Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen của cây ba kích (morinda offcinalis how ) ở miền bắc việt nam

Đa dạng sinh học các mẫu thuộc loài Morinda officinalis dựa vào đặc điểm hình thái .... So sánh đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc loài Morinda officinalis How.. Hơn thế nữa dược liệu

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 CÂY BA KÍCH 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Phân bố và đặc tính sinh thái 2

1.1.3 Bộ phận dùng 3

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Tác dụng dược lý 6

1.1.6 Tác dụng trong Y học cổ truyền 7

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN 7

1.2.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR 7

1.2.2 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS 8

1.2.3 Giới thiệu sơ lược về Kỹ thuật giải trình tự GEN (DNA sequencing) 9

1.2.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây Ba kích 11

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 13

2.1.2 Dung môi, hóa chất 14

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Phân tích hình thái 15

2.2.2 Phân tích hóa học 16

2.2.3 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS 17

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

3.1 TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 21

3.1.1 Đa dạng sinh học các mẫu thuộc loài Morinda officinalis dựa vào đặc điểm hình thái 21

3.1.2 Đặc điểm hình thái các mẫu thuộc chi Polygala 36

3.1.3 So sánh đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc loài Morinda officinalis How và mẫu Polygala sp 37

3.2 SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA CÁC MẪU BA KÍCH THUỘC LOÀI MORINDA OFFICINALIS HOW VÀ POLYGALA SP 38

3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ADN 40

3.3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 40

3.3.2 Kết quả phân tích các sản phẩm khuếch đại trên gel agarose 41

3.3.3 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA 41

3.3.4 Cây phân loại trình tự ITS-rADN 53

Chương 4: BÀN LUẬN 55

4.1 Về phân tích hình thái 55

4.2 Về phân tích đặc điểm hóa học 56

4.3 Về phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị ITS 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo Nucleic Acid Deoxyribo Nucleic

CTAB Cetyl trimethylammonium

bromide

Cetyl trimethylammonium bromide

dATP 2’-deoxyadenosin triphosphat 2’-deoxyadenosin triphosphat

dCTP 2’-deoxycytidin-5’-triphosphat 2’-deoxycytidin-5’-triphosphat

dGTP 2’-deoxyguanosin triphosphat 2’-deoxyguanosin triphosphat

dNTP deoxynucleotide Triphosphate deoxynucleotide Triphosphate

dTTP 2’-deoxythymin triphosphat 2’-deoxythymin triphosphat

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid Ethylendiamin Tetraacetic Acid

ETS External Transcribed Spacer Vùng phiên mã bên ngoài

Dược Hà Nội

HPTLC High performance thin layer

chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

ITS Internal Transcribed Spacer Vùng phiên mã bên trong

NCBI National Center for Biotechnology

Information

Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

RAPD Random Amplification of

Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid

rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid Ribosomal Ribonucleic Acid

TAE Tris base-acetate-EDTA Tris base-acetate-EDTA

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.1 Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR 18

Bảng 2.2 Chu trình khuếch đại ADN 18

Bảng 3.1 Các đặc điểm khác nhau giữa 11 mẫu Morinda officinalis 29

Bảng 3.2 Các đặc điểm hình thái phân biệt các mẫu Morinda officinalis How và các mẫu Polygala sp 37

Bảng 3.3 Diện tích peak Nystose của 13 mẫu Ba kích 40

Bảng 3.4 Kết quả giải trình tự ITS của 11 mẫu nghiên cứu 42

Bảng 3.5 Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu giống nghiên cứu 45

Bảng 3.6: Bảng so sánh gióng hàng ADN của 11 mẫu Ba kích thực hiện bằng phần mềm Megav6.0 46

Bảng 3.7 Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 11 mẫu 53

Bảng 4.1: Trình tự Gen vùng ITS của các mẫu Morinda Officinalis công bố trên NCBI 57

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Một số anthraquinon trong rễ Ba kích 3

Hình 1.2: Một số iridoid có trong Ba kích 4

Hình 1.3: Một số oligosaccharid tác dụng chính trong rễ Ba kích 5

Hình 1.4 Một số hợp chất thuộc coumarin và sterol phân lập từ rễ Ba kích 6

Hình 1.5: Sơ đồ vùng rDNA- ITS 9

Hình 3.1 Dạng sống của loài Morinda officinalis How 22

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái rễ loài Ba kích Morinda officinalis How 23

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái thân non loài Morinda officinalis How 23

Hình 3.4 Đặc điểm hình thái lá và lá kèm loài Morinda officinalis How 24

Hình 3.5 Đặc điểm bề mặt lá loài Morinda officinalis How 24

Hình 3.6 Cụm hoa loài Morinda officinalis How 25

Hình 3.7 Các dạng hoa loài Morinda officinalis How 25

Hình 3.8 Đài hoa loài Morinda officinalis How 25

Hình 3.9 Tràng hoa loài Morinda officinalis How 26

Hình 3.10 Các dạng bộ nhụy loài Morinda officinalis How 26

Hình 3.11 Các dạng cụm quả loài Morinda officinalis How 27

Hình 3.12 Quả và hạt loài Morinda officinalis How 27

Hình 3.13 Phân loại các mẫu Morinda officinalis bằng phép phân loại đa biến TWINSPAN 35

Hình 3.14 Đặc điểm hình thái loài Polygala sp 36

Hình 3.15 Sắc ký đồ dịch chiết methanol 13 mẫu Ba kích khai triển với hệ Ethyl Acetat: Nước: Acid Acetic: Acid Formic (6,5:2,5:2:2) ở bước sóng 366nm và ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử 39

