Nghiên cứu thành phần loài cua ghẹ sống tầng đáy ở khánh hòa và phú yên dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

Nghiên cứu hiện tại dựa trên phương pháp phân loại về hình thái và di truyền để phân loại một số loài cua ghẹ sống đáy phân bố ở hai khu vực Khánh Hòa và Phú Yên.. Xuất phát từ những vấn

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

Khánh Hòa: 06/2017

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp tại Trường Đại Học Nha Trang, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ tận tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè Nhân đây tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình, người đã định hướng cũng như tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến thấy cô giáo thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại Học Nha Trang, những người đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập của những năm vừa qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và các anh chị trong Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử đã quan tâm, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 06 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Trúc Sơn

TÓM TẮT

Khánh Hòa và Phú Yên nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa chịu ảnh hưởng của khí hậu đại dương, có đường bờ biển dài và là nơi có nhiều vũng vịnh, đầm phá và nhiều đảo lớn nhỏ Đồng thời, hai khu vực đa dạng hệ sinh thái như rạn san hô, rừng ngập mặn, đầm phá, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loài sinh vật, đặc biệt là các loài cua ghẹ sống tầng đáy Tuy nhiên, hiện nay tình trạng khai thác thủy hải sản một cách quá mức và thực trạng ô nhiễm môi trường cùng với biến đổi khí hậu

đã làm suy giảm đa dạng sinh học các loài sinh vật sống đáy nói chung và các loài cua ghẹ nói riêng

Nghiên cứu hiện tại dựa trên phương pháp phân loại về hình thái và di truyền để phân loại một số loài cua ghẹ sống đáy phân bố ở hai khu vực Khánh Hòa và Phú Yên Nghiên cứu phân loại được 23 loài thuộc 16 giống và 12 họ, trong đó có 14 loài phân loại cả hình thái và di truyền, 9 loài chỉ phân loại bằng hình thái Trong số các họ mà nghiên cứu ghi nhận được thì đa dạng nhất là họ Portunidae – 7 loài, tiếp đến là họ Xanthidae – 3 loài Họ Calappidae, Euryplacidae và Gonephacidae mỗi họ có 2 loài Các họ còn lại đều chỉ có 1 loài gồm Galenidae, Dorippidae, Grapsidae, Leucosiidae, Macrophthalmidae, Carpiliidae và Gecarcinucidae

Trình tự gen CO1 mtDNA được sử dụng kết hợp với một số trình tự trên Genbank

để xây dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp Nieghbor – Joining với giá trị bootstrap (BT) 1000 lần Cây phát sinh loài cho thấy sự phân tách di truyền của 7 họ cua

ghẹ được phân thành 2 nhóm chính: nhóm I (Xanthidae, Carpiliidae, Gecarcinucidae, Portunuidae) và nhóm II (Calappidae, Macrophthalmidae và Grapsidae) Trong đó, nhóm I phân thành 2 nhóm phụ gồm nhóm I.1 (Xanthidae, Carpiliidae, Gecarcinucidae)

và nhóm I.2 (Portunuidae) Nhóm II chia thành 2 nhóm gồm nhóm II.1 (Calappidae)

và nhóm II.2 (Macrophthalmidae và Grapsidae)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

DANH MỤC HÌNH v

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu 3

1.1.1 Vị trí địa lý, khí hậu và tài nguyên thiên nhiên của Khánh Hòa 3

1.1.2 Vị trí địa lý, khí hậu và tài nguyên thiên nhiên của Phú Yên 5

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng các loài cua ghẹ ở trong nước và thế giới 6

1.3 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong nghiên cứu đa dạng sinh học cua ghẹ 10

1.3.1 DNA ty thể và nghiên cứu di truyền 10

1.3.2 Ứng dụng kĩ thuật di truyền mã vạch (DNA barcoding) trong nghiên cứu đa dạng sinh học cua ghẹ 12

1.3.3 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh loài ở cua ghẹ 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3 Phân loại dựa vào hình thái 17

2.4 Nghiên cứu di truyền cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên 18

2.4.1 Tách chiết DNA, khuếch đại DNA bằng kĩ thuật PCR và giải trình tự 18

2.4.2 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Phân loại về hình thái 24

3.1.1 Thành phần các loài cua ghẹ thu được tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên 24

3.1.2 Bản đồ phân bố các loài cua ghẹ trong nghiên cứu hiện tại 26

3.1.3 Đặc điểm hình thái các loài cua ghẹ thu tại Khánh Hòa và Phú Yên 27

3.2 Nghiên cứu di truyền các loài cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên 49

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 49

3.2.2 Khuếch đại, giải trình tự DNA các loài cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên 49 3.2.3 So sánh sự khác biệt trình tự giữa các loài cua ghẹ nghiên cứu 50

3.2.4 So sánh sự tương đồng trình tự với Genbank 52

3.2.5 Xây dựng cây phát sinh loài cua ghẹ tại Khánh Hòa và Phú Yên 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bản đồ tỉnh Khánh Hòa 4

Hình 1.2 Bản đồ tỉnh Phú Yên 5

Hình 1.3 DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA và 13 vùng mã hóa protein Mũi tên màu vàng chỉ vùng gen CO1 mtDNA được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại 10

Hình 2.1 Các chỉ số đo trong phân loại cua ghẹ 17

Hình 2.2 Các chỉ tiêu đếm trong phân loại cua ghẹ 18

Hình 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR của cặp mồi LCO 1490/HCO 2198 20

Hình 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR của cặp mồi CF20/CR19 20

Hình 3.1 Bản đồ phân bố các loài cua ghẹ trong nghiên cứu hiện tại 26

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái loài Charybdis natator 28

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái loài Charybdis acutifrons 29

Hình 3.4 Đặc điểm hình thái loài Charybdis anisodon 30

Hình 3.5 Đặc điểm hình thái loài Charybdis vadorum 31

Hình 3.6 Đặc điểm hình thái loài Portunus gladiator 32

Hình 3.7 Đặc điểm hình thái loài Podophthalmus vigil 33

Hình 3.8 Đặc điểm hình thái loài Thalamita crenata 34

Hình 3.9 Đặc điểm hình thái loài Atergatis floridus 36

Hình 3.10 Đặc điểm hình thái loài Atergatis integerrimus 37

Hình 3.11 Đặc điểm hình thái loài Liagore rubromaculata 38

Hình 3.12 Đặc điểm hình thái loài Calappa pustulosa 39

Hình 3.13 Đặc điểm hình thái loài Calappa lophos 40

Hình 3.14 Đặc điểm hình thái loài Eucrate alcocki 41

Hình 3.15 Đặc điểm hình thái loài Eucrate crenata 42

Hình 3.16 Đặc điểm hình thái loài Carcinoplax longimanus 43

Hình 3.17 Đặc điểm hình thái loài Carcinoplax purpurea 44

Hình 3.18 Kết quả điện di DNA tổng số của một số loài cua ghẹ 49

Hình 3.19 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA của một số loài cua ghẹ 49

Hình 3.20 Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor – Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trên gen CO1 mtDNA của các loài cua ghẹ thu tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên 54

