Ứng dụng chỉ thị SNPs trong nghiên cứu di truyền quần thể chim yến tổ trắng aerodramus fuciphagus (thunberg,1812) tại khu vực trung và nam bộ, việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SNPs TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TỔ TRẮNG Aer

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SNPs TRONG NGHIÊN CỨU

DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TỔ TRẮNG

Aerodramus fuciphagus (THUNBERG, 1812) TẠI

KHU VỰC TRUNG VÀ NAM BỘ, VIỆT NAM

Giảng viên hướng dẫn : TS Đặng Thúy Bình

Sinh viên thực hiện : Võ Thị Đức

Mã số sinh viên : 55133687

Khánh Hòa, năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN SINH HỌC

-o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SNPs TRONG NGHIÊN CỨU

DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TỔ TRẮNG

Aerodramus fuciphagus (THUNBERG, 1812)

TẠI KHU VỰC TRUNG VÀ NAM BỘ, VIỆT NAM

GVHD: TS Đặng Thúy Bình SVTH: Võ Thị Đức

MSSV: 55133687

Khánh Hòa, tháng 6 năm 201

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, trước tiên em bày bỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình và ThS Vũ Đặng Hạ Quyên đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện đồ án

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo thuộc viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức rất bổ ích cho em trong suốt quá trình học tập 4 năm qua

Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cơ sở vật chất cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Em xin cảm ơn đề tài ―Khai thác và phát triển nguồn gen chim yến

đảo (Aerodramus fuciphagus germani Oustalet, 1878) phục vụ phát triển bền vững

nghề chim yến của Việt Nam‖ của Công ty TNHHMTV Yến sào Khánh Hòa đã tài trợ kinh phí và hỗ trợ thu mẫu cho em thực hiện đồ án này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè và các anh chị trên phòng thí nghiệm sinh học phân tử đã quan tâm, giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt thời gian thực hiện để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Mặc dù, em đã rất cố gắng để hoàn thiện đồ án nhưng do thời gian và kiến thức còn hạn chế, nên trong quá trình thực hiện đồ án không thể nào tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được góp ý của thầy, cô giáo để đồ án được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 25 tháng 6 năm 2017

Sinh viên

TÓM TẮT

Việt Nam có đường bờ biển dài từ Bắc đến Nam, có nhiều đảo và quần đảo thích

hợp cho việc sinh sống và trú ngụ của chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus Đây

là loài chim mà tổ được làm từ nước bọt có giá trị kinh tế cao, và là nguồn thực phẩm

bổ dưỡng của nhiều quốc gia trên thế giới Cũng chính vì chúng mang lại nhiều lợi ích nên con người đã khai thác quá mức tổ yến có nguồn gốc tự nhiên dẫn đến suy giảm nguồn lợi tổ yến, cũng như ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của quần thể chim yến

Nghiên cứu hiện tại áp dụng phương pháp ezRAD (ez Restriction-site Associated DNA) nhằm khảo sát sự khác biệt di truyền và kết nối các quần thể chim yến phân bố

ở đảo (đảo A1- Khánh Hòa và Côn Đảo) và chim yến nuôi trong nhà (Nha Trang –

Khánh Hòa và Kiên Giang) tại Việt Nam Từ 75 cá thể chim yến Aerodramus fuciphagus thu được từ các khu vực Khánh Hòa, Côn Đảo, Kiên Giang, hệ gen tham chiếu của chim yến Aerodramus fuciphagus đã được xây dựng dựa vào các thông số

tối ưu Nghiên cứu phát hiện 721 SNPs có ý nghĩa di truyền từ 593.637 SNPs thô Kết quả phân tích cho thấy có sự kết nối giữa quần thể chim yến nhà với chim yến nhà, chim yến đảo với chim yến đảo, đồng thời có sự phân tách giữa các quần thể chim yến nhà (Kiên Giang, Nha Trang) và quần thể chim yến đảo (Đảo A1, Côn Đảo) Kết quả nghiên cứu đã góp phần hỗ trợ các giả thuyết trước đây về nguồn gốc của quần thể chim yến nhà Kiên Giang rất có thể có nguồn gốc từ Thái Lan Nghiên cứu góp phần

khảo sát sự đa dạng di truyền chim yến Aerodramus fuciphagus và cung cấp dữ liệu

đầu vào về cấu trúc và kết nối quần thể chim yến tổ trắng làm cơ sở cho việc xây dựng chiến lược bảo tồn và quản lý nguồn lợi

Từ khóa: Aerodramus fuciphagus, di truyền quần thể, SNPs, ezRAD

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH HÌNH VẼ v

DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU vi

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu 4

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 5

1.2.1 Hệ thống phân loại chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 5

1.2.2 Đặc điểm hình thái 6

1.2.3 Phân bố 7

1.2.4 Hành vi, tập tính 9

1.2.5 Khả năng định vị bằng tiếng vang 10

1.2.6 Thức ăn và cách thức bắt mồi 10

1.2.7 Đặc điểm sinh sản của chim yến 11

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 12

1.3.1 Tổng quan về giải trình tự thế hệ mới (NGS) 12

1.3.2 Tổng quan về Restriction site Associated DNA Sequencing

1.3.3 Tổng quan về ezRAD 13

1.3.4 Tổng quan về SNPs 14

1.4 Tình hình nghiên cứu di truyền bộ chim yến (Apodiformes) trên thế giới và tại Việt Nam 16

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu di truyền chim yến tổ trắng Aerodramus

fuciphagus Thunberg, 1812 22

2.2.2 Giải thích quy trình thực hiện 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Kết quả nghiên cứu 28

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 28

3.1.2 Thu nhận thư viện ezRAD 28

3.1.3 Xây dựng hệ gen tham chiếu của chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus) 29

3.1.4 Phát hiện chỉ thị SNPs ở các quần thể ở các quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 31

3.1.5 Xây dựng cấu trúc quần thể chim yến A fuciphagus tại Việt Nam 33

3.2 Thảo luận 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 6

Hình 1.2 Bản đồ phân bố của chim yến Aerodramus fuciphagus 7

Hình 1.3 Bản đồ phân bố chim yến tại Việt Nam 8

Hình 1.4 Đảo yến Hòn Nội (A)-Hòn Ngoại (B) tại Khánh Hòa 9

Hình 1.5 Chim yến đang làm tổ (A) và tổ yến (B) 11

Hình 1.6 Chim con 2 ngày tuổi(A) và chim tập bay (B) 12

Hình 1.7 Quá trình tạo thư viện gen bằng phương pháp EzRAD 14

Hình 1.8.Chỉ thị phân tử SNPs 14

Hình 2.1 Mẫu chim trứng (A) và mẫu chim yến tổ trắng (B) Aerodramus fuciphagus 21

Hình 2.2.Địa điểm thu mẫu chim yến 21

Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu di truyền chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 22 Hình 2.4 Tạo thư viện gen ezRAD 23

Hình 2.5 Cấu trúc của Adapter 25

Hình 3.1 DNA tổng số của chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 28

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR ezRAD 29

Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện % (A+T) và % (G+C) của ba hệ gen tham chiếu theo từng giá trị coverage và cutoff 30

Hình 3.4 Hình ảnh của hệ gen tham chiếu sử dụng phần mềm Seaview dựa vào các thông số tối ưu 31

Hình 3.5 Phân tích tọa độ về di truyền quần thể chim yến Aerodramus fuciphagus dựa trên chỉ thị SNPs 35

DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Số lượng mẫu thu tại các địa điểm 22

