Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ bọt biển stylissa flexibilis

Với một hệ sinh vật phong phú và khả năng tổng hợp nhiều loại phân tử làm đa dạng trong việc nghiên cứu khoa học và có vai trò bảo vệ môi trường.. Bọt biển xuất hiện như là một nguồn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

VÕ THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH

HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN STYLISSA FLEXIBILIS

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học)

Nha Trang – Năm: 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

VÕ THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH

HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN STYLISSA FLEXIBILIS

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học)

GVHD: TS LÊ ĐÌNH HÙNG

Nha Trang – Năm: 2017

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên: Võ Thị Hảo MSSV: 55134649

Lớp: 55CNHH

Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học

Đề tài: “Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ bọt

biển Stylissa flexibilis”

Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo:

Hiện vật:

NHẬN XÉT:

KẾT LUẬN:

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Ký và ghi rõ họ tên)

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc PHIẾU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG ĐỀ TÀI

Họ và tên sinh viên: Võ Thị Hảo MSSV: 55134649

Lớp: 55CNHH

Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học

Đề tài: “Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ bọt

biển Stylissa flexibilis”

Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo:

Hiện vật:

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

Kết luận

Điểm phản biện

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017

CÁN BỘ PHẢN BIỆN

(Ký và ghi rõ họ tên)

_

Điểm phản biện

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Ký và ghi rõ họ tên)

Cảm ơn các anh chị tại Phòng Công Nghệ Sinh Học Biển - Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này

Trong quá trình nghiên cứu, cũng như trong quá trình làm bài luận văn tốt nghiệp,

do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô Luận văn tốt nghiệp được thực hiện từ đề tài “Nghiên cứu và định hướng sử dụng hemagglutinin từ sinh vật biển” do Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tài trợ với mã số: VAST06.04/16-17

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày tháng năm 2017

Sinh viên

Võ Thị Hảo

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ bảo của thầy cô hướng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Nha Trang, ngày tháng năm 2017

Chữ ký sinh viên

Võ Thị Hảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

1.1 TỔNG QUAN VỀ BỌT BIỂN 3

1.1.1 Giới thiệu chung về bọt biển 3

1.1.2 Cấu tạo của bọt biển 3

1.1.3 Phân loại bọt biển 3

1.1.4 Bọt biển Stylissa flexibilis 4

1.1.5 Tiềm năng các hoạt tính sinh học từ bọt biển 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN 5

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin 6

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới 7

1.3 LECTIN TỪ BỌT BIỂN 8

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ bọt biển trong nước và ngoài nước 8

1.3.2 Phân loại lectin từ bọt biển 9

1.3.3 Cấu tạo của lectin từ bọt biển 9

1.3.4 Một số tính chất lý hóa và sinh học của lectin từ bọt biển 10

1.3.5 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN 11

1.4 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN 12

1.4.1 Các kỹ thuật chiết xuất lectin 12

1.4.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 14

2.2 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 14

2.2.1 Vật liệu 14

2.2.2 Hóa chất 14

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.3.1 Quy trình sàng lọc lectin từ động vật bọt biển 16

2.3.2 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (NKHC) 16

2.3.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951) 17

2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ BỌT BIỂN S FLEXIBILIS 19

2.4.1 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ bọt biển 19

2.4.2 Xác định điều kiện chiết thích hợp để thu nhận lectin từ bọt biển S flexibilis

20

2.4.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ CaCl2 (mM) ảnh hưởng đến hoạt độ NKHC (TN1) 20

2.4.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v) (TN2) 21

2.4.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết (giờ) (TN3) 22

2.4.4 Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 23

2.4.5 Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 24

2.4.6 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 24

2.4.7 Phương pháp khảo xác khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ bọt biển S flexibilis 27

2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 KẾT QUẢ SÀNG LỌC LECTIN TỪ BỌT BIỂN 29

3.2 CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾT LECTIN TỪ BỌT BIỂN 30

3.2.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 (mM) đến hoạt độ NKHC của lectin có trong bọt biển S flexibilis 30

3.2.2 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của lectin có trong bọt biển S flexibilis 31

3.2.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt độ NKHC của lectin có trong bọt biển S flexibilis 32

3.3 TINH CHẾ LECTIN 33

3.3.1 Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 33

3.3.2 Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 34

3.3.3 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 34

3.3.4 Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ bọt biển S flexibilis 35

3.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH LÝ, HÓA CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN S FLEXIBILIS 37