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 19

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 19

Bảng 2.3 Trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cua ghẹ 22

Bảng 3.1 Danh sách các loài cua ghẹ thu tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên 24

Bảng 3.2 Chỉ tiêu hình thái các loài cua ghẹ ở tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên 27

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái của 7 loài cua ghẹ tại Khánh Hòa và Phú Yên thuộc 7 giống và 7 họ 46

Bảng 3.4 Sự khác biệt về trình tự CO1 mtDNA của 14 loài cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên 51

Bảng 3.5 Kết quả độ tương đồng của các trình tự CO1 mtDNA từ 14 loài cua ghẹ thu ở tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên với dữ liệu từ Genbank 52

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

mtDNA Mitochondrial deoxyribonucleic acid

rbcL Ribulose bisphosphate carboxylase large chain

MỞ ĐẦU

Đa dạng sinh học đang tồn tại hiện nay trên thế giới là kết quả của một quá trình lịch sử tiến hóa lâu dài với nhiều bước biến đổi, phát sinh, phát triển rồi tuyệt chủng (Đặng Ngọc Thanh và Nguyễn Huy Yết, 2009) Do các tác nhân của tự nhiên và gần đây là sự tác động của con người làm cho đa dạng sinh học đang bị suy thoái với tốc độ rất nhanh, các nguồn gen hoang dã cũng đang trên đà suy thoái nhanh và bị suy giảm mạnh (Nguyễn Minh Quang và ctv, 2011; Schmidt và ctv, 2012)

Việt Nam có tổng diện tích vùng biển rộng hơn 1 triệu km2 và đường bờ biển dài 3.260 km2, trải dài trên 15 vĩ độ và nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á Vị trí địa lý cũng như những đặc trưng về khí hậu, lịch sử phát triển địa chất, thủy lý hóa học của nước biển đã tạo nơi đây một môi trường sống riêng, liên quan chặt chẽ với đời sống sinh vật cũng như tính đa dạng sinh học trong vùng biển này (Lê Đức Tố và ctv, 2009) Vì vậy Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học biển phong phú

Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện có khoảng trên 11 nghìn loài sinh vật sống trong vùng biển Việt Nam, trong đó có 692 loài thực vật phù du, 657 loài động vật phù, khoảng 2.109 loài cá với trên 100 loài cá kinh tế, 653 loài rong biển, 14 loài cỏ biển, 21 loài bò sát biển, 21 loài thú biển (Nguyễn Văn Chung và ctv, 2009) Các loài động vật đáy đã biết khoảng 6.000 loài, trong đó động vật thân mềm – 2.500 loài, giun nhiều tơ – 700 loài, ruột khoang – 650 loài, da gai – 350 loài, hải miên – 150 loài, giáp xác –

1500 loài với nhiều loài cua ghẹ có giá trị kinh tế (Lê Đức Tố và ctv, 2009) Ngoài ra, với số lượng loài đã biết, các nhà khoa học trong và ngoài nước đánh giá biển Việt Nam

là một trong những trung tâm đa dạng sinh vật biển thế giới

Khánh Hòa và Phú Yên là hai tỉnh có vị trí địa lý nằm kề nhau có khí hậu nhiệt đới gió mùa chịu ảnh hưởng của khí hậu đại dương, có hệ sinh thái biển rất đa dạng, phong phú bậc nhất Việt Nam với nhiều loài sinh vật có giá trị kinh tế Trong đó, nhiều loài cua, ghẹ ở khu vực Khánh Hòa và Phú Yên là một trong những nguồn lợi hải sản có mức độ phong phú, đa dạng về thành phần loài, có giá trị về thực phẩm và kinh tế cao Tuy nhiên, các nghiên cứu đa dạng về giáp xác nói chung và các loài cua ghẹ còn mang tính chất riêng lẻ, chưa thống nhất Chủ yếu là các nghiên cứu của Võ Sĩ Tuấn và ctv (2005); Nguyễn Văn Long và ctv (2014); Phan Thị Kim Hồng và ctv (2014); Hoàng Đình Trung và Nguyễn Hữu Nhật (2016) Những nghiên cứu này chỉ mang tính chất

khảo sát và đánh giá về mặt hình thái, chưa đi sâu vào các nghiên cứu phân loại dựa trên lĩnh vực sinh học phân tử

Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác động đến động vật, thực vật của các quốc gia là khác nhau, sự xác định loài sử dụng phương pháp nhanh là cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vực này nhằm bảo vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp Hiện nay, phương pháp sử dụng mã vạch DNA là một trong những công cụ phục vụ định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách

sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là DNA – barcoding (Hebert và ctv, 2003; Rougerie và ctv, 2009)

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu thành phần loài cua ghẹ sống tầng đáy ở Khánh Hòa và Phú Yên dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền” được

thực hiện nhằm bước đầu xây dựng mối quan hệ loài, cung cấp dẫn liệu về hình thái, phân bố và di truyền của một số loài cua ghẹ ở hai khu vực này, làm cơ sở cho các nghiên cứu đánh giá đa dạng sinh học bằng việc xây dựng mã vạch DNA

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những thông tin khoa học liên quan đến mối quan hệ phát sinh loài và đa dạng di truyền của các loài cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

Các loài cua ghẹ sống đáy thu được ở tỉnh Phú Yên và khu vực tỉnh Khánh Hòa dựa trên phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên Sau đó, mẫu được phân loại bằng hình thái ngay khi còn tươi, các nghiên cứu di truyền được thực hiện tại phòng thí nghiệm trường Đại học Nha Trang

Mục tiêu của đề tài:

Phân loại các loài cua ghẹ thu được tại khu vực Khánh Hòa và Phú Yên dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền Xây dựng cây phát sinh loài của một số loài cua ghẹ

sống tầng đáy ở Khánh Hòa và Phú Yên

Để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu này, đề tài tiến hành các nội dung sau:

1 Thu mẫu các loài cua ghẹ sống tầng đáy tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên

2 Phân loại, định danh các loài cua ghẹ thu được dựa vào đặc điểm hình thái và

di truyền

3 Khảo sát mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cua ghẹ sống tầng đáy

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu

1.1.1 Vị trí địa lý, khí hậu và tài nguyên thiên nhiên của Khánh Hòa

 Vị trí địa lý

Khánh Hòa nằm ở vùng duyên hải Nam Trung Bộ của Việt Nam, phía Bắc giáp tỉnh Phú Yên, phía Nam giáp tỉnh Ninh Thuận, phía Tây giáp tỉnh Đăk Lăk và phía Tây Nam giáp tỉnh Lâm Đồng, phía đông giáp Biển Đông

Khánh Hòa có diện tích tự nhiên là 5.197 km2, phần đất liền của tỉnh nằm kéo dài

từ tọa độ địa lý 12052’15” đến 11042’52” vĩ độ Bắc và từ 108040’33” đến 109027’55” kinh độ Đông, có đường bờ biển dài khoảng 385 km với nhiều kênh lạch, đầm, vịnh, cùng khoảng 200 hòn đảo lớn nhỏ ven bờ và các đảo san hô của vùng đảo Trường Sa (Giang Nam và Nguyễn Văn Khánh, 2003) Các vũng vịnh và đầm phá phân bố liên tục

và dọc theo đường bờ biển của Khánh Hòa: Vũng Rô – Đại Lãnh, vũng Bến Gỏi – vịnh

Vân Phong, vịnh Bình Cang, đầm Nha Phu và đầm Thủy Triều - vịnh Cam Ranh

Hình 1.1 Bản đồ tỉnh Khánh Hòa (Nguồn: http://www.chinhphu.vn – Cập nhật

ngày 10/05/2017)