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng enzyme cắt giới hạn 24

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR tạo thư viện DNA 25

Bảng 2.4 Giá trị trong thang đo Phred 26

Bảng 3.1 Thông số hệ gen tham chiếu dựa vào giá trị Coverage và Cutoff, %(A+T) và %(G+C) 30

Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc SNPs của chim yến Aerodramus fuciphagus 32

Bảng 3.3 Số lượng cá thể chim yến tổ trắng trước và sau khi sàng lọc 32

Bảng 3.4 Các thông số đa dạng di truyền của các quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus dựa trên chỉ thị SNPs 34

Bảng 3.5 Chỉ số sai khác di truyền Fst (phía dưới đường bên) và p- value (phía trên đường bên giữa các quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 33

DNA Deoxyribonucleic acid

NGS Next Generation Sequencing

SSCP Single Stranded Conformation Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism LSA Locus Specific Amplification

CHD Chromodomain helicase DNA binding protein GAPDH Glyceraldehyde 3 – phosphate dehydrogenase DAPC Discriminant analysis of principal components RADP Random Amplified Pholimorphic DNA

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism RAD Restriction site Associated DNA Sequencing

rRNA ribosome Ribonucleic acid

DAPC Discriminant Analysis of Principal Components SPB Sample Purification Beads

PCoA Principal Coordinates Analysis

DA Discriminant Analysis

A, T, G, C Adenine, Thymine, Guanine, Cytocine

MỞ ĐẦU

Chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus Thunberg, 1812) là một loài chim nhỏ,

phân bố ở bờ biển của Việt Nam và một số nước Đông Nam Á và Ấn Độ (Chantler và

Driessens, 2000) Chim yến tổ trắng làm tổ ở những vách đá cheo leo hẻo lánh ở ngoài

đảo xa, đây là nơi trú ngụ an toàn, tránh những loài khác cạnh tranh cũng như có nhiệt

độ và độ ẩm thích hợp Tổ yến được làm hoàn toàn bằng nước bọt tiết ra từ 2 tuyến ở

dưới lưỡi và hai bên má, thời gian làm tổ khoảng hơn 30 ngày (Nguyen và ctv, 2002) Tổ

chim yến tổ trắng có giá trị kinh tế cao và hàm lượng dinh dưỡng lớn hơn so với tổ các loài chim yến khác nên được dùng làm thực phẩm và dược phẩm ở một số quốc gia Đông Nam Á, Trung Quốc, Nhật Bản… (Medway, 1963; Lau và Melville, 1994) Chính vì có

mùi vị đặc trưng, nhiều công dụng và giá cả luôn ở mức cao (Frenández và ctv, 2000) nên

tổ yến luôn bị khai thác quá mức trong những năm gần đây Việc khai thác quá mức tổ yến có nguồn gốc từ thiên nhiên dẫn đến suy giảm đến nguồn lợi tổ chim yến, cũng như ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của quần thể chim yến (Hobbs, 2004) Ngoài

ra, việc tạo nhà nuôi chim yến có thể thu hút những loài yến vốn không phải bản xứ đến sinh sống, ảnh hưởng đến sự phân bố quần thể chim yến cũng như sự biến động về mặt di truyền trong quần thể chim yến (Nguyễn Khoa Diệu Thu, 2009)

Di truyền quần thể là một lĩnh vực của di truyền học liên quan đến sự khác biệt di

truyền trong và giữa các quần thể, và là một phần của sinh học tiến hóa (Pool và ctv,

2010) Hiện nay, di truyền quần thể được xem là một công cụ tiện ích để nghiên cứu sinh thái quần thể của các loài sinh vật (Houser và Seeb, 2008) Cấu trúc di truyền và thông tin về sự kết nối quần thể có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn đa dạng di truyền và duy trì khả năng phát triển tự nhiên của quần thể, đặc biệt đối với các loài là đối tượng khai thác (Reed và Frankham, 2003) Ở mức độ phân tử, nghiên cứu có thể xác định được sự thích nghi với điều kiện môi trường thay đổi ở mức độ địa phương,

đặc biệt là do biến đổi khí hậu (Reed và Frankham, 2003; Allendorf và ctv, 2010) Chi

phí cho công nghệ giải trình tự giảm xuống tạo điều kiện cho những nghiên cứu di

truyền quần thể phổ biến ở nhiều sinh vật khác (Pool và ctv, 2010)

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu tập trung vào mối quan hệ phát sinh loài chim yến (Lee và ctv, 1996; Thomassen và ctv, 2003, 2005; Thomassen và Povel, 2006; Parkert và ctv, 2012), tập tính sống của chim yến (Fullard và ctv, 2010) và sự tiến hóa

dựa trên sự định vị bằng tiếng vang (Price và ctv, 2004, 2005) Các nghiên cứu về di

truyền quần thể chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus) chỉ dừng ở mức độ khảo

sát sự khác biệt trong 2 gen Cytb và ND2 thuộc DNA ty thể (mtDNA) và 8 chỉ thị microsatellite ở Thái Lan (Aowphol và ctv, 2008)

Cho đến nay, những nghiên cứu về chim yến ở nước ta chủ yếu được thực hiện ở mức độ khảo sát, thu thập mẫu và dữ liệu liên quan đến phân loại, mô tả hình thái và

giá trị kinh tế của loài chim yến tố trắng (Aerodramus fuciphagus), ấp nở chim yến

nhân tạo, nuôi chim trong nhà để lấy tổ, di đàn và nhân đàn chim yến (Nguyen và ctv, 2002; Nguyễn Khoa Diệu Thu và ctv, 2009; Lê Hữu Hoàng và ctv, 2010)

Các nghiên cứu liên quan đến đa dạng loài và đa dạng di truyền quần thể của chim yến ở Việt Nam còn nhiều hạn chế, và chưa thống nhất về các phân loài phân bố

ở Việt Nam Theo Hồ Thị Loan và ctv (2015) các quần thể chim yến cư trú ngoài đảo

(chim yến đảo) thuộc phân loài Aerodramus fuciphagus germani và chim yến làm tổ trong nhà ở đất liền (chim yến nhà) thuộc phân loài A f amechanus So sánh phân tích

di truyền cho thấy, quần thể yến nhà A f amechanus ở Việt Nam có sự tương đồng

với các quần thể phân loài chim yến này ở Malaysia và Thái Lan Trong khi đó, nghiên cứu của Lê Hữu Hoàng, Đặng Thúy Bình (2013) nhận định về mặt di truyền chim yến Việt Nam phân thành 3 nhóm, trong đó, quần thể chim yến đảo Khánh Hòa và Côn Đảo có khả năng là phân loài đặc hữu ở Việt Nam, quần thể chim yến ở Trảng Bom -

Đồng Nai có thể có nguồn gốc từ phân loài A f vestitus, quần thể chim yến ở Kiên Giang có thể có nguồn gốc từ phân loài A f amechanus

Thực tế này đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu bảo tồn một cách hợp lý và kịp thời để nguồn tài nguyên tổ yến tránh bị khai thác quá mức Đồng thời vạch ra phương hướng bảo vệ quần thể loài chim yến tự nhiên trong tương lai Vì

những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài ―Ứng dụng chỉ thị SNPs trong

nghiên cứu di truyền quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus

(Thunberg, 1812) tại khu vực Trung và Nam bộ, Việt Nam”

Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài là áp dụng phương pháp ezRAD (ez Restriction-site Associated DNA), đây là một phương pháp sử dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ

mới trong nghiên cứu cấu trúc quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus Thunberg, 1812 Trên cơ sở đó khảo sát sự khác biệt di truyền và kết

nối các quần thể chim yến phân bố ở đảo và chim yến nuôi trong nhà ở các khu vực

địa lý khác nhau

Ý nghĩa của đề tài

 Nghiên cứu sử dụng thành công phương pháp ezRAD ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới để xây dựng dữ liệu bộ gen chim yến