Hình 3.16 Ảnh điện di ADN tổng số của 11 mẫu Ba Kích 40

Hình 3.17 Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên 11 mẫu Ba Kích với thang chuẩn Marker: 100bp 41

Hình 4.1 Thực trạng bán giả Ba kích tại Sa Pa (Lào Cai) và Quản Bạ (Hà Giang)

55

Hình 4.2 Cây phân loại 11 mẫu với các mẫu đã được công bố trên NCBI dựa trên so sánh trình tự ITS-Radn 59

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ba kích (Morinda officinalis How.) là một vị thuốc được sử dụng rộng rãi

trong Y học cổ truyền và Y học hiện đại với tác dụng bổ thận dương, mạnh gân xương Trước đây, Ba kích được khai thác chủ yếu từ tự nhiên không những phục

vụ nhu cầu trong nước mà còn phục vụ xuất khẩu Hiện nay, do sự khai thác quá mức, dẫn đến nguồn Ba kích tự nhiên bị cạn kiệt Nhiều địa phương như Bắc Giang, Quảng Ninh, Lạng Sơn đã triển khai trồng Ba kích và đã mang lại những hiệu quả kinh tế nhất định Tuy nhiên các nguồn giống Ba kích được thu hái trong

tự nhiên từ rất nhiều nơi khác nhau điều này ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng dược liệu và năng suất cây trồng Hơn thế nữa dược liệu Ba kích còn được làm giả

mạo bởi một số cây thuộc chi Polygala; đặc biệt tại tỉnh Lào Cai (khu du lịch Sa

Vì các lý do đó, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen của cây

Ba kích (Morinda officinalis How.) ở miền Bắc Việt Nam” được thực hiện với

các mục tiêu sau:

1 Phân tích đặc điểm hình thái và định tính hóa học của một số mẫu Ba kích

thuộc loài Morinda officinalis How và một số mẫu làm giả Ba kích thuộc chi Polygala ở khu vực miền Bắc Việt Nam

2 Xác định tính đa dạng di truyền của một số mẫu Ba kích thuộc loài

Morinda officinalis How ở khu vực miền Bắc Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 CÂY BA KÍCH

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học:Morinda officinalis How

Tên thường gọi: Ba kích

Tên gọi khác: Ba kích thiên, Dây một gà, Chấu phóng xì (Hải Ninh), Thau tày cáy (Tày), Chồi hoàng kim, Sáy cày (Thái), Chày kiang dòi (Dao), Liên châu ba kích, Medicinal indian Mulberry (Anh) [8], [11]

Cây thảo, sống lâu năm, leo bằng thân cuốn, dài hàng mét Rễ hình trụ, mập, vặn vẹo, vỏ ngoài màu hồng nhạt, thịt màu hồng hay tím, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, giữa có lõi [4] Thân hình tròn trơn, màu nâu xám, có nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với nhau Thân non màu tím có lông, sau nhẵn, lóng dài 5-10cm [1],[2],[4],[9] Lá mọc đối Cuống dài 5-7mm Phiến lá hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6-14cm, rộng 2,5-6cm, lúc non có lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở gân và mép lá, màu xanh lục, sau già ít lông hơn và màu trắng, gân phụ 8-9 cặp Lá kèm mỏng,

ôm sát vào thân [1],[2],[3],[4] Cụm hoa mọc thành tán ở đầu cành, dài 1,5cm Hoa nhỏ màu trắng, sau hơi vàng Đài hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều Tràng hàn liền ở phía dưới thành ống ngắn Nhị 4, bầu dưới Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi chín màu đỏ, mang đài tồn tại ở đỉnh, có long [4],[9],[11] Mùa hoa: Tháng 5-

0,3-6 Mùa quả: Tháng 7- 10 [3],[4],[5]

1.1.2 Phân bố và đặc tính sinh thái

Ba kích mọc hoang ở ven rừng thứ sinh, trung du và miền núi Cây cũng được trồng nhiều nơi, trồng bằng những đoạn rễ trên đất nhiều màu, ẩm, mát, được che bóng có giá tựa cho cây leo [4]

Ba kích được gặp nhiều ở Quảng Ninh, Hà Nội, Ninh Bình, Phú Thọ,

Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Bắc Ninh Còn có cả ở Trung Quốc [4] 1.1.3 Bộ phận dùng

Rễ (Radix Morindae officinalis), có thể đào rễ quanh năm, tốt là vào mùa

thu đông, rửa sạch cắt bỏ rễ con, phơi hay sấy cho gần khô, đập dẹt rồi phơi sấy tiếp cho đến khô hẳn [4]

1.1.4 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu đã chứng minh rễ Ba kích có rất nhiều hợp chất thuộc các nhóm như anthraquinon, iridoid (nhóm diterpenoid), terpenoid, phytosterol, các sacchrid (nhất là nhóm oligosaccharid) và acid hữu cơ, coumarin…

anthraquinon -OH -H -H -H -OH 2-methyl-

anthraquinon -H -CH3 -H -H -H Hình 1.1: Một số anthraquinon trong rễ Ba kích

Một số anthraquinon được phân lập từ Ba kích như: Rubiadin, 1-methyl ether, 1-hydroxy anthraquinon, 1-hydroxy-2-methyl anthraquinon, 1,6-dihydroxy-2,4-dimethoxy anthraquinone [15], 1,6-dihydroxy-2-methoxy anthraquinon, 1-hydroxy-2-methoxy anthraquinon, physcion, 2-methyl-anthraquinon, 1-hydroxy-2-hydroxymethyl anthraquinon, 1,3-dihydroxy-2-methoxy-anthraquinon, 1,4-dimethoxy-2-hydroxy anthraquinone [24], 1,4-

rubiadin-alizarin-1-methylether, lucidin-ω-methylether, anthraquinon, 1-hydroxy-3-hydroxymethyl anthraquinon, 3-hydroxy-1,2-dimethoxy-anthraquinon, 2-hydroxy-1-methoxy anthraquinon, 1,2-dihydroxy-3-methyl-anthraquinon, 1,3,8-trihydroxy-2-methoxy-anthraquinon, 2-hydroxymethyl-3-hydroxy anthraquinon, 2-methoxy-anthraquinon, alizarin-2-methylether, 1,2-dimethoxy anthraquinon… (Hình 1.1), [21],[25],[34],[46]

