Định tính một số thành phần hóa học và đánh giá tác dụng sinh học của bài thuốc AZK

ĐẶT VẤN ĐỀHo là phản xạ sinh lý của cơ thể để tăng lưu thông khí đường hô hấp, nhưng cũng là một trong những triệu chứng ban đầu của rối loạn đường hô hấp; có nhiều tác nhân gây ho, tron

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1.CHỨNG HO 2

1.1.1.Theo Y học hiện đại 2

1.1.2.Theo Y học cổ truyền: 3

1.2.BÀI THUỐC AZK 6

1.2.1 Thông tin chung về bài thuốc 6

1.2.2 Các vị thuốc trong bài thuốc 6

1.2.3 Cơ sở của bài thuốc 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 188

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 188

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 188

2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu 188

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 199

2.2.1 Định tính một số thành phần hoá học của cao đặc AZK 199

2.2.2 Đánh giá một số tác dụng sinh học của cao đặc AZK 20

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 233

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 244

3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CAO THUỐC 244

3.1.1 Các chỉ tiêu hoá lý 244

3.1.2 Định tính các nhóm thành phần hoá học 266

3.2 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO AZK 344

3.2.1 Độc tính cấp 344

3.2.2 Tác dụng giảm ho 355

3.2.3 Tác dụng long đờm 377

3.2.4 Tác dụng chống co thắt khí phế quản 399

Chương 4 BÀN LUẬN 444

4.1 VỀ ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CAO 444

4.2 VỀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC 444

4.2.1 Độc tính cấp 444

4.2.2 Tác dụng giảm ho 455

4.2.3 Tác dụng long đờm 476

4.2.4.Tác dụng chống co thắt phế quản 488

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 522

1 KẾT LUẬN 522

1.1 Một số chỉ tiêu hoá lý của cao đặc AZK 522

1.2 Thành phần hoá học của cao đặc AZK 522

1.3 Tác dụng sinh học của cao đặc AZK 522

2 KIẾN NGHỊ 533

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Kết quả tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của cao đặc AZK 25

Bảng 3.3 Kết quả tỷ lệ tro toàn phần của cao đặc AZK 26

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của cao đặc AZK lên số lần ho của chuột 36Bảng 3.7 Ảnh hưởng của cao đặc AZK lên số lần ho trong 5 phút 36Bảng 3.8 Kết quả ảnh hưởng của cao đặc AZK tới mật độ quang

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của cao đặc AZK đến đáp ứng co thắt phế quản

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ (%) giảm ho của các lô thử nghiệm 37

Hình 3.3 Hình ảnh đáp ứng co thắt phế quản gây ra bởi histamin 40Hình 3.4 Hình ảnh đáp ứng co thắt phế quản gây ra bởi histamin

Hình 3.5 Hình ảnh đáp ứng co thắt phế quản gây ra bởi histamin

Hình 3.6 Tỷ lệ (%) co thắt phế quản so với co thắt cực đại 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ho là phản xạ sinh lý của cơ thể để tăng lưu thông khí đường hô hấp, nhưng cũng là một trong những triệu chứng ban đầu của rối loạn đường hô hấp; có nhiều tác nhân gây ho, trong đó những nguyên nhân phổ biến là: ô nhiễm không khí, thay đổi thời tiết, các dị nguyên, một số loại thực phẩm hay một số loại thuốc cũng có tác dụng phụ gây kích ứng làm co thắt khí quản sinh ho Ô nhiễm môi trường, đặc biệt là ô nhiễm khói bụi trong không khí, đang là vấn đề nghiêm trọng, khói bụi không chỉ gây phản ứng kích ứng mà khi vào sâu có thể gây viêm nhiễm đường hô hấp Sự thay đổi của thời tiết cũng là một nguyên nhân gây ho, trong giai đoạn giao mùa cơ thể không kịp thích nghi hoặc khi thời tiết quá ẩm, quá khô hay quá lạnh cũng có thể gây ho Đặc biệt khi cơ thể tiếp xúc với các yếu tố dị ứng cũng gây phản ứng co thắt khí quản sinh ho Ho là phản xạ tự nhiên, nhưng ho kéo dài có thể gây khó chịu cho người bệnh và tổn thương đường hô hấp Trong y học cổ truyền, ho là chứng khái thấu, do ngoại cảm hay nội thương, căn cứ vào các nguyên nhân khác nhau có các phép trị khác nhau.Với kinh nghiệm điều trị lâm sàng lâu năm, kết hợp nghiên cứu kế thừa và phát triển các bài thuốc cổ phương, PGS TS Phùng Hoà Bình (Phòng chẩn trị Phùng Gia Đường) đã xây dựng bài thuốc AZK điều trị chứng khái thấu Với mong muốn có thêm cơ sở khoa học chứng minh tác dụng của bài thuốc, từ đó nghiên cứu phát triển sản phẩm điều trị chứng ho, chúng tôi tiến hành đề tài

“Định tính một số thành phần hoá học và đánh giá tác dụng sinh học của bài

thuốc AZK” với mục tiêu:

1 Định tính một số thành phần hoá học trong cao bào chế từ bài thuốc AZK

2 Đánh giá độc tính cấp, tác dụng giảm ho, long đờm và chống co thắt phế quản của cao bào chế từ bài thuốc AZK

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 CHỨNG HO

1.1.1 Theo Y học hiện đại

1.1.1.1 Định nghĩa:

Theo y học hiện đại, ho là một phản xạ sinh lý bảo vệ cơ thể để tăng lưu thông khí đường hô hấp, đồng thời cũng là triệu chứng của nhiều loại bệnh thuộc đường hô hấp hoặc bệnh của các cơ quan khác trong cơ thể có ảnh hưởng đến chức năng hô hấp [15]

1.1.1.2 Nguyên nhân

Có nhiều tác nhân gây ho, như là:

- Tác nhân hoá học: ô nhiễm không khí, đặc biệt là khi hít phải các khí độc

SO2, NO2, NO3, amoniac, clo… hay các khói bụi công nghiệp, khói thuốc lá

- Tác nhân vật lý: không khí quá khô, quá ẩm hay quá lạnh cũng gây ho

- Các tác nhân dị ứng: ho cũng là một phản ứng dị ứng khi cơ thể tiếp xúc với

dị nguyên gây ho hen Các tác nhân có thể là phấn hoa, thực phẩm hay thuốc…[3]

1.1.1.3 Triệu chứng

Có thể gặp ho không có đờm khi cảm cúm hay ho do kích ứng, dị ứng đường thở, ho có đờm trong các bệnh viêm đường hô hấp hay ho hen do phế quản bị co thắt Ho có thể đi kèm với khó thở, khản tiếng Trong một số bệnh viêm nhiễm đường hô hấp, ho có thể kèm theo sốt

1.1.1.4 Điều trị

Các thuốc giảm ho được chia thành hai loại:[18]

- Thuốc giảm ho ngoại biên: Làm giảm nhạy cảm của các receptor gây phản

- Thuốc giảm ho trung ương: Các thuốc này ức chế trực tiếp, làm nâng cao ngưỡng kích thích của trung tâm ho ở hành tuỷ, đồng thời có tác dụng an thần,

ức chế nhẹ trung tâm hô hấp Các thuốc giảm ho trung ương hay dùng như:

+ Alkaloid của thuốc phiện và các dẫn chất: codein, dextromethorphan, noscapin.…

+ Thuốc giảm ho kháng histamine H1: Alimemazin, diphenhydramin…

1.1.2 Theo Y học cổ truyền:

1.1.2.1 Định nghĩa

Trong y học cổ truyền, chứng “khái thấu” được mô tả tương tự chứng ho trong y học hiện đại, hai từ “khái” và “thấu” có nghĩa khác nhau: “khái” là ho có tiếng mà không có đàm, còn “thấu” là có đàm mà không có tiếng, nhưng thường

đi đôi với nhau nên gọi là chứng khái thấu Các tài liệu y học cổ truyền cũng ghi chép lại, ho là triệu chứng bệnh của phế nhưng các tạng phủ khác mắc bệnh ảnh hưởng đến phế cũng gây ho Như sách Tố Vấn, chương “Khái luận” viết: “Ngũ tạng lục phủ có bệnh đều làm cho ho, không riêng gì bệnh của phế” [15]

là chủ yếu, xâm nhập cơ thể qua đường miệng mũi hoặc qua da lông khiến phế khí không tuyên thông mà sinh ra ho

b Nội thương

Ho do chức năng của các tạng phủ mất điều hoà, thường gặp do các nguyên nhân sau:

 Tỳ hư sinh đàm: do chức năng tỳ suy giảm, thuỷ cốc không được vận hoá hấp thu bình thường, ứ trệ mà sinh đàm, ủng trệ ở phế làm phế khí không thông sinh ho Y văn cổ có câu: “Tỳ sinh đàm mà phế trữ đàm”.

 Can hoả phạm phế: mạch can lên sườn ngực đi vào phế, can khí uất nghịch hoá hoả phạm phế gây ho

 Phế nhiệt lâu ngày gây âm hư, phế khí không đủ gây ho, phế khí nghịch gây khó thở

 Thận hư không nạp khí (Phế chủ hô, thận chủ hấp) sinh ho kèm hụt hơi khó thở Thận hư thuỷ phiếm sinh đàm làm cho ho nặng thêm

 Phế khí hư: phế chủ đường hô hấp nên phế khí hư gây ho suyễn thở gấp, tiếng nói nhỏ, càng vận động thì triệu chứng càng nặng

Chứng ho ngoại cảm kéo dài dễ phát triển thành ho nội thương

1.1.2.3 Các thể bệnh và điều trị:

Cần phân biệt ho ngoại cảm và ho nội thương: ho do ngoại cảm thường là bệnh mới mắc thời gian ngắn, kèm theo các triệu chứng bệnh ngoại cảm, phép trị chủ yếu là tuyên thông phế khí, sơ tán ngoại tà, chưa nên vội dùng thuốc chỉ khái Ho do nội thương thường bệnh đã lâu ngày, kèm theo các triệu chứng bệnh

lý của tạng phủ, phép trị chủ yếu là điều lý tạng phủ như kiện tỳ, dưỡng phế, thanh can hoả, bổ thận, tư âm [21],[22]

a Ho do ngoại cảm

 Phong hàn:

Gặp trong các bệnh viêm phế quản, hen phế quản, viêm thanh quản…

- Cơ chế bệnh sinh và triệu chứng: phong hàn phạm phế làm phế khí mất tuyên giáng sinh ho, khò khè (suyễn), đờm tăng, miệng không khát Mũi là khiếu của phế, gây ra chảy nước mũi, ngạt mũi Phong hàn làm mất phế vệ, nên sinh ra

sợ lạnh, phát sốt

- Pháp trị: phát tán phong hàn (tán hàn tuyên phế, ôn phế tán hàn)

- Vị thuốc: Ma hoàng, Tía tô, Bạch chỉ, Cát cánh…

- Bài thuốc: Hạnh tô tán, Chỉ khái tán, Tô tử giáng khí thang…

 Phong nhiệt

Gặp ở bệnh viêm phế quản cấp, hen phế quản, viêm thanh quản, viêm phổi,

áp xe phổi giai đoạn đầu…

- Cơ chế bệnh sinh và triệu chứng: phong nhiệt phạm phế sinh ra hao tổn tân dịch, tuyên giáng thất thường gây ho, miệng khát, họng đau, đờm đặc vàng, miệng khô, thấy sốt ra mồ hôi, nước mũi đặc

- Phép trị: phát tán phong nhiệt (thanh nhiệt tuyên phế)

- Vị thuốc: Tang diệp, Bạc hà, Hoa cúc, Kinh giới…

- Bài thuốc: Ngân kiều tán, Ma hạnh thạch cam thang, Tang cúc ẩm…

 Phế táo:

Gặp ở bệnh viêm phế quản, viêm họng, các bệnh truyền nhiễm…

- Cơ chế bệnh sinh và triệu chứng: táo thương phế, làm tổn thương tân dịch gây ra ho khan hay ho ít đờm mà dính, mũi họng khô Táo uất phần phế vệ làm sốt, nhức đầu, người đau mỏi

- Phép trị: thanh phế nhuận táo

- Vị thuốc: Tô tử, Lá hẹ, Thiên môn, Sa sâm, Mạch môn…

- Bài thuốc: Tang cúc ẩm, Thanh táo cứu phế thang…

b Ho do nội thương

 Tỳ hư đàm thấp:

- Triệu chứng: ho nhiều, tiếng ho nặng, đờm đục nhiều, đờm ra được thì hết

ho, buổi sang hoặc sau khi ăn ho nhiều hơn và khạc nhiều đờm, ăn đồ ngọt béo càng ho nhiều, ngực tức bụng đầy

- Phép trị: kiện tỳ táo thấp hoá đàm, hoá đờm, chỉ khái

- Bài thuốc: Nhị trần thang, Tam tử dưỡng thân thang gia giảm

 Can hoả phạm phế:

- Triệu chứng: ho do khí nghịch, trong cơn ho mặt đỏ, họng khô, thường cảm thấy đờm vướng ở họng, khó khạc ra, ngực sườn trướng đau

- Bài thuốc: Tả bạch tán gia giảm hợp Đại cáp tán.

 Phế âm hư:

- Triệu chứng: ho khan, tiếng ho ngắn gấp, đờm ít dính màu trắng hoặc có huyết, miệng họng khô, tiếng khàn

- Phép trị: tư âm, nhuận phế, hoá đàm, chỉ khái

- Bài thuốc: Sa sâm mạch đông thang gia giảm

1.2 BÀI THUỐC AZK

1.2.1 Thông tin chung về bài thuốc

Bài thuốc AZK gồm 8 vị thuốc:

- Tỳ giải (Rhizoma Heterosmilacis)

- Huyền sâm (Radix Scrophulariae)

- Mạch môn (Radix Ophiopogonis japonici)

- Đơn lá đỏ (Folium Excoecariae)

- Mơ muối (Fructus Armeniacae praeparatus)

- Tô diệp (Folium Perillae frutescensis)

- Trắc bách diệp (Folium Platycladi)

- Thạch cao (Gypsum fibrosum)

Bài thuốc có tác dụng nhuận phế, chỉ khái, dùng bổ phế, giảm ho trong các trường hợp: ho gió, ho khan, ho do thay đổi thời tiết, ho lâu ngày, ho do viêm đường hô hấp

1.2.2 Các vị thuốc trong bài thuốc

1.2.2.1 Tỳ giải (Rhizoma Heterosmilacis)

 Tên khác: Khúc khắc, Dị kim gaudichaud

 Bộ phận dùng: Rễ của cây Tỳ giải (Heterosmilax gaudichauduana Wall ex kunth.), họ Khúc khắc Smilacaceae [7].