3.4.1 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin 37

3.4.2 Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin 38

3.4.3 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

KẾT LUẬN 41

KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 45

EDTA : Axit Ethylenediaminetetraacetic

SDS-PAGE : Kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các máy móc và thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Khảo sát khả năng liên kết của lectin với một số loại đường và glycoprotein

27 Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc lectin từ bọt biển 29

Bảng 3.2 Kết quả tinh sạch lectin từ bọt biển S flexibilis (40 g) 36

Bảng 3.3 Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt độ NKHC

của lectin từ bọt biển 39 Bảng PL 1 Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (μg/ml) 45 Bảng PL 2 Giá trị Rf và lg M của protein trong thang chuẩn 45 Bảng PL 3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 (mM) đến hoạt độ NKHC của

lectin 46 Bảng PL 4 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin

46 Bảng PL 5 Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 46 Bảng PL 6 Kết quả đo A 280 nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi chạy

sắc ký ion DEAE-Sepharose 47 Bảng PL 7 Kết quả đo A 280 nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi chạy

sắc ký lọc gel trên cột nhựa Sephadex S-200 49 Bảng PL 8 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ bọt biển

S flexibilis 50

Bảng PL 9 Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ bọt bển S

flexibilis 50

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Một số đại diện bọt biển (theo Hickman) 4

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình sàng lọc lectin 16

Hình 2.2 Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry 18

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ bọt biển S flexibilis 19

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ CaCl2 (mM) 20

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ : dung môi chiết (w/v) 21

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết (giờ) 22

Hình 2.7 Đồ thị tương quan giữa lgM và Rf của protein trong thang chuẩn 26

Hình 3.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 (mM) đến hoạt độ NKHC 30

của lectin 30

Hình 3.2 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) đến HĐTS và HĐR của lectin 31

Hình 3.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến HĐTS và HĐR của lectin 32

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (A = 280 nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 33

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (A = 280 nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 34

Hình 3.6 Kết quả điện di protein lectin qua từng bước tinh sạch 35

Hình 3.7 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin 37

Hình 3.8 Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ bọt biển S flexibilis. 38

MỞ ĐẦU

Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu, liên kết với carbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch Lectin giữ vai trò quan trọng như là một phân tử nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế bào hoặc tế bào với tế bào, do chúng có thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khả năng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào Những đặc tính này làm cho lectin trở thành một công cụ hữu ích cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: nghiên cứu miễn dịch học, hóa sinh, sinh học tế bào nhằm xác định và phát hiện nhóm máu, nghiên cứu tế bào ung thư Hơn nữa, lectin là hợp chất phân bố rộng trong tự nhiên có ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật và đặc biệt là động vật biển Vì vậy, nguồn nguyên liệu để chiết xuất lectin rất đa dạng và phong phú [9]

Việt Nam có chiều dài bờ biển trên 3260 km, có hơn 9000 loài bọt biển, chúng sống trong các môi trường đại dương, từ các vùng cực đới đến vùng nhiệt đới Hầu hết sống ở sâu dưới đáy biển Bọt biển rất phong phú nhưng ở vùng biển ôn đới ít đa dạng hơn so với ở các vùng biển nhiệt đới [25] Với một hệ sinh vật phong phú và khả năng tổng hợp nhiều loại phân tử làm đa dạng trong việc nghiên cứu khoa học và có vai trò bảo vệ môi trường Bọt biển xuất hiện như là một nguồn phân tử với các ứng dụng sinh học, y học tiềm năng đây là điều kiện thuận lợi cho việc đẩy mạnh các nghiên cứu về các hợp chất cho nguồn gốc từ động vật biển mà đặc biệt là động vật thân lỗ

Do đó, việc đa dạng hóa nguồn nguyên liệu thu nhận lectin là việc cần thiết để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn nhằm định hướng ứng dụng trong y dược cũng như ứng dụng trong các lĩnh vực khác

Xuất phát từ những lí do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tinh

chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis”

 Mục tiêu nghiên cứu

- Sàng lọc lectin từ bọt biển và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng Chọn ra

loài bọt biển thích hợp cho các thí nghiệm tiếp theo

- Xác định điều kiện thích hợp để tách chiết, tinh sạch lectin từ bọt biển Stylissa

flexibilis

- Xác định các tính chất hóa lý của lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis

 Nội dung nghiên cứu

- Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose

- Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200

2 Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của lectin

3 Nghiên cứu các đặc tính lý hóa của lectin

- Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin

- Khả năng liên kết carbohydrate

 Ý nghĩa khoa học

Thu nhận thêm thông tin khoa học về lectin từ động vật bọt biển

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Xây dựng được quy trình chiết, tách lectin thô từ động vật bọt biển và xác định