1-hydroxy-2,3-dimethyl-* Nhóm chất iridoid glycosid (diterpenoid)

- Nhóm gắn đường glucose: Asperulosid, monotropein [27], asperulosid tetra-acetat, morofficinalosid, acid asperulosidic [39], acid desacetyl-asperulosidic… [16]

- Nhóm gắn đường lacton: Morindoli, monotropein, morofficinalosid… (Hình 1.2) [10],[28],[42],[43]

hexasaccharid and heptasaccharid, sucrose, inulin-type trisaccharide, inulotriose, inulotetrose, inulopentose, 1-kestose (nhóm oligosaccharid), Arabinose, galactose, galacturonic acid [30.], acidic polysaccharides (nhóm monosaccharid)… (Hình 1.3) Hiện nay nystose đang được dùng để đánh giá chất lượng trong chuyên luận Ba kích của một số quốc gia và vùng lãnh thổ như Trung Quốc, Hồng Kông,… [18],[20],[21],[34]

Hình 1.3: Một số oligosaccharid tác dụng chính trong rễ Ba kích 5) Nhóm coumarin: Scopoletin [35], [43]

6) Nhóm sterol: Một số phytosterol đã được phân lập từ rễ Ba kích như

sigmasterol, daucosterol [30],[34], β-sitosterol … [21]

7) Các acid hữu cơ : Acid fumaric, acid succinic…[21], [24]

Daucosterol β-sitosterol

Hình 1.4 Một số hợp chất thuộc coumarin và sterol phân lập từ rễ Ba kích

* Đánh giá chất lượng Ba kích bằng phương pháp hóa học:

- Theo Dược điển Việt Nam 4, trong chuyên luận Ba kích không có phương pháp định lượng và chỉ có định tính bằng Phương pháp sắc ký lớp mỏng so với dịch chiết của mẫu chuẩn

- Theo Dược điển Hồng Kong 2012 với chuyên luận Ba kích đã sử dụng phương pháp định tính và định lượng theo hợp chất Nystose

- Theo Dược điển Trung Quốc 2010 với chuyên luận Ba kích đã sử dụng phương pháp định lượng theo hợp chất Nystose

1.1.5 Tác dụng dược lý

Cao chiết từ Ba kích có nhiều tác dụng khác nhau trong đó tác dụng hướng sinh dục nam là tác dụng được quan tâm nhất Dịch chiết rễ Ba kích có tác dụng làm tăng nồng độ testosteron, tăng hormone vùng dưới đồi, tuyến yên [40],[45], tăng cường khả năng tình dục [33] và có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tinh trùng [36] Đây là một trong những cơ chế chữa vô sinh và yếu sinh lý ở nam giới

Ngoài ra, Ba kích còn được nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng khác : Tác dụng tăng lực : Với liệu pháp chuột bơi, dịch chiết nước Ba kích với liều 5-10g/kg cơ thể, dùng liên tiếp 7 ngày có tác dụng tăng cường sức dẻo dai cho súc vật thí nghiệm [11],[17]

Tác dụng chống độc : Baijiasu phân lập từ Ba kích có tác dụng chống lại khả năng gây độc thần kinh gây ra bởi beta amyloid trong tế bào PC12

[14]; tăng cường khả năng tình dục của chuột đực và tác dụng bảo vệ, chống

oxy hóa của tinh trùng người [11]

Ngoài ra, còn một số tác dụng khác đã được chứng minh trên thực

nghiệm, gồm : Tác dụng hạ đường huyết và giảm stress [29] ; Tác dụng dự phòng thiếu máu cục bộ nhờ cơ chế tăng canxi và các gốc tự do [11]; Tác

dụng tăng sinh tế bào xương và ngăn ngừa tiêu xương trên xương [47], thành phần anthraquinon được chứng minh là có tác dụng giảm đau, chống viêm

[22], kháng khuẩn, chống HIV…[13],[29],[44]

1.1.6 Tác dụng trong Y học cổ truyền

Tính vị công năng : Ba kích có vị ngọt, tính ấm vào kinh thận

Công dụng : Ôn thận trợ dương, mạnh gân cốt, trừ phong thấp

Chủ trị : liệt dương, di mộng tinh, xuất tinh sớm, tử cung lạnh, khó mang thai, kinh nguyệt không đều, bụng dưới đau lạnh, phong tê thấp đau, gân xương mềm yếu [2]

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG

DI TRUYỀN

1.2.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR

Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp cho phép nhân một trinh tự AND bất kỳ lên một số lượng bản sao gần như vô hạn tạo nguồn vật liệu AND cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo

PCR là quá trình khuếch đại của một trình tự AND đặc hiệu in vitro do

sự xúc tác của enzyme AND polymerase Sự khuếch đại này nói chung được thực hiện như các quy trình lặp lại gồm 3 giai đoạn: Biến tính gắn mồi kéo dài chuỗi Trong dung dịch có các đoạn mồi mỗi loại sẽ bắt cặp bổ xung với đầu mạch đơn tương ứng: như vậy 1 mạch kép AND sau phản ứng do AND polymerase thực hiện sẽ thành 2 mạch AND kép và có thể thực hiện chu kỳ mới tạo thành số AND mới theo cấp số nhân 2n sau n chu kỳ [6]

Các bước tiến hành: Mỗi chu kỳ tiến hành theo 3 bước cơ bản:

Bước 1: Biến tính AND khuôn

Bước 2: Lai hay bắt gặp mồi

Bước 3: Kéo dài chuỗi

1.2.2 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS

rDNA là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được nghiên cứu vì nó là gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hoá cho bất kỳ protein nào Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá Ribosome hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các primer thiết kế dựa trên những Oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều đoạn mồi cũng được thiết

kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi

sinh vật [32]

rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5,8S (một tiểu đơn vị ribosome nhỏ hơn trở thành một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS Vùng phiên mã 18S kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28S cộng với 5,8S và một gen 5S thêm vào từ những phần khác của genome hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosome RNA Những vùng ITS được phiên mã (tổng hợp từ RNA), nhưng bị cắt trước khi rRNA hoàn thiện được hình thành, tuy nhiên ITS lại có chức năng trong sự hình thành ribosome Ở đầu kết thúc 5’ của 18S

và đầu kết thúc 3’ của 28S, cũng có một vùng được biết đến là ETS IGS là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA Tuy nhiên vùng không gian không phiên mã của những rDNA chứa trình tự kết thúc phiên mã của những gene rRNA

Hình 1.5: Sơ đồ vùng rDNA- ITS Các rDNA 5,8S; 18S; 28S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng ITS và các vùng ETS Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã Có một rDNA 5S thường không có

vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm [23]

rDNA 18S thường được quan tâm nghiên cứu, rDNA 5,8S có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đối song rRNA 5S là thành phần không thể thiếu của nu-LSU- rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosome và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein [31]

Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hoá trong cùng loài [23]

Những gen rRNA ở sinh vật có nhân điển hình (ribosome DNA hay rDNA) được tìm thấy như những phần đơn vị lặp lại được sắp xếp thành từng cặp

Mỗi đơn vị lặp lại chứa một vùng phiên mã (ETS1, ETS2, 18S, 25S

và 5,8S) và một vùng không phiên mã Trong vùng phiên mã, ITS được tìm thấy trên gen 5,8S rRNA bao gồm ITS1 và ITS2

1.2.3 Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật giải trình tự GEN (DNA sequencing)

Kỹ thuật giải trình tự Gen là công trình được công bố bởi Maxam và Gilbert năm 1977 Tuy nhiên hơn 20 năm qua kỹ thuật này được cải tiến rất nhiều Đặc biệt với sự trợ giúp của máy tính, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ

thành công cụ rất có giá trị, làm nền tảng cho phân tích genome

Phương pháp hóa học giải trình tự DNA

Nguyên tắc của phương pháp này là:

(1) Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P);

(2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA

Ví dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng các thêm một gốc methyl ở vị trí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine và NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine và Adenine, NaOH để làm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine [26]

Phương pháp enzyme giải trình tự DNA:

Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do

Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G) Phản ứng được thực hiện trong 4 ống, và mỗi ống cho một loại dNTP khác nhau Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì

ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào Nhờ vậy trong ống phản ứng cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ

ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA

Giải trình tự bằng máy tự động (Automated sequencer):

Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di

Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA

Với các ddNTP đánh dấu huỳnh quang khác nhau, các đọan trình tự tận cùng ở đầu 5’ sẽ được đánh dấu bằng 4 màu huỳnh quang khác nhau tương ứng với nuleotide là A, hay T, hay C hay G Chính nhờ vậy không cần phải thực hiện phản ứng giải trình tự trong 4 ống phản ứng

1.2.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây Ba kích

Các nghiên cứu về đa dạng di truyền cây Ba kích trước đây được tiến hành chủ yếu sử dụng mồi RAPD

Đặc điểm hình thái và di truyền của Ba kích đã được các nhà khoa học

Trung Quốc nghiên cứu Năm 2006, Ding và cộng sự đã phân tích sự đa dạng

di truyền Ba kích bằng chỉ thị RAPD Trong số 40 mồi RAPD được sử dụng thì 14 mồi cho sản phẩm đa hình Qua phân tích kết quả, tác giả đưa ra kết luận cây Ba kích có sự đa dạng ở mức độ phân tử [19]

Ở Việt Nam, năm 2010 Nguyễn Cẩm Dương đã sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) để phân biệt các dạng hình thái khác nhau của loài Ba kích Nghiên cứu di truyền của 25 mẫu Ba kích thu ở Quảng Ninh, Phân tích phổ băng điện di của kết quả thu được một số băng ADN đồng hình cho tất cả 25 mẫu Ba kích sử dụng trong nghiên cứu, có sự khác biệt giữa phổ băng ADN của các mẫu có đặc điểm hình thái thân có lông và thân không có lông [7]

Nghiên cứu cũng cho thấy về di truyền giữa 25 mẫu loài Ba kích thu thập trong nghiên cứu được chia thành hai nhóm lớn rõ rệt: Nhóm thứ nhất (I) bao gồm các mẫu Ba kích có đặc điểm hình thái thân có lông (L) có hệ số tương đồng di truyền giữa chúng dao động từ 0,54 đến 0,88; nhóm thứ hai (II)

là các mẫu Ba kích có đặc điểm hình thái thân không có lông (K) có hệ số tương đồng di truyền giữa chúng từ 0,56 đến 0,95 [7]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