 Tài nguyên thiên nhiên

So với các tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ, tỉnh Khánh Hòa được thiên nhiên ưu đãi với khí hậu thuận lợi, địa hình và chất đáy bờ biển khá đa dạng với nhiều đầm, vịnh và các đảo tạo những điều kiện thuận lợi cho sự hình thành các hệ sinh thái như hệ sinh thái rạn san hô, thảm cỏ biển, rừng ngập mặn, cửa sông, đầm vịnh

Khánh Hòa được xếp vào các vùng ven biển có độ đa dạng sinh học cao nhất ở Việt Nam bao gồm vịnh Nha Trang với 12 hòn đảo lớn nhỏ và mặt nước xung quanh, vịnh Vân Phong, vịnh Cam Ranh và nhiều đảo lớn nhỏ khác Theo điều tra ban đầu, ở khu vực vịnh Nha Trang có 350 loài san hô, 222 loài cá rạn, 69 loài động vật giáp xác, 106 loài động vật thân mềm, 252 loài rong biển, 7 loài cỏ biển và 27 loài da gai (Võ Sĩ Tuấn

và ctv, 2005) Còn ở khu vực vịnh Vân Phong đã ghi nhận được 294 loài san hô tạo rạn,

267 loài cá, 68 loài giáp xác, 169 loài thân mềm, 37 loài da gai và 162 loài giun nhiều

tơ, trong đó cá và nhiều loài giáp xác có giá trị và nguồn lợi thủy sản cao (Nguyễn Văn Long và ctv, 2014)

Trong những năm gần đây sức ép của sự tăng nhanh dân số, phát triển kinh tế xã hội, quá trình khai thác như đánh bắt quá mức, đánh bắt bằng thuốc nổ và sử dụng tài nguyên môi trường chưa hợp lý ở Khánh Hòa đã đe dọa thật sự đến các tài nguyên và môi trường biển (Võ Sĩ Tuấn và ctv, 2005) Các hệ sinh thái vùng ven bờ đang đứng

trước các nguy cơ bị hủy hoại, suy thoái hoặc mất cân cân bằng sinh thái, giảm sút nguồn lợi và tính đa dạng sinh học, cũng như giảm đi số lượng loài cua ghẹ, gây nên những ảnh hưởng xấu cho mọi chiến lược bảo vệ, khai thác bền vững và phát triển kinh tế

1.1.2 Vị trí địa lý, khí hậu và tài nguyên thiên nhiên của Phú Yên

Phú Yên với chiều dài bờ biển 198 km chạy từ Cù Mông đến Vũng Rô, có nhiều dãy núi ăn nhô ra biển hình thành các đầm, vịnh Toàn tỉnh có nhiều đầm, vịnh như đầm

Ô Loan có diện tích 1.570 ha, đầm Cù Mông có diện tích 15.000 ha, đầm Vũng Rô, vịnh

Xuân Đài (Nguyễn Chí Bền và ctv, 2003)

Hình 1.2 Bản đồ tỉnh Phú Yên (Nguồn: http://www.chinhphu.vn – Cập nhật ngày

Tỉnh Phú Yên chỉ có 2 mùa là mùa khô kéo dài từ tháng 1 đến tháng 8, còn mùa mưa rất ngắn kéo dài từ tháng 9 đến tháng 12, riêng 4 tháng lượng mưa chiếm 70% - 80% lượng mưa cả năm Hệ thống sông ngòi Phú Yên hàng năm đổ ra biển khoảng 12,13

tỷ m3 nước, mang theo lượng phù sa, bùn cát gần 2,3 triệu tấn và các chất hoà tan khoảng 0,55 triệu tấn, tạo nên vùng sinh thái nước lợ giàu dinh dưỡng cho các loài thuỷ sinh vật phát triển phong phú ở các vùng nước cửa sông, lạch ven biển (Nguyễn Chí Bền và ctv, 2003)

 Tài nguyên thiên nhiên

Phú Yên có điều kiện tự nhiên khí hậu thuận lợi, vùng biển có nguồn lợi thủy sản

vô cùng đa dạng và phong phú bao gồm: Cá, các loài giáp xác, thân mềm, rong biển, trong đó chủ yếu là nguồn lợi cá biển và các loài tôm, cua ghẹ có giá trị về thực phẩm

và kinh tế Phú Yên có điều kiện tự nhiên và tài nguyên vùng ven bờ, hệ thực vật, động vật nơi đây đa dạng, phong phú bao gồm 263 loài tảo phù du, 9 loài cỏ biển, 35 loài thực vật ngập mặn, 90 loài động vật phù du, 14 loài động vật thân mềm, 224 loài cá (Nguyễn Minh Hạnh, 2016)

Những năm gần đây, vùng ven biển của Phú Yên đang chịu nhiều tác động từ các hoạt động phát triển kinh tế - xã hội, vùng biển này không chỉ là “vùng trọng điểm” của nghề khai thác bằng các ngư cụ mang tính hủy diệt, mà còn là nơi đang bị ô nhiễm do hậu quả của nghề nuôi tôm và người dân sống xung quanh đã biến thành nơi chứa chất thải, đồng thời chịu ảnh hưởng của thiên tai, bão lũ (Nguyễn Thị Hoài Trang, 2011; Nguyễn Minh Hạnh, 2016) Từ đó làm suy thoái sinh cảnh và tài nguyên thủy sinh, gây

ô nhiễm môi trường, đe dọa đến sự mất đa dạng sinh học, làm suy giảm nguồn lợi thủy sản cũng như số lượng các loài cua ghẹ

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng các loài cua ghẹ ở trong nước và thế giới

Guinot và ctv (2008) đưa ra danh sách các loài cua thuộc phân thứ bộ Brachyuran trên thế giới bao gồm 6.793 loài và phân loài, 1.271 giống và phân giống, 93 họ và 38 phân họ

Cumberlidge và ctv (2011) với nghiên cứu sự đa dạng các loài cua ở Trung Quốc

và ghi nhận được sự đa dạng nhất của hai họ: Potamidae (505 loài thuộc 95 giống) và Gecarcinucidae (344 loài thuộc 59 giống) phân bố chủ yếu ở phía tây nam, trung nam

và phía đông

Karasawa và ctv (2011) nghiên cứu sự phát sinh loài của phân thứ bộ Brachyura thuộc phân bộ Pleocyemata (bộ Decapoda) bao gồm 30 loài đã tuyệt chủng và hiện hữu dựa trên 74 đặc điểm được miêu tả bởi Guinot (1977) Nhóm tác giả ghi nhận 4 đơn vị

phân loại mới gồm Homoloida, Torynommoida, Etyoida, Dakoticancroida và 2 họ mới

(Basinotopidae và Xandarocarcinidae)

