Phân lập và bước đầu định danh vi nấm biển từ vịnh nha trang

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi nấm biển phân lập được .... Tuy nhiên, hiện nay số loài nấm được mô tả khoảng 10.000 loài và chỉ định danh được khoảng 1112 trong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

-o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

PHÂN LẬP VÀ BƯỚC ĐẦU ĐỊNH DANH VI NẤM BIỂN

TỪ VỊNH NHA TRANG

Giáo viên hướng dẫn : TS PHẠM THU THỦY

Sinh viên thực hiện : HUỲNH NGÔ Ý NHI

Mã số sinh viên : 55131222

Khánh Hòa: 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Khánh Hòa, tháng 6/2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Phân lập và bước đầu định danh vi

nấm biển từ vịnh Nha Trang” được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực,

khách quan

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn đều đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều chính xác và được chỉ rõ nguồn gốc

Khánh Hòa, ngày 26 tháng 06 năm 2017

Tác giả luận văn

Huỳnh Ngô Ý Nhi

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi muốn gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp đại học

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến giáo viên hướng dẫn tôi là

TS Phạm Thu Thủy và PGS.TS Nguyễn Văn Duy đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt

nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi khi tôi thực hiện đề tài này

Bên cạnh đó, tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn đến toàn bộ Quý thầy cô của Viện Công nghệ sinh học & Môi trường đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về vi nấm biển 3

1.1.1 Giới thiệu về vi nấm biển 3

1.1.2 Phân loại vi nấm 3

1.1.3 Vai trò và ứng dụng của vi nấm biển 5

1.1.4 Nấm men 6

1.1.4.1 Khái niệm nấm men 6

1.1.4.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của nấm men 6

1.1.4.3 Dinh dưỡng của nấm men 9

1.1.4.4 Hình thức sinh sản của nấm men 10

1.1.5 Nấm mốc 11

1.1.5.1.Khái niệm nấm mốc 11

1.1.5.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của nấm mốc 11

1.1.5.3 Dinh dưỡng của nấm mốc 13

1.1.5.4 Hình thức sinh sản của nấm mốc 14

1.2 Giới thiệu về vịnh Nha Trang 15

1.3 Phương pháp định danh vi nấm biển 16

1.3.1 Định danh vi nấm bằng quan sát hình thái 16

1.3.2 Định danh vi nấm bằng kĩ thuật sinh học phân tử 17

1.3.3 Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu phân loại vi nấm 18

1.4 Một số nghiên cứu về đa dạng vi nấm biển trên thế giới và ở Vệt Nam 23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 26

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

2.2 Nguyên vật liệu 27

2.2.1 Môi trường 27

2.2.2 Thuốc nhuộm 28

2.2.3 Hóa chất khác 28

2.3 Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng 30

2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 31

2.5 Phương pháp nghiên cứu 32

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu nước biển 32

2.5.2 Phân lập vi nấm bằng phương pháp màng lọc 33

2.5.3 Phương pháp nuôi cấy và bảo quản chủng vi nấm 34

2.5.4 Phương pháp soi tươi và nhuộm đơn tế bào vi nấm 36

2.5.5 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số nấm mốc 37

2.5.6 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số nấm men 39

2.5.7 Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của vi nấm 40 2.5.8 Kỹ thuật điện di gel Agarose 41

2.5.9 Giải và phân tích trình tự gen 42

2.5.10 Xây dựng cây phát sinh loài 42

2.5.11 Phương pháp xử lý số liệu bằng Excel 42

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Phân lập vi nấm từ mẫu nước biển ở vịnh Nha Trang 43

3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi nấm biển phân

lập được 43

3.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nấm men phân lập được 43

3.2.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nấm mốc phân lập được 53

3.3 Tách chiết DNA tổng số từ 14 chủng vi nấm biển tại vịnh Nha Trang 61

3.4 Giải và phân tích trình tự gen đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của 12 chủng vi nấm biển 64

3.4.1 Trình tự của 12 chủng vi nấm biển 64

3.4.2 Phân tích trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của 12 chủng vi nấm biển phân lập được 70

3.5 Xây dựng cây phát sinh loài 74

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Phản ứng chuỗi nhờ polymerase)

(Nhiệt độ nóng chảy)

17 RBP1 Retinol Binding Protein 1 (Vùng liên gen 1)

18 RBP2 Retinol Binding Protein 2 (Vùng liên gen 2)

19 nu - rDNA Nuclear - Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

(rDNA nhân)

20 mt -rDNA Mitochondrial Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

(rDNA ty thể)

21 NCBI National Center for Biotechnology Information

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái tế bào nấm men 7

Hình 1.2: Cấu tạo tế bào nấm men 7

Hình 1.3: Cấu trúc thành tế bào nấm men 8

Hình 1.4: Sợi nấm có vách ngăn và sợi nấm không vách ngăn 12

Hình 1.5: Cấu trúc của sợi nấm 13

Hình 1.6: Dạng bào tử đính 14

Hình 1.7: Hình thái tế bào và khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus fumigatus 16

Hình 1.8: Cơ quan sinh sản của nấm mốc Aspergillus fumigatus 17

Hình 1.9: Cấu trúc gen rDNA nhân của vi nấm 19

Hình 1.10: Hệ gen ty thể của nấm Phlebia radiata 20

Hình 1.11: So sánh kết quả khuếch đại của 4 chỉ thị ITS, LSU, SSU và RPB1 của các loài vi nấm 22

Hình 1.12: Gen rRNA nhân và các cặp mồi thể hiện trên vùng ITS 22

Hình 2.1: Thiết bị lấy mẫu nước nằm ngang (Wildco, Mỹ) 33

Hình 2.2: Thiết bị lọc hút chân không 33

Hình 2.3: Cấy chuyển vi nấm sang đĩa peptri bằng que cấy vòng 35

Hình 2.4: Làm tiêu bản giọt ép 37

Hình 3.1: Kết quả tách chiết DNA tổng số của 14 chủng 61

Hình 3.2: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của các chủng vi nấm biển ở Cửa sông Cái 62

Hình 3.3: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của các chủng vi nấm biển ở bãi biển trung tâm Nha Trang 62

Hình 3.4: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của các chủng vi nấm biển ở nhiệt độ bắt cặp 60°C và 63°C 63

Hình 3.5: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của các chủng vi nấm biển ở nhiệt độ bắt cặp là 50°C 63

Hình 3.6 Cây phát sinh loài của 12 chủng vi nấm biển phân lập được 74

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thông tin chi tiết về vị trí lấy mẫu 26

Bảng 3.1: Kết quả phân lập chủng vi nấm biển ở mỗi chạm lấy mẫu 43

Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của nấm men 44

Bảng 3.3: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của nấm mốc 53

Bảng 3.4: Danh sách các chủng được lựa chọn cho định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 60

Bảng 3.5: Trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của 12 chủng vi nấm biển 64

Bảng 3.6: So sánh trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của 12 chủng phân lập được với các chủng gần nhất trên GenBank bằng công cụ BLAST 70