- Mẫu Ba kích thuộc loài Morinda officinalis How được thu thập từ các

quần thể mọc tự nhiên từ vùng Đông Bắc (Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh); Tây Bắc (Lào Cai) trong giai đoạn từ tháng 1/2014 - 4/2014 Tổng cộng có 11 quần thể được thu thập, được ký hiệu từ BK1 đến BK11 (Phụ lục 1) Các mẫu này được trồng, chăm sóc, trong cùng một điều kiện tại thôn Bà Gò, xã Nghĩa Phương, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang từ tháng 4/2014 đến tháng 6/2016

- Mẫu "Ba kích" thuộc chi Polygala được thu thập tại tỉnh Lào Cai, từ

1 BK1 Xã Yên Định, huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang HNIP/18287/16

2 BK2 Xã Tuấn Đạo, huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang HNIP/18288/16

3 BK3 Xã An Thượng, huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang HNIP/18289/16

4 BK4 Xã Tràng Lương, huyện Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh HNIP/18290/16

5 BK5 Xã Thượng Yên Công, huyện Uông Bí, tỉnh Quảng Ninh HNIP/18291/16

6 BK6 Xã Lương Mông, huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh HNIP/18292/16

7 BK7 Xã Đại Thành, huyện Tiên Yên, tỉnh Quảng Ninh HNIP/18293/16

8 BK8 Xã Đại Đồng, huyện Tràng Định, tỉnh Lạng Sơn HNIP/18294/16

9 BK9 Xã Quân Chu, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên HNIP/18295/16

10 BK10 Xã Lam Vĩ, huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên HNIP/18296/16

- Mẫu phân tích đặc điểm hình thái: Toàn cây

- Mẫu phân tích thành phần hóa học: Rễ cây Riêng rễ của Morinda

officinalis được trồng trong cùng điều kiện tại thôn Bà Gò, xã Nghĩa Phương,

huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang Các mẫu rễ được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 60 0C, xay thành bột thô

- Mẫu phân tích đa dạng di truyền: Lá cây

- Các mẫu này được giám định tên khoa học và lưu mẫu tại Phòng Tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP ),số hiệu mẫu từ HNIP/18287/16 đến HNIP/18299/16

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam IV

- Bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck)

- Dung môi phân tích, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích

- Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng Sigma và Merck gồm có CTAB, tris base, boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymeraza (Sigma); ethanol, 2-propanol, acetic acid glacial, phenol, chloroform, isoamyalcohol, agarose, các mồi ITS (Merck)

Danh sách các mồi ITS (White et al 1989) (Sigma):

+ ITS1; trình tự Nucelotid: GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG + ITS2; trình tự Nucelotid: CACGCTTCTCCAGACTACA

- Chất chuẩn Nystose (hàm lượng 98%) (Baoji Guokang Bio Technology - Trung Quốc)

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

2.1.3.1 Phân tích hình thái:

Kính lúp soi nổi Leica EZ4, máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D, Canon

SD4000IS tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.3.2.2 Nghiên cứu hóa học

- Tủ sấy SHELLAB

- Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01 g

- Máy xác định hàm ẩm AND MF-50

- Hệ thống chiết siêu âm

- Máy cô quay Buchi

- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: Máy chấm sắc ký Linomat 5, buồng triển khai ADC2, buồng phát hiện TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCATS và VideoScan

- Các dụng cụ thủy tinh: Cốc có mỏ nhiều thể tích, bình định mức nhiều thể tích, ống nghiệm, pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, bình gạn

2.3.2.3 Nghiên cứu di truyền

- Thiết bị bảo quản mẫu: Tủ lạnh sâu -230C (Biomedical Freezer – Sanyo)

- Dụng cụ tách chiết bao gồm: Chày, cối sứ, máy ly tâm để bàn tốc độ cao Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu -300C, ống eppendorf (0,2 ml; 1,5 ml), bể ổn nhiệt Memmert WNB10, máy lắc vortex IKA

- Dụng cụ nhân gen: Eppendorf Mastercycler Pro S, máy soi chụp ảnh gen UVP Gel-docIt , máy điện di Consort EV 222

- Dụng cụ giải trình tự gen: máy giải trình tự ABI 3730xl DNA Analyzer, máy nhân gen DNA Engine Tetrad 2 Peltier Therma Cycler (BIO-RAD)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phân tích hình thái

Các đặc điểm hình thái được quan sát và ghi chép tạo thành các biến phân loại bao gồm: dạng sống; lá (cuống lá: hình dạng cuống lá; kích thước cuống lá,

bề mặt; gốc lá: hình dạng gốc lá; phiến lá: hình dạng; chỉ số lá; hình dạng gân lá (gân chính, gân phụ; gân cấp 3); số lượng gân lá; bề mặt lá; hình dạng mép lá; hình dạng ngọn lá, bề mặt trên lá, bề mặt dưới lá), lá kèm (cách đính, màu sắc, hình dạng, bề mặt, độ dài); thân (bề mặt thân, màu sắc thân non, màu sắc thân

già), quả (cách mọc, số quả trên cụm; bề mặt), hạt (số hạt) Tổng cộng có 35 biến được sử dụng (Phụ lục 2)

Các mẫu và biến số của nó được lập thành ma trận phân loại và được phân tích bằng phép phân loại đa biến bảng 2 chiều loài chỉ thị (TWINSPAN), sử dụng phần mềm PCORD phiên bản 4.0