Tsang và ctv (2014) dựa trên 6 gen nhân mã hóa protein gồm AK, Enolase, GAPDH, H3, PEPCK, NaK và 2 gen ti thể là 12S rRNA và 16S rRNA xây dựng cây phát sinh loài của phân thứ bộ Brachyura thuộc bộ Decapoda với tổng số 142 loài thuộc 58 họ Devi và ctv (2015) nghiên cứu sự đa dạng các loài cua ở Cochin, Kerala phía tây nam Ấn Độ, tổng cộng có 24 loài cua thuộc 16 giống và 8 họ đã được ghi nhận Trong

đó, họ có số loài nhiều nhất gồm Portunidae – 9 loài, Grapsidae – 7 loài và nhiều họ khác có số lượng loài ít như Ocypodidae, Xanthidae, Pinnotheridae, Leucosiidae, Hymenosomatidae

Abbas và ctv (2016) dựa trên hai phương pháp phân loại là hình thái bên ngoài và

di truyền để xác định 5 loài cua được thu thập ở thành phố Suez và vùng Abo Zenima ở vịnh Suez phía Bắc biển Đỏ của Ai Cập Bằng phương pháp phân loại hình thái, nhóm tác giả đã mô tả dựa trên màu sắc, hình dạng răng hàm, mai, càng, chân bò, đồng thời gen CO1 mtDNA đã được sử dụng cho nghiên cứu di truyền Kết quả xác định được 5

loài cua gồm: Charybdis natator (Herbst, 1794), Charybdis hellerii (A Milne-Edwards, 1867), Portunus pelagicus (Linnaeus, 1758), Liocarcinus corrugatus (Pennant, 1777)

và Atergatis roseus (Ruppell, 1830)

 Trong nước

Cua ghẹ là một nhóm động vật giáp xác thuộc bộ mười chân có số loài và số lượng

cá thể nhiều trong các mẫu kéo lưới động vật đáy, đây là nét đặc trưng của hệ sinh vật đáy của vùng biển nhiệt đới Khu vực biển Việt Nam, giáp xác có khoảng 1500 loài

thuộc 70 họ, trong đó một số họ có số loài nhiều là Xantiidae, Gonoplacidae, Leucosidae, Portunidae, Ocypodidae (thuộc nhóm cua), Penaeidae, Alpheidae, Paguridae, Palaemonidae (thuộc nhóm tôm) (Đặng Ngọc Thanh và Nguyễn Huy Yết, 2009), còn khu hệ nước ngọt có số lượng loài cua đã biết là 45 loài (Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh Hải, 2012), bên cạnh đó mỗi vùng Bắc Trung Nam lại có những nhóm loài đặc trưng riêng

như cua bùn (Scylla serrata), ghẹ hoa (Portunus pelagicus)

Nghiên cứu đa dạng động vật đáy cỡ lớn ở đảo Bạch Long Vĩ – Hải Phòng của Bùi Đức Quang và ctv (2013) ghi nhận số lượng nhiều loài cua thuộc họ Xanthidae (8 loài),

điển hình nhất là cua đá (Atergatic spp.) và nhiều loài có giá trị kinh tế như Charybdis feriata (Linnaeus, 1785), Portunus sanguinolentus (Herbst, 1783), Thalamita sima

(Edwards, 1834)

 Khu vực miền Trung

Trương Văn Đàn và ctv (2010) nghiên cứu khu hệ động vật đáy khu vực Hải Vân - Sơn Trà, từ đó xác định các loài cua ghẹ tại khu vực chỉ tập trung ở một số họ như Xanthidae – 14 giống, 17 loài; sau đó đến các họ Portunidae – 5 giống, 12 loài; Grapsidae – 5 giống, 7 loài; Ocypodidae – 4 giống, 6 loài; các họ còn lại có số lượng giống, loài khá ít

Nghiên cứu của Tôn Thất Chất và Trần Thị Minh Thư (2011) xác định được 13 loài thuộc 5 giống của họ cua bơi (Portunidae) thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế, trong đó giống

chiếm số loài lớn nhất là Charybdis và Portunus với 4 loài (chiếm 30,76%), tiếp đến là Scylla (chiếm 23,08%) có 3 loài, Podophthamus và Thalamita 1 loài (chiếm 7,7%)

Nghiên cứu của Nguyễn Đắc Tạo và Hoàng Đình Trung (2011) ghi nhận được lớp giáp xác gồm 6 họ, 10 giống và 13 loài ở khu vực đảo Cồn Cỏ tỉnh Quảng Trị, trong đó

có 11 loài cua thuộc 5 họ gồm Grapsidae, Ocypodidae, Leucossidae, Mictyridae, Portunidae

Tại khu vực quần đảo Hòn Mê – Thanh Hóa, Lưu Thế Anh và ctv (2011) xác định được 37 loài giáp xác, đáng chú ý trong thành phần loài ghi nhận được 7 loài thuộc họ ghẹ xanh (Portunidae) đây là một nhóm có giá trị kinh tế cao Đồng thời, ghi nhận được

loài Charybdis feriatus (Linnaeus, 1758) thuộc loài động vật đáy quí hiếm

Nguyễn Tống Cường và ctv (2015) nghiên cứu thành phần loài tôm và cua nước ngọt ở vườn quốc gia Phong Nha – Kẻ Bàng tỉnh Quảng Bình, thành phần loài của nhóm cua có 5 loài thuộc 4 giống và 2 họ (Parathelphusidae, Potamidae), trong đó ghi nhận

thêm 1 loài cua nước ngọt Somanniathelphusa pax cho khu vực, ngoài ra có 1 mẫu cua thuộc giống Villopotamon có thể là loài mới cho khoa học

Ở khu vực tỉnh Khánh Hòa, Phan Thị Kim Hồng và ctv (2014) nghiên cứu động vật đáy vịnh Vân Phong xác định được nhiều loài cua ghẹ thuộc họ Xanthidae – 42 loài, Pilumnidae – 12 loài, Portunidae – 8 loài, Goneplacidae – 5 loài Thuộc khu vực tỉnh Phú Yên, có nghiên cứu của Hoàng Đình Trung và Nguyễn Hữu Nhật (2016) điều tra

về thành phần loài động vật đáy có giá trị kinh tế tại đầm Ô Loan xác định được 6 loài,

4 giống và 2 họ thuộc lớp giáp xác Trong đó, ghi nhận được 2 loài cua ghẹ thuộc họ

Portunidae là Scylla serrata (Forskal, 1775) và Portunus pelagicus (Linnaeus, 1758)

 Khu vực biển Nam Bộ và đồng bằng sông Cửu Long

Nghiên cứu của Đỗ Văn Nhượng (2003) dẫn liệu bước đầu về cua (Brachyura) ở rừng ngập mặn Cần Giờ xác định được 49 loài cua, họ có số loài nhiều nhất là Ocypodidae – 25 loài, Grapsidae – 13 loài, các họ khác có số lượng loài ít hơn: Portunidae – 5 loài, Potamidae – 2 loài, Leucosiidae – 2 loài, Majida – 1 loài và Mictyridae – 1 loài