được những tính chất hóa lý đặc tính của lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis, từ đó có

thể thu nhận lectin ở quy mô lớn hơn để đưa ra khả năng ứng dụng thực tế

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ BỌT BIỂN

1.1.1 Giới thiệu chung về bọt biển

Bọt biển còn gọi là hải miên hay động vật thân lỗ là một ngành động vật đa bào nguyên thuỷ, có cấu trúc tế bào tách biệt và phần lớn là sinh sống ở biển Cơ thể động vật thân lỗ có hình cốc gồm các động vật đa bào, phát triển từ các tập đoàn tế bào Chúng

đã từng được xem là đã tách ra từ các động vật khác trước đây

Bọt biển là động vật không cuống trông giống như thực vật được phân bố rộng rãi trên toàn thế giới Dưới mắt thường, chúng không cử động, hay không có sự sống, những sinh vật này vẫn làm việc rất tích cực Mỗi ngày, bọt biển bơm rất nhiều nước qua cơ thể để lọc lấy các sinh vật đơn bào bé nhỏ làm thức ăn Phải lọc 1 tấn nước, chúng mới

có được khoảng 30 g thức ăn Dù làm việc như thế, nhưng bọt biển vẫn chỉ là những động vật bậc thấp Chúng không có hệ thần kinh hay hệ hô hấp, không có khả năng chuyển động [25]

1.1.2 Cấu tạo của bọt biển

Bọt biển là những metazo nguyên thủy có khả năng tạo ra một lượng lớn các hợp chất, bảo vệ chúng khỏi những kẻ săn mồi cũng như khỏi nhiễm trùng bởi các mầm bệnh khác

1.1.3 Phân loại bọt biển

Dựa vào đặc điểm hình thái và thành phần hóa học của bộ xương, bọt biển được chia thành ba lớp: lớp bọt biển đá vôi (Calcarea), lớp bọt biển silic (Hexactinellida) và lớp bọt biển mềm (Demospongiae) [26, 27] Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Homoscleromorpha thuộc Demospongiae, thực sự được phân tách rõ rệt Do đó, chúng gần đây đã được công nhận là loại bọt biển thứ tư

 Lớp bọt biển đá vôi (Calcarea)

Sống ở biển, có bộ xương là các gai xương đá vôi có một, ba hay bốn trục Cơ thể kiểu: ascon, leucon hay sycon Các loài hiện còn sống chỉ có cấu trúc cơ thể kiểu ascon [28]

 Lớp bọt biển silic (Hexactinellida)

Sống đơn độc, thân cao, phân bố ở biển sâu của vùng cực đới xích đạo Cấu trúc

cơ thể rất tinh tế và đối xứng, với gai silic 6 tia Một số loài sống bám vào đáy mềm nhờ các gai silic, tuy nhiên phần lớn sống trên nền đáy cứng Cấu trúc cơ thể kiểu sycon hay leucon Lớp tế bào ngoài của bọt biển là hợp bào, tức là không có lớp mô bì dẹt Đại

diện có các loài: Hyalonema, lophocalyx [28]

 Lớp bọt biển mềm (Demospongiae)

Đây là lớp lớn, gồm 80% số loài hiện đang sinh sống, phân bố ở biển hay nước ngọt Cơ thể kiểu leucon, bộ xương là sợi spongin hay các gai silic gồm một hay bốn

trục, không có gai đá vôi [28]

Hình 1.1 Một số đại diện bọt biển (theo Hickman)

A: pseudocoralia B:Ectyoplania C: Monachora

1.1.4 Bọt biển Stylissa flexibilis.

Stylissa flexibilis thuộc lớp Demospongiae Cơ thể xốp bao gồm silic và

sponginevezel và có khả năng hấp thụ rất nhiều nước Tên khoa học của loài được xuất bản lần đầu năm 1961 bởi Lévi đã phân loại như sau: [29]