Tên khoa học được xác định dựa trên phương khóa phân loại và mô tả loài trong các tài liệu thực vật trong nước Các mẫu sau khi tra khóa được so sánh đối chiếu với các tiêu bản type hoặc isotype của từng loài tham khảo từ mẫu lưu tại phòng tiêu bản Paris, New York và Kew

b Mẫu thử

Cân chính xác khoảng 0,5g bột, chiết siêu âm với 10ml Ethanol 3 lần mỗi lần 20 phút Gộp các dịch chiết, lọc qua giấy lọc và cô cất quay ở áp suất giảm đến cắn Hòa tan cắn trong 5ml methanol, lọc Dịch lọc được sử dụng làm mẫu để tiến hành xác định sắc kí lớp mỏng

đầu tiên so với vết mép bản mỏng là 15 mm Độ dài băng chấm 8,0 mm và thể tích chấm mỗi vết là 2,0 μl

- Hệ dung môi khai triển: Ethylacetat : Nước : Acid formic : Acid Acetic

(6,5:2,5:2:2)

- Điều kiện chạy HPTLC:

+ Điều kiện môi trường: nhiệt độ 260C; độ ẩm tương đối 65% + Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; dung môi khai triển: 10,0 ml + Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút

+ Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút

+ Thời gian bão hòa bản mỏng: 4 phút

+ Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80,0 mm

- Bản mỏng được nhúng thuốc thử valinin/acid sulphuric (pha theo DĐVN IV), sau đó sấy ở 1050C trong 15 phút và hiện màu dưới ánh sáng thường

- Chụp ảnh bản mỏng, tính toán giá trị Rf tương ứng của vết chuẩn Nystose 2.2.3 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS

1) Tách chiết ADN tổng số:

Sử dụng phương pháp CTAB của P Doyle và Doyle (1987) có một số cải tiến nhỏ đã được lựa chọn để tiến hành tách chiết ADN từ 11 mẫu nghiên cứu

- Quy trình:

+ Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C

+ Nghiền khoảng 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn

+Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10% Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB 2%

+ Ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút

+ Bổ sung chloroform, lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa Ly tâm 10.500 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4C Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới

+ Tiếp tục chiết lần 2 bằng chloroform, thu được dịch chiết chứa ADN

+ Kết tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh Để ở -200C trong 1 giờ + Ly tâm 10.500 vòng/phút trong 15 phút ở 40C Lấy tủa

+ Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE

+ Loại ARN: bổ sung RNase vào mẫu ADN và ủ ở 370C trong 1 giờ

2) Khuếch đại ADN (PCR):

- Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.2 Chu trình khuếch đại ADN

Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản phẩm PCR được bổ sung 4µl ADN Sequencing Stop Solution (Bao gồm: 10 mM NaOH + 95% formamide + 0,05% bromophenol + 0,05% xylene cyanol)

3) Điện di ADN trên gel agarose:

Cân 0,4 g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn Để nguội 45-50C bổ sung 2,5 l ethidium bromide, đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm

+ Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4l loading dye và tra vào các giếng trên gel

+ Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với

bộ nguồn

+ Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr

4) Thôi gel theo kit Qiagen:

1 Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2ml

2 Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG : 1 thể tích gel (100mg

~100μl)

3 Ủ ở nhiệt độ 500C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn

4 Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10μl sodium acetate 3M, pH 5

5 Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút

6 Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng/ phút để loại hết agarose dư thừa

7 Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút

8 Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1.5ml sạch

9 Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8.5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút, thu lượng ADN tinh sạch

5) Giải trình tự:

Sản phẩm PCR ITS sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) Sau đó các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng chương trình MEGA v5.1 để tạo cây đa dạng

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

3.1.1 Đa dạng sinh học các mẫu thuộc loài Morinda officinalis dựa vào

đặc điểm hình thái

3.1.1.1 Đặc điểm chung

11 mẫu thu thập thuộc loài Morinda officinalis How có đặc điểm hình thái

chung như sau:

Cây dây leo bằng thân cuốn, dài từ 3 - 5m (Hình 3.1) Rễ phình to thành củ, hình trụ, mập, vặn vẹo, từ 1 củ chính phân thành 2 - 3 nhánh cấp 2;

từ nhánh cấp 2 phân thành 3 - 5 nhánh cấp 3, có thể phân tới nhánh cấp 5 Đường kính củ chính từ 1,5 - 10 mm; chiều dài củ từ 20 - 60 cm Củ thường hơi thắt lại tạo thành các đốt có chiều dài từ 1 - 3 cm, trông giống ruột gà Vỏ ngoài màu hồng nhạt, thịt màu hồng, tím hay trắng, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, giữa có lõi cứng có tỷ lệ so với đường kính củ khác nhau (Hình 3.2)

Thân hình tròn, chia nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với nhau Thân non nhẵn, phủ lông ngắn-cứng hay lông dài, có cạnh, màu xanh, tím đậm hoặc tím nhạt, sau nhẵn, chuyển từ màu xanh sang nâu Mỗi đốt dài 5-15 cm (Hình 3.3)

Lá đơn, mọc đối Cuống dài 2 - 10 mm, đường kính 1,5-3 mm, phủ lông hay nhẵn Phiến lá hình mác hoặc bầu dục thuôn nhọn, dài 4-13,5cm, rộng 2,5 - 5,5 cm, chỉ số lá 2 - 3,5 Gốc lá hơi lệch, nhọn, tròn hoặc hơi hình tim; mép phẳng hay lượn sóng, hơi uốn mặt sau; ngọn lá tròn hay nhọn; mặt trên nhẵn hay phủ lông dài; mặt dưới nhẵn hay phủ lông Lá non màu tím sau chuyển sang xanh, có thể có hoặc không hốc Domatia hốc giữa gân chính và phụ có phủ lông Gân lá hình lông chim, gồm 4-9 cặp gân bên, nổi mặt dưới, lõm ở mặt trên Gân chính có lông hoặc nhẵn ở mặt dưới Lá kèm 2, dính nhau, ôm lấy thân, mỏng, mỗi lá có 2 thùy nhọn hoặc hàn liền ở dưới, trên chia làm 2 thùy, dài 2-4mm, màu trắng, nâu hay tím nhạt, ôm sát vào thân, dài