Bảng 3.7: Tổng kết các chủng vi nấm biển qua các bước nghiên cứu 73

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vi nấm là nhóm vi sinh vật có kích thước hiển vi Vi nấm khác hẳn với vi khuẩn và xạ khuẩn, chúng có cấu tạo nhân điển hình, vì vậy chúng được xếp vào nhóm Eukaryotes Vi nấm biển được biết đến là nguồn quan trọng để sản xuất các sản phẩm

vi sinh vật mới.(Trần Thanh Thủy và cộng sự, 2005)

Trong số các vi sinh vật sống trong môi trường nước biển và đại dương thì nấm biển là nhóm vi sinh vật được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm đến nhiều Tuy nhiên ở Việt Nam, việc nghiên cứu, khai thác lợi ích nấm từ biển vẫn còn mới mẻ, chưa thực sự được chú ý Theo các tác giả như Pietra (1997), Rodrigues và cộng sự (2000), Raghukumar và cộng sự (1994), nấm biển là nguồn sinh vật có tiềm năng trong việc chuyển hóa các hợp chất thứ cấp, chứa một lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học, chúng có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ, điều này góp phần quan trọng trong ứng dụng công nghệ thực phẩm cũng như là y học

Theo Hawksworth (2001) số lượng nấm có khoảng 1.5 triệu loài nấm trên trái đất Tuy nhiên, hiện nay số loài nấm được mô tả khoảng 10.000 loài và chỉ định danh được khoảng 1112 trong tổng số loài nấm biển (Jones và cộng sự, 2015; Schmit và Mueller, 2007; O’Brien, 2005; Blackwell 2011; Taylor, 2014) số lượng lớn các loài vi nấm trong tự nhiên vẫn còn chưa được khám phá chính vì lý do này tôi chọn đề tài:

“Phân lập và bước đầu định danh vi nấm biển từ vịnh Nha Trang” nhằm góp phần

cho sự định danh, mong muốn tìm kiếm loài mới điều đó mang lại sự đa dạng hệ sinh thái về các loài vi nấm

2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập vi nấm từ các mẫu nước biển thu thập từ vịnh Nha Trang

- Bước đầu định danh vi nấm biển bằng bằng kỹ thuật PCR và giải trình đoạn

gen ITS1 – 5.8S – ITS2

- Xây dựng cây phát sinh loài của vi nấm biển

3 Nội dung chính của đề tài

- Phân lập các chủng vi nấm từ các mẫu nước ven biển từ vịnh Nha Trang

- Tách chiết DNA tổng số của các chủng vi nấm biển phân lập được

- Khuếch đại trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của các chủng vi nấm biển

- Bước đầu giải, phân tích trình tự gen và xây dựng cây phát sinh loài

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Đề tài nghiên cứu giúp thiết lập phương pháp phân lập

nuôi cấy phụ thuộc đồng thời sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc định danh vi nấm trên đối tượng là nước biển ven bờ Mong muốn có những hiểu biết về đa dạng vi nấm ở vịnh Nha Trang , làm cơ sở cho các nghiên

cứu tiếp theo

- Ý nghĩa thực tiễn: Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần định danh

và phát hiện thêm các loài vi nấm mới có ý nghĩa về đa dạng sinh học

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về vi nấm biển

1.1.1 Giới thiệu về vi nấm biển

Vi nấm (microfungi) bao gồm tất cả các nấm không có mũ nấm (quả thể) có thể thấy rõ bằng mắt thường (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2012) Đó là những vi sinh vật nhân thực sống dị dưỡng, màng tế bào của chúng hầu như có chứa các thành tế bào mỏng là các hợp chất chitin và cellulose cấu tạo thành Vi nấm được phân bố rộng rãi

cả trong môi trường tự nhiên và trên cơ thể người, chúng đóng vai trò quan trọng trong lợi ích của người, động vật, thực vật và trong chức năng của hệ sinh thái (Jianping Xu, 2016)

Trong một thời gian dài, các nhà phân loại học đã xếp nấm là thành viên của giới thực vật Sự phân loại này chủ yếu được dựa trên sự tương đồng trong cách sống giữa nấm và thực vật Thêm nữa, cả hai đều có thành tế bào, điều mà giới động vật không có

Căn cứ dựa trên hình thái người ta chia vi nấm thành hai nhóm khác nhau: nhóm nấm men (yeast) và nhóm nấm mốc (mold) Chúng chỉ khác nhau về hình thái chứ không phải là sự xếp nhóm phân loại riêng biệt Nhiều nấm men cũng có dạng sợi

và rất khó phân biệt với nấm mốc (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2012)

1.1.2 Phân loại vi nấm

Giới nấm bao gồm các sinh vật dị dưỡng, vì cơ thể của chúng không có diệp lục

tố, dinh dưỡng theo kiểu hấp thụ - dị dưỡng (hoại sinh hay kí sinh)

Theo David Moore và cộng sự (2011) phân loại giới nấm làm 7 ngành, quá trình phân loại nấm dựa trên cấu trúc của cơ quan sinh sản hữu tính của chúng:

 Chytridiomycota (706 loài thuộc 105 chi)

 Blastocladiomycota (179 loài thuộc 14 chi)

 Neocallimastigomycota (20 loài thuộc 6 chi)

 Microsporidia (1.300 loài thuộc 170 chi)

 Glomeromycota (169 loài thuộc 12 chi)

 Ascomycota (64.163 loài thuộc 6355 chi)

 Basidiomycota (31.515 loài thuộc 1589 chi)

Ngành Oomycota và Hyphochytriomycota trước đây thuộc giới nấm, sau bị tách ra khỏi giới nấm và hiện tại được xếp vào ngành Chromista của tảo nâu và tảo cát

Ngành Zygomycota cũng bị tách khỏi ngành nấm và được xếp vào giới động vật nguyên sinh, bởi vì ngành Zygomycota bị nghi ngờ có mối quan hệ giữa các nhóm trong ngành này (David Moore và cộng sự, 2011)

Ngành Chytridiomycota (nấm trứng) chúng tồn tại rải rác khắp nơi trên thế giới, Chytridiomycota sản sinh ra những bào tử động mà có khả năng di chuyển linh động trong môi trường nước với một tiên mao duy nhất Sự phát sinh loài phân tử, dựa trên chuỗi operon rRNA tương ứng ở những tiểu đơn vị ribosome 18S, 28S và 5.8S, cho thấy Chytridiomycota là nhóm nấm căn bản tách ra từ những ngành nấm khác, bao gồm cả bốn ngành chính với những dấu hiệu cho thấy tính cận ngành (paraphyly) hoặc

có thể cận ngành của nấm Chytridiomycota

Ngành Blastocladiomycota trước đây từng được cho là một nhánh phân loại của Chytridiomycota Những dữ liệu phân tử và đặc điểm siêu cấu trúc gần đây đã đưa Blastocladiomycota vào một nhánh riêng giống như với các ngành Zygomycota, Glomeromycota và Dikarya Lớp nấm Blastocladiomycetes là những sinh vật hoại sinh hoặc ký sinh của tất cả các nhóm sinh vật nhân chuẩn và chúng giảm phân tạo bào tử, không giống với chytrid, họ hàng gần của chúng, là những loài chủ yếu giảm phân tạo hợp tử