 Nghiên cứu cung cấp dữ liệu đầu vào về cấu trúc và kết nối quần thể chim yến

tổ trắng làm cơ sở cho việc xây dựng chiến lược bảo tồn và quản lý nguồn lợi

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus được thu từ tháng 5/2016 đến tháng

3/2017 tại khu vực Nam Trung Bộ (Nha Trang – Khánh Hòa), Khu vực Nam Bộ (Côn

Đảo, Kiên Giang), Việt Nam

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Trường Đại học Nha Trang

Nội dung nghiên cứu

 Thu mẫu chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus bao gồm yến đảo (Khánh

Hòa, Côn Đảo) và yến nhà (Khánh Hòa, Kiên Giang)

 Phát hiện các chỉ thị phân tử SNPs ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc quần thể

chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus

 Khảo sát cấu trúc và kết nối quần thể chim yến tổ trắng giữa các khu vực nghiên cứu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu

Việt Nam có đường bờ biển dài, nhiều đảo và nhiều dãy núi nhô ra biển hình thành các hang đá tự nhiên cũng là nơi sinh sống lí tưởng của nhiều loài chim đặc biệt là chim

yến (Nguyen và ctv, 2002) Khí hậu ở đây cũng khá thích hợp để chim yến sinh sống với

số ngày nắng trong năm nhiều hơn số ngày mưa, nhiệt độ trung bình hàng năm khoảng

27ºC, độ ẩm trong năm luôn duy trì ở mức cao trên 75% Vì vậy, nước ta rất thuận lợi cho việc phát triển nghề nuôi chim yến đảo và nghề nuôi chim yến đảo thiên nhiên tại Việt Nam đã hình thành từ rất lâu đời (Koon và Cranbrook, 2002)

 Khu vực Trung bộ

Khu vực Trung bộ là một dải đất hẹp chạy dọc từ Bắc đến Nam, một bên là Biển Đông ở phía đông và phía tây là dãy Trường Sơn (Nguyễn Quang Kim, 2005) Địa hình nơi đây bao gồm đồng bằng ven biển và núi thấp, có chiều ngang theo hướng Đông- Tây Dải đất bị chia cắt bởi dãy Trường Sơn vươn ra đến tận biển nên đồng bằng miền Trung nhỏ, hẹp bị cắt xẻ mạnh tạo ra nhiều vũng, vịnh, đầm phá, sông suối,… (Trần Viết Ôn và ctv, 2005) Đồng thời nơi đây có khá nhiều đảo và quần đảo, nhiều vách đá, khe đá khá kín gió

Khu vực Trung Bộ chịu sự ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hai mùa

rõ rệt là mùa mưa và mùa khô (Lê Đức Minh, 2005) Mùa khô ở đây kéo dài 8 tháng, lượng mưa chỉ chiếm 20-25% lượng mưa cả năm, có những tháng hầu như không mưa, lượng mưa trung bình vào các tháng mùa khô khoảng 40 mm/tháng, nhiệt độ trung bình năm khoảng 27 ºC, có mùa đông ít lạnh và độ ẩm quanh năm luôn duy trì trên 75% (Trần Viết Ôn và ctv, 2005)

 Khu vực Nam bộ

Khu vực Nam Bộ gồm 17 tỉnh và 2 thành phố, là một trong những khu vực phát triển kinh tế trọng điểm của nước ta (Lê Bá Thảo, 1998) Khu vực Nam bộ chia thành hai vùng rõ rệt là miền Đông và miền Tây Địa hình nơi đây khá bằng phẳng, độ cao trung bình từ 20-200m, có đủ các dạng địa hình như đồng bằng, núi rừng, biển đảo; hệ thống sông ngòi, kênh rạch dày đặc Hệ sinh thái nhiệt đới và cận xích đạo khá đa dạng, rừng ngập mặn, hệ sinh thái ngập nước, hệ sinh thái cửa sông, hệ sinh thái biển đảo Nam Bộ nằm trong vùng khí hậu đặc trưng nhiệt đới gió mùa và cận xích đạo, nền nhiệt ẩm phong phú, ánh nắng dồi dào Biên độ nhiệt giữa ngày và đêm của các tháng

trong năm thấp, ôn hòa, ít thiên tai Độ ẩm trung bình hàng năm khoảng 80-82% Khí hậu hình thành trên hai mùa chủ yếu là mùa khô và mùa mưa (Phạm Thanh, 2010) Như vậy, khu vực Nam Bộ có khí hậu, không khí, địa hình khá đa dạng và lí tưởng rất thích hợp để chim yến tổ trắng làm tổ và sinh sống, góp phần phát triển và bảo tồn loài chim mang lại hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao này

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.2.1 Hệ thống phân loại chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus

Chim yến là tên gọi để chỉ chung cho các loài thuộc họ Apodidae Các loài chim trong họ này đều có chung đặc điểm là kích thước nhỏ, ăn côn trùng và có thể điều khiển hướng bay trong hang tối bằng cách sử dụng âm thanh (Madway và Pye, 1977)

Họ Apodidae gồm 2 phân họ, 4 tông, 20 giống với khoảng 96 loài (Phil và

Gerald, 2000) Cho đến nay, việc phân loại các loài yến thuộc hai giống Aerodramus

và Collocalia vẫn chưa rõ ràng, các loài trong giống Aerodramus đôi khi vẫn được sắp xếp vào giống Collocalia (Chantler và ctv, 2000) Việc phân loại yến nói chung là

phức tạp, với ranh giới giữa các giống và loài còn nhiều tranh cãi, đặc biệt là ở tông

Collocalini Phân tích hành vi và kiểu phát ra âm thanh không cho kết quả khả quan do

tiến hóa song song, trong khi các phân tích về các đặc điểm hình thái và các gen khác

nhau cho các kết quả chưa rõ ràng và thậm chí có phần mâu thuẫn (Thomassen và ctv,

2005) Sai khác di truyền (genetic divergence) giữa các phân loài yến trong đó có

Aerodramus là rất ít (xấp xỉ 1,8%), còn trong một phân loài thì sai khác còn ít hơn

(khoảng 0,5%) Nhiều nhà khoa học đã nhất trí xếp các loài chim yến có thể dò tìm đường trong bóng tối, sống và làm tổ ở nơi có cường độ ánh sáng mờ tối đến tối vào

giống Aerodramus Giống này có nhiều loài, trong đó một số loài có chung đặc điểm là

cho tổ ăn được (Medway, 1977)

Cho đến nay, tổ của 3 loài chim yến được thương mại hóa gồm yến tổ trắng

Aerodramus fuciphagus (hay còn gọi là yến hàng, yến lông xám), yến xiêm Aerodramus maximus, yến Ấn Độ Aerodramus unicolor (Ali, 1996; Wells, 1999) Trong đó, 2 loài yến A maximus và A unicolor sử dụng nước bọt trộn lẫn lông và cỏ

để xây tổ; riêng loài A fuciphagus chỉ sử dụng nước bọt để làm tổ nên tổ của chúng

được đánh giá khá cao về mặt dinh dưỡng và giá cả trên thị trường so với tất cả các

loại tổ yến khác (Nguyen và ctv, 2002)

Theo hệ thống phân loại sinh vật quốc tế (Integrated Taxonomic Information

System – ITIS) năm 2008, chim yến tổ trắng Aeroramus fuciphagus có vị trí phân loại

nhƣ sau:

Giới: Animalia

Ngành: Chordata

Phân ngành: Vertebrata Lớp: Aves

Bộ: Apodiformes (Peters, 1940) Họ: Apodidae (Hartert, 1897)

màu nâu đen hạt nhãn, cằm màu nâu xám bạc tạo thành vòng cườm Chim bao gồm 7 lông cánh thứ cấp, 10 lông cánh sơ cấp, lông đuôi thứ cấp gồm 10 lông

Chim yến đảo có chiều dài cánh dài 124 mm, lông đuôi có chiều dài trung bình 50,1 mm, chiều dài cẳng chân trung bình dài 11 mm, ống chân chiều dài trung bình 21 mm.Trong khi đó các chỉ số về chiều dài mỏ, lông đuôi, chiều dài cẳng chân của chim yến nhà đều thấp hơn so với chim yến đảo Chim yến nhà có chiều dài mỏ trung bình 2

mm, chiều dài cánh 122 mm, lông đuôi dài trung bình 45 mm, chiều dài cẳng chân 10,9

mm, chiều dài ống chân trung bình 21 mm, móng chân dài trung bình 4 mm

1.2.3 Phân bố

Chim yến tổ trắng A fuciphagus được phân bố ở vùng Đông Nam Á là chính

(Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam,…) và một số vùng ven biển thuộc Ấn Độ

(Hình 1.2)

Vùng chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus sinh sống

Hình 1.2 Bản đồ phân bố của chim yến Aerodramus fuciphagus

(Nguồn: http://humanimalab.org/archives/772)

Ở Việt Nam chim yến tổ trắng A f germani được tìm thấy ở các đảo phân bố từ

Quảng Bình đến Côn Đảo, trong đó Khánh Hòa là địa phương có số lượng quần thể và

sản lượng cao nhất cả nước Chim yến nhà A f amechanus phân bố tại các tỉnh từ

Thanh Hóa đến Cà Mau và các tỉnh phía tây như Bình Phước, Đăk Lăk (Hình 1.3)

(Nguyen và ctv, 2002) Tính đến tháng 3 – 2017, theo nghiên cứu của Sở khoa học và

đề xuất các giải pháp phát triển nghề nuôi chim yến bền vững tại Việt Nam cả nước có

5.069 nhà yến trên 36 tỉnh thành Trong số đó số lượng nhà yến tại Tiền Giang, Thành phố Hồ Chí Minh và Kiên Giang là cao nhất cả nước với trên 500 nhà yến Đặc biệt có thêm một số tỉnh thành miền Bắc và Tây Nguyên phát triển nghề nuôi chim yến là Hải Phòng, Quảng Ninh, Gia Lai, Kon Tum,…

Hình 1.3 Bản đồ phân bố chim yến tại Việt Nam

(Nguồn:http://www.baomoi.com/tinh-hinh-nuoi-chim-yen-va-phuong-huong-quy-hoach/) Tuy nhiên mới đây theo nghiên cứu của Lê Hữu Hoàng và ctv (2014) nhận định

về mặt di truyền chim yến Việt Nam phân thành 3 nhóm, trong đó, quần thể chim yến đảo Khánh Hòa và Côn Đảo có khả năng là phân loài đặc hữu ở Việt Nam, quần thể

chim yến ở Trảng Bom – Đồng Nai có thể có nguồn gốc từ phân loài A f vestitus, quần thể chim yến ở Kiên Giang có thể có nguồn gốc từ phân loài A f amechanus

Theo thống kê sơ bộ, số lượng đảo yến toàn quốc khoảng trên 50 đảo với trên 180 hang yến Trong đó Công ty yến sào Khánh Hòa quản lý 32 đảo yến với 169 hang yến (Lê Hữu Hoàng và ctv, 2015) Một số đảo yến nổi tiếng ở Khánh Hòa như: hòn Nội,

hòn Ngoại (Hình 1.4), hòn Mun, hòn Tre, hòn Đối, hòn Ngọc, hòn Hố…

Hình 1.4 Đảo yến Hòn Nội (A)-Hòn Ngoại (B) tại Khánh Hòa

(Nguồn: http://yensaokhanhhoa.vn)

1.2.4 Hành vi, tập tính

Loài chim yến sống thành quần đàn, làm tổ từng cặp riêng lẻ; cũng có một số con thích sống đơn lẻ, những con này khó dẫn dụ vào nhà Chúng sống ở chỗ gần nước (sông, hồ, biển), kiếm ăn ở các đồng ruộng, rừng cây thấp, nơi đây sản sinh ra nhiều loại côn trùng bay là nguồn thức ăn yêu thích của chim yến (Nguyen và ctv, 2002) Tùy theo đặc điểm thời tiết từng ngày, từng mùa trong năm, sự xuất hiện của chim yến ở các vùng có những sự khác nhau Thời gian chim rời tổ kiếm ăn tùy thuộc vào mùa Quan sát camera hồng ngoại lắp tại các hang yến và nhà yến thu được kết quả về thời gian chim yến rời tổ đi kiếm ăn, về lại tổ nghỉ ngơi của chim yến đảo và chim yến nhà là khác nhau Đối với chim yến đảo thời gian đi vào lúc 4h00-4h30, vào mùa đông thì trễ hơn vào lúc 5h00.Thời gian về vào lúc 19h00-20h00, vào mùa đông thì sớm hơn vào lúc 18h30 Còn đối với chim yến nhà thì thời gian đi lúc 5h00 - 5h30, vào mùa đông thì trễ hơn vào lúc 6h00 và thời gian về lúc 18h00 - 18h30, vào mùa đông thì sớm hơn vào lúc 17h30 Chim yến đảo rời tổ đi kiếm ăn sớm hơn và về tổ muộn hơn chim yến nhà Điều này có thể được giải thích là vì quãng đường đi kiếm ăn

và về lại tổ của chim yến đảo xa hơn chim yến nhà (Lê Hữu Hoàng và ctv, 2012) Đối với chim yến trong giai đoạn không nuôi chim con thì chúng rời tổ đi kiếm

ăn từ sáng cho đến chiều tối mới về tổ nghỉ ngơi Những cặp chim đang ấp thì luân phiên nhau về ấp trứng Những cặp chim đang nuôi chim con tùy thuộc vào chim con

lớn hay nhỏ mà chim bố mẹ quay về tổ cho chim con ăn nhiều hay ít (Nguyen và ctv,

2002) Môi trường sống vi mô của chim yến phải đảm bảo các điều kiện thích hợp: nhiệt độ không khí nằm trong phạm vi 27-31ºC; độ ẩm không khí 70-85%; ánh sáng nhỏ hơn 0,4 lux; là nơi yên tĩnh, an toàn, ít sự đe dọa của thú săn mồi; có lối bay vào

và bay ra dễ dàng Chim sống thành từng cặp, rất chung thủy với lứa đôi và trung thành với nơi ở của chúng, đường bay đi và về nơi ở khá ổn định và chúng không thích làm tổ ở những nơi có độ cao trên 500 m so với mực nước biển Tuy nhiên, chúng rất nhạy cảm với sự thay đổi ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm nơi chúng làm tổ Nếu những yếu tố này không phù hợp hoặc thay đổi thì chúng sẽ bỏ đi nơi khác và không bao giờ quay trở lại (Nguyễn Khoa Diệu Thu và ctv, 2009)