Lê Văn Thọ và Phan Doãn Đăng (2011) tiến hành khảo sát động vật đáy không xương sống cỡ lớn trên sông Vàm Cỏ Đông tỉnh Long An ghi nhận được 41 loài, 6 lớp

và 3 ngành, trong đó có hai loài cua thuộc họ Potamidae là Potamon sp và Deacapoda larva

Nghiên cứu về cua nước ngọt ở các đảo lớn Việt Nam của Đỗ Văn Tứ (2015) thực hiện trên 5 đảo gồm Cát Bà, Cù Lao Chàm, Côn Đảo, Hòn Khoai và Phú Quốc, ghi nhận

được 8 loài cua nước ngọt thuộc 8 giống, 2 họ (Gecarcinucidae – 3 loài và Potamidae –

và mã hóa cho một số protein tham gia vào chuỗi chuyền điện tử, có khoảng một vài

trăm ty thể trên một tế bào (Chial và Craig, 2008)

Hình 1.3 DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA và 13 vùng mã hóa protein Mũi tên màu vàng chỉ vùng gen CO1 mtDNA được sử dụng trong

nghiên cứu hiện tại (Nguồn: https://www.mitomap.org/MITOMAP - Cập nhật

tháng 05/2017) Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của DNA và mỗi tế bào chứa từ hàng trăm đến hàng triệu ty thể nên số lượng DNA ty thể là rất lớn (Taylor và Turnbull, 2005) DNA

ty thể có các ưu điểm hơn DNA trong nhân như sau:

- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 - 10 lần so với hệ gen nhân (Chial và Craig, 2008)

- Số lượng bản sao lớn (Taylor và Turnbull, 2005)

- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp (Hubert và ctv, 2004)

- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài (Hubert và ctv, 2004)

DNA gen nhân có kích thước lớn, tần số đột biến thấp, chúng lại được di truyền từ

cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ Trong khi đó, DNA ty thể có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 - 10 lần so với các gen nhân do cơ chế sửa chữa tái bản DNA không hiệu quả, do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong cùng một loài Bên cạnh đó, các biến dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau

DNA ty thể có đặc điểm không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa

là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtDNA thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng

mẹ Thêm vào đó mtDNA tồn tại với số lượng bản sao lớn và khá đồng nhất trong mỗi

tế bào, tần số đột biến cao (Chial và Craig, 2008) Các đặc điểm trên cùng với việc DNA

ty thể bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng (Chin và ctv, 2005), nên sử dụng DNA ty thể như là một công cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi Tuy nhiên, việc sử dụng DNA ty thể trong nghiên cứu di truyền cũng có một số giới hạn Đôi khi, trong những nghiên cứu phân loại, cây phát sinh loài dựa trên gen ti thể có thể không phản ánh đúng hệ thống phân loại của loài bởi vì sự phân nhánh của các giống loài có thể trước hoặc sau khi phân chia quần thể, thậm chí là loài mới Kích thước DNA

ty thể nhỏ nên đột biến có thể dễ dàng xảy ra mà không phản ánh được mối quan hệ phát sinh loài hay lịch sử tiến hóa Hơn nữa, DNA ty thể di truyền theo dòng mẹ nên sự đa dạng có thể lớn và không nhất thiết phản ánh đúng sự đa dạng tại các vị trí khác của gen

ở mức độ loài Vì vậy, người ta đề nghị nên sử dụng nhiều đoạn gen để có kết quả với

độ chính xác cao (Avise, 2009; Kress và ctv, 2008; Chase và ctv, 2005)

Các chỉ thị của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa CO1, 16S rRNA, 12S rRNA, tRNA Bên cạnh đó, trình tự của các gen mã hóa thuộc DNA ribosome (28S, 5.8S và 18S) cũng như các gen không mã hóa (khoảng chèn giữa gen ITS1 và ITS2) cũng được sử dụng rộng rãi trong phân loại và định danh loài (Cunningham và ctv, 1996; Berg và ctv, 2000) Trên thực tế, sử dụng một cặp mồi chung khuếch đại đoạn gen cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) của DNA ty thể có thể định danh được đến loài

ở hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật (Herbert và ctv, 2003) và thường được sử dụng như một mã vạch DNA (DNA barcoding) để nghiên cứu sự đa dạng sinh học của giới sinh vật (Herbert và ctv, 2003; 2004)

1.3.2 Ứng dụng kĩ thuật di truyền mã vạch (DNA barcoding) trong nghiên cứu đa dạng sinh học cua ghẹ

Khái niệm mã vạch DNA được biết đến rộng rãi từ những năm đầu thế kỷ 21, khi các nhà khoa học Canada trình bày nghiên cứu sử dụng một đoạn gene dài 648 nucleotid từ bộ gene ty thể (vùng gen CO1 – Cytochrome Oxidase subunit 1) để định

loại 260 loài chim và đề xuất dùng nó như một "mã vạch" để lưu trữ, chuẩn hóa thông

tin các loài động vật (Hebert và ctv, 2004) Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một vùng DNA có kích thước từ 400-800bp như là một tiêu chuẩn để nhận dạng các loài một cách nhanh chóng, chính xác và phương pháp này được gọi là mã vạch DNA (DNA barcoding)

Mã vạch DNA là phương pháp dựa trên việc so sánh các trình tự DNA ngắn, chuẩn của các loài sinh vật chưa biết với ngân hàng trình tự DNA của Genbank, từ đó xác định tên loài của mẫu nghiên cứu (Dương Văn Tăng và ctv, 2014; Trần Thị Việt Thanh và ctv, 2015)

Sự khác biệt về trình tự DNA ty thể của đa số các loài động vật là rất rõ ràng, do đó giải trình tự DNA ngắn được sử dụng làm mã vạch cho các loài động vật hứa hẹn sẽ cung cấp một công cụ giám định loài chính xác, hiệu quả và định loại được với cả các mẫu không nguyên vẹn, mẫu con non khó định loại bằng hình thái (Gill và Slikas, 1992; Avise, 1995)

 Đặc điểm mã vạch DNA (DNA barcoding)

Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcoding là phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một barcoding nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhưng

ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể (Kress và ctv, 2015)

Do đó, DNA barcoding lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR

Hệ thống mã vạch DNA lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:

- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ khác biệt để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá lớn giữa các cá thể trong cùng loài

- Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau

- Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (giống, họ,…)

- Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có

độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA

- Thứ năm, đoạn DNA nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản DNA không bị sai lệch (Taberlet và ctv, 2007)

Ward và ctv (2009) sử dụng vùng gen CO1 đã định loại được 5000 loài cá được thu nhiều nơi trên thế giới, tiếp tục công trình của Ward thì đến năm 2011 Becker và ctv đánh dấu DNA mã vạch của 7800 loài cá

Kress và ctv (2009) dựa vào phương pháp mã vạch DNA sử dụng hệ gen lục lạp gồm ba vùng gen rbcL, matK và trnH – PsbA xác định được 296 loài thực vật ở khu rừng trên đảo Barro Colorado – Panama

Mã vạch DNA cũng được ứng dụng tại cửa khẩu nhằm hỗ trợ xác định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu để ngăn cản việc vận chuyển trái phép các loài động, thực vật quý hiếm qua biên giới và còn được ứng dụng trong thực phẩm như Vartak và ctv (2014) xác định được có 11 sản phẩm từ 11 loài cua kém chất lượng ghi nhãn không đúng cách ở các nhà hàng Ấn Độ

Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcoding cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life) đã được thành lập vào tháng

5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia Mục tiêu ban đầu là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự mã vạch cho tất cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào Với sự hỗ trợ của CBOL, mã vạch DNA ngày càng phát triển và trở thành một phương pháp phân loại và định danh loài mới

1.3.3 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh loài ở cua ghẹ

Cho đến nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về sự phát sinh loài cua ghẹ đã được thực hiện Tuy nhiên, mối quan hệ phát sinh chủng loài của chúng vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để

Daniels và ctv (2002) sử dụng trình tự của ba gen ti thể 12S rRNA, 16S rRNA và

CO1 mtDNA nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của giống cua Potamonautes ở Nam

Phi Kết quả dựa vào vị trí trên cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ chặt chẽ của 14

loài cua thuộc giống Potamonautes

Hultgren và Stachowicz (2008) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài cua thuộc siêu họ Majoidea được thu thập ở vùng bờ biển phía tây, đông của Hoa Kì và bờ biển phía đông Nhật Bản Nghiên cứu sử dụng hai gen ti thể (16S rRNA và CO1 – cytochrome C oxidase 1) và một gen nhân (28S rRNA), kết quả đã xác định được 37 loài cua và cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các họ Epialtidae, Pisidae, Tychidae và Mithracidae

Viswanathan và ctv (2010) nghiên cứu mối quan hệ của 4 loài cua bùn thuộc giống

Scylla dựa trên trình tự gen CO1 được thu từ rừng ngập mặn Pichavaram bờ biển phía Đông Nam Ấn Độ Đồng thời, 96 trình tự từ Genbank thuộc giống Scylla được sử dụng

để xây dựng cây phát sinh loài, từ đó xác định sự khác biệt của 4 loài và mối quan hệ tiến hóa của chúng

Ip và ctv (2015) sử dụng các gen ty thể (gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA) kết hợp với các gen nhân mã hóa protein (NaK, Enolase và Histone 3) để xây dựng cây phát sinh chủng loại của 32 loài cua thuộc họ Grapsidae Kết quả các loài cua

này được chia thành hai nhánh chính: nhánh thứ nhất thuộc giống Metopograpsus và nhánh thứ hai thuộc hai giống Grapsus và Planes với một số loài thuộc giống Pachygrapsus nằm trong các nhánh

Baeza (2016) nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa của các loài cua thuộc họ Porcellanidae từ khu vực phía đông nam Thái Bình Dương, dựa vào sự kết hợp các chỉ thị phân tử 16S rRNA ty thể và một gen nhân Histone 3 (H3), xác định mối quan hệ của

11 loài cua thuộc 3 giống gồm: Petrolisthes – 6 loài, Liopetrolisthes – 2 loài và Allopetrolisthes – 3 loài, đồng thời cho thấy sự đa dạng về tập tính sống, môi trường

sống và màu sắc của 3 giống

Ở Việt Nam, Thái Thanh Bình và ctv (2009) sử dụng vùng gen ty thể CO1 nhận

dạng các loài cua xanh Scylla spp với tổng 33 trình tự và kết quả xác định 4 loài cua xanh có mối quan hệ gần nhau Trên đối tượng là loài cua xanh thuộc giống Scylla, Nguyễn Giang Sơn và ctv (2011) định loại được 2 mẫu thuộc loài S olivacea và S paramamosain phân bố ở vùng biển thuộc tỉnh Cà Mau dựa trên trình tự gen 16S RNA

ribosomal, từ đó đánh giá mối quan hệ phát sinh chủng loại các loài cua thuộc giống

Scylla

Như vậy, việc sử dụng rộng rãi các chỉ thị phân tử, đặc biệt là việc kết hợp các chỉ thị phân tử DNA ty thể và DNA bộ gen đã góp phần làm sáng tỏ mối quan hệ của các loài cua ghẹ nói chung và theo vùng địa lý nói riêng, góp phần cung cấp các dữ liệu cần thiết cho việc bảo tồn loài cua ghẹ trên thế giới và Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu

Các loài cua ghẹ thu được ở tỉnh Phú Yên và một số khu vực tỉnh Khánh Hòa, sử dụng phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên ở hai khu vực tại các địa điểm: Vùng biển Lương Sơn – Nha Trang, Vạn Ninh – Khánh Hòa, vùng biển Tuy Hòa – Phú Yên Mẫu sau khi thu được đem đi rửa sạch, chụp hình và tiến hành phân loại bước đầu về hình thái Sau

đó, tiến hành lấy mô cơ các loài cua ghẹ thu được cố định trong cồn 96o và bảo quản ở -200C cho các thí nghiệm sau

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu:

2.3 Phân loại dựa vào hình thái

Cua ghẹ được phân loại dựa theo mô tả của Đặng Ngọc Thanh và ctv (2001), Nguyễn Văn Chung (2002), Carpenter và Niem (1998), Jeyabaskaran và ctv (2000), Castro và

Ng (2010) Quan sát bên ngoài cơ thể cua ghẹ, cân trọng lượng cơ thể, đo các chỉ tiêu hình thái như chiều dài – rộng của mai, chiều dài của các chân bò, chân bơi, chiều dài của càng Các chỉ tiêu về phân loại như đếm số lượng các gai nhọn, răng cưa, quan sát màu sắc, hình dạng, chi tiết hoa văn trên mai Mẫu được bảo quản ở Phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Trường Đại học Nha Trang

 Các chỉ tiêu đo về hình thái

Mẫu cua ghẹ sau khi thu còn tươi và được rửa bằng nước sạch, tiến hành chụp hình, dùng thước đo có độ chính xác 1 mm để đo các chỉ tiêu hình thái bên ngoài Mẫu cua ghẹ sau khi đo được xác định khối lượng bằng cân điện tử có độ chính xác là 0,01g

Đo mẫu cua ghẹ theo các chỉ tiêu Hình 2.1:

- Đo chiều dài mai (DM): đo từ vị trí mép hai bên mai

- Đo chiều rộng mai (RM): đo từ phần đỉnh giữa hai mắt đến cuối mép dưới mai

- Đo chiều dài chân bò 1 (L1): đo từ phần bụng đến hết chân

- Đo chiều dài chân bò 2 (L2): đo từ phần bụng đến hết chân

- Đo chiều dài chân bò 3 (L3): đo từ phần bụng đến hết chân

- Đo chiều dài chân bò 4 (L4): đo từ phần bụng đến hết chân

- Đo chiều dài càng phải (LCP): đo từ phần bụng đến đỉnh càng

- Đo chiều dài càng trái (LCT): đo từ phần bụng đến đỉnh càng

Hình 2.1 Các chỉ số đo trong phân loại cua ghẹ (Nguồn: Carpenter và Niem, 1998)

 Các chỉ tiêu phân loại

Quan sát các đặc điểm bên ngoài như: màu sắc, hình dạng mai, các chi tiết trên mai

Số lượng răng cưa hai bên xung quanh mai, số lượng răng cưa ở phía trước mai, số lượng các gai nhọn trên càng

Hình 2.2 Các chỉ tiêu đếm trong phân loại cua ghẹ (Nguồn: Carpenter và Niem, 1998)