Ngành Neocallimastigomycota đầu tiên cũng đặt vào ngành Chytridiomycota Những thành viên của ngành nhỏ này là những sinh vật kỵ khí, sống trong hệ thống tiêu hóa của những động vật ăn cỏ lớn và cũng có thể sống ở môi trường nước và mặt đất Chúng không có ty thể nhưng lại chứa những hydrogenosome là nguồn gốc của ty thể Giống như chytrid, neocallimastigomycetes có thể tạo ra những bào tử động mà có một hay nhiều tiên mao ở phía sau

Ngành Microsporidia là những loài nấm kí sinh nội bào bắt buộc ở động vật Chúng có cơ quan vô cùng yếu ớt và không có ty thể Hiện nay có một số nghiên cứu

về phân tử cho thấy chúng có mối quan hệ với ngành Zygomycota (David Moore và cộng sự, 2011)

Ngành Glomeromycota là những nấm tạo ra nấm rễ mút phân nhánh (arbuscular mycorrhizae) ở thực vật bậc cao Chúng sống cộng sinh

Ngành Ascomycota (nấm túi hay nấm nang), là nhóm phân loại nhiều nhất trong Eumycota (Nấm thật) Chúng tạo ra những bào tử giảm phân gọi là bào tử nang,

mà được chứa trong một cấu trúc đặc biệt có dạng giống túi gọi là nang (ascus) Ngành

này bao gồm nấm nhăn (moscela), vài loại nấm lớn và nấm cục, những nấm men đơn

bào (như các chi Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia và Candida) và nhiều nấm

sợi sống hoại sinh, ký sinh và cộng sinh Nhiều loài nấm nang chỉ trải qua quá trình sinh sản vô tính (ở nấm gọi là anamorph), tuy nhiên, những dữ liệu phân tử đã giúp nhận dạng được những giai đoạn hữu tính (teleomorph) gần nhất của chúng ở nấm nang

Ngành Basidiomycota (Nấm đảm), sinh sản ra những bào tử đảm chứa trong những thân hình dùi gọi là đảm Đa phần những loài nấm lớn đều thuộc ngành này, cũng như nấm than hay nấm gỉ sắt

1.1.3 Vai trò và ứng dụng của vi nấm biển

Theo thống kê có khoảng 90% nhiên liệu sinh học bắt nguồn từ vi sinh vật biển

Và vi nấm biển được xem như là nguồn sản xuất ra những sản phẩm mới tự nhiên như các sản phẩm từ sự lên men, sự lọc sinh học và hợp chất điều trị bệnh Hơn 60% của

456 sản phẩm tự nhiên của vi sinh vật biển được ghi nhận vào năm 2012 thì được sản xuất bởi vi nấm (Nikos Andreakis và cộng sự, 2015)

Một công trình nghiên cứu khác về vi nấm biển là nghiên cứu về cấu trúc hydrocacbon không no trong vi nấm mong muốn đưa ra những hợp chất có hoạt tính sinh học và hóa học trong sản xuất thuốc (Rainer Ebel, 2010)

Bostrycin là một hợp chất mới được phân lập từ vi nấm biển, hợp chất bostrycin

có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều tế bào ung thư Tuy nhiên việc làm ức chế những tế bào ung thư phổi thì chưa được ghi nhận Nghiên cứu này thực hiện khảo sát những ảnh hưởng của sự ức chế và cơ cấu của bostrycin trên các tế bào ung thư phổi của người ở in vitro (Wei Sheng Chen và cộng sự, 2011)

Từ vùng Nam cực và biển Baltic (Kiel Fjord) các loài vi nấm được phân lập từ bọt biển, nghiên cứu đã tìm ra 2 hợp chất mới là lindgomycin và ascosetin có hoạt tính kháng sinh giúp chống lại sự gây bệnh của các vi sinh vật trên người và thực vật (Bin

Wu và cộng sự, 2015)

Từ đó cho thấy vi nấm đóng vai trò rất quan trọng công nghệ ứng dụng và đời sống, giúp con người tận dụng được nguồn tài nguyên sẵn có Không những mang lại lại ích cho con người mà còn duy trì sự cân bằng về hệ sinh thái

1.1.4 Nấm men

Nấm men lần đầu tiên được Antonie Van Leeuwenhoek mô tả vào năm 1680 nhưng vào thời điểm đó nấm men chưa được coi là một sinh vật sống Cho đến những năm 1857 – 1863, Pasteur đã xác nhận nấm men là một sinh vật sống và phát hiện nấm men chính là nguồn gốc của quá trình lên men (Trần Thị Lệ Quyên, 2010)

1.1.4.1 Khái niệm nấm men

Nấm men là tên chung để chỉ nhóm vi nấm có cơ thể đơn bào, thường sinh sôi nảy nở bằng phương pháp nảy chồi Nấm men không thuộc về một nhóm phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành nấm đảm (Basidiomycota) (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2012)

1.1.4.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của nấm men

 Đặc điểm hình thái của tế bào nấm men

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thực Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn, có kích thước thay đổi trong khoảng 2,5– 10 µm

x 4,5 – 21 µm Và tùy loài nấm men mà tế bào có hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình chanh, hình elip, hình mũ phớt, hình mụn cơm, hình sao thổ, hình cái liềm, hình thuôn, hình thoi, hình ong, hình cung nhọn, hình tam giác, hình chai, hình kéo dài, hình mũ sắc, hình quả óc chó, hình bán cầu, hình thận, hình lưỡi liềm, hình thấu kính, hình elip dài, hình quả lê, hình kim không có phần phụ, hình con suốt có phần phụ, hình bán cầu có rìa hẹp, hình mũ lưỡi chai,…(Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)

Một số nấm men khi phát triển trong những môi trường nuôi cấy lâu hay trong điều kiện thiếu oxi có thể tạo thành bào tử kéo dài, xếp nối tiếp với nhau, được gọi là khuẩn ty Người ta phân biệt hai loại khuẩn ty: khuẩn ty thật các tế bào dạng sợi có vách ngăn (septate hyphae), khuẩn ty giả là các tế bào dạng sợi không có vách ngăn (aseptate hyphae)

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái tế bào nấm men

 Cấu tạo tế bào nấm men

Thành phần cấu trúc tế bào nấm men bao gồm:

Hình 1.2: Cấu tạo tế bào nấm men

(Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003) Trong đó: Sc – sẹo chồi, Cm – màng tế bào, Cp – tế bào chất, D – thể Golgi, ER – lưới nội chất, Li – lipit, Mi – ti thể chứa DNA và RNA riêng, N – nhân, NL – chất nhân, Po – polyphosphat, Rb – Riboxom (80s), V – không bào, Cw – thành tế bào