4mm (Hình 3.4, Hình 3.5)

Cụm hoa dạng tán, gồm 1-8 tán ở nách lá hay đầu cành, mỗi tán mang 1-14 hoa Cuống tán dài 0,3-1,5cm, đường kính 2-3mm, nhẵn hay phủ lông Hoa nhỏ, khi mới nở màu trắng, sau hơi vàng hay tím đen Đài 3-4, hơi dính nhau ở dưới, dài 1-5mm, rộng 1-2mm, đều hay không đều nhau: 2 đài nhỏ dài 1-3mm, rộng 1-2mm, hình tam giác, đài lớn hình dải, dài 5mm, rộng 2mm, màu xanh, nhẵn hay phủ lông cả hai mặt Tràng 3-4, có phần móng dính nhau tạo thành ống hình chum hoặc hình trụ, đường kính 3mm, cao 5mm, nhẵn hay phủ lông ở mặt ngoài; phần phiến rời, hình tam giác, dài, rộng khoảng 3mm, mặt ngoài nhẵn hay phủ lông, mặt trong có một vòng lông dày đặc, thẳng, màu trắng, dài khoảng 1,5mm, ở phía trên họng tràng Bộ nhị 3-4, dính vào họng tràng Chỉ nhị rất ngắn Bao phấn 2 ô, dài 1mm, thuôn hai đầu, nứt dọc

Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau tạo thành bầu dưới, 3 ô, đường kính 3mm, nhẵn hay phủ lông Mỗi ô mang 2 noãn (Hình 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10) Quả hình cầu, từ 1-8 quả/1 tán, rời hoặc dính với nhau thành quả kép ở các mức độ khác nhau Bề mặt quả nhẵn hoặc phủ lông, xanh khi non và chuyển màu cam khi chín, mang 3 đài còn lại trên đỉnh quả, có hình dạng và kích thước không đều nhau Hạt 4 - 6/quả (Hình 3.11, Hình 3.12)

2-Hình 3.1 Dạng sống của loài Morinda officinalis How

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái rễ loài Ba kích Morinda officinalis How

1,2: Hình dạng rễ; 3,4; Tiết diện rễ (3 lõi lớn, 4 Lõi nhỏ); 5: Tím; 6: Trắng

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái thân non loài Morinda officinalis How

1 Thân phủ lông dài; 2 thân nhẵn

Hình 3.4 Đặc điểm hình thái lá và lá kèm loài Morinda officinalis How

1 Thân mang lá; 2,3 Hình dạng lá; 4,5 Mặt trên và mặt dưới lá; 6,7 Lá kèm

Hình 3.5 Đặc điểm bề mặt lá loài Morinda officinalis How

1,2 nhẵn ; 3,4 phủ lông

Hình 3.6 Cụm hoa loài Morinda officinalis How

Gồm nhiều tán nhỏ, cuống dài (trái), ít tán, cuống ngắn (phải)

Hình 3.7 Các dạng hoa loài Morinda officinalis How

Hình 3.8 Đài hoa loài Morinda officinalis How

Hình 3.9 Tràng hoa loài Morinda officinalis How

1: Ống tràng hình trụ; 2 Ống tràng hình chum, phủ lông; 3: Ống tràng hình

chum, nhẵn; 4: 3 tràng; 5: 4 tràng

Hình 3.10 Các dạng bộ nhụy loài Morinda officinalis How

1: Bầu nhẵn, 2 vòi nhụy; 2 Bầu phủ lông, 2 vòi nhụy; 3: Bầu phủ lông, 3 vòi nhụy

Hình 3.11 Các dạng cụm quả loài Morinda officinalis How

1: Rời, có lông; 2: Tụ, có lông; 3: Rời, nhẵn; 4: Tụ, nhẵn

Hình 3.12 Quả và hạt loài Morinda officinalis How

3.1.1.2 Tính đa dạng dựa trên đặc điểm hình thái các mẫu thuộc loài Morinda officinalis How

Về hình thái, 11 mẫu Morinda officinalis How thu được có nhiều đặc điểm

khác nhau về hình thái

Về thân: Tất cả các mẫu thu được đều có lông trên thân tuy nhiên rất khác nhau về mật độ và độ dài của lông Các mẫu BK3, BK4, BK5, BK9, BK11 có lông dài và dày trên thân, các mẫu: BK1, BK2, BK7, BK8, BK10 có lông ngắn và thưa trên thân Thân non các mẫu BK1, BK4, BK6, BK7, BK8 có màu tím hoặc xanh tím còn các mẫu còn lại thân non màu xanh, hầu hết đều có thân trưởng thành màu xanh hoặc nâu

Về lá kèm: Lá kèm mỏng màu trắng hoặc nâu nhạt ôm lấy thân, đa số có 2 gân tạo thành 2 thùy nhọn (BK1, BK2, BK3, BK4, BK5, BK6) các mẫu còn lại lá kèm hình tù song vẫn có 2 gân (BK7, BK8, BK10, BK11) chỉ duy có mẫu BK9 lá kèm không rõ gân và tù