Hình 1.2 Bọt biển Stylissa flexibilis

1.1.5 Tiềm năng các hoạt tính sinh học từ bọt biển

Bọt biển là những sinh vật có triển vọng để phân lập các phân tử có hoạt tính sinh học mới làm nguồn tiềm năng ứng dụng để tạo ra các loại thuốc mới Chúng được biết đến là một trong những nguồn giàu chất dược lý có hoạt tính tốt từ sinh vật biển [30] Trong bọt biển có nhiều chất chuyển hóa có hoạt tính tốt có tiềm năng ứng dụng trong y dược như khả năng chống viêm và chống virus Hơn 5.300 sản phẩm khác nhau được biết đến từ bọt biển và các vi sinh vật có liên quan và hơn 200 các chất chuyển hóa mới từ bọt biển được báo cáo mỗi năm [30] Một ví dụ được đưa ra vào năm 1999, khi

các nhà nghiên cứu cô lập C-nucleoside từ Cryptotethya crypta, chế tạo ra thuốc chống

ung thư đầu tiên có nguồn gốc từ sinh vật biển, được sử dụng lâm sàng để điều trị bệnh bạch cầu [30] Nhiều sản phẩm tự nhiên biển đã thành công tiến đến giai đoạn cuối của thử nghiệm lâm sàng, như ara-A (vidarabine) một loại thuốc chống virus được sử dụng chống lại virus viêm não herpes simplex Hơn nữa, một số lượng lớn các loại bọt biển đã được chọn làm thử nghiệm hứa hẹn cho việc đánh giá lâm sàng mở rộng, bao gồm cả manzamine A (hoạt tính chống sốt rét, bệnh lao, HIV, và bệnh khác), lasonolides (hoạt tính kháng nấm) và psammaplin A (hoạt tính kháng khuẩn) [1] Do đó, có tiềm năng đáng

kể trong ngành công nghiệp dược phẩm như một phương tiện tạo ra các loại thuốc mới Bọt biển đã trở thành đối tượng nghiên cứu của nhiều ngành công nghiệp quan trọng và hấp dẫn, với sản lượng khai thác hàng năm từ năm 1913-1938 thường xuyên vượt quá 181 tấn và tạo ra hơn 1 triệu đô la Mỹ Đối với năm 2003, nhu cầu về bọt biển tăng cao là 2.127 tấn, sản lượng toàn cầu thu hoạch chỉ đáp ứng một phần tư số lượng cần thiết [30]

1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin

Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho các mục đích y tế Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý gây độc của

các hạt Aprus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dịch lỏng

có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein Những

protein như vậy, được đề cập dưới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật Tuy nhiên, tất cả các nhà khoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutinin là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường đại học Dorpat (nay

là trường đại học Tartu, Estonia) vào năm 1888 Chất hemagglutinin được Stillmark tách

chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên là ricin, một độc tố mà

sau đó được xác định là có bản chất protein [14]

Năm 1980, Goldstein và các cộng sự đưa ra định nghĩa “Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” [8] Khái niệm này đồng nhất với định nghĩa về lectin mà Houston và Dooley đã đưa ra năm 1982: “Lectin là protein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó là khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu”

Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc liên quan đến chức năng của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [18]

Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin như sau: “Lectin là một loại protein không gây đáp ứng miễn dịch có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặc glycolipid trên bề mặt Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau” [31]

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới

 Sự phân bố lectin trong giới thực vật

Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộng trong các cơ quan như thân, lá và hạt Tác giả Allen và Brillantine (1969), đã tiến hành điều tra ở 2663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó các cây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [4] Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loài lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa lectin [5]

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [3] Lectin từ họ Dâu

tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay (Artocarpus tonkinensis), Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao [2].

Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của lectin

ở nhiều loài của thực vật và động vật như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y (Lichenes)

và Rong (Algae) [22]

Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật [1]

 Sự phân bố lectin trong giới động vật

Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm Lectin trong giới

động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus polyphemus)

Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật thuộc ngành Ruột khoang mới đây là ngành động vật thân lỗ cũng đã được tiến hành điều tra

Ở Việt Nam, khi khảo sát 30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang

- Khánh Hòa xuất hiện 10 loài có chứa lectin [1]

Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điều tra

cơ bản Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia), lớp

Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) cũng có chứa lectin Ngoài

ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata) hay trứng

cá vược (Perca piuviatitis) Một kết quả nghiên cứu khá thú vị, là ở mô người như mô

cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng

chứa lectin Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin Đó cũng là bằng chứng

về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [6]

 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật

Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện vào năm 1942, khi Hirst và cộng sự

đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [1] Sau này, một số công trình khoa học của Bruoly (1948), Stone (1949) và Bruet (1951) cũng đã phát hiện thấy lectin ở một số loài virus khác [24]