 TPHH: Sơ bộ xác định trong thân rễ Tỳ giải có các thành phần chính sau:

saponin, flavonoid, sterol, acid amin, polysaccharide và đường khử [16]

 Tác dụng dược lý:

- Tác dụng chống viêm cấp: có tác dụng chống viêm cấp yếu trên mô hình gây phù thực nghiệm bằng kaolin ở chân chuột cống trắng.

- Tác dụng chống viêm mạn: có tác dụng chống viêm mạn tính ở mức trung bình trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian ở chuột cống trắng [24]

 Tính vị, quy kinh: Vị chát, hơi ngọt, tính bình [7]

 Công năng: Lợi thấp hoá trọc.

 Chủ trị: Tiêu độc, chống dị ứng, chống viêm, lợi thấp, mạnh gân cốt, thanh

nhiệt Khúc khắc được dùng chữa mụn nhọt, tràng nhạc, lở ngứa, dị ứng, ngộ độc thuỷ ngân Ngoài ra còn chữa thấp khớp, đau lưng, nhức xương, đau khớp Trong thực tế, các lương y Việt Nam vẫn cho rằng tác dụng của khúc khắc tương

tự tác dụng của thổ phục linh nên thường dùng thay thế [19],[24]

 Liều dùng: Ngày dùng 15 - 30g, dạng thuốc sắc, thuốc bột hay thuốc viên.

 Kiêng kỵ: âm hư hoả vượng, đau lưng do thận hư [7].

1.2.2.2 Huyền sâm (Radix Scrophulariae)

 Tên khác: Hắc sâm, Nguyên sâm

 Bộ phận dùng: Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Huyền sâm (Scrophularia

buergeriana Miq hoặc Scrophularia ningpoensis Hemsl.), họ Hoa mõm chó

(Scrophulariaceae) [7]

 TPHH: Rễ Huyền sâm có scrophularin, harpagid, harpanosid, ningpogenin,

O - Me catalpol, angorosid C Một số thành phần khác như alkaloid, đường, steroid, acid amin (L asparagin), acid béo (acid oleic, acid stearic), tinh dầu (vết), carotene và 17 nguyên tố vi lượng [17],[24]

 Tác dụng dược lý: Thử nghiệm trên tim ếch cô lập, cao lỏng Huyền sâm

với nồng độ thích hợp làm tăng sức co bóp cơ tim, làm chậm nhịp tim Tiêm tĩnh mạch cho thỏ có tác dụng hạ huyết áp nhẹ và tạm thời, kích thích mạnh hô hấp Nghiên cứu bằng phương pháp lồng rung, huyền sâm có tác dụng an thần

Huyền sâm có tác dụng kháng sinh với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh ở da

Huyền sâm có tác dụng điều trị tốt đối với viêm họng mạn tính, phối hợp với sâm cau có hiệu quả rõ rệt đối với viêm họng đỏ cấp tính [17], [24].

 Tính vị, quy kinh: Vị đắng ngọt, hơi mặn; tính mát Quy vào các kinh phế,

thận [19]

 Công năng: Tư âm giáng hỏa, sinh tân dịch, nhuận táo, lương huyết giải

độc

 Chủ trị: Huyền sâm được dùng làm thuốc cường tim, giảm sốt, chống viêm

trong điều trị các chứng sốt nóng, khát nước, phát ban, miệng lưỡi lở loét, viêm họng, viêm amidan, ho khan, mẩn ngứa, mụn nhọt

 Liều dùng: Ngày dùng 8 - 12 g, dạng thuốc sắc [7].

 Kiêng kỵ: Những người có thấp ở tỳ vị, tỳ vị hư hàn, rối loạn tiêu hoá

Không nên sử dụng các dụng cụ bằng đồng để bào chế, không dùng chung Huyền sâm với Lê lô

 Bài thuốc có huyền sâm: [24]

- Chữa viêm họng, viêm amidan, ho, khản tiếng: Huyền sâm 10g, mạch môn 8g, cam thảo 5g, cát cánh 5g, thăng ma 5g Sắc với 600ml nước, còn 200ml, chia

3 – 4 lần uống trong ngày hoặc ngậm và súc miệng

- Chữa viêm amidan cấp (Phức phương lương cách thang gia giảm): Huyền sâm 16g, thạch cao sống 40g, kim ngân hoa 16g; hoàng cầm, liên kiều, đạm trúc diệp, sơn chi tử, mỗi vị 12g; cát cánh, cam thảo, mỗi vị 8g; bạc hà 4g Sắc uống mỗi ngày một thang

1.2.2.3 Mạch môn (Radix Ophiopogonis japonici)

 Tên khác: Mạch môn đông, Lan tiên

 Bộ phận dùng: Rễ củ phơi hay sấy khô của Mạch môn đông (Ophiopogon

japonicus (L.f.) Ker-Gawl.), họ Mạch môn đông (Convallariaceae) [7]

 TPHH: Từ rễ củ mạch môn phân lập được 5 glucosid Ba chất đầu thuỷ

phân thu được diosgenin, chất thứ 4 genin là ruscogenin, chất thứ 5 cho choophiogenin

Ngoài ra, còn có 11 chất thuộc các nhóm chất sau: Các stigmasterol, β - sitosterol, β - D - glucosid, các hợp chất polysacharid, tinh dầu và các thành phần như β - patchoulen, longifolen, cyperen, α - humulen, guajol, jasmolelon cũng được phát hiện trong cả mạch môn.

Gần đây, phân lập được các saponin steroid là ophiopogonin A, B, C, D Ophiopogonin A, B và D khi thuỷ phân cho genin là ruscogenin [17],[25]

 Tác dụng dược lý: Rễ củ Mạch môn đã được nghiên cứu và chứng minh có

các tác dụng dược lý sau: [17],[25]

- Tác dụng chống viêm rõ rệt với cả giai đoạn cấp tính và bán mạn tính của phản ứng viêm thực nghiệm Thử nghiệm trên chuột cống trắng gây phù chân bằng carragenin, dịch chiết ethanol của mạch môn có tác dụng ức chế phù

- Tác dụng ức chế tương đối khá trên phế cầu và yếu hơn trên sự phát triển

của các chủng vi khuẩn: tụ cầu vàng, Shigella dysenteriae, Bacillus subtilis.

- Tác dụng giảm ho: tác dụng rõ rệt khi gây ho nhẹ bằng khí dung với amoniac hoặc acid citric, có tác dụng long đờm, tăng tiết dịch ở khí phế quản

- Tác dụng hạ đường huyết: dịch chiết nước của mạch môn áp dụng trên thỏ gây đái tháo đường bằng alloxan có tác dụng hạ đường huyết kéo dài

- Độc tính: uống liều cao 200g/kg không gây biểu hiện độc tính cấp trên chuột thí nghiệm

 Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, mặn, hơi đắng; tính hàn Quy vào các kinh phế,

vị, thận [19]

 Công năng: Dưỡng vị, sinh tân, nhuận phế chỉ ho, thanh tâm trừ phiền,

nhuận tràng thông tiện [7]

 Chủ trị: Phế táo, ho khan; tân dịch thương tổn, khát nước; tâm bứt rứt mất

ngủ, nội nhiệt tiêu khát; trường ráo táo bón [7]

Rễ củ mạch môn được dùng để chữa ho khan, viêm họng, lao phổi nóng âm ỉ

về chiều, sốt cao, tâm phiền khát nước, thổ huyết, khái huyết, chảy máu cam, hen phế quản, khó ngủ [25]

 Liều dùng: Ngày dùng 6 - 12g Dạng thuốc sắc.