Về lá: Gốc lá các mẫu BK1, BK2, BK3, BK10 hình nhọn còn lại các mẫu khác gốc lá tròn hoặc tròn hơi tim, cuống lá các mẫu đa số đều có kích thước trung bình 5-6mm, mẫu BK4, BK8 cuống lá ngắn 2-5 mm; mẫu BK9 cuống dài 8-10

mm Các mẫu BK1, BK2, BK3, BK7, BK9 trên lá có hốc Domatia các mẫu còn lại không có

Về hoa: Các mẫu BK4, BK5, BK6, BK8, BK9 nhiều tán, các mẫu còn lại ít tán, bề mặt đài và bầu của các mẫu BK3,8,9,11 phủ nhiều lông, các mẫu còn lại phủ ít lông hoặc nhẵn Nhìn chung các mẫu đều có: Tràng hoa hình chum, 3 tràng, bầu 2 ô, 2 vòi nhụy chỉ có mẫu BK10 có cấu tạo hoa khác: Tràng hoa hình trụ, 4 tràng, bầu 3 ô, 3 vòi nhụy

Về quả: các mẫu BK2, BK8, BK9, BK11 quả đơn, các mẫu còn lại đều có hỗn hợp quả đơn và quả tụ 2, tụ 3

Các đặc điểm được thể hiện chi tiết trong Bảng 3.1, trong đó khác nhau lớn nhất là về mật độ và kích thước lông trên thân, cuống, gân lá, lá, kèm, hoa và quả

Điều này cho thấy rằng 11 mẫu nghiên cứu thuộc loài Morinda officinalis có tính

đa dạng rất cao dựa vào đặc điểm hình thái

Bảng 3.1 Các đặc điểm khác nhau giữa 11 mẫu Morinda officinalis

1 Kích thước

lõi rễ

Trung bình

Trung bình

Trung bình Lớn

Trung

2 Bề mặt thân

có lông ngắn, thưa

có lông ngắn, thưa

có lông dài dày

có lông dài và dày

có lông ngắn, thưa

có lông dài và dày

có lông ngắn và thưa

có lông ngắn và thưa

có lông dài và dày

có lông ngắn, thưa

có lông dài và dày

3 Màu sắc

thân non xanh tím xanh xanh tím nhạt xanh tím nhạt xanh tím

tím nhạt xanh xanh xanh

4 Màu sắc

thân già nâu

xanh và nâu

xanh và nâu Nâu

hàn liền ở dưới, trên chia làm

2 thùy

ôm lấy thân

ôm lấy thân

ôm lấy thân

ôm lấy thân ôm lấy thân

ôm lấy thân

ôm lấy thân

ôm lấy thân

ôm lấy thân

6 Màu sắc tím nhạt nâu trắng tím nhạt nâu trắng trắng trắng nâu nâu nâu

STT Đặc điểm Kết quả đặc điểm

có 2 thùy nhọn

có 2 thùy nhọn

có 2 thùy nhọn

có 2 thùy nhọn

có 2 thùy nhọn tù, 2 gân

tù, 2 gân

không thây gân, tù

lông ngắn, thưa

lông dài

và dày

lông rất ngắn, dày

lông dài

và dày

lông ngắn, thưa

lông ngắn, thưa

lông dài và thưa

lông ngắn,

lông dày và

lông dày

và dài

lông ngắn,

lông dày

và dài

lông ngắn, dày

lông ngắn,

lông dày và

lông ngắn,

lông dày và

STT Đặc điểm Kết quả đặc điểm

tròn hơi tim

có lông rất ngắn, thưa

có lông dài và dày

có lông dài và dày

có lông rất ngắn, thưa

có lông dài và dày

có lông rất ngắn, thưa

có lông dài và dày

có lông dài và dày

có lông dài và dày

có lông dài và dày

STT Đặc điểm Kết quả đặc điểm

hình mạng

hình mạng

gân phụ song song với gân cấp

1

hình mạng

có một số gân phụ vuông gốc với gân chính

hình mạng

gân phụ song song với gân cấp 1

hình mạng

hình mạng

hình mạng

STT Đặc điểm Kết quả đặc điểm

Lông dày

Lông dày Nhẵn

Lông dày

Lông thưa Lông thưa Nhẵn

Lông thưa

Lông thưa Nhẵn

Lông thưa

31 Bề mặt bầu Nhẵn Nhẵn Lông

thưa Nhẵn

Lông thưa Lông thưa Lông thưa

Lông thưa

Lông thưa Nhẵn

Lông thưa

STT Đặc điểm Kết quả đặc điểm

đơn đơn đơn/kép

lông dài, dày

lông dài, dày nhẵn

lông dài,

lông dài, dày nhẵn nhẵn

lông dài, dày

Kết quả phân loại đa biến dựa vào TWINSPAN (Phụ lục 3,4) cho thấy

11 mẫu nghiên cứu thuộc loài Morinda officinalis thuộc vào 2 nhóm chính ở

mức tương đồng 75% (Hình 3.13) :

+ Nhóm 1 gồm các mẫu BK3; BK4, BK6, BK8, BK9, BK11

+ Nhóm 2 gồm các mẫu BK1, BK2, BK5, BK7, BK10

2 nhóm này được phân biệt qua đặc điểm chính là bề mặt dưới phiến lá:

nhóm 1 gồm các mẫu có lông; nhóm 2 gồm các mẫu không có lông

Bảng mã hóa biến hình thái và kết quả phân tích TWINSPAN được trình

bày trong phụ lục 3 và phụ lục 4

Hình 3.13 Phân loại các mẫu Morinda officinalis bằng phép phân loại đa

biến TWINSPAN