Trên đối tượng là vi khuẩn E coli, Ofek (1987) đã cho biết: trên bề mặt của tế bào

vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào Hoạt tính này mất đi khi

có mặt một số loại đường như galactoza và dẫn xuất amin của nó Đó chính là lectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn Dạng lectin này cũng đã được phát hiện ở một số loài vi khuẩn khác như Houssto năm 1983 hay của Smit và cộng sự năm 1984 [17]

1.3 LECTIN TỪ BỌT BIỂN

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ bọt biển trong nước và ngoài nước

❖ Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Trên thế giới, các nghiên cứu về lectin từ bọt biển thực sự bắt đầu vào những năm

1980 nhằm nghiên cứu lectin có khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu Từ đó một loạt hoạt tính sinh học đã được chứng minh, bao gồm các yếu tố di truyền, kháng sinh, các hoạt động gây độc tế bào

Mebs và các đồng nghiệp đánh giá khả năng ngưng kết của 48 loài bọt biển thu được ở Biển Đỏ, trong rạn san hô Barrier của Úc và Florida Keys Kết quả cho thấy 42% loài nghiên cứu chứa lectin có khả năng ngưng kết hồng cầu ở người Hơn một thập niên sau, 22 loài khảo sát có 12 loài của miếng bọt biển nhiệt đới đã được phân tích [15]

❖ Tình hình nghiên cứu trong nước

Khác với lectin từ thực vật bậc cao, cho đến nay, việc nghiên cứu lectin từ bọt biển

ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Từ năm 2008 cho đến nay, Viện nghiên cứu và Ứng dụng Cộng nghệ Nha Trang tập trung nghiên cứu về các loài rong biển, các công trình nghiên cứu tại đây đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển khác nhau, thuộc 3 dòng: rong

đỏ, rong nâu và rong xanh [12] Đề tài chiết tách, tinh chế lectin từ bọt biển vẫn đang còn

là một lĩnh vực mới tạo tiền đề cho nhiều công trình nghiên cứu mới được phát triển

1.3.2 Phân loại lectin từ bọt biển

Lectin từ bọt biển thường được phân loại theo cấu trúc chính của chúng bao gồm galectin, loại C, loại tachylectin và loại F

- Galectin ( lectin loại S): là nhóm lectin liên kết đặc trưng với β-galectside, dựa

vào cấu trúc mà chia thành 3 loại: galectin - proto, galactin-chimra và repeat-type [10] Các galectin nguyên mẫu thường ở dạng dimer Galectin-chirma đều

galactin-tandem-có hai miền riêng biệt: galactin dạng N-terminal và galectin dạng C-terminal, chúng galactin-tandem-có khả năng liên kết với các gốc thuốc không đường để tạo ra các gốc thuốc có đường Tuy nhiên, galectin từ bọt biển khác với galectin từ động vật bởi chúng chứa các đặc trưng cấu trúc khác nhau [16]

- Lectin loại C: đây là lectin rất phổ biến có mặt trong vi khuẩn, thực vật và động

vật Lectin này chứa các chất: ficolin, conglutinin, lõi proteoglycan, selectin, thụ thể endocytic và thụ thể macrophage Sự ràng buộc của các protein này với lượng carbohydrate cụ thể được quy định bởi sự có mặt của Ca2+ trong môi trường [21]

- Tachylectin-like lectin: lectin này có khả năng liên kết với N-acetylglucosamine

và N-acetylgalactosamine Lectin này gồm 6 tachylectin tandem repeat thường biểu hiện khả năng kháng khuẩn chống lại sinh vật tiền nhân bằng cách liên kết màng carbohydrate [7, 19]

- Lectin loại F: được đặc trưng bởi carbohydrate và cụ thể liên kết đặc hiệu với

fucose Trong lectin loại F, Ca2+ không đóng vai trò quan trọng trong hoạt động gắn kết nhưng giúp ổn định các protein [21]

1.3.3 Cấu tạo của lectin từ bọt biển

Khối lượng phân tử của lectin từ bọt biển

Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện di trên gel polyacrylamide, phương pháp siêu ly tâm và phương pháp quang phổ khối ion hóa phun điện tử (electron spray ionization-mass spectrometry) khối lượng phân tử của khá nhiều dạng lectin đã được xác định

Nói chung, các lectin đã được khảo sát cho thấy sự thay đổi lớn về khối lượng đơn vị từ monomer đến octamer Đa số các lecin đã được nghiên cứu thì khối lượng phân tử

lectin từ bọt biển nằm trong khoảng từ 50 kDa cho đến 70 kDa: Halichondria okadai,