Thành tế bào: bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm

mại có thể đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động bên ngoài và chất độc Thành phần hóa học của thành tế bào gồm có các phức chất protein – polysacarit, phosphat và lipit Thành tế bào dày khoảng 25 nm và chiếm khoảng 25% khối lượng tế bào Trong thành phần polysacarit thấy có glucan (chủ yếu) và mannan, hai thành phần này chiếm 90% trọng lượng thành của tế bào Glucan là thành phần chính cấu tạo nên thành tế bào, nếu thành phần này bị hỏng thì tế bào bị phá vỡ hoàn toàn Còn Mannan chủ yếu nằm ngoài thành tế bào, nhưng không phải là thành phần quyết định của thành tế bào, nếu bỏ phần mannan hình dáng tế bào không bị biến đổi Thành tế bào nấm men còn có kitin (chitin), thường nằm sát ở vùng nấm men nẩy chồi

Hình 1.3: Cấu trúc thành tế bào nấm men Màng tế bào chất: Xung quanh tế bào chất được bao quanh một lớp màng rất

mỏng, chiều dày không quá 0,1 nm dính chắt với tế bào chất Màng tế bào chất có bốn chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắn thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào, thực hiện sinh tổng hợp một số thành phần của tế bào (các cấu tạo của thành tế bào); nơi khu trú một số enzym và cơ quan tử của tế bào (như riboxom)

Tế bào chất: Ở vùng giữa thành tế bào với màng tế bào chất có chứa hàng loạt

enzyme chủ yếu là enzyme thủy phân như β – fructofuranozidaza và phosphataza axit

Tế bào chất còn gọi là nguyên sinh chất Nó có cấu trúc không đồng nhất (heterogen)

và ở thể keo, chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của tế bào: ti thể, ribosome, mạng lưới nội chất, các chất dữ trữ và các thể vùi của hợp chất lipoit và hydrocacbon tự nhiên trong nội bào Ngoài ra, còn có những chất xúc tác sinh học rất quan trọng là enzyme tham gia vào tất cả các phản ứng hóa sinh

Lipoxom: đây là thể vùi có dạng siêu hiển vi, được cấu tạo từ lipoit, protit và

axit ribonucleic (RNA)

Ti thể: có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc sợi mảnh phân bố trong tế bào chất ở

khoảng giữa thành tế bào và không bào, chiều dài của sợi ti thể 0,2 – 7,5 µm Hình dáng có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy Cấu trúc của ti thể biển đổi khi điều kiện sống của nấm men chuyển từ kỵ khí sang hiếu khí Khi nấm men phát triển ở điều kiện

kỵ khí với môi trường không có lipit thì ti thể ở dạng rất đơn giản gồm có hai lớp màng, nhưng không có nếp gấp Nếu thêm hợp chất lipit như axit oleic và ergosterol sẽ kích thích tạo thành nếp gấp Có nhiều nghiên cứu về cấu trúc và sự phân bố của enzyme trong ti thể ở các lớp màng và khung cho thấy kết quả phần lớn các enzyme tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử và quá trình quang hợp có oxy lại liên quan đến lớp màng có nếp gấp bên trong của ti thể

Không bào: là một cơ quan nội bào có dạng hang chứa đầy dịch bào và được

tách ra từ tế bào chất thành màng không bào Sự tạo thành không bào ở tế bào nấm men đến nay vẫn chưa biết được đầy đủ Song không bào có chứa các enzyme thủy phân, enzyme oxi hóa – khử, các polyphosphat, lipit, các hợp chất trung gian của tế bào có phân tử lượng thấp và các ion kim loại

Mạng lưới nội chất: hay còn gọi là thể golgi hay bộ máy golgi bao gồm dãy

màng kép có gai cong dày Chúng tham gia vào các hoạt động của tế bào

Nhân tế bào: có màng vỏ, hạch nhân (thể nhiễm sắc) và chất nhân

(karyoplasma) Vỏ nhân tham gia vào điều hòa các quy trình trong nhân bằng cách thay đổi tính thấm và thông báo trực tiếp giữa nhân với môi trường bên ngoài tế bào, cũng như giữa nhân và tế bào chất Nhân có dạng hình cầu hoặc elip (Lương Đức Phẩm, 2009)

1.1.4.3 Dinh dưỡng của nấm men

Dinh dưỡng của nấm men được chia làm hai nguồn là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡng nội bào Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bên ngoài Khi tế bào ở trạng thái môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào, như glycogen, tregaloza, lipit, các hợp chất chứa Nitơ sẽ được sử dụng

Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc đi vào thành phần tế bào để cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng của tế bào (Lương Đức Phẩm, 2009)

Nguồn carbon

Các nguồn carbon dinh dưỡng trước hết phải kể đến các loại đường Đường glucoza được tất cả các loài nấm men sử dụng Có thể coi tính sử dụng kế tiếp các nguồn cacbon là tính đa dưỡng của nấm men Trong nuôi cấy theo giai đoạn glucoza

và fructoza được sử dụng trước hết, kế tiếp là axit béo phụ thuộc vào chủng loài và thành phần của axit này Như là một quy luật, trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn cacbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ được sử dụng trước

Nguồn nitơ

Nguồn nitơ cần thiết cho sự tổng hợp các cấu tử chứa nitơ của tế bào Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các axit amin, peptit, các nucleotit… có trong cao ngô, cao nấm men hay dịch thủy phân protein tự nhiên

Các nguyên tố vô cơ

Trong nuôi cấy nấm men nguyên tố phospho tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào như nucleoproteit, axit nucleic, polyphosphat, phospholipit… chúng đóng vai trò xác định các biến đổi hóa sinh khác nhau, trong trao đổi chất hydrocacbon

và trong vận chuyển năng lượng Lưu huỳnh từ axit amin (cystin, cystein, metionin), vitamin (tiamin, biotin) đóng vai trò trong hoạt động sống của nấm men Các nguyên

tố vi lượng cũng rất cần để quá trình sinh lý trong tế bào nấm men được xảy ra bình thường (Lương Đức Phẩm, 2009)

1.1.4.4 Hình thức sinh sản của nấm men

a Sinh sản vô tính

Nảy chồi là cách sinh sản vô tính điển hình của nấm men Khi đó thành tế bào

nở ra để tạo ra một chồi (bud) Chồi phát triển thành tế bào con và có thể tách khỏi tế bào mẹ ngay từ khi còn nhỏ hoặc cũng có thể vẫn không tách ra ngay cả khi lớn bằng

tế bào mẹ Nhiều khi nhiều thế hệ vẫn dính vào một tế bào đầu tiên nảy chồi và tạo thành một cành nhiều nhánh tế bào Chồi có thể mọc ra theo bất kì hướng nào như nảy chồi đa cực, hai cực hay ở một cực nhất định (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2012)

Nấm men còn có hình thức sinh sản phân cắt như vi khuẩn Tế bào dài ra, ở giữa mọc ra vách ngăn chia tế bào ra thành hai phần tương đương nhau mỗi tế bào con

có một nhân Hình thức sinh sản này thường gặp ở nấm men Schizosaccharomyces

(Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008)

Nấm men thuộc ngành nấm đảm có thể sinh ra dạng bào tử có cuống nhỏ

(sterigmatoconidia) hoặc bào tử bắn (ballistoconidia hay ballistospore) Bào tử có

cuống nhỏ thường gặp ở các chi nấm men Fellomyces, Kockovaella và

Sterigmatomyces, khi đó chồi sinh ra trên một nhánh nhỏ và tách ra khi nhánh bị gẫy

