Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ rong đỏ gracilaria eucheumatoides

Đồ án tốt nghiệp đại học được thực hiện từ đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ giữa chức năng, cấu trúc và hoạt tính sinh học của lectin liên kết high-mannose từ rong đỏ ở Việt Nam” do Quỹ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỖ THỊ KIỀU VY

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA

HỌC CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ GRACILARIA EUCHEUMATOIDES

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỖ THỊ KIỀU VY

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA

HỌC CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ GRACILARIA EUCHEUMATOIDES

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học)

GVHD: TS LÊ ĐÌNH HÙNG

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên: Đỗ Thị Kiều Vy MSSV: 55134401

Lớp: 55CNHH

Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học

Đề tài: “Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ rong

đỏ Gracilaria eucheumatoides”

Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo:

Hiện vật:

NHẬN XÉT:

KẾT LUẬN:

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Ký và ghi rõ họ tên)

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc PHIẾU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG ĐỀ TÀI

Họ và tên sinh viên: Đỗ Thị Kiều Vy MSSV: 55134401

Lớp: 55CNHH

Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học

Đề tài: “Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ rong

đỏ Gracilaria eucheumatoides”

Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo:

Hiện vật:

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

Kết luận

Điểm phản biện

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017

CÁN BỘ PHẢN BIỆN

(Ký và ghi rõ họ tên)

_

Điểm phản biện

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Trường Đại Học Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm học vừa qua Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp đại học mà còn là hành trang quý báu để tôi định hướng công việc mai sau

Cảm ơn các anh chị tại Phòng Công Nghệ Sinh Học Biển- Viện Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang- Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp đại học

Đặc biệt cảm ơn thầy TS Lê Đình Hùng (Trưởng phòng Công Nghệ Sinh Học Biển-Viện Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang) vì sự giúp đỡ và dìu dắt tận tình của thầy trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện đồ án này

Trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp đại học, do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô

Đồ án tốt nghiệp đại học được thực hiện từ đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ giữa chức năng, cấu trúc và hoạt tính sinh học của lectin liên kết high-mannose từ rong đỏ ở Việt Nam” do Quỹ Khoa học và Công Nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ với mã số:106-YS-2015.16

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

ĐỖ THỊ KIỀU VY

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về rong biển 3

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển 3

1.1.2 Phân loại rong biển 4

1.1.3 Rong đỏ Gracilaria eucheumatoides 4

1.2 Tổng quan về lectin 6

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin 6

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới 7

1.2.2.1 Lectin trong giới thực vật 7

1.2.2.2 Lectin trong giới động vật 8

1.2.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật 8

1.3 Lectin từ rong biển 9

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới và trong nước 9

1.3.2 Cấu tạo của lectin từ rong biển 10

1.3.3 Một số tính chất vật lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển 13

1.3.3.1 Tính tan và kết tủa 13

1.3.3.2 Sự tương tác của lectin từ rong biển với các loại đường và dẫn xuất của nó 13

1.3.3.3 Khả năng gây ngưng kết tế bào 13

1.3.3.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ của lectin 14

1.4 Ứng dụng của lectin từ rong biển 15

1.5 Phương pháp thu nhận lectin 17

1.5.1 Các kỹ thuật chiết lectin 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.2 Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 20

2.2.1 Đối tượng 20

2.2.2 Hóa chất 20

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu 22

2.3.2 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951) 23

2.3.3 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ rong biển 25

2.3.3.1 Phương pháp xác định các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 26

2.3.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết (TN1) 27

2.3.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v) (TN2) 28

2.3.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết (giờ) (TN3) 29

2.3.3.5 Khảo sát tác nhân tủa ammonium sunfate (NH4)2SO4 và nồng độ tủa (%) thích hợp để thu chế phẩm lectin 30

2.3.4 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE- sepharose 31

2.3.5 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 32

2.3.6 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 33

2.3.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 35

2.3.7.1 Khảo sát nhiệt độ hoạt động thích hợp 35

2.3.7.2 Khảo sát pH hoạt động thích hợp 35

2.3.8 Phương pháp khảo sát khả năng liên kết carbohydrate của lectin 36

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả các điều kiện tách chiết lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 38

3.1.1 Ảnh hưởng của dung môi đến hoạt độ NKHC của lectin có trong rong đỏ G eucheumatoides 38

3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của lectin

có trong rong đỏ G eucheumatoides 39

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt độ NKHC của lectin có trong rong đỏ G eucheumatoides 40

3.2 Kết quả tinh sạch lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 41

3.2.1 Khảo sát nồng độ ammonium sunfate (NH4)2SO4 để kết tủa lectin 41

3.2.2 Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE- sepharose 43

3.2.3 Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 44

3.2.4 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử từ lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 45

3.2.5 Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 46

3.3 Kết quả xác định tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 48

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 48

3.3.2 Ảnh hưởng của pH 49

3.3.3 Khả năng ngưng kết các loại hồng cầu khác nhau của lectin 50

3.4 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin rong đỏ G eucheumatoides 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

KẾT LUẬN 54

KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

(đệm phosphat chứa NaCl 0,15M)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Trình tự sắp xếp các axit amin đầu tận cùng N ở rong đỏ Kappaphycus

striatum [21] và các loài rong thuộc chi Eucheuma [29, 30] 12

Bảng 1.2: Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng 16 Bảng 2.1: Các máy móc và thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng 2.2: Khảo sát khả năng liên kết của lectin với một số loại đường và glycoprotein.