Kim cydonium Nhưng cũng có một số loài bọt biển có chứa lectin có khối lượng phân

tử thấp từ 10 kDa cho đến 30 kDa: Lubomirskia baicalensis, Crambe crambe, cũng có

loài bọt biển chứa khối lượng phân tử lớn hàng trăm kDa như Cliona varians, Pellina

semitubulosa, Cinachyrella apion

1.3.4 Một số tính chất lý hóa và sinh học của lectin từ bọt biển

 Tính tan và kết tủa

Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ bọt biển hòa tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng Lectin có bản chất là protein nên chúng dễ bị kết tủa bởi một số tác nhân lý hóa của môi trường như: tác dụng của ethanol, acetone, của một số muối trung tính ở nồng độ cao đặc biệt là ammonium sunphate

 Sự tương tác của lectin từ bọt biển với các loại đường và dẫn xuất của nó

Về đặc tính carbohydrate, người ta đã quan sát được rằng nhiều lectin tách khỏi bọt biển có khả năng liên kết với các loại đường đơn Tuỳ thuộc vào từng loại bọt biển

mà lectin có khả năng liên kết với các loại đường khác nhau

Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác với đường của lectin vẫn còn khá phức tạp Mặc dù đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu về lectin Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì có thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó [11] Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu

 Khả năng gây ngưng kết tế bào

Loại tế bào dễ bị lectin gây ngưng kết là các tế bào hồng cầu ở động vật và người Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin Số lượng lectin có khả năng ngưng kết hồng cầu duy nhất chỉ một nhóm máu là rất ít vì chúng đồng thời có thể gây ngưng kết với nhiều hồng cầu khác như: thỏ, cừu, gà, ngựa, nhóm máu người A, B, O

Theo Sharon (1989), lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người, động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi [20]

 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ của lectin

- Ảnh hưởng của pH

Mỗi dạng lectin thường có pH thích hợp với hoạt độ của nó, đó là giá trị pH mà ở

đó hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái ổn định

So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ bọt biển có khoảng pH

thích hợp, hầu hết từ pH 6 đến 8 như các bọt biển thuộc loài Lubomirskia baicalensis,

Axinella corrugata, Ephydatia fluviatilis

- Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Lectin có bản chất là protein và glycoprotein nên nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt

độ của chúng So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, hoạt độ của lectin từ bọt biển khá ổn định Lectin dạng C, lectin dạng F hay tachylectine từ bọt biển đa số được nghiên cứu đều ổn định ở nhiệt độ 60 0C như loài Lubomirskia baicalensis, Pellina

semitubulosa, Crambe crambe, Ephydatia fluviatilis Một phần của chúng đặc trưng khả

năng ngưng kết hồng cầu Sự chịu nhiệt vừa phải này chủ yếu do sự hiện diện của các liên kết disulfide trong cấu trúc của chúng [13, 23] Các nghiên cứu khác cho thấy rằng

cũng có một số loài bọt biển ổn định ở 100 °C như loài Cinachyrella sp, Aplysina

archeri.

- Ảnh hưởng của một số nhân tố khác

Enzyme có khả năng làm tăng hoạt độ lectin Trong nhiều thí nghiệm, các hồng cầu được xử lý bằng các enzyme như trypsin, papain thì chúng dễ bị lectin làm ngưng kết Sở dĩ có hiện tượng này là vì khi hồng cầu xử lý với enzyme thì chính enzyme đã thủy phân giới hạn một số protein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm phơi ra các nhóm carbohydrate của nó, vì vậy lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, dẫn đến hoạt độ lectin tăng lên

- Ảnh hưởng của cation kim loại:

Trong các loại lectin từ bọt biển thì lectin dạng C phụ thuộc sự có mặt của cation kim loại như Ca2+ hoặc Mg2+ Khi mẫu được chiết bằng đệm thường không có Ca2+ thì mẫu sẽ không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp, khi ta bổ sung thêm Ca2+ thì hoạt tính của chúng tăng lên, do ion Ca2+ giúp các chuỗi protein đang lơ lững tự do gắn kết lại với nhau, hình thành mạng lưới bắt giữ hồng cầu tạo nên ngưng kết