Bào tử bắn được sinh ra trên một gai nhọn của tế bào nấm men và bị bắn ra phía đối diện khi thành thục Nếu cấy các nấm men sinh bào tử bắn thành hình zích zắc trên ống thạch nghiêng hoặc trên đĩa petri thì sau một thời gian nuôi cấy sẽ thấy xuất hiện trên thành ống nghiệm hoặc nắp đĩa petri có một hình zích zắc khác được hình thành bởi các bào tử bắn lên Bào tử bắn là đặc điểm của nấm men thuộc các chi

Bensingtonia, Bullera, Deoszegia, Kockovaella, Sporobolomyces (Nguyễn Lân Dũng

và cộng sự, 2012)

Ngoài ra, một số tế bào nấm men sinh sản vô tính bằng việc hình thành các bào

tử đốt Khi đó sẽ hình thành các vách ngăn ở đầu các nấm men dạng sợi, sau đó tách ra thành các bào tử đốt (Nguyễn Lân Dũng và cộng sư, 2012) Thường gặp nhất là ở các

chi nấm men Galactomyces, Dipodascus (dạng vô tính là Geotrichum) và

Trichosporon

b Sinh sản hữu tính

Sinh sản hữu tính ở nấm men thường ít xảy ra so với sinh sản vô tính, tuy nhiên nhờ có sinh sản hữu tính mà các hiện tượng tái tổ hợp các đặc điểm di truyền xảy ra Ở nấm men có hình thức sinh sản hữu tính bằng bào tử nang Bào tử nang được hình thành do sự tiếp nối của hai tế bào khác giới, chỗ tiếp nối sẽ tạo một lỗ thông và qua

đó nguyên sinh chất có thể đi qua để tiến hành phối chất và nhân cùng đi qua để tiến hành phối nhân Qua phân bào giảm nhiễm sẽ tạo thành các tế bào con (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008)

1.1.5 Nấm mốc

1.1.5.1.Khái niệm nấm mốc

Nấm mốc là tất cả các loài nấm không phải nấm men và cũng không sinh mũ nấm (quả thể có kích thươc lớn) như ở các nấm lớn, hay là giai đoạn mà nấm chưa sinh

mũ nấm của nấm lớn vẫn được coi là nấm mốc (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)

1.1.5.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của nấm mốc

Sợi nấm (Hypha) của nấm mốc là những ống nhỏ, thành ống bao lấy một lớp nguyên sinh chất có nhiều nhân, đầu các nhánh sợi nấm luôn luôn phát triển hai bên sợi cũng phân nhánh rất nhiều, khiến cho cơ thể nấm mau chóng trở thành một lớp như sợi bông hoặc có cấu trúc len dạ Khi nấm trưởng thành, một số sợi nấm phân hóa ít hoặc nhiều để trở thành cơ quan sinh sản, mang những cấu trúc làm nhiệm vụ duy trì nòi giống Đa số ở nấm mốc, sợi nấm thường có đường kính 5 – 10 µm nhưng cũng có khi nhỏ 1 – 2 µm hoặc cũng có khi lớn đến 25 µm (Đặng Vũ Hồng Miên, 2015)

Các loài nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách ngăn Ngược lại, các loài nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách ngăn Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều nhân nhưng vẫn có thể gọi là đơn bào Ở các nấm không vách ngăn thì vách ngăn vẫn có thể bình hình thành khi cơ thể sinh sản hoặc tại các bộ phận sợi nấm bị tổn thương Đó là loại vách ngăn liền, không có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ cơ thể (Võ Thị Bích Vân, 2010)

Sợi nấm có vách ngăn là cơ thể đơn bào Mỗi tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân Tuy nhiên, sợi nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều tế bào Vách ngăn ngang được hình thành từ thành tế bào Lúc đầu là một gờ nhỏ hình khuyên sau đó tiến dần vào trong và lấp kín lại Tuy nhiên, vách ngăn thường có một hay nhiều lỗ thủng Các lỗ có kích thước bằng nhau hay có lỗ lớn nhất ở giữa và nhiều lỗ nhỏ xung quanh (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)

Hình 1.4: Sợi nấm có vách ngăn và sợi nấm không vách ngăn

Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón không tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần ngọn sợi nấm Phần này chất nguyên sinh không có nhân và chứa ít cơ quan tử Tiếp đến là phần tăng trưởng chứa nhiều nhân, nhiều cơ quan tử và nhiều enzym Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và phân nhánh của sợi nấm Dưới nữa là phần thành cứng – phân thành thục của sợi nấm Bắt đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ Sắc tố của nấm còn tiết ra môi trường và làm thay đổi màu khu vực có nấm phát triển Một số nấm còn tiết ra chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên cả khuẩn lạc thường có màu (Võ Thị Bích Vân, 2010)

Hình 1.5: Cấu trúc của sợi nấm

1.1.5.3 Dinh dưỡng của nấm mốc

Phần lớn các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là 2oC đến 5 oC, tối ưu từ 22– 27oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35 – 40oC, cá biệt có một số loài có thể sống sót ở 0oC và 60oC Bên cạnh đó, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH = 6) nhưng pH tối ưu là 5 – 6,5 (Nguyễn Văn Bá và cộng sự, 2005)

Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký

sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ, cũng như có nhóm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định

Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự như sau: C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và

Ca Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucoza, muối ammonium… sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sinh sản và tiết ra bên ngoài các loại enzym thích hợp để phân cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ dàng hấp thu vào trong tế bào (Nguyễn Văn Bá và cộng sự, 2005)

1.1.5.4 Hình thức sinh sản của nấm mốc

Nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái

(3) Bào tử đốt (actrospore) được hình thành do sự phân đốt ở khuẩn ti dinh dưỡng (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008)

Hình 1.6: Dạng bào tử đính

(3) Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid) qua

sự giảm phân từ 2n nhiễm sắc thể (nhị bội) thành n nhiễm sắc thể (đơn bội) (Nguyễn Văn Bá và cộng sự, 2005)

1.2 Giới thiệu về vịnh Nha Trang

Vịnh Nha Trang có diện tích khoảng 507 km2 bao gồm 19 hòn đảo lớn nhỏ, trong đó Hòn Tre là đảo lớn nhất, với diện tích 3.250 ha; đảo nhỏ nhất là Hòn Nọc chỉ khoảng 4 ha Vịnh có khí hậu hai mùa rõ rệt Mùa khô kéo dài từ tháng giêng đến tháng 8, mùa mưa từ tháng 9 đến tháng 12; nhiệt độ bình quân hàng năm là 26°C; nóng nhất là 39°C, lạnh nhất là 14,4°C Về mặt sinh thái, vịnh Nha Trang là một trong những hình mẫu tự nhiên hiếm có của hệ thống vùng, vịnh trên thế giới bởi nó có hầu hết các hệ sinh thái điển hình, quý hiếm của vùng biển nhiệt đới Đó là hệ sinh thái đất ngập nước, rạn san hô, rừng ngập mặn, thảm cỏ biển, hệ sinh thái cửa sông, hệ sinh thái đảo biển, hệ sinh thái bãi cát ven bờ