Chim yến là loài chim có thể bay lượn và bay xa đến 100 km để kiếm ăn (Lê Hữu

Hoàng và ctv, 2010), có lúc lên đến 160 km/h (Nguyen và ctv, 2002) Vùng kiếm ăn

của chim yến có thể thay đổi theo mùa, chúng bay vào đất liền để kiếm ăn Chim có một đặc điểm là lượn quanh vòng tròn với đường kính tối thiểu là 4 m và khó bẻ quặt đường chim bay khi đổi hướng, tối thiểu cần 1,53 - 2,13 m Trong thực tiễn của nghề nuôi chim yến, cần tránh ép chim thay đổi đường bay, vì như vậy sẽ ảnh hưởng đến sự

phát triển của đàn yến (Nugroho và ctv, 2000) Chim yến có khả năng nhìn tốt, mũi và

tai nghe rất thính Giác quan của nó khá nhạy nên có thể nhận biết được kẻ thù và

những nguy hiểm trong môi tường xung quanh (Nguyen và ctv, 2002)

1.2.5 Khả năng định vị bằng tiếng vang

Một trong những đặc trưng của chim yến là khả năng định vị bằng tiếng vang được

tìm thấy ở một số loài, bao gồm chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus) và chim yến

tổ đen (Aerodramus maximus) Sự định vị bằng tiếng vang là khả năng phát hiện ra sự

hiện diện của vật thể bằng cách phát ra âm thanh và phân tích tiếng dội trở lại qua sự nghe

của tai (Pye và ctv,1980) Tiếng vang của chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus là

gấp đôi bình thường, bao gồm hai xung âm liên tiếp dài 1-2 phần nghìn giây Xung âm thứ 2 luôn có biên độ cao hơn, mặc dù sự biến thiên chỉ ở mức độ chênh lệch Các tiếng vang của các loài chim khác nhau cho thấy các đỉnh tần số khác nhau và do đó cho phép từng con nhận ra tiếng vọng của riêng mình (Medway và Pye, 1977)

1.2.6 Thức ăn và cách thức bắt mồi

Thức ăn hàng ngày chủ yếu của chim yến là côn trùng có kích thước nhỏ (0,01- 0,72 g) bay trong không khí: ong bắp cày, ong nhỏ, phù du, kiến cánh, mối, ruồi, muỗi,

bọ gậy,… Thức ăn ưa thích là ong kiến chiếm 50-70%, tiếp đến là mối cánh, ruồi muỗi, bọ rầy, cào cào, … (Nguyễn Quang Phách và ctv, 1999)

Chim bắt thức ăn trong khi bay, ở độ cao dưới 30 m, theo sự phân bố của côn trùng trong không trung Thức ăn của chim con đều được chim bố mẹ bắt về và mớm cho chúng, nhìn chung chim yến non ăn thức ăn có vỏ kitin mỏng (Nguyễn Quang Phách và ctv, 1999)

1.2.7 Đặc điểm sinh sản của chim yến

Thời gian sinh sản bắt đầu từ tháng 12, kết thúc vào tháng 7 năm sau (Đinh Thị Phương Anh và ctv, 2011) Chim yến có khả năng giao phối sau 7-8 tháng tuổi Chim thường xây tổ lần đầu mất 3 tháng, lần 2 và lần 3 chỉ mất 1 tháng (trong tự nhiên) Thường trong nhà yến chim xây tổ khoảng 30-32 ngày để tạo thành cái tổ có kích

thước đủ để đẻ trứng (Nguyen và ctv, 2002)

Hình 1.5 Chim yến đang làm tổ (A) và tổ yến (B)

(Nguồn: http://yensaokhanhhoa.com.vn) Trứng chim yến đảo và chim yến nhà giống nhau và thông thường chim yến đẻ 2 quả trứng trong một lứa đẻ, trứng có màu trắng, trọng lượng khoảng 2,25 g Đối với chim yến đảo thời gian đẻ giữa trứng 1 và trứng 2 khoảng 1 đến 4 ngày Sau khoảng

26 – 28 ngày cả 2 quả trứng đều nở, quả trứng đầu tiên nở khoảng 23- 24 ngày Thời gian nở quả trứng thứ nhất và trứng thứ 2 cách nhau khoảng 1 -4 ngày

Đối với chim yến nhà thời gian đẻ giữa trứng 1 và trứng 2 khoảng 2 đến 6 ngày Sau khoảng 25 -27 ngày thì cả 2 quả trứng đều nở, quả trứng đầu tiên nở khoảng 22 –

23 ngày Thời gian nở của trứng thứ nhất và trứng thứ 2 cách nhau khoảng 2 -3 ngày Con non: quan sát con non mới nở có trọng lượng trung bình 1,5g Sau khi nở khoảng

1 ngày tuổi chim non phát tín hiệu đòi ăn, chim bố mẹ bắt đầu mớm mồi cho con, một

ngày trung bình 3 lần/ngày Thời điểm mớm mồi tập trung vào lúc 7 giờ và 19 giờ trong ngày Khi xuất hiện lông cánh, chim non bắt đầu vỗ cánh tập bay Số lần vỗ cánh tăng theo tuổi Sau khi nở 41-51 ngày chim đã đủ khỏe mạnh và rời tổ và 7 tháng sau

chim sẽ giao phối và sinh sản (Nguyen và ctv, 2002)

Hình 1.6 Chim con 2 ngày tuổi (A) và chim tập bay (B)

(Nguồn: http://yensaokhanhhoa.com.vn )

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.3.1 Tổng quan về giải trình tự thế hệ mới (NGS)

Nhu cầu của công nghệ mang tính cách mạng chưa bao giờ lớn như hiện nay với mục đích phân tích thông tin toàn bộ bộ gen một cách nhanh chóng, kinh tế và chính xác Thách thức này chính là động lực thúc đẩy sự phát triển các công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing – NGS) Khả năng tạo ra lượng lớn các dữ liệu về trình

tự là lợi thế cơ bản so với phương pháp chuẩn trước đó (Sanger) (Michael và ctv, 2010) Nguyên tắc chung của phương pháp là DNA bộ gen được cắt thành những đoạn DNA ngắn, sau đó các đoạn này sẽ được gắn adapter vào hai đầu Các đoạn DNA sau

đó được gắn trên bề mặt flow cell, dùng PCR với đoạn mồi đặc hiệu khuếch đại các đoạn DNA và giải trình tự

So với các phương pháp giải trình tự cũ như Sanger chỉ có thể giải trình tự ở mức 1500bp, thì phương pháp giải trình tự thế hệ mới có thể giải trình tự từ 8-600 Gbase, đồng nghĩa với việc là giải trình tự toàn bộ hệ gen (Phạm Hùng Vân, 2012) Giải trình tự thế hệ mới cho phép xử lý hàng triệu chuỗi đọc song song so với 96 tại một thời điểm Với việc cho phép tạo ra một lượng lớn dữ liệu so với các công cụ giải trình tự truyền thống, từ đó số lượng các nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực sinh học cũng tăng theo

1.3.2 Tổng quan về Restriction site Associated DNA Sequencing (RAD - Seq)

Kỹ thuật RADseq là chiến lược giải trình tự những phân đoạn DNA của bộ gen, được thiết kế để truy vấn 0,1 – 10% bộ gen Bằng cách sử dụng enzyme cắt giới hạn để

phân cắt DNA bộ gen thành những phân đoạn ngắn và được gắn các adapter vào 2 đầu thì số lượng lớn các biến thể di truyền như Single-Nucleotide Polymorphism (SNPs)

có thể được xác định từ những dữ liệu trình tự DNA (Baird và ctv, 2008)