1.3.5 Ứng dụng của lectin từ bọt biển

Lectin từ bọt biển có khả năng liên kết carbohydrate và các chất dẫn xuất trên bề mặt tế bào, cũng như sự kết hợp của chúng với các đại phân tử khác, chẳng hạn như oligosaccharide, glycoprotein hoặc glycolipid Các đại phân tử hoạt động như một điểm kết nối tiềm năng giữa lectin với các loại đường Tuy nhiên, theo phân loại, sự ràng buộc của lectin với đường là điểm then chốt trong việc ứng dụng và xác định các hoạt động

sinh học [11] Một trong những hoạt tính sinh học nổi bật nhất của lectin là khả năng

kích thích sự phân bào ở cả động vật và con người Như lectin từ Axinella corrugata (ACL-1), Craniella australiensis, Pellina semitubulosa và Cinachyrella alloclada

1.4 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN

1.4.1 Các kỹ thuật chiết xuất lectin

Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiết xuất lectin ra khỏi các mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể thực hiện dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau như dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0.9%, dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl

 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính

Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thể được hòa tan trở lại Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị 1, anion

đa hóa trị như: (NH4)2SO4,Na2SO4 các protein khác nhau được kết tủa ở những nồng độ muối trung tính khác nhau nên kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính thường được sử dụng trong các quy trình chiết xuất lectin nhằm cô đặc dung dịch protein cần tách

 Kết tủa phân đoạn bằng dung môi

Một số dung môi hữu cơ có thể dễ hòa tan trong nước như axetone, polyetylenglycol, ethanol, làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng

có thể bị kết tủa nhanh chóng Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất dễ gây biến tính protein, vì vậy việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành

ở nhiệt độ thấp

 Thẩm tích

Phương pháp thẩm tích được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán thấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phần tử lớn so với kích thước phân tử của màng Thẩm tích thường dùng để loại muối và những chất có khối lượng phân tử nhỏ khác ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm tích

1.4.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin

 Sắc ký trao đổi ion

Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích Tùy thuộc vào pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm Lợi dụng tính chất này người

ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như DEAE-Sepharose, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl, được sử dụng làm chất trao đổi anion Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện

âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl, được sử dụng làm chất trao đổi cation Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định

Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy

CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: mẫu bọt biển Stylissa flexibilis thu ở vùng biển Vĩnh Hy,

Ninh Thuận vào tháng 4/2016, các mẫu bọt biển khác thu ở Vịnh Nha Trang 5/2016 và Sơn trà – Đà Nẵng 8/2016 Sau khi thu mẫu được giữ lạnh bằng đá khô và chuyển về phòng thí nghiệm, giữ ở -20 oC cho đến khi dùng

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công Nghệ Sinh Học Biển, Viện Nghiên Cứu Và

Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang, số 2 – Hùng Vương, thành phố Nha Trang, tỉnh

Khánh Hòa

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2/2017 đến tháng 6/2017

2.2 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Vật liệu

Hồng cầu của máu thỏ lấy từ Viện Vaccine - Nha Trang, hồng cầu các nhóm máu

A, B, O ở người lấy từ Bệnh viện đa khoa tỉnh Khánh Hòa

2.2.2 Hóa chất

Các loại đường và glycoprotein: glucose, N-acetyl-glucosamine, galactose, N-acetyl-D-Galactosamine, Mucin, Asialo-mucin, Mannose (Sigma, USA), NANA (N-acetylneuraminic acid) (Đức)

D Nhựa sắc ký trao đổi ion DEAE D Sepharose Fast Flow của (Pharmacia, Uppsala D

Thụy Điển)

- Nhựa sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 của (Pharmacia, Uppsala - Thụy Điển)

Hóa chất phân tích các loại:

- BSA (Bovine serium albumin) (Đức)

- Enzyme Trypsin (Sigma – USA)

- Thuốc thử Folin (Đức)

- NaCl (Trung Quốc)

- Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Sigma – USA)

- Canxi clorua (Trung Quốc)

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.1 Các máy móc và thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu

vật liệu, dung tích Xuất sứ

3 Cột sắc ký trao đổi ion 1.6 x 20 cm GE Healthcare Sweden

4 Hệ thống bơm và thu phân đoạn Frac-920 GE Healthcare Sweden

5 Khay 96 giếng đáy chữ V Polystyrene Greiner- Đức

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Quy trình sàng lọc lectin từ động vật bọt biển

Mẫu được nghiền đồng nhất trong dung dịch đệm TBS (0,02M, NaCl 0,15M) Ly tâm thu dịch thô Xác định hoạt tính NKHC của dịch chiết thô với hệ hồng cầu người A,

B, O và hồng cầu thỏ ở dạng tự nhiên và được xử lý enzyme trypsin hoặc papain

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình sàng lọc lectin 2.3.2 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (NKHC)