Trong số các khu bảo tồn đang hoạt động ở nước ta thì khu bảo tồn biển vịnh Nha Trang được xem là có tầm vóc quốc tế Với tổng diện tích là 160 km2, Hòn Mun

là khu bảo tồn đầu tiên ở Việt Nam và đã được Quỹ Động vật hoang dã thế giới đánh giá là khu vực đa dạng sinh học biển phong phú bậc nhất ở nước ta Theo thống kê thế giới có khoảng 2000 loài san hô và sinh vật biển thì ở Hòn Mun đã có tới 1500 loài (Nguyễn Văn Hoàng, 2012)

Chính vì những lý do đó, vịnh Nha Trang được coi như là vị trí thuận tiện cho quá trình nghiên cứu và có nhiều tiềm năng để tìm kiếm và định danh các loài vi nấm biển

1.3 Phương pháp định danh vi nấm biển

1.3.1 Định danh vi nấm bằng quan sát hình thái

Cùng với những tiến bộ mới của kỹ thuật sinh học hiện đại, trong việc phân loại nấm, người ta cũng ứng dụng nhiều phương pháp mới như phân tích sinh hóa học, nghiên cứu siêu cấu trúc các thành phần tế bào, áp dụng máy tính điện tử và toán học,… Các phương pháp vừa kể trên, có thể nói rằng các phương pháp sinh hóa học tuy được nhiều người chú ý và có những công dụng nhất định nhưng không những phức tạp và đòi hỏi nhiều phương tiện kĩ thuật mà còn có vấn đề phải bàn cãi

Còn phương pháp phân loại dùng máy tính điện tử thì đòi hỏi: phải có một hệ thống thuật ngữ chính xác được tất cả mọi người công nhận, phải tiêu chuẩn hóa các bản mô tả (diagnosis), thu thập các dữ kiện sinh lý hóa sinh

Hơn nữa, việc thành lập chương trình đòi hỏi phải có những kiến thức rất chính xác về các yếu tố của vấn đề : chọc lọc những đặc điểm nào, dùng phương pháp phân tích nào, cân nhắc đánh giá các thuộc tính… Ở đây, yếu tố cá nhân nhà nghiên cứu có ảnh hưởng rất lớn: mỗi người có thể có cách nhận định khác nhau và những nhà nghiên cứu chọn những số liệu khác nhau sẽ đi đến những kết quả phân loại khác hẳn nhau, mà mỗi cái đều có giá trị ngang nhau

Cho đến nay, phương pháp phân loại nấm trước hết vẫn là dựa trên các yếu tố hình thái bằng kính hiển vi quang học đôi khi bằng kính hiển vi điện tử, trên sự phát sinh conidi, kết hợp với một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái khác Như vậy cũng đã đủ để xác định các chủng nấm cần phân loại đến loài (species) và một vài cấp dưới loài như thứ (variety) và dạng (special form) Phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm hình thái là phương pháp truyền thống vừa thuận tiện vừa đảm bảo độ tin cậy cần thiết (Đặng Vũ Hồng Miên, 2015)

Hình 1.7: Hình thái tế bào và khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus fumigatus

Hình 1.8: Cơ quan sinh sản của nấm mốc Aspergillus fumigatus

Bào tử đính (conidies), thể bình (phyalide), cuống thể bình (prophyalide), bọng (vesicle), cuống bào tử (conidiophore), sợi nấm (hyphe)

1.3.2 Định danh vi nấm bằng kĩ thuật sinh học phân tử

Việc phân loại hay giám định vi nấm chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Phương pháp phân loại này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế, như: nhiều sinh vật có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau); ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau) Mặt khác, phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài Gần đây nhờ vào sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép chúng

ta nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài vi nấm, thậm chí giữa các cá thể vi nấm trong cùng loài Từ đó có thể định danh được vi nấm

và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử DNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữ loài vi nấm này với loài vi nấm khác một cách chính xác

Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích định danh Trong đó, mã vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định loài vi nấm

Các gen của một cơ thể vi sinh vật bao gồm tất cả các thông tin về di truyền, chúng không chỉ là những gen đã được mã hóa bởi nhân Hệ gen vi nấm bao gồm: DNA nhiễm sắc thể, hệ gen ty thể, các plasmid và các gen virus Mỗi thành phần này

có thể góp phần về mặt ý nghĩa đến việc định danh vi nấm Nhiễm sắc thể của mọi vi nấm thì gần như nhỏ bé và ở dạng dính lại gần nhau, điều đó làm cho việc đếm những

tế bào trên kính hiển vi gặp khó khăn bởi vì vẫn còn tồn tại màng nhân trong suốt chu

kỳ phân bào (Deacon, 2006)

Trong gen nhân của vi nấm thì có kích thước nhỏ hơn so với nhiều những sinh

vật nhân thực khác Chẳng hạn như kích thước gen của Saccharomyces cerevisiae là

12 Mb, trong khi đó Schizophyllum commune (Basidiomycota) có kích thước khoảng

37 Mb (Deacon, 2006)

Hệ gen ty thể của vi nấm là một phân tử DNA nhỏ và có kích thước rất là đa

dạng, dao động khoảng 19 – 121 kb Chẳng hạn như Saccharomyces cerevisiae là 70

kb và Schizophyllum commune là 50 kb (Deacon, 2006)

1.3.3 Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu phân loại vi nấm

a Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân loại vi nấm

Các rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa Bên cạnh đó, ribosome hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa Phần lớn trình tự rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các mồi được thiết kế dựa trên những đoạn oligonucleotit có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều đoạn mồi cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de Peer và cộng sự, 1996)

Theo White và cộng sự (1989), rDNA vi nấm có thể được chia thành 2 nhóm: rDNA nhân và rDNA ty thể:

 rDNA nhân

rDNA nhân (nu – rDNA) gồm có nu – SSU – rDNA (17S – 18S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị nhỏ (small subunit rDNA) và nu – LSU – rDNA (26S – 28S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị lớn (large subunit rDNA)

Nu – SSU – rDNA tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền Nu – LSU – rDNA mặc dù có ít vùng biến đổi nhưng lại rất có ý nghĩa trong nghiên cứu so sánh và phân loại ở nhiều cấp độ (Guarro, 1999)

Hình 1.9: Cấu trúc gen rDNA nhân của vi nấm

(Dominik Begerow và cộng sự, 2010) Những gen mã hóa rRNA nhân được xem như là vùng đầy hứa hẹn cho

mã vạch DNA Bởi vì các gen này hầu như là các gen phổ rộng cho nghiên cứu hệ thống phát sinh loài Trong khi đó, những trình tự rDNA của vùng SSU thì được dùng

để định danh các loài thuộc lớp glomeromycetes, trong đó vùng gen SSU là vùng gen bảo tồn của các nhóm vi nấm (Beck et al và cộng sự, 2007)