 Kiêng kỵ: Tỳ vị hư hàn, ăn uống chậm tiêu, ỉa chảy.

 Bài thuốc có mạch môn: [25]

- Chữa ho, viêm họng: Mạch môn 10g, bách bộ (bỏ lõi sao vàng) 10g, vỏ rễ dâu (cạo vỏ vàng) 10g, vỏ quýt 5g, xạ can 5g, cam thảo dây 5g Dạng thuốc phiến ngậm, mỗi ngày 4 – 5 lần, mỗi lần 1 phiến (mỗi phiến tương đương 3g), hoặc dạng cao loãng, mỗi lần 1 thìa cà phê

- Chữa trẻ em viêm phế quản, viêm họng: Mạch môn 24g, huyền sâm 12g, thiên môn 12g Sắc uống

- Chữa viêm phế quản cấp tính (Thanh táo cứu phế thang): Mạch môn 12g, đảng sâm 16g, tang diệp, thạch cao, tỳ bà diệp, mỗi vị 12g, hạnh nhân, a giao, mỗi vị 8g, cam thảo 6g, gừng 4g Sắc uống mỗi ngày một thang

- Chữa viêm phổi trẻ em (Nhân sâm ngũ vị thang): Mạch môn 12g, phục linh, đại táo, bạch truật, mỗi vị 8g; chích thảo 4g; sinh khương 2g Sắc uống

1.2.2.4 Đơn lá đỏ (Folium Excoecariae)

 Tên khác: Đơn mặt trời, Đơn tía, Đơn tướng quân

 Bộ phận dùng: Lá được phơi hay sấy khô của cây Đơn lá đỏ (Excoecaria

cochinchinensis Lour.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [7]

 TPHH: 1,5% flavonoid, saponin, coumarin, anthranoid, tanin, đường khử

Sơ bộ xác định flavonoid có 6 chất trong đó một chất nhóm flavonol [17],[24]

 Tác dụng dược lý:

- Tác dụng chống viêm, chống dị ứng: có tác dụng tốt Dịch chiết đơn lá đỏ

có tác dụng giảm phù từ giờ thứ 4,5 Dịch chiết flavonoid toàn phần giảm 85,8%; lô uống dịch sắc giảm 90,3% phản ứng dị ứng [1],[2]

- Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm: có tác dụng kháng các vi khuẩn B cereus, B pulmilus, S lutea, B subtilis tùy dạng chiết xuất Dịch chiết flavonoid kháng vi khuẩn Gr (+) tốt nhất Dịch chiết saponin có kháng nấm C albicans [2]

- Tác dụng khác: Dịch chiết đơn lá đỏ có tác dụng chống oxy hóa, giảm co thắt cơ trơn trên hồi tràng chuột lang cô lập [1].

- Độc tính: Có tác giả cho rằng nhựa cây độc đối với cá [25] Thử nghiệm trên chuột nhắt, ở liều 100g/kg TT - liều cao gấp 300 lần liều thường dùng ở người (10-20g/người), chuột giảm hoạt động nhưng khi kích thích vẫn hoạt động bình thường Do vậy không tính được LD50 [1],[2]

 Tính vị, quy kinh: Vị đắng nhạt, cay, mát, ít độc Quy kinh can, thận [19].

 Công năng: Thanh nhiệt giải độc, khu phong trừ thấp, lợi tiểu, chỉ thống,

thông kinh hoạt lạc [7]

 Chủ trị: Mụn nhọt, mẩn ngứa, ban chẩn mề đay; đi lỏng lâu ngày, đái ra

máu Ở Trung Quốc, dùng đơn lá đỏ chữa sởi, quai bị, viêm amidan, đau thắt ngực, đau thận, đau cơ

 Liều dùng: 10-15g (tươi: 15-20g sao vàng sắc uống) [7]

 Kiêng kỵ: Người hay chảy máu, chứng hư hàn.

1.2.2.5 Mơ muối (Fructus Armeniacae praeparatus)

 Tên khác: Ô mai, diêm mai, bạch mai

 Bộ phận dùng: Quả già màu vàng đã chế muối của cây Mơ (Prunus

armeniaca L.), họ Hoa hồng (Rosaceae) [7].

 TPHH: Trong thịt quả mơ chín có chừng 2,5% acid trong đó chủ yếu là

acid citric, acid tactric, khoảng 27% chất đường (chủ yếu là sacaroza), một ít dextrin, tinh bột, quecetin, isoquecetin, carotene, lycopen, vitamin C, tannin, pectin, metylsalicylat, men peroxydase và urease [17]

Năm 1968, từ quả mơ, người ta chiết được một chất có tác dụng ức chế vi

khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis Tác dụng này có liên quan đến sự có mặt

của acid citric và acid malic [17]

 Tác dụng dược lý:

Nước mơ pha đường và siro mơ có tác dụng giải khát, giảm lượng mồ hôi, giảm lượng nước uống, giảm lượng muối mất đi do mồ hôi trong lao động, chống mệt mỏi, bớt hiện tượng đái ra máu vi thể Lá mơ có tác dụng lợi tiểu.Nhật Bản có bài thuốc cổ truyền được dùng từ lâu đời để chữa hen, gồm hạt

mơ, ma hoàng, cam thảo, thạch cao Thử tác dụng giảm ho của từng dược liệu và

cả bài thuốc trên mô hình gây ho cho chuột nhắt bằng sulfur dioxyd, kết quả cho thấy hạt mơ chống ho mạnh hơn ma hoàng

Chất amygladin và men phân huỷ có trong các tế bào của nhân hạt mơ, trong quá trình nhai hoặc ngậm sẽ sinh ra acid hydrocyanic HCN, đây là chất độc mạnh có thể gây ngộ độc và chết ở liều cao Tuy nhiên, khi dùng liều nhỏ amygladin, HCN được giải phóng từ từ có tác dụng trấn tĩnh trung khu hô hấp, giảm ho [25]

 Tính vị, quy kinh: Vị chua, chát; tính ấm Quy kinh can, tỳ, phế [19].

 Công năng: Nhuận phế, sinh tân dịch, sáp trường, sát trùng.

 Chủ trị: Ho lâu ngày phế hư, viêm họng, hư hoả tiêu khát, ỉa chảy, lỵ mạn

đau bụng [19] Mơ muối được dùng trong nhân dân làm thuốc chữa ho, trừ đờm, chữa viêm họng, hen suyễn, khó thở, phù thũng; tả lỵ ra máu, nôn mửa

 Liều dùng: Ngày dùng 6 - 10 g, dạng thuốc sắc hoặc ngậm Thường phối

hợp với các loại thuốc khác

 Bài thuốc có Mơ muối: [25]

- Chữa ho lâu năm: Mơ muối, thiên môn, mạch môn, bách bộ, vỏ rễ dâu (lượng bằng nhau) Trừ mơ muối, các dược liệu phơi khô, tán nhỏ, luyện với mật ong và nước gừng, làm viên bằng hạt nhãn, mỗi lần dùng 1 viên ngậm, nuốt dần

- Chữa ho lâu ngày, khan tiếng, viêm phế quản, viêm họng: Ô mai 4g, lá tre 8g, tô mộc 8g, cam thảo dây 5g, chua me đất 5g, lá chanh 4g, gừng sống 2g, nước 500ml Sắc còn 250ml, chia 2 lần uống trong ngày

- Chữa ho nhiệt, khạc ra đờm có máu: Ô mai, hoa hoè sao, dành dành sao, vỏ

rễ dâu, mỗi vị 12g Sắc uống

1.2.2.6 Tô diệp (Folium Perillae)

 Bộ phận dùng: Lá (hoặc có lẫn nhánh non) đã phơi hay sấy khô của cây Tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt.), họ Bạc hà (Lamiaceae) [7]

 TPHH: Toàn cây tía tô có chứa 0,5% tinh dầu, trong đó thành phần chủ

yếu là perilla-andehyd C10H14O (55%), limonene (20-30%), α-pinen và dihydrocumin C10H14O Chất perillaandehyd có mùi thơm đặc biệt của tía tô.