Hiện nay, phương pháp RAD đang được sử dụng và phát triển với nhiều kỹ thuật

như: mbRAD (Miller và Cribb, 2007; Baird và ctv, 2008), genotype by sequencing (GBS) (Elshire và ctv, 2011), 2-enzyme BGS (Poland và ctv, 2012), 2b-RAD (Wang

và ctv, 2012), double digest RAD (ddRAD) (Peterson và ctv, 2012) và EzRAD (Toonen và ctv, 2013) Mỗi phương pháp đều có những ưu và khuyết điểm khác nhau,

do đó tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm mà lựa chọn phương pháp phù hợp

1.3.3 Tổng quan về EzRAD

EzRAD là kỹ thuật mới được phát triển tại trường Đại học Texas, Hoa Kỳ, nhằm thu thập các thư viện bộ gen ứng dụng trong nghiên cứu di truyền quần thể, sử dụng bộ

kit TruSeq Nano DNA Library Preparation (Toonen và ctv, 2013) EzRAD sử dụng

các enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme – RE) để cắt bộ gen thành những đoạn ngắn mong muốn mà không cần đòi hỏi mỗi enzyme phải tương thích cho một đoạn nối adapter Việc dùng enzyme giới hạn cắt thành các đoạn ngắn giúp cho giải trình tự được lượng lớn DNA trên toàn bộ hệ gen Tiếp theo, phản ứng PCR được tiến hành với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại các đoạn DNA, và tiến hành giải trình tự Phương pháp này có thể phân tích kiểu gen để suy ra cấu trúc quần thể với thao tác thực hiện nhanh chóng và chi phí hợp lí Với kỹ thuật ezRAD nhiều cá thể có thể được gộp chung với nhau mà không cần tách các trình tự riêng biệt Như vậy, sẽ tiết kiệm

được thời gian và chi phí lớn, đặc biệt là khi số lượng cá thể lớn (Sham và ctv, 2002)

Phương pháp ezRAD sử dụng hai enzyme cắt giới hạn MboI và Sau3AI đều có vị trí nhận biết là GATC nhưng độ nhạy về tính methyl hóa khác nhau nhằm tạo ra những phân đoạn có kích thước phù hợp khi giải trình tự (300- 500 bp) thay vì sử dụng bước phá mẫu siêu âm sau khi cắt enzyme như phương pháp cơ bản mbRAD (Toonen và

ctv, 2013) Những phân đoạn DNA được gắn adapter theo bộ kit thương mại không

phải thiết kế theo từng loại enzyme, nhằm cho phép các nhà nghiên cứu có thể thử nghiệm và lựa chọn loại enzyme tối ưu cho từng hệ gen Quá trình tạo thư viện gen

được thể hiện ở Hình 1.7

Hình 1.7 Quá trình tạo thư viện gen bằng phương pháp EzRAD

Một biến thể được coi là SNPs khi tần suất xảy ra sự thay đổi của 1 hoặc hơn 1

nucleotide trong đoạn trình tự dài 1000 nucleotide (Pierce và ctv, 2003) Không giống

như đột biến, SNPs không nhất thiết nằm trong các gen, và chúng không phải lúc nào cũng ảnh hưởng đến chức năng của một protein SNPs chia làm 2 loại chính: SNPs liên kết không nằm trong vùng mã hóa và SNPs nằm trong vùng mã hóa Các SNPs không nằm trong vùng mã hóa thường không gây ảnh hưởng đến chức năng của protein Các SNPs nằm trong vùng mã hóa sẽ làm thay đổi trình tự acid amin của protein nên thường gây ảnh hưởng đến chức năng của protein từ đó biểu hiện kiểu hình gây bệnh hoặc tác động đến các phản ứng đáp ứng của cơ thể đôi khi có các yếu tố tác

động (Gupta và ctv, 2001)

Tập hợp SNPs giữa các cá thể có sự khác biệt với tỷ lệ hơn 90%; do đó rất hữu

hiệu cho việc nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể và lập bản đồ gen (Frohlich và ctv, 2004); chúng ổn định hơn so với các marker DNA khác nên phù hợp trong việc đánh dấu và lựa chọn SNPs di truyền như là các biến thể allen (Beuzen và ctv, 2000)

Do đó, bất cứ công bố nào về SNPs phải hàm chứa hai nội dung là xác định trình tự chuỗi DNA và tần số alen Điều quan trọng là SNPs có thể xuất hiện ở vùng gen mã hoá, tác động trực tiếp đến tính trạng quan tâm, rất hiệu quả trong việc xác định mối

tương quan giữa SNPs và tính trạng nào đó (Beuzen và ctv, 2000) SNPs tồn tại khá

nhiều và xuyên suốt bộ gene Bởi tính đa dạng cả về số lượng lẫn mức độ phân bố trong suốt toàn bộ bộ gene, nên SNPs được sử dụng như một chỉ thị phân tử nghiên cứu di truyền quần thể (Pierce, 2003)

Ngày nay có rất nhiều phương pháp để phát hiện SNPs bao gồm phương pháp lai (lai allen đặc biệt, SNPs microarray), phương pháp sử dụng các enzyme (RFLP, PCR, phương pháp kéo dài mồi, sử dụng 5’- nuclease,…), các phương pháp dựa trên tính chất vật lý của DNA đối với các sản phẩm PCR (SSCP, điện di gradient nồng độ, sắc

ký lỏng cao áp biến tính,…), và phương pháp giải trình tự (Jehan và ctv, 2006)

Ngoài ra, chiến lược trực tiếp điển hình để khám phá các SNPs là giải trình tự các sản phẩm nhân bản các locus đặc thù (locus specific amplification- LSA), từ nhiều cá thể hoặc xác định trình tự các chuỗi thể hiện được đánh dấu (giải trình tự các EST)

(Twyman và ctv, 2004; Suh và ctv, 2005) Các chiến lược trực tiếp khác có thể kể như sau: giải trình tự toàn bộ hệ gen hoặc giải trình tự các vùng đại diện (Guryev và ctv,

2005) Phân tích trực tiếp từ sự khác nhau trong trình tự giữa nhiều cá thể với số lượng

các locus lớn có thể đạt được bởi công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Schadt và ctv,

2010) Giải trình tự lại hay tái giải trình tự (re-sequencing) được sử dụng để xác định

sự thay đổi ở các cá thể cho các chỉ thị di truyền phân tử và thấy được vai trò của gen

(Vermeer và ctv, 2010 ) Quá trình tái giải trình tự toàn bộ genome (whole genome

re-sequencing) sử dụng công nghệ đọc ngắn (short read technology) bao gồm sự so sánh những bộ hàng triệu chuỗi đọc lần lượt từng nucleotide với chuỗi genome so sánh Bằng kỹ thuật này có thể xác định được sự biến đổi trong chuỗi nucleotide của mẫu nghiên cứu và đối chứng

Mặc dù SNPs thể hiện sự ưu việt hơn các kỹ thuật khác và có khá nhiều phương pháp để tìm SNPs, nhưng vẫn có một số nhược điểm như sự hạn chế như số lượng alen

ít, mỗi điểm đánh dấu ít thông tin; số lượng mẫu DNA sử dụng nhiều hơn so với microsatellite

1.4 Tình hình nghiên cứu di truyền bộ chim yến (Apodiformes) trên thế giới và tại Việt Nam

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có nhiều nghiên cứu tập trung vào mối quan hệ phát sinh loài chim

yến (Lee và ctv,1996; Thomassen và ctv, 2003, 2005; Thomassen và Povel, 2006; Parkert và ctv, 2012), khả năng định vị bằng tiếng vang (Price và ctv, 2004, 2005), tập tính (Fullard và ctv, 2010),… Tại châu Á, chim yến là nguồn tài nguyên quý hiếm

nhưng các nghiên cứu tại các nước sử dụng nguồn lợi vẫn chưa thực sự đi sâu vào đa dạng di truyền và xây dựng cấu trúc quần thể