Theo nghiên cứu của Poll và cộng sự (2009) nhận định rằng những trình tự rDNA SSU bị giới hạn về sự nhận dạng của một số loài vi nấm hoặc có khả năng nhận dạng các loài vi nấm thấp

 rDNA ty thể

rDNA ty thể (mt – rDNA) cũng gồm có 2 loại: mt SSU – rDNA (19S) và

mt – LSU – rDNA Các mt – rDNA tiến hóa khá nhanh, thường được sử dụng trong nghiên các sinh vật cùng họ (Yamamoto và cộng sự, 1995)

Hệ gen ty thể của nấm thường có kích thước rất khác nhau, ví dụ 19.4 kb đối

với nấm S pombe và 175 kb kích đối với nấm Agaricus bisporus (Hudspeth, 1992)

Những gen được mã hóa bởi những gen ty thể bao gồm:

- Gen mã hóa RNA: Ribosomal small subunit RNAs (rns), ribosomal large subunit RNAs (rnl) và gen trnA-W

- Các gen mã hóa cho protein: cytochrome oxidase subunits (cox1, cox2,

cox3), gen mã hóa apocytochrome b (cob), gen mã hóa các tiểu đơn vị của

enzym NADH dehydrogenase (nad1 đến nad6) và một số tiểu đơn vị ATP synthase (atp6, atp8, atp9)

- Các protein ribosome cần thiết cho việc tập hợp của các protein ribosome

cấu tạo nên tiểu đơn vị nhỏ (rps3, var1, hoặc S5) (Georg Hausner, 2003)

Sáu vùng DNA có giá trị như là tiềm năng nhận biết các mã vạch DNA của vi nấm Ở vùng gen ty thể CO1 hay cox1 (c oxidase subunit) được xem như là mã vạch cho động vật không được coi như là marker có khả năng nhận biết đối với vi nấm, bởi

vì CO1 gặp khó khăn trong việc khuếch đại trình tự vi nấm, chúng thường không chứa những DNA mang mã di truyền và ít biến đổi (Schooch và cộng sự, 2012; Seifert, 2007; Vialle và cộng sự, 2009)

Hình 1.10: Hệ gen ty thể của nấm Phlebia radiata

(Heikki Salavirta và cộng sự, 2014)

Còn đối với vùng gen nhân thì trong số những vùng gen mã hóa rRNA của ribosome, vùng gen ITS (internal transcribed spacer) có xác suất về sự định danh hầu hết các loài vi nấm (Schooch và cộng sự, 2012)

Bảng 1.1: Một số gen chỉ thị thường được sử dụng trong định danh vi nấm năm 2009

Gen chỉ thị Số lượng gen được công bố

Theo Songlin Zhou và cộng sự (2016) nghiên cứu cho kết quả trong tổng số 195 chủng vi nấm biển phân lập thì thuộc 46 họ, 84 chi, 142 loài, các chủng này hầu hết thuộc vào ngành Ascomycota, Basidiomycota và Zygomycota được phân tích dựa trên

trình tự gen ITS Chiếm ưu thế trong số các loài phân lập được là Aspergillus,

Penicillium, Trichoderma, Glioderma Về mức độ tương đồng đưa ra là từ 100 – 96%

Từ đó cho thấy vùng gen ITS thường được xem như là gen marker của vi nấm và được

sử dụng cho nghiên cứu liên quan đến hệ thống loài, cây phát sinh loài và định danh của các loài vi nấm (Dominik Begerow và cộng sự, 2010)

Hình 1.11: So sánh kết quả khuếch đại của 4 chỉ thị ITS, LSU, SSU và RPB1

tỉ lệ 99% vùng gen ITS của Ascomycetes và Basidiomycetes Đặc biệt là mồi xuôi có ITS9mun, ITS1F_KYO2 và ITS5 có độ bao phủ cao hơn 98% Mồi ngược ITS4 có độ bào phủ cao hơn khoảng 97% bằng so với các mồi ngược mới là ITS4_KYO1, ITS4_KYO2 và ITS4_KYO3

Từ kết quả so sánh như vậy chúng tôi lựa chọn cặp mồi ITS_KYO2/ITS4 cho phản ứng khuếch đại đoạn gen ITS trong định danh vi nấm

1.4 Một số nghiên cứu về đa dạng vi nấm biển trên thế giới và ở Vệt Nam

 Tình hình nghiên cứu về đa dạng vi nấm biển trên thế giới

Trên thế giới, việc nghiên cứu về vi nấm đã và đang được các nhà nghiên cứu quan tâm được thể hiện qua một số các bài nghiên cứu sau đây:

Theo một nghiên cứu về sự đa dạng của vi nấm từ vùng ven biển phía Bắc của Trung Quốc, nhóm nghiên cứu này sử dụng phương pháp nuôi cấy phụ thuộc Tổng cộng có 22 chủng nấm và 9 chủng nấm men phân lập được từ 30 mẫu nước biển và 2 mẫu cát biển Họ sử dụng trình tự gen rRNA ITS kết quả cho thấy hầu hết các loài vi nấm biển phân lập được đều thuộc về ngành Ascomycota và Basidiomycota, còn ngành Mucoromycotina và Zygomycota chỉ chiếm rất nhỏ khoảng 3% (Li Li và cộng

ra như sau Lignincola laevis (16,8%), Verruculina enalia (13,3%), Trichocladium

achrasporum (12,1%), Savoryella lignicola (11,0%) Dictyosporium pelagicum

(11,2%), Halocyphina villosa (11,0%) và Lulworthia grandispora (10,9%) (Siti A

Tám mẫu cát biển ở Kongsfjorden (Svalbard, High Arctic) được phân lập vi nấm biển góp phần cho đa dạng sinh học biển Cho kết quả dựa trên việc tìm kiếm trên GenBank, 113 OTUs được định danh tại các hệ thống phân loại khác nhau 113 OTUs được kéo dài 5 ngành, 11 lớp, 25 bộ, 32 họ, 30 chi và 30 loài (Tao Zhang và cộng sự, 2015)

Tổng số 50 loài vi nấm được phân lập từ tảo nâu thì có 2 loài thuộc lớp zygomycetes, 48 loài còn lại được định danh là thược lớp ascomycetes Trong số các

vi nấm được phân lập thì có 6 loài không định danh được ở mức loài và chi, bởi vì mức độ tương đồng khi Blast thấp hơn 95% (Joo-Hyun Hong và cộng sự, 2015)

Trên 227 chủng nấm sợi phân lập từ biển trong đó có rừng ngập mặn, kết quả

có 7 chủng có khả năng kháng Vibrio parahaemoliticus, 55 chủng kháng S aureus

(Carsten Christophersen, 1999)

 Tình hình nghiên cứu về đa dạng vi nấm biển ở Việt Nam

Ở Viêt Nam phần lớn các nghiên cứu về vi nấm chủ yếu là ở trên cạn còn so với các nghiên cứu ở biển còn đang mới mẻ Chính vì vậy, vi nấm biển sẽ được coi là chủ