 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu (HC) 2%

- Mẫu máu được rửa từ 3-5 lần Sau đó, được định mức lên 50 ml dùng dung dịch đệm TBS (0,02 M; NaCl 0,15M) Huyền phù HC 2% được dùng như HC tự nhiên

- Hồng cầu xử lý trypsin được chuẩn bị như sau: 1/10 thể tích của dung dịch trypsin 0,5% (w/v) được cho vào huyền phù HC tự nhiên 2% (v/v) Hỗn hợp được ủ ở 37 0C trong vòng 90 phút Sau khi ủ, hồng cầu được rửa bằng dung dịch đệm TBS (0,02 M; NaCl 0,15M) từ 3 đến 5 lần và hòa lại bằng đệm TBS (0,02 M; NaCl 0,15M), ta thu được dịch hồng cầu 2% đã xử lí enzyme

- Thêm 25 µl mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ NKHC vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha loãng là 1/2n (n: số lần pha loãng)

- Tiếp tục cho 25 µl hồng cầu máu 2% đã xử lý trypsin vào tất cả các giếng

- Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng Sau 1 giờ, đọc kết quả

 Đọc kết quả

- Kết quả âm tính: tất cả HC lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ

- Kết quả dương tính: HC trong giếng bị ngưng kết hơn 50%

 Đơn vị hoạt độ

Một đơn vị hoạt độ lectin hay một đơn vị hoạt độ ngưng kết hồng cầu (NKHC) viết tắt là HA (hemagglutinin assay) trên 1 ml chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch lectin có khả năng làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng Đơn vị (HU/ml)

 Hoạt độ lectin được xác định theo hai chỉ số:

- Hoạt độ tổng số (HĐTS): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất

định Đơn vị: HU

HĐTS = V 2 n Trong đó: V: tổng thể tích (ml)

n: số lần pha loãng

- Hoạt độ riêng (HĐR): là số đơn vị lectin có trong 1 mg protein Đơn vị: HU/mg

HĐR = HĐTS/Protein tổng Trong đó: HĐTS: tổng số đơn vị hoạt tính

Proteintổng: tổng hàm lượng protein

- MAC (minimum agglutination concentration): là nồng độ protein nhỏ nhất có khả

năng gây ngưng kết HC đã được xử lý enzyme trypsin Đơn vị: (µg/ml)

MAC = Hàm lượng proten (µg/ml) /2 n 2.3.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry và cộng sự năm 1951, dùng Albumin huyết thanh bò (BSA- Bovine serum albumin) làm chất chuẩn

 Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở phức chất đồng - protein khử hỗn hợp photphomolipden photphovonphramat (thuốc thử Folinb – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong phạm vi nhất định Đo

cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750 nm Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein cần phân tích

 Hóa chất

- Thuốc thử A: gồm Na2CO3 2% và NaOH 0,1 M

- Thuốc thử B: Dung dịch Sodium citrate 1% và CuSO4.5H2O 0.5%

- Dung dịch thuốc thử C: hỗn hợp của 2 dung dịch A: B theo tỉ lệ 50 : 1 (yêu cầu pha trước khi sử dụng)

- Thuốc thử Folin: pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng

- Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1 mg/ml

 Xây dựng đường chuẩn

Dung dịch gốc BSA có nồng độ 1 mg/ml Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 80, 120, 160 và 200 µg/mL để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn

Lấy chính xác 0,5 ml dịch chứa BSA với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch thuốc thử C, lắc đều để yên trong 20 phút Sau

đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút Mẫu trắng (ĐC) thay dịch chứa BSA bằng nước cất, các bước còn lại tiến hành tương tự Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm

Thực hiện thí nghiệm, xây dựng đường hồi quy Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2013

Hình 2.2 Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry

y = 0,0025x + 0,0008 R² = 0,9995

 Xác định nồng độ protein của các mẫu thí nghiệm

Lấy 0,5 ml dịch protein cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch thuốc thử C, lắc đều để yên trong 20 phút Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút Mẫu trắng (ĐC) thay dịch protein bằng nước cất, các bước còn lại tiến hành tương tự Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm

Kết quả được tính dựa vào đường chuẩn protein

2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ CHIẾT

LECTIN TỪ BỌT BIỂN S FLEXIBILIS

2.4.1 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ bọt biển

a Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ bọt biển S flexibilis

- Thời gian chiết (giờ)

- Xác định ảnh hưởng của pH, nhiệt độ

- Khả năng ngưng kết đường

- Sắc ký trao đổi ion

- Sắc ký lọc gel

Điện di

SDS-PAGE