Theo Sankaran (2001), loài yến Collocalia fuciphaga hiện bị khai thác quá mức tại

quần đảo Andaman và Nicobar, Ấn Độ Số lượng chim yến được đánh giá thông qua số lượng tổ, và sự sụt giảm trong số lượng chim yến ước tính qua những thay đổi trong sản lượng tổ Sự suy giảm trong sản lượng tổ yến ở các đảo Andaman, giữa hiện tại và 5 - 8 năm trước (195 hang động) là 61%, và hơn 10 năm trước (45 hang động) là 83% Tùy thuộc vào chiến lược thu hoạch tổ, sự giảm năng suất trong quần đảo Nicobar khoảng từ

40 đến 95% Tác giả cho rằng các biện pháp bảo vệ cần phải được thực hiện khẩn trương, đồng thời đề xuất các biện pháp đã được áp dụng tai Indonesia nên được phát triển như là một biện pháp bảo tồn chuyển vị tại quần đảo Andaman và Nicobar

Thomassen và ctv (2003) đánh giá sự phát sinh chủng loại mới của chim yến dựa vào trình tự Cytochrom b thuộc DNA ty thể (mtDNA), kích thước của trình tự thu

được là 1143 bp lớn hơn so với dữ liệu của Lee và ctv, 1996 (996 bp), phân tích đã đưa ra nhiều nhóm phát sinh Tuy nhiên, vị trí phân loại của giống Hydrochous vẫn

không như mong đợi cần bổ sung phân tích ở nhiều nguồn gen bảo tồn và thu thêm nhiều mẫu, điều quan trọng là nghiên cứu đã giải quyết được Collocalini là một nhóm đơn Cấu trúc quần thể của nhóm cũng cho thấy giống không sử dụng tiếng vang tông

Collocalia và giống dùng tiếng vang Aerodramus là 2 nhóm tách biệt

Thomassen và ctv (2005) xây dựng cây phát sinh loài bằng cách phân tích riêng

biệt và kết hợp 3 trình tự: DNA ty thể 12S rRNA, beta- fibrinogen intron 7 (Fib 7) và

Cyt b của 6 loài chim yến lớn (Hydrochous spp.), 2 loài chim yến nhỏ (Aerodramus

spp.) và một nhóm của loài chim ruồi tại Malaysia và Australia Kết quả là loài

Hydrochous gigas xếp gần gũi với nhánh Aerodramus và các nhóm yến tạo thành

nhánh đồng nhất (monophyletic group)

Aowphol và ctv (2008) khảo sát sự khác biệt di truyền giữa các quần đàn chim

yến Aerodramus fuciphagus nuôi tại Thái Lan sử dụng 2 gen mtDNA (Cyt b và ND2)

và 8 chỉ thị microsatellite Nghiên cứu này được thực hiện bằng cách lấy mẫu 10 quần thể chim yến tổ trắng dọc theo bờ biển của vịnh Thái Lan và Andaman (Thái Lan) trong thời gian từ năm 2003-2006 Mặc dù mức độ đa dạng di truyền dựa trên các chỉ thị microsatellites khá cao nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê Việc thiếu sự khác biệt di truyền giữa các đàn chim yến nhà có thể là kết quả của sự chuyển gen (gene flow) giữa các quần thể với quy mô lớn Kết quả nghiên cứu cho rằng loài

Aerodramus fuciphagus nuôi gần đây đã thành lập đàn ở Thái Lan nên được xem là

thành viên của một quần thể giao phối ngẫu nhiên Nghiên cứu mở ra định hướng xem xét sự giao phối ngẫu nhiên này là ổn định hay chỉ là kết quả tạm thời do sự phát triển

số lượng các đàn chim yến nuôi trong nhà

Hệ phân loại chim yến ở Đông Nam Á (Apodidae, Collocaliini) về hình thái đã gặp nhiều khó khăn vì những thay đổi về kích thước và màu sắc giữa các loài chim yến phân bố ở các vùng khác nhau Chính vì vậy Cranbrook và ctv (2013) tiến hành nghiên cứu về hình thái và di truyền các loài chim yến tổ trắng được nuôi trong nhà tại Malaysia Hai loài chim yến phân bố chủ yếu ở Malaysia, được xác định là chim yến

đuôi xám Aerodramus inexpectatus, với các phân loài A i germani và A i perplexus,

và chim yến Aerodramus fuciphagus, với các phân loài A f fuciphagus và A f vestitus Chim yến nuôi trong nhà ở phía nam Thái Lan, bờ biển phía đông và phía tây

của bán đảo Malaysia, Sarawak thuộc Malaysia; Java và phía đông nam Kalimantan thuộc Indonesia trong thời gian từ năm 2003- 2010 đã cho thấy sự khác biệt về màu sắc ở lông đuôi Chim yến nhà ở Sarawak không giống với những loài chim yến tự nhiên trong cùng một khu vực phân bố Các mẫu phôi chim yến đã đƣợc thu tại các nhà yến ở Medan, Sumatra thuộc Indonesia; Sibu và Sarawak thuộc Malaysia cho các nghiên cứu di truyền Kết quả phân tích sự phát sinh loài, các giá trị AMOVA và FSTpairwise đƣợc phân tích dựa trên chuỗi cytochrome b Trong số 11 haplotype đƣợc xác

định, có 2 haplotype thuộc quần thể chim yến đuôi nâu tự nhiên A f vestitus ở miền

trung Baram, Sarawak, có sự khác biệt về mặt di truyền với chim yến nhà Có 1 haplotype phổ biến ở tất cả các quần thể yến nhà, 2 haplotype là đặc hữu ở Medan, 3 haplotype ở Kuantan và 1 haplotype ở Endau-Rompin Các loài chim yến từ Sarawak

có sự chia sẻ haplotype chung với tất cả các quần thể chim yến nhà ở bán đảo Malaysia và Medan, Sumatra Bằng chứng cho hai nhóm chim yến thuộc các mẫu yến nhà chứng minh rằng chim yến ở bán đảo Malaysia là sự kết hợp di truyền giữa loài

chim yến ở phía bắc (A inexpectatus germani) và phía nam (A fuciphagus) Chim yến

nhà Sarawak có các đặc điệm về bộ lông và gen giống với quần thể chim yến ở phía đông bán đảo Malaysia, và rõ ràng là đã có sự di nhập tự phát từ Bán đảo Malaysia Nếu các con lai đƣợc tạo ra ở quần thể chim yến nhà tại Malaysia, thì chúng có thể đƣợc xếp thành một loài mới dựa theo Quy tắc Quốc tế về Danh mục Động vật học

Kolade (2013), tiến hành nghiên cứu chứng minh sự đa dạng di truyền của A fuciphagus thuộc 6 quần thể bao gồm Sungkai, Kota, Kuala Terergganu, Gua Madai và

Pitas thuộc Malaysia, Tanah Merah (Singapo), dựa trên việc phân tích 7 gen thuộc DNA

ty thể (Cytb, ND2, ND3, ND5, 12S rRNA, 16S rRNA và COI) Kết quả giải trình tự của DNA thể hiện đƣợc 33 haplotype Cytb và ND2 có sự đa dạng cao nhất với 8 haplotype, 12S rRNA thu đƣợc 5 haplotype, 16S rRNA thu đƣợc 6 haplotype, COI thu đƣợc 4 haplotype, ND5 thu đƣợc 5 haplotype và ND3 chỉ thu đƣợc 1 haplotype Tính toán sự khác biệt di truyền mtDNA không cho thấy cấu trúc di truyền trong và giữa các quần đàn của chúng Việc chia sẻ haplotype chứng tỏ có sự di nhập gen giữa các quần thể