2.4 Nghiên cứu di truyền cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên

2.4.1 Tách chiết DNA, khuếch đại DNA bằng kĩ thuật PCR và giải trình tự

 Tách chiết DNA

Các mẫu cua ghẹ sau khi xác định hình thái và kích thước, được sử dụng cho các phân tích về di truyền DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể cua ghẹ bằng bộ kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản

xuất (Phụ lục 1) và bảo quản DNA tổng số ở -20oC

 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

9 µL dung dịch tách chiết DNA tổng số được dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen CO1 mtDNA (Cytochrome oxidase c subunit 1 mitochrondrial

DNA) Trình tự các đoạn mồi được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

Folmer và ctv, 1994

Nghiên cứu hiện tại

Trong nghiên cứu hiện tại, cặp mồi CF20/CR19 được thiết kế dựa trên một số trình

tự có sẵn trên Genbank của 4 họ cua ghẹ của cùng một gen (CO1 - cytochrome c oxidase

subunit 1) Trình tự bắt cặp của mồi thiết kế được trình bày trong phần Phụ lục 2 Đặc điểm của cặp mồi CF20/CR19:

- Độ dài của mồi CF20 – 20 nucleotide và CR19 – 19 nucleotide

- Nhiệt độ nóng chảy của mồi CF20 là 58,40C và CR19 là 54,10C

- Nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi là 510C

- Sản phẩm PCR khoảng 500bp

Thành phần phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng 2.2 Phản ứng được chạy trên máy

luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo chương trình nhiệt độ như sau:

- Cặp mồi LCO 1490/HCO 2198: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút; sau đó

là 35 chu kì của 94oC trong 30 giây, 42oC trong 45 giây, 72oC trong 30 giây; cuối cùng

là bước kéo dài tại 72oC trong 5 phút (Hình 2.3)

- Cặp mồi CF20/CR19: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 4 phút; sau đó là 33 chu

kì của 94oC trong 30 giây, 51oC trong 45 giây, 72oC trong 45 giây; cuối cùng là bước kéo dài tại 72oC trong 10 phút (Hình 2.4)

Hình 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR của cặp mồi LCO 1490/HCO 2198

Hình 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR của cặp mồi CF20/CR19

 Điện di kiểm tra kết quả

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel 1,5% nhuộm Ethidium bromide

- Chuẩn bị gel agarose 1,5% : Cân 0,6g agarose rồi cho vào 40mL đệm TBE 1X chứa trong bình tam giác 100mL, đem đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn Hạn chế bay hơi nước khi đun để tránh tăng nồng độ agarose Để nguội đến nhiệt

độ khoảng 60OC– 70OC, chuyển qua bình tam giác 100mL thứ hai Thêm 2µL Ethidium

bromide, lắc nhẹ tránh tạo bọt Đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược (lược 8 giếng hoặc lược

15 giếng) Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra theo phương thẳng đứng để tránh rách các giếng (Lưu ý: Chất Ethidium bromide là chất độc hại nên

cần cẩn thận an toàn khi thao tác)

- Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di và thêm đệm TBE 1X cho đến khi ngập bản gel Dùng micropipette mix đều 5µL sản phẩm PCR, rồi load vào các giếng nhỏ trên gel Hút 3µL DNA chuẩn (Marker) vào 1 giếng để xác định kích thước phân tử DNA Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90V, cường độ dòng điện là 400mA trong 25 phút Phân tử DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương

- Đọc kết quả: Sau khi chạy điện di xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator

và xem các band DNA dưới tia cực tím

 Giải trình tự DNA

Sản phẩm PCR được tiến hành phản ứng giải trình tự theo nguyên tắc Dye – labelles dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 960C trong 20 giây,

500C trong 20 giây, cuối cùng là 600C trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems)

2.4.2 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại

 Kết nối trình tự

Các trình tự gen của các loài cua ghẹ được kết nối bằng chương trình Contig Express trong phần mềm Vector NTIv 9.0 (Lu và Moriyama, 2004) Sau đó, các trình tự được kiểm chứng với dữ liệu trên Ngân hàng Gen bằng chương trình Blast Nucleotide (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) Các trình tự được dóng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999), sử dụng tính năng ClustalW, sau đó được kiểm tra và chỉnh sửa bằng

mắt thường, xác định mức độ tương đồng và sự khác biệt di truyền của các loài cua ghẹ

 Xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cua ghẹ

Phân tích di truyền được tiến hành với trình tự gen CO1 mtDNA các mẫu cua ghẹ, bao gồm 14 trình tự của nghiên cứu hiện tại ở khu vực tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên với

29 trình tự từ Genbank Thông tin về các trình tự cua ghẹ được thể hiện ở Bảng 2.3

Bảng 2.3 Trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cua ghẹ

STT Loài Địa điểm thu

mẫu

Mã số Genbank Tác giả

(2014)

(2012)

(2012)

(2015)

25 Calappa calappa Mỹ KU853965 Ewers-Saucedo và ctv

(2016)

(2016)

(2016)

(2016)

(2012)

* Loài có trình tự gen làm nhóm ngoại Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm Mega 6.06 (Tamura và ctv, 2013),

sử dụng thuật toán Neighbor – Joining (NJ) Giá trị bootstrap (BT) được tính toán để

xác định tính chính xác của thuật toán NJ với độ lặp lại 1000 lần Hai loài Neolithodes grimaldii và Acantholithodes hispidus được chọn làm nhóm ngoại (Outgroup)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân loại về hình thái

3.1.1 Thành phần các loài cua ghẹ thu được tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên

Sau khi tiến hành thu mẫu phân tích hình thái, nghiên cứu phân loại được 23 loài cua ghẹ thuộc 16 giống, 12 họ và 1 bộ Khu vực tỉnh Khánh Hòa có 14 loài (chiếm 61%), khu vực Phú Yên có 6 loài (chiếm 26%) và 3 loài (chiếm 13%) có cả ở hai vùng nói

trên Danh sách các loài cua ghẹ được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Danh sách các loài cua ghẹ thu tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên

gọi

Địa điểm thu mẫu

C vadorum Ghẹ Va-Do Phú Yên

Portunus P gladiator Ghẹ đỏ dẹp Khánh Hòa

Podophthalmus P vigil Cua mắt dài Phú Yên

Thalamita T crenata Ghẹ cơre Khánh Hòa

C lophos Cua khúm

lúm lopho Phú Yên

Euryplacidae Eucrate E alcocki

Cua hoa vuòng

Khánh Hòa, Phú Yên

Gonephacidae Carcinoplax C longimanus Cua cacci

càng dài Phú Yên

C purpurea Cua cacci

Carpiliidae Carpilius C convexus Cua đốm Khánh Hòa

 Tỉ lệ các loài cua ghẹ xếp theo họ

Trong số các họ mà nghiên cứu ghi nhận được thì đa dạng nhất là họ Portunidae có

số loài nhiều nhất với 7 loài (chiếm 30,4%), tiếp đến là họ Xanthidae với 3 loài (chiếm 13%) Họ Calappidae, họ Euryplacidae và họ Gonephacidae có 2 loài mỗi họ (mỗi họ chiếm 8,7%) Các họ còn lại đều chỉ có 1 loài (mỗi họ chiếm 4,3%)