Chất màu trong lá tía tô là do este của chất cyanin clorid C27H31O16Cl Ngoài các chất trên, trong tía tô còn chứa adenine C5H5N5 và arginin C6H14N4O2 [17]

 Tác dụng dược lý:

- Tác dụng kháng khuẩn: tinh dầu tía tô có tác dụng kháng khuẩn in vitro đối

với các vi sinh vật: tụ cầu vàng, trực khuẩn lỵ Flexner, trực khuẩn lao, Bacillus

mycoides, B subtilis, liên cầu tan máu, trực khuẩn lỵ Shiga, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Candida albicans, trực khuẩn coli, phế cầu, amip lỵ [25].

- Tác dụng trấn tĩnh, hạ nhiệt, làm toát mồ hôi, ức chế co thắt cơ trơn ruột do histamine và acetylcholine, gây cảm ứng interferon

- Dịch chiết từ tô diệp làm tăng nhu động ruột, dạ dày, giãn phế quản Điều

đó chứng minh cho công năng kiện vị, chỉ ho trong điều trị [17]

- LD50 của cao chiết tía tô tiêm phúc mạc cho chuột nhắt trắng là 1 g/kg Tía

tô chứa furanyl ceton gây phù phổi cấp, nguy hại cho sức khoẻ khi dùng nhiều

 Tính vị, quy kinh: Vị cay; tính ấm Quy kinh phế, tỳ [19].

 Công năng: Giải biểu tán hàn, hành khí hoà vị, lý khí an thai.

 Chủ trị: Cảm mạo phong hàn, ho, khí suyễn buồn nôn, động thai, trúng độc

cua cá [19] Tô diệp được dùng chữa cảm mạo không ra mồ hôi, ho nhiều đờm, ngạt mũi nhức đầu, tiêu hoá kém, giảm đau, nôn mửa, giải độc, còn có tác dụng chữa ngộ độc nôn mửa, đau bụng do ăn cua cá

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Tô diệp có tác dụng làm ra mồ hôi, trừ hàn, điều hoà chức năng dạ dày, chữa cảm hàn, nôn trong thai kỳ, ngộ độc cua

cá Ấn Độ dùng tía tô với tác dụng an thần, chống co thắt, làm ra mồ hôi, chữa nhức đầu Nhật Bản làm thuốc ra mồ hôi, giải biểu, hành khí, giải độc tôm cá.

 Liều dùng: Ngày dùng 5 – 9 g, dạng thuốc sắc.

 Kiêng kỵ: Ho khan, ho ra máu, người âm hư nội nhiệt, hoặc nóng trong, mồ

hôi ra nhiều và không phải ngoại cảm phong hàn

 Bài thuốc có tía tô

- Chữa ho đờm:

+ Tía tô 120g, vỏ quýt 160g Sắc ½ rượu, ½ nước Uống làm 2 lần

+ Siro ho: cao tía tô 2/1 15g, cao chỉ xác 2/1 15g, cao húng chanh 2/1 15g, siro đơn vừa đủ 100g, cồn vỏ cam tươi vừa đủ cho thơm Người lớn mỗi ngày 2 – 3 lần, mỗi lần 30ml Trẻ em mỗi lần 10ml, uống sau bữa ăn

1.2.2.7 Trắc bách diệp (Cacumen Platycladi)

 Bộ phận dùng: Cành non và lá đã phơi hay sấy khô của cây Trắc bá (Platycladus orientalis (L.) Franco), họ Hoàng đàn (Cupressaceae) [7]

 TPHH: Trong lá và cành có tinh dầu và chất nhựa Trong tinh dầu có pinen,

cariophylen Lá trắc bá chứa tinh dầu 0,6 – 1%, flavonoid, lipid và acid hữu cơ Theo phân tích của Phòng hoá học thực vật – Viện nghiên cứu khoa học y học Trung Quốc (Bắc Kinh), trắc bách diệp có phản ứng của glycosid tim

Trong lá trắc bách diệp có những chất sau: [17],[20]

- Tinh dầu: chứa fenchon C10H16O, camphor, borneol acetat và terpineol

- Các flavonoid toàn phần 1,72%: quercetin, myricetin C15H10O8, hinokiflavon C30H18O10, amentoflavon C30H18O10

- Phần sáp sau khi xà phòng hoá sẽ được 81% acid hữu cơ, trong đó chủ yếu gồm những acid juniperic C16H32O3, acid sabini C12H24O3 và 17% hexadecane – 1,16 – diol Các acid hữu cơ ở dạng estolide

 Tác dụng dược lý:

Cao methanol lá trắc bá có hoạt tính ức chế in vitro các chủng vi khuẩn:

Staphylococus albus, phế cầu, trực khuẩn mủ xanh, phẩy khuẩn tả; ức chế ở mức

trung bình các chủng vi khuẩn: E coli, Klebsiella aerogenes, tụ cầu vàng, liên

cầu tan máu và Cao ethanol lá có tác dụng với liên cầu tan máu và

Staphylococus albus Cao aceton ức chế in vitro trực khuẩn mủ xanh và Klebsiella aerogenes Lá và thân có hoạt tính kháng trực khuẩn thể in vitro, một

biểu hiện của hoạt tính kháng siêu vi khuẩn hoặc kháng ung thư của thuốc

Lá trắc bá sao vàng có tác dụng giãn mạch ngoại biên trên mạch cô lập hoàn toàn, nhưng gây co mạch với mạch máu cô lập còn giữ lại dây thần kinh nối tai với cơ thể động vật Trong thử nghiệm in vivo trên thỏ và chó được tiêm thuốc chống đông, lá trắc bá làm giảm thời gian Quick của máu, tăng tỷ lệ prothrombin trong máu, cầm máu, giống như vitamin K Lá trắc bá làm tăng nhịp độ và biên

độ co bóp tử cung trong thử nghiệm in vitro và in vivo [25]

 Tính vị, quy kinh: Vị đắng, chát; tính hơi hàn Quy kinh phế, can, tỳ [19]

 Công năng: Lương huyết chỉ huyết, trừ thấp nhiệt.

 Chủ trị: Nôn ra máu, chảy máu cam, ho ra máu, đại, tiểu tiện ra máu, băng

huyết, rong huyết Trắc bách diệp còn làm thuốc lợi tiểu, chữa ho, sốt [19]

 Liều dùng: Ngày uống 6 - 12 g; dùng ngoài với lượng thích hợp.

