sứ và chiết xuất enzyme trong dung dịch succinate 0,025 M, pH 5,2, cụ thể

như sau:

Hình 2.4: Phương pháp tách chiết enzyme từ động vật thân mềm biển

Nghiền và đồng nhất trong đệm succinate tỉ lệ 1:3 (w/v) ở 4oC/1h

Tách chiết bộ phận tiêu hóa

(gan tụy)

Ly tâm 9000 rpm/4oC trong

20 phút

Thu phần dịch nổi đã loại lipid

Sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-25 Thu mẫu và định danh

Thu enzyme, xác định protein và thử hoạt tính thủy phân ulvan

2.3.2 Phương pháp sắc ký lọc gel

Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein Sắc ký lọc gel còn được gọi là phương pháp dùng chất rây phân tử, lọc gel (gel filtration) Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp

để tách chúng ra Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc kí lọc gel nhằm tinh sạch sơ bộ, thu các phân đoạn enzyme có hoạt tính để thử hoạt tính thủy phân ulvan lyase ở bước sàng lọc đối tượng

Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrofil)

Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên Sephadex là chế phẩm dextran do

các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môi

trường chứa saccharose

Phương pháp lọc rây phân tử được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định Sau đó cho dung dịch protein enzyme lên cột Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này

là protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột (Hình 2.5) Vì vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có trọng lượng phân tử nhỏ Người ta còn sử dụng sephadex để loại muối thay cho quá trình thẩm tích Và hơn thế nữa, trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme

Hình 2.5: Sơ đồ của sắc ký lọc gel

2.3.3 Phương pháp kết tủa protein bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4

Độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước Sự tương tác đó sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ hoặc muối trung tính Người ta có thể dùng muối (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4, … để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng Trong nghiên cứu này, chúng tôi kết tủa protein enzyme bằng cách sử dụng muối (NH4)2SO4 vì đây là loại muối chẳng những không làm hại mà mặt khác còn làm ổn