 Tỉ lệ các loài cua ghẹ xếp theo giống

Trong số các giống ghi nhận được thì giống Charybdis có số loài nhiều nhất với 4 loài (chiếm 17,4%), tiếp theo là 4 giống Atergatis, Calappa, Eucrate và Carcinoplax với

2 loài mỗi giống (mỗi giống chiếm 8,7%) Các giống còn lại đều chỉ có 1 loài (mỗi giống chiếm 4,3%)

3.1.2 Bản đồ phân bố các loài cua ghẹ trong nghiên cứu hiện tại

Hình 3.1 Bản đồ phân bố các loài cua ghẹ trong nghiên cứu hiện tại

Sự phân bố của các loài cua ghẹ trong nghiên cứu hiện tại được thể hiện trong Hình 3.1 Sự phân bố của các loài cua ghẹ tập trung không đồng đều, các loài tập trung nhiều

nhất ở hai địa điểm là khu vực biển Lương Sơn – Khánh Hòa với 9/23 loài và vùng biển Tuy Hòa – Phú Yên với 17/23 loài

Riêng khu vực ở Vạn Ninh – Khánh Hòa có số lượng loài ít nhất, trong đó 2 loài

Thalamita crenata và Macrophthalmus latreillei phân bố ở Cửa biển Hải Triều và loài Somanniathelphusa dangi ở hồ nước Hoa Sơn Các loài Calappa pustulosa, Galene bispinosa và Eucrate alcocki ghi nhận được sự có mặt ở cả hai tỉnh

3.1.3 Đặc điểm hình thái các loài cua ghẹ thu tại Khánh Hòa và Phú Yên

Bảng 3.2 Chỉ tiêu hình thái các loài cua ghẹ ở tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên

(cm)

RM (cm)

LCP (cm)

LCT (cm)

L1 (cm)

L2 (cm)

L3 (cm)

L4 (cm)

m (g)

Theo http://www.marinespecies.org/ (Cập nhật tháng 05/2017), bộ Decapoda có hệ

thống phân loại như sau:

ở 2 đốt cuối cùng phần rìa có lông mịn (Carpenter và Niem, 1998)

(1) Charybdis natator (Herbst, 1794) – ghẹ đỏ nata:

Tên Tiếng Anh (FAO name): Ridged swimming crab

Tên Tiếng Việt: Ghẹ đỏ nata

Theo http://www.marinespecies.org/ (Cập nhật tháng 05/2017), Charybdis natator

có hệ thống phân loại như sau:

Họ: Portunidae

Giống: Charybdis

Loài: C natator

Danh pháp tương tự: Cancer natator (Herbst, 1794)

Địa điểm thu mẫu: Vùng biển Lương Sơn - Khánh Hòa

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái loài Charybdis natator (TĐTL= 1 cm)

A Hình chụp, B Hình vẽ mô tả chi tiết đặc điểm phân loại loài Charybdis natator

1 – Hai bên mai mỗi bên có 6 răng cưa; 2 – Giữa hai mắt có 8 răng cưa; 3 – Trên mai

có các đường vân màu đen; 4 – Có 9 gai nhọn trên mỗi càng

 Đặc điểm hình thái (Hình 3.2.A, B):

Mai có màu nâu xám, chiều dài 5 cm và chiều rộng 3,7 cm (Bảng 3.2) Phía trước hai bên mai thì mỗi bên có 6 răng cưa nhỏ, ở giữa hai mắt có 8 răng cưa nhỏ và có các

vạch màu đen nằm dọc theo chiều dài mai Loài Charybdis natator có nhiều hạt được

bao phủ ở hai càng, trên mỗi càng có 9 gai nhọn và hai chân bò cuối có dạng mái chèo

 Nhận xét:

Loài Charybdis natator nghiên cứu hiện tại có đặc điểm hình thái giống mô tả của

Carpenter và Niem (1998) Chiều dài lớn nhất của mai ghi nhận được từ 8,2 – 10 cm

(Nguyễn Văn Chung, 2002)

(2) Charybdis acutifrons (de Man, 1879)

Tên Tiếng Anh: Swimmer crab

Theo http://www.marinespecies.org/ (Cập nhật tháng 05/2017), Charybdis acutifrons có hệ thống phân loại như sau:

Họ: Portunidae

Giống: Charybdis

Loài: C acutifrons

Danh pháp tương tự: Goniosoma acutifrons (de Man, 1879)

Địa điểm thu mẫu: Vùng biển Lương Sơn – Khánh Hòa

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái loài Charybdis acutifrons (TĐTL= 1,3 cm)

A Hình chụp, B Hình vẽ mô tả chi tiết đặc điểm phân loại loài Charybdis acutifrons

1 – Hai bên mai mỗi bên có 5 răng cưa; 2 – Giữa hai mắt có 8 răng cưa; 3 – 2 đường

vân trên mai; 4 – Hai chấm màu đỏ nâu trên mỗi càng

 Đặc điểm hình thái (Hình 3.3.A, B)

Cơ thể ghẹ có màu đỏ nâu, mai có chiều dài 6,5 cm và chiều rộng 5,3 cm (Bảng 3.2) Phía trước hai bên mai mỗi bên có 5 răng cưa, ở giữa hai mắt có 8 răng cưa, các răng cưa khá lớn và có kích thước đều nhau và có 2 đường vân nằm dọc theo chiều dài của mai Mắt cua to, ở giữa có 4 râu (hai râu ngoài cùng gần mắt dài 2,3 cm, hai râu

giữa dài 1,2 cm Hai chân bò cuối có dạng mái chèo và lông mịn ở phần rìa, hai càng có

các gai lớn và có 2 chấm màu đỏ nâu trên mỗi càng

 Nhận xét:

Loài Charybdis acutifons nghiên cứu hiện tại có đặc điểm giống mô tả của Jeyabaskaran và ctv (2000) Charybdis acutifons có thể phân biệt với loài Charybdis japonica (Milne – Edwards, 1861) dựa vào số lượng gai trên càng (Charybdis acutifons

– 10 gai, Charybdis japonica – 8 gai)

(3) Charybdis anisodon (De Haan, 1850)

Tên Tiếng Anh (FAO name): Two-spined arm swimming crab

Theo http://www.marinespecies.org/ (Cập nhật tháng 05/2017), Charybdis anisodon có hệ thống phân loại như sau:

Họ: Portunidae

Giống: Charybdis

Loài: C anisodon

Danh pháp tương tự: Portunus (Thalamita) anisodon (De Haan, 1850)

Địa điểm thu mẫu: Vùng biển Lương Sơn – Khánh Hòa

Hình 3.4 Đặc điểm hình thái loài Charybdis anisodon (TĐTL=1,2 cm)

A Hình chụp, B Hình vẽ mô tả chi tiết đặc điểm phân loại loài Charybdis anisodon

1 – Có 2 gai hướng vào trong ở đốt càng gần mai; 2 – Có 3 gai ở đốt đỉnh càng; 3 –

Hai bên mai mỗi bên có 6 răng cưa; 4 – Các đường vân trên mai