1.2.2.8 Thạch cao (Gypsum fibrosum)

 Tên khác: Đại thạch cao, băng thạch

 Bộ phận dùng: Chất khoáng thiên nhiên có thành phần chủ yếu là calci

sulfat ngậm 2 phân tử nước (CaSO4.2H2O) [7]

 TPHH: Thành phần chủ yếu là CaSO4.2H2O Trong đó có chừng 32,5% CaO; 46,6% SO3 và 20,9% H2O, thỉnh thoảng có lẫn ít đất sét, cát, chất hữu cơ, hợp chất sunfua, đôi khi có lẫn ít sắt và magie [24]

- Tác dụng cường tim ở nồng độ loãng.

 Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, cay; tính hàn Quy kinh phế, vị, tam tiêu [19]

 Công năng: Thanh nhiệt tả hoả, trừ phiền chỉ khát.

 Chủ trị: Thực nhiệt ở phần khí của phế vị (sốt cao, mồ hôi nhiều khát

nhiều, mạch hồng đại), nhiệt độc thịnh ở kinh mạch (sốt cao phát ban), giai đoạn sau của bệnh ôn (sốt nhẹ, tâm phiền, miệng khô, hơi đỏ), viêm lợi [10]

 Liều dùng: Ngày dùng 12 – 40g, dạng sắc (sắc trước các loại thuốc khác).

 Kiêng kỵ: những người yếu dạ dày, yếu tim, mạch vi tế hoặc khi bị chứng

dương hư không dùng

1.2.3 Cơ sở của bài thuốc

Ho và đàm có quan hệ mật thiết, thuốc chỉ ho thường có tác dụng trừ đàm và ngược lại, thuốc trừ đàm cũng có tác dụng chỉ ho [19]

Thuốc hoá đàm có tác dụng làm hết đàm, long đàm, trừ đàm, làm cho đàm dễ khạc ra Y học cổ truyền chia thuốc hoá đàm thành 2 loại: thuốc ôn hoá hàn đàm thường là các vị thuốc cay ấm chủ yếu dùng cho chứng hàn đàm; thuốc thanh hoá nhiệt đàm gồm các vị thuốc có tính hàn để chữa các chứng đàm nhiệt [19]Thuốc chỉ khái (chỉ ho) có tác dụng ôn phế, thanh phế, nhuận phế, giáng khí phế nghịch, đồng thời cũng có thể có tác dụng hoá đàm, để trị ho do nhiều nguyên nhân Thuốc chỉ khái được chia thành 2 loại: thuốc ôn phế chỉ khái để chữa ho thuộc chứng hàn, do ngoại cảm phong hàn hay nội thương, ho có đờm lỏng, dễ khạc, ngạt mũi, khản tiếng; thuốc thanh phế chỉ khái để chữa ho thuộc chứng nhiệt, táo nhiệt làm tổn thương phế khí, gây ra ho khan, đàm dính [19]Dựa trên cơ sở công năng, chủ trị của các vị thuốc, kết hợp lý luận y học cổ truyền và các nghiên cứu hiện đại về thành phần hoá học, tác dụng dược lý của các dược liệu, tác giả Phùng Hoà Bình đã phối hợp các vị thuốc vào bài thuốc AZK có tác dụng điều trị chứng ho: tác dụng giảm ho (Huyền sâm, Mạch môn,

Mơ muối, Tô diệp), tác dụng sinh tân dịch, long đờm (Huyền sâm, Mạch môn,

Mơ muối), tác dụng chống dị ứng, chống co thắt phế quản (Đơn lá đỏ, Tô diệp)

Huyền sâm, Mạch môn vị ngọt thể chất nhuận, tính hàn mát, quy vào các kinh phế, tỳ, có công năng dưỡng phế âm, thanh phế nhiệt Mơ muối vừa có tác dụng chỉ ho, vừa sát khuẩn đường hô hấp.

Trắc bách diệp, Tô diệp là thuốc chỉ ho bình suyễn, Thạch cao thanh nhiệt tả hỏa; phối hợp cùng nhau có tác dụng thanh trừ nhiệt độc trong các trường hợp phế nhiệt, viêm nhiễm Tỳ giải có tác dụng thanh nhiệt ra ngoài theo đường hạ tiêu Tỳ giải, Đơn lá đỏ còn có tác dụng chống viêm, chống dị ứng

Bài thuốc có tác dụng chữa ho, long đờm, dùng điều trị chứng ho trong các trường hợp ho khan, ho có đờm, ho lâu ngày, ho do thay đổi thời tiết

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cao đặc toàn phần được bào chế bằng phương pháp chiết nước từ bài thuốc AZK gồm các thành phần: Tỳ giải, Huyền sâm, Mạch môn, Mơ muối, Đơn lá đỏ,

Tô diệp, Trắc bách diệp, Thạch cao Cao đặc tỷ lệ 1g cao tương đương 4g dược liệu, do Công ty Cổ phần Dược phẩm ANVY cung cấp Ngày sản xuất: 05/04/2016

2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu

 Thiết bị

- Tủ sấy Memmert

- Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius)

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510

- Máy phun mù Omron CX (Japan)

- Đồng hồ bấm giây Q & Q HS45J003Y (Citizen, Nhật Bản)

- Lồng kính quan sát chuột: hình trụ tròn, trơn nhẵn và trong suốt, đường kính 20cm, cao 40cm

- Máy Elisa (Biotek, Mỹ) Đĩa 96 giếng

- Máy trợ thở Rodent ventilator 7025

- Bộ đo và khuếch đại thông tin Bronchospasm tranducer 7020

- Bộ ghi và in kết quả Uni record 7050

- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

- Các dụng cụ sử dụng lấy mẫu và phẫu thuật: micropipet tự động, dụng cụ thủy tinh, bơm và kim tiêm các cỡ, ống nghiệm các loại, kéo, panh, kẹp

- Các dụng cụ bắt giữ động vật, bơm và kim đầu tù để cho động vật uống

 Hóa chất

- Hóa chất thử tác dụng sinh học đạt tiêu chuẩn dược dụng:

+ Bột Codein phosphat, dung dịch NH4OH; dung dịch NaCl 0,9%

+ Phenol đỏ 0,25% (pha trong dung dịch NaHCO3 5%)

+ Bột Ammonium chlorid (NH4Cl) 500g – Merk

+ Bột Sodium hydrogen carbonat (NaHCO3) 500g – Merk

+ Histamin lọ bột 300 g (MP Biomedicals, Pháp)

+ Aminophylin 4,8% (biệt dược Diaphyllin, Gedeon Richter Ltd, Hungary).+ Thiopental lọ bột 1 g (Rotex Medical, Trittau, Đức)

+ Xylazin 20 mg/ml (Kepro, Hà Lan)

- Các hoá chất thử nghiệm khác: tiêu chuẩn phân tích

 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng trưởng thành chủng Swiss cả hai giống, trọng lượng 20 – 25g, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột lang trưởng thành, trọng lượng 300 – 400 g, do Viện Pasteur Nha Trang cung cấp

Động vật thí nghiệm được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lực, Trường ĐH Dược Hà Nội ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Định tính một số thành phần hoá học của cao đặc AZK

2.2.1.1 Các chỉ tiêu hoá lý

- Cảm quan: Độ đồng nhất, màu sắc, mùi vị: dùng thị giác, khứu giác, vị giác

để đánh giá

- Mất khối lượng do làm khô: Xác định theo phụ lục 9.6 – DĐVN IV

- pH: Đo pH dung dịch cao thuốc ở nồng độ 1%, sử dụng máy đo pH Eutech

chất theo phương pháp thường quy được ghi trong các tài liệu hóa học thực vật [4],[9],[20]