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Các nghiên cứu về di truyền quần thể loài chim yến (Aerodramus spp.) tại Việt

Nam, tập trung chủ yếu vẫn là những nghiên cứu về hình thái, đặc điểm sinh học cũng nhƣ các vấn đề về khai thác và giá trị dinh dƣỡng của tổ yến Một số nghiên cứu điển

hình như của Nguyễn Quang Phách (1993) công bố về cơ sở khoa học của việc khai

thác hợp lý, bảo vệ và phát triển nguồn lợi chim yến hàng (Collocakia fuciphaga germani Oustalet - 1876); Nguyễn Khoa Diệu Thu và ctv (2009) đã tiến hành công bố

nghiên cứu nuôi thử nghiệm chim yến trong nhà để lấy tổ tại bán đảo Phương Mai- Bình Định; Lê Hữu Hoàng và ctv (2012) nghiên cứu và đưa ra kỹ thuật nuôi chim yến khoa học và thực tiễn để phát triển nghề nuôi chim yến tại Việt Nam

Chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus là loài khó phân biệt giới tính khi dựa

vào hình thái bên ngoài, nên việc xác định dựa vào hình thái bên ngoài là việc hết sức khó khăn (Hoyo và ctv, 1999) Chính vì lẽ đó năm 2013, Hồ Thị Loan và ctv tiến hành

sử dụng phương pháp PCR để xác định giới tính của chúng với cặp mồi 2550F và 2718R (Fridolfsson và Ellegren, 1999) dựa trên vùng gen CHD (Chromodomain helicase DNA binding protein) Cặp mồi 2550F, 2718R dùng để xác định giới tính của chim không khuếch đại đồng thời hai gen CHD1Z và CHD1W của chim cái mà chỉ khuếch đại một đoạn gen có chiều dài hơn 500bp thuộc gen CHDW của chim Yến

hàng A fuciphagus Kết quả đã xác định được trình tự DNA đích có kích thước 457bp

Đối chiếu với trình tự trên Genbank cho thấy trình tự DNA thu được có độ tương đồng

cao 94% với các trình tự gen của loài CHD1W của loài Phalacrocorax carbo Tuy

không có trình tự tương đồng của loài nghiên cứu, nhưng do trình tự nghiên cứu tương đồng cao với đoạn gen CHD1W của chim nên dự đoán nó thuộc nhiễm sắc thể W Xác định thành công giới tính của 5 mẫu chim yến bằng kỹ thuật PCR trên cơ sở phân tích 2 mẫu vỏ trứng của chim yến đã ấp

Võ Tấn Phong và ctv (2016) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của việc khai thác

tổ yến đến sức sinh sản của quần thể chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus) tại

Quảng Nam từ 2012- 2013 Kết quả nghiên cứu đã cho thấy, khi không khai thác tổ, chim yến tổ trắng đẻ nhiều nhất 2 lứa/năm Sau khi đẻ lứa thứ nhất, có khoảng 53,9% tổng số chim cái đẻ lại lứa thứ hai, tỷ lệ chim non rời tổ của lứa đẻ thứ hai thấp hơn lứa đẻ thứ nhất Khi có khai thác tổ 2 vụ/năm, tỷ lệ chim làm tổ lại và tỷ lệ chim non rời tổ phụ thuộc vào thời điểm khai thác tổ vụ thứ nhất Nếu khai thác tổ sớm, tỷ lệ chim làm tổ lại và tỷ lệ chim non rời tổ cao hơn và ngược lại Kích thước, khối lượng

tổ trong vụ thứ hai giảm rõ rệt so với vụ thứ nhất Nếu khai thác tổ sau mùa sinh sản, khối lượng cơ thể chim bố mẹ giảm mạnh hơn so với quá trình giảm khối lượng cơ thể chim bố mẹ sau mùa sinh sản không có sự khai thác tổ

Lê Hữu Hoàng và Đặng Thúy Bình (2013) thực hiện về nghiên cứu về di truyền

và phân loại quần thể chim yến tại Việt Nam (Aerodramus fuciphagus) Nhóm nghiên

cứu đã thu mẫu yến tại 5 địa điểm Khánh Hòa, Bình Phước, Kiên Giang, Côn Đảo- Bà Rịa Vũng Tàu, Trảng Bom- Đồng Nai Nghiên cứu được thực hiện dựa trên chỉ thị

phân tử Cytb (mtDNA), GAPDH (genomis DNA) từ các phân loài Aerodramus fuciphagus kết hợp với các trình tự từ GenBank Kết quả cho thấy rằng yến tổ trắng ở

Việt Nam được chia làm hai nhóm chính Các mẫu đến từ Trảng Bom – Đồng Nai,

Bình Phước, Kiên Giang có mối quan hệ chặt chẽ với A f amechanus và A f vestitus

Các mẫu yến đảo từ Khánh Hòa và Côn Đảo có sự khác biệt rõ rệt với nhóm trên Phân tích dựa trên Cytb và GAPDH cho thấy quần thể yến ở Kiên Giang có thể có nguồn

gốc là A f amechanus, quần thể yến ở Trảng Bom- Đồng Nai có thể có nguồn gốc từ

A f vestitus và quần thể chim yến từ Khánh Hòa và Côn Đảo có khả năng là phân loài

đặc hữu ở Việt Nam

Hồ Thị Loan và ctv (2015) đã tiến hành nghiên cứu di truyền một số quần thể chim yến ngoài đảo và trong đất liền ở Việt Nam dựa trên một phần vùng gen Cytb mtDNA Nhóm nghiên cứu tiến hành thu thập yến đảo và trong nhà tại một số tỉnh Khánh Hòa, Bình Định, Quảng Nam, Kiên Giang, Thành phố Hồ Chí Minh và Bình Dương trong khoảng thời gian từ năm 2007- 2013 Kết quả cho thấy các quần thể chim yến cư trú

ngoài đảo (chim yến đảo) thuộc phân loài Aerodramus fuciphagus germani và chim yến làm tổ trong nhà ở đất liền (chim yến nhà) thuộc phân loài A f amechanus So sánh phân tích di truyền cho thấy, quần thể yến nhà A f amechanus ở Việt Nam có sự tương

đồng với các quần thể phân loài chim yến này ở Malaysia và Thái Lan

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu

Mẫu chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus được thu tại đảo A1 – Khánh

Hòa, Côn Đảo – Bà Rịa Vũng Tàu (yến đảo), Nha Trang – Khánh Hòa, Kiên Giang (yến nhà) từ tháng 5/2016 đến tháng 3/2017 Thông tin về địa điểm thu mẫu và số

lượng mẫu, loại mẫu được trình bày ở Bảng 2.1, Hình 2.1, Hình 2.2

Mẫu trứng đã được thụ tinh và mẫu chim yến trưởng thành được thu tại các địa điểm nghiên cứu, vận chuyển về phòng thí nghiệm trong điều kiện phù hợp Mẫu trứng được tách bỏ vỏ lấy phôi, đối với chim yến trưởng thành lấy cơ cho vào eppendorf 1,5

mL chứa cồn 96 %, bảo quản ở 4 ºC và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Hình 2.1 Mẫu chim trứng (A) và mẫu chim

yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus (B)

Hình 2.2.Địa điểm thu mẫu chim yến Vòng tròn thể hiện các địa điểm trong nghiên cứu

hiện tại