đề hay cho việc nghiên cứu về định danh loài mới ở Việt Nam

Theo phân loại các chủng nấm men biển từ nguồn phân lập trên đối tượng là nước biển có khả năng sinh lipit bằng việc xác định các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lí, sinh hóa, hệ thống Ubiquinone và đọc trình tự gen 26S rDNA vùng D1/D2 cho

thấy chúng thuộc loài nấm men Pichia guilliermondii Nghiên cứu này giúp con người

tận dụng được những hợp chất có trong vi sinh vật để sản xuất ra sản phẩm vi sinh vật mới (Trần Thanh Thủy và cộng sự, 2005)

Môi trường biển được chứa nguồn tài nguyên vi sinh vật vô tận cho khai thác các hoạt chất sinh học Với sự hợp tác với các nhà khoa học Nga nhằm tìm kiếm các chủng vi sinh vật sản sinh chất kháng sinh, 38 chủng nấm biển được phân lập từ các nguồn khác nhau như trầm tích và các sinh vật biển Kết quả cho thấy 23 trong số 38 chủng có khả năng ức chế mạnh vi sinh vật kiểm định (chiếm 60,2%), bao gồm 4 chủng kháng từ 5 vi sinh vật kiểm định trở lên (chiếm 10,5%), 14 chủng kháng từ 3 –

4 vi sinh vật kiểm định (36,8%), 5 chủng kháng 1 – 2 vi sinh vật kiểm định (13,1%) Đặt biệt là tất cả các chủng phân lập từ bọt biển có biểu hiện hoạt tính vi sinh vật kiểm định (100%), từ rong biển (44,4%), từ bùn(54,5%), từ san hô mềm (37,5%) (Nguyễn Đình Luyện và cộng sự, 2012)

Trong công trình “Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật biển ở các vịnh nổi tiếng Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử hiện đại” Kết quả khảo sát số lượng và đa dạng vi sinh vật ở một số vịnh ven bờ như Hạ Long, Cát Bà, Dung Quất, Quy Nhơn, Nha Trang Những khu vực gần bờ, gần cửa sông có số lượng vi sinh vật cao hơn, đa dạng hơn các mẫu lấy xa bờ Bao gồm vi khuẩn hiếu khí, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn lên men, vi khuẩn oxy hóa ammonium, vi khuẩn oxy hóa nitrit, vi khuẩn khử nitrat, vi khuẩn sử dụng dầu và vi khuẩn khử sunphat Vi sinh vật hữu ích trong các mẫu thu được đều xuất hiện với số lượng rất cao Bên cạnh đó, những vi sinh vật biển trong quá trình nuôi trồng thủy sản giúp hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh và duy trì cân bằng sinh thái, đồng thời có thể ứng cứu khi có sự cố tràn dầu xảy ra bằng biện pháp phân hủy sinh học (Lại Thúy Hiền và cộng sự, 2012)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các chủng vi nấm được phân lập từ các mẫu nước biển ven bờ ở vịnh Nha Trang, với 6 trạm lấy mẫu dự kiến bao gồm:

 Vùng lõi Hòn Mun (khu bảo tồn sinh thái biển, không có hoạt động khai thác, nuôi trồng thủy hải sản và neo đậu tàu thuyền)

 Vùng đệm Hòn Mun (cách vị trí một là 1 km, có hoạt động khai thác thủy sản

và neo đậu tàu thuyền)

 Vũng Ngán (khu vực nuôi trồng thủy sản)

 Cảng cầu Đá (khu vực neo đậu tàu thuyền thương mại, du lịch)

 Bãi biển trung tâm Nha Trang (hoạt động tắm biển, du lịch)

 Cửa sông Cái (độ muối, dòng chảy, hoạt động khai thác thủy sản)

Do giới hạn về thời gian nghiên cứu nên đề tài mới chỉ tiến hành thu mẫu tại 3

vị trí Cửa sông Cái, Bãi biển trung tâm Nha Trang, Cảng cầu Đá Các vị trí khác được tiếp tục lấy mẫu và phân tích tiếp theo

Bảng 2.1: Thông tin chi tiết về vị trí lấy mẫu

Ngày lấy

mẫu

Vị trí Kinh độ Vĩ độ Mẫu

phân tích

Độ sâu (cm)

Nhiệt

độ (°C)

Độ mặn

%

Giá trị

28 1,6 8,15

07/05/2017 Bãi

biển trung tâm Nha Trang

109 o 11’Đ 12 o 14’B Nước

biển

30 – 50

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2017 đến 06/2015 tại phòng thí nghiệm Vi sinh và Sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Đại học Nha Trang

2.2 Nguyên vật liệu

2.2.1 Môi trường

 Môi trường SDA

Công thức Difco TM Sabouraud Dextrose Agar (65g/L)

Peptic Digest of Animal Tissue 5.0g

Pancreatic Digest of Casein 5.0g

Dextrose 40g

Agar 15.0g

pH 5.6 +/- 0.2

Cách pha: Hòa tan 65g bột môi trường SDA trong 1L nước cất Hòa lẫn hoàn

toàn Sau đó, đun môi trường thường xuyên khuấy đảo và cho sôi đến 1 phút để bột hòa tan hoàn toàn Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút Để nguội 45 – 50oC và đổ

vào các đĩa peptri vô trùng Để môi trường đông lại khoảng 30 phút Ghi chú: Môi

trường đã chuẩn bị bảo quản được ở nhiệt độ 8 – 15oC, trạng thái môi trường thạch có màu hổ phách, hơi trắng đục (Zimbro và cộng sự, 2009)

 Mô trường YPD lỏng

Công thức DifcoTM Yeast Extract Peptone Dextrose Borth (50g/L)

 Môi trường PDA

Công thức Potato Dextrose Agar (39g/L)

Potato Starch .4g/L

- My Taq mix (Bioline, Anh)

- Nước loại nuclease

Bảng 2.2: Trình tự cặp mồi ITS1F_KYO2 và ITS4

STT Tên mồi Trình tự 5'→3' Độ dài

(nucleotit)

Nhiệt

độ nóng chảy (Tm)

Tài liệu tham khảo

Sản phẩm PCR dự kiến

1 ITS1F_KYO2 TAGAGGAAGTAA

o C

Hirokazu Toju và cộng sự,

2012

 Hóa chất cho điện di

- Agarose, Biobasic, Canada

- Dung dịch đệm TAE 1X

Thành phần:

+ Tris base: 108 g + Acid boric: 55 g + EDTA 0.5M: 40 ml

- 6X GelRed TM loading buffer with Tricolor

- Thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas, Mỹ)

2.3 Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng

- Máy PCR DNA Engine (Biorad, Mỹ)

- Bộ điện di (Biorad, Mỹ)

- Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

- Cân phân tích BL 3200H (Shimadzu, Nhật)

- Tủ âm sâu DF 9007 (Labkorea, Hàn Quốc)

- Tủ cấy (Telstar AV 100, Tây Ban Nha)

- Tủ sấy ED115 (Binder, Đức)

- Nồi hấp khử trùng (Sturdy industrial Co., Ltd, Đài Loan)

- Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc)

- Máy vortex Maxi mix II M37615 (Thermolyne, Mỹ)

- Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)

- Tủ ấm Binder BF115 (Binder, Đức)

- Thiết bị lây mẫu nước (Wilco, Mỹ)

- Bộ lọc hút chân không