2.2.2 Đánh giá một số tác dụng sinh học của cao đặc AZK

2.2.2.1 Độc tính cấp

 Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss trưởng thành, giống

cái, trọng lượng 20 – 25g

 Phương pháp nghiên cứu: thử độc tính cấp theo hướng dẫn của Bộ Y tế kết

hợp với hướng dẫn của OECD [5],[6],[30],[31],[32],[33],[37]

- Thể tích mẫu thử dùng theo đường uống: 0,2ml/10g chuột

- Số lần cho chuột uống: 2 lần trong 24 giờ, mỗi lần cách nhau 2 giờ

- Sau khi uống thuốc 2 giờ, chuột được cho ăn trở lại, uống nước bình thường

- Sau khi thử nghiệm thăm dò trên một số lượng chuột hạn chế, chuột thí nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô 10 con làm thử nghiệm chính thức Tùy theo kết quả của thử nghiệm thăm dò để lựa chọn các mức liều cho thử nghiệm chính thức Thiết kế thí nghiệm với lô đầu uống liều tối đa không gây chết chuột

và lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết toàn bộ chuột thí nghiệm

- Theo dõi chuột trong 14 ngày sau khi dùng mẫu thử (theo dõi chuột liên tục trong vòng 4 giờ, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau lần cuối cùng uống cao đặc AZK)

 Theo dõi, đánh giá

- Theo dõi chuột trong 72 giờ sau khi uống thuốc, ghi chép lại các thông số:+ Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu

+ Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống.

+ Số chuột chết: xác định tỷ lệ chuột chết ở các lô trong 72 giờ để tính LD50.+ Khi có chuột chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng Nếu cần,

có thể làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân

- Tiếp tục theo dõi chuột cho đến 14 ngày sau khi uống cao đặc AZK

Tiến hành gây ho cho động vật thực nghiệm bằng dung dịch amoniac và đánh giá ảnh hưởng của thuốc trên tần suất cơn ho có thể chứng minh tác dụng giảm

ho của thuốc [27],[36],[38]

 Thông số đánh giá

- Số lần ho trong 5 phút tính từ lúc cho chuột vào bình phun mù amoniac

- Tỷ lệ (%) giảm ho của lô thử so với lô chứng

Thuốc được coi là có tác dụng giảm ho khi làm giảm các thông số trên so với

lô chứng

 Xử lý số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng m (a;b) trong đó m là trung vị, a là giá trị nhỏ nhất, b là giá trị lớn nhất

 Phương pháp: Đánh giá tác dụng chống co thắt cơ trơn phế quản tại chỗ

trên chuột lang theo phương pháp của Konzett-Rossler [8],[34]

Đáp ứng co thắt phế quản được ghi dựa trên sự thay đổi thể tích không khí trong đường hô hấp của động vật thí nghiệm được đặt trong 1 hệ thống kín gồm

1 máy thông khí hỗ trợ và 1 ống mao quản chứa nước cho phép đo thể tích hoặc

áp lực của không khí dư thừa Khi phế quản bị co thắt dưới tác động của tác nhân gây co thắt như histamin, lượng không khí phát ra từ máy trợ thở vào phổi giảm đi, làm tăng thể tích không khí thừa ra (phần không bị chiếm giữ bởi phổi sau sự co thắt phế quản) Lượng khí thừa sẽ tạo ra áp suất làm dâng cột nước

trong ống mao quản của bộ phận ghi Tín hiệu sẽ được khuếch đại và được ghi trên băng giấy cho phép lượng giá mức độ co thắt phế quản.

Trong đó: Cmax: co thắt cực đại

Ct: co thắt cực đại tại các thời điểm (0-5 phút, 5-10 phút, 10-15 phút, 15 – 20 phút)

Các kết quả thử tác dụng sinh học được biểu diễn theo quy định:

Số liệu thuộc phân phối chuẩn được biểu diễn dưới dạng M  SE, trong đó M

là giá trị trung bình, SE là sai số chuẩn So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng phân tích One-Way ANOVA, dùng test hậu kiểm Dunnett t hoặc Dunnett’s T3 để so sánh giá trị trung bình của các lô thử với lô chứng

Số liệu không thuộc phân phối chuẩn được biểu diễn dạng m (a;b) trong đó m

là trung vị, a là giá trị nhỏ nhất, b là giá trị lớn nhất Sử dụng test phi tham số Kruskal- Wallis, và Mann – Whitney U test để so sánh sự khác biệt giữa các lô.Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0, sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p<0,05

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CAO THUỐC 3.1.1 Các chỉ tiêu hoá lý

- Mùi (xác định bằng khứu giác): Cao thuốc có mùi thơm

- Vị (xác định bằng vị giác): Cao thuốc có vị hơi mặn

Nhận xét: Cao thuốc đặc quánh, màu nâu đen đồng nhất, thơm mùi dược liệu

và có vị hơi mặn

 Mất khối lượng do làm khô

Dùng chén sứ miệng rộng đựng mẫu thử, sấy ở 105oC trong 30 phút, cân xác định khối lượng chén Cân ngay vào chén chính xác khoảng 1 g cao Sấy ở áp suất thường, nhiệt độ 105 ± 2oC trong 3 giờ Sau khi sấy chuyển vào bình hút ẩm

có silicagen, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân lại Làm 5 lần lấy giá trị trung bình

Tỷ lệ mất khối lượng do làm khô được tính theo công thức:

X(%) =a ‒ b

a .100%

Trong đó: X: Tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của cao thuốc (%)

a: Khối lượng cao ban đầu (g)

b: Khối lượng cắn sau khi sấy (g)

Kết quả tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của cao đặc AZK được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của cao đặc AZK

Mẫu Khối lượng

Nhận xét: Tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của cao thuốc trung bình là

18,32%, đạt yêu cầu của cao đặc theo DĐVN IV (2009)

 Xác định pH

Lấy 100 mg cao đặc hoà tan bằng nước cất vào bình định mức 10 ml được dung dịch 1% để đo pH Đo 5 mẫu lấy giá trị pH trung bình Kết quả giá trị pH của cao đặc AZK được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 pH của dung dịch cao 1%

ẩm có silicagen, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân khối lượng các chén

Tỷ lệ % tro toàn phần được tính theo cao khô như sau:

T(%) =

M ‒ mc

Mo.(1- x).100%

Trong đó: T: Tỷ lệ tro toàn phần (%)

M: Khối lượng chén và tro sau khi nung (g)

mc: Khối lượng chén (g)

Mo: Khối lượng cao ban đầu (g)x: Độ ẩm của cao ban đầu (g)Kết quả tỷ lệ tro toàn phần của cao đặc AZK được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả tỷ lệ tro toàn phần của cao đặc AZK

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc, thêm khoảng 10mg bột Mg kim loại Nhỏ

từ từ khoảng 3 – 5 giọt HCl đậm đặc, để yên vài phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam

 Phản ứng với kiềm

- Phản ứng với hơi amoniac: nhỏ riêng biệt 2 giọt dịch chiết lên giấy lọc, sấy khô, hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy lọc

khác có 1 giọt dịch chiết đối chứng Phản ứng dương tính khi vết có màu vàng đậm lên.

- Phản ứng với NaOH 10% : cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính khi có xuất hiện tủa vàng, thêm 1ml nước cất, tủa tan và màu vàng của dung dịch đậm lên

 Phản ứng với FeCl 3

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Phản ứng dương tính khi thấy dung dịch xuất hiện màu xanh đen

 Phản ứng với diazo hoá

Chuẩn bị thuốc thử: hoà tan khoảng 0,9g acid sulfanilic trong 9ml HCl đậm đặc (đun nóng), pha loãng với nước đến 100ml Lấy 10ml dung dịch ngâm trong nước đá rồi thêm 10ml dung dịch NaNO2 4,5% cũng vừa được ngâm trong nước

đá Lắc đều, giữ ở nhiệt độ 0oC trong 15 phút Dung dịch pha xong dùng ngay.Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, kiềm hoá bằng dung dịch NaOH (thử bằng giấy quỳ), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng cách thuỷ Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu đỏ

b Định tính coumarin

Chuẩn bị dịch chiết để tiến hành phản ứng như với phản ứng định tính flavonoid

 Phản ứng mở đóng vòng lacton

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết

+ Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

+ Ống 2: để nguyên

Đun sôi cả 2 ống nghiệm, để nguội rồi quan sát Phản ứng dương tính khi ống

1 xuất hiện tủa vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong

Thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml nước cất, lắc đều rồi quan sát:

+ Ống 1: dung dịch vẫn đục

+ Ống 2: trong suốt

 Phản ứng diazo hoá

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ đến sôi, để nguội, nhỏ vài giọt thuốc thử diazo Phản ứng dương tính khi thấy dung dịch màu đỏ gạch

 Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi

tác dụng với kiềm

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy nhẹ, che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng đồng xu kim loại, chiếu tia tử ngoại trong vài phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát dưới đèn tử ngoại Phản ứng dương tính khi thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che Tiếp tục chiếu tia tử ngoại phần bị che sáng dần lên Sau vài phút 2 phần phát quang như nhau

 Phản ứng Salkowski

Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết Nghiêng ống nghiệm 45o, cho từ từ theo thành ống 2 – 3 giọt acid sulfuric đặc Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng màu đỏ tía ở mặt phân cách, lắc nhẹ dung dịch chuyển sang màu đỏ

d Định tính glycosid tim

Cho 5g cao đặc vào bình nón 100ml, thêm 30ml cồn 25o, lắc đều, ngâm 24 giờ Lọc lấy dịch chiết, thêm chì acetat 30% đến dư để tủa hết tạp Để lắng, lọc lấy dịch lọc vào bình gạn Lắc kĩ 2 lần với cloroform, mỗi lần 20ml, để lắng, gạn lọc lấy dịch chiết Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm khô, cô cách thuỷ đến cắn để làm các phản ứng

 Phản ứng Lieberman

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml H2SO4 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp Phản ứng dương tính khi thấy có vòng màu hồng tím đến xanh ở mặt tiếp xúc 2 lớp chất lỏng

 Phản ứng Legal

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu đỏ

 Phản ứng Keller – Kiliani

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic, lắc đều Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo ống 0,5ml dung dịch H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính khi có vòng màu tím đỏ ở mặt tiếp xúc

Cho 1ml dịch chiết cloroform vào ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch amoniac 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính khi lớp nước có màu đỏ sim Thêm tiếp từng

giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp dung môi hữu cơ mất màu vàng còn lớp nước đỏ thẫm hơn lúc ban đầu.

Lấy 1ml dịch chiết cloroform vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính khi lớp nước có màu đỏ sim

Lấy 1 phần dịch chiết cloroform lắc 2 lần với acid sulfuric 1N, mỗi lần 5ml Gộp các dịch chiết nước, chia đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 1ml:

+ Ống 1: thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện tủa nâu đến đỏ nâu

+ Ống 2: thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ

+ Ống 3: thêm 2 giọt thuốc thử Mayer Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện tủa trắng đến vàng

k Định tính đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ

Cho khoảng 5g cao đặc vào bình nón, thêm 30ml nước cất, đun sôi 2 phút, để nguội, lọc lấy dịch lọc làm phản ứng

 Định tính đường khử: cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt thuốc

thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B Đun cách thuỷ 10 phút Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa đỏ gạch

 Định tính polysaccharid:

Lấy 2 ống nghiệm

+ Ống 1: 4ml dịch lọc và 5 giọt thuốc thử Lugol

+ Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

Quan sát và so sánh 2 ống nghiệm Phản ứng dương tính khi ống 1 có màu xanh đậm hơn ống 2

 Định tính acid amin:

Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc, thêm 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3% Đun sôi cách thuỷ 10 phút Phản ứng dương tính khi xuất hiện dung dịch màu xanh tím

 Định tính acid hữu cơ:

Cho vào ống nghiệm 4ml dịch lọc, thêm một ít bột Na2CO3 Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí bay lên

l Định tính chất béo, sterol, caroten

Cho 5g cao đặc vào bình nón 100ml, đổ ngập ether dầu hoả, ngâm qua đêm, lọc lấy dịch làm phản ứng

45o, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống Phản ứng dương tính khi thấy ở mặt phân cách 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng tròn màu tím đỏ

 Định tính caroten:

Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết ether dầu hoả, cô cách thuỷ đến cắn Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn Phản ứng dương tính khi thấy dung dịch chuyển sang màu xanh lá đậm

Kết quả định tính các nhóm thành phần hoá học trong cao đặc AZK được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả định tính các nhóm chất trong cao thuốc

PƯ Cyanidin Dung dịch màu đỏ cam

Xuất hiện tủa vàng

+Diazo hóa Xuất hiện tủa đỏ gạch

Hiện tượng tạo bọt

PƯ Libermann

Có vòng tròn tím đỏ ở mặt phân cách giữa 2 chất lỏng

++

PƯ Keller-Kiliani

Có vòng tròn tím đỏ ở mặt phân cách giữa 2 chất lỏng

Dung dịch không có màu tím sẫm

-Không có

8 Acid hữu cơ PƯ với Na2CO3 Không thấy có bọt khí bay lên

-Không có

9 Đường khử TT Fehling A, B Xuất hiện kết tủa đỏ gạch

Caroten Dung dịch màu xanh lá đậm

Sterol

Sterol

Có vòng tròn tím đỏ ở mặt phân cách hai lớp chất lỏng

Nhận xét: Từ kết quả định tính trên sơ bộ kết luận trong cao đặc AZK có

chứa: flavonoid, saponin, glycosid tim, anthranoid, đường tự do, chất béo, sterol, caroten, coumarin, polysaccarid, acid hữu cơ

3.2 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO AZK

 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

- Cao đặc AZK được pha loãng bằng nước với liều thích hợp để cho động vật thí nghiệm uống

- Mẫu nghiên cứu được dùng theo đường uống trên động vật thí nghiệm

3.2.1 Độc tính cấp

3.2.1.1 Thử nghiệm thăm dò

- Sử dụng 10 chuột nhắt trắng, giống cái, chia thành 5 nhóm, mỗi nhóm 2 con

và cho uống cao đặc AZK với liều tăng dần

- Kết quả: Sau 4 giờ, cả 10 con chuột đều không có biểu hiện bất thường; sau

72 giờ cả 10 con chuột đều còn sống và không xuất hiện chuột chết trong vòng

14 ngày sau khi uống thuốc thử Các động vật thử nghiệm không có biểu hiện bất thường

- Kết thúc thử nghiệm thăm dò đã xác định được liều 56g cao đặc/kg chuột, tương đương 0,4ml/10g chuột là mức liều cao nhất có thể cho uống được vẫn không gây chết chuột nhắt trắng thí nghiệm

3.2.1.2 Thử nghiệm chính thức