36

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 % đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin 41

Bảng 3.3: Kết quả tinh sạch lectin từ rong đỏ G eucheumatoides (100 g rong tươi) 46

Bảng 3.4: Khả năng gây ngưng kết các loại hồng cầu khác nhau của lectin 50 Bảng 3.5: Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt độ NKHC

của lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 51

Bảng PL 1: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (μg/ml) 60 Bảng PL 2: Giá trị Rf và lg M của protein trong thang chuẩn 60 Bảng PL 3: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến MAC, HĐTS và HĐR của lectin 60 Bảng PL 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v) đến MAC, HĐTS

và HĐR của lectin 61

Bảng PL 5: Ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến MAC, HĐTS và HĐR của lectin.

61

Bảng PL 6: Kết quả đo A 280 nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi sắc ký

trao đổi ion DEAE- sepharose 62

Bảng PL 7: Kết quả đo A 280 nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi sắc lọc

gel trên cột nhựa Sephacryl S-200 63

Bảng PL 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ G

eucheumatoides 64

Bảng PL 9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ G

eucheumatoides 64

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Rong đỏ G eucheumatoides 5

Hình 2.1: Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry 24

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát thu nhận lectin từ rong biển 25

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết 27

Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v) 28

Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết (giờ) 29

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 (%) 30

Hình 2.7: Đồ thị tương quan giữa lgM và Rf của protein trong thang chuẩn 35

Hình 3.1: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 38

Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến HĐTS và HĐR của lectin 39

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến HĐTS và HĐR của lectin 40

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ muối ammonium sunfate (NH4)2SO4 (%) đến HĐTS và HĐR của lectin 42

Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (A 280 nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc trao đổi ion DEAE- sepharose 43

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (A 280 nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 44

Hình 3.7: Kết quả điện di protein lectin qua từng bước tinh sạch 45

Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectintừ rong đỏ G eucheumatoides 48

Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 49

MỞ ĐẦU

Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu, liên kết với carbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch Lectin giữ vai trò quan trọng như

là một phân tử nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế bào hoặc tế bào với tế bào

vì chúng có thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khả năng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào Những đặc tính này làm cho lectin trở thành một công cụ hữu ích cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: nghiên cứu miễn dịch học, hóa sinh, sinh học tế bào, xác định và phát hiện nhóm máu, nghiên cứu tế bào ung thư [38]

Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 [9] và cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứng dụng của lectin từ rong biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [11] Các nghiên cứu về lectin từ rong biển cho thấy đặc tính của những lectin này có nhiều khác biệt so với lectin từ thực vật bậc cao Hầu hết, các lectin từ rong biển có trọng lượng phân tử thấp, tồn tại ở dạng monomer, không có ái lực với đường đơn nhưng có ái lực với glycoprotein (đặc biệt là các glycoprotein từ động vật), thuộc nhóm protein rất bền nhiệt và hoạt tính của chúng không đòi hỏi sự có mặt của các cation hóa trị II Với những tính chất ưu việt trên, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu cơ bản cũng như các ứng dụng của chúng trong tương lai

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biển khoảng 3260 km, với hơn 1000 loài rong biển đã được tìm thấy Trong đó, đã xác định được 151 loài thuộc ngành rong Lục (Chlorophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta), 143 loài thuộc ngành rong Nâu (Phaeophyta) và 76 loài thuộc ngành rong Lam (Cyanophyta) [32] Đây là nguồn vật liệu vô cùng phong phú cung cấp cho việc nghiên cứu, điều chế những hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lectin

Với kết quả khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 80 loài rong biển thuộc vùng biển Ninh Thuận và Khánh Hòa từ năm 2009 đến 2011 của TS Lê Đình Hùng và cộng sự cho thấy: hơn 90% dịch chiết từ rong được khảo sát cho thấy sự hiện diện lectin Chúng

có khả năng làm ngưng kết với ít nhất một trong các loại hồng cầu được thử nghiệm

Trong đó, dịch chiết từ rong đỏ G eucheumatoides thuộc ngành rong đỏ cho hoạt tính

ngưng kết hồng cầu mạnh nhất với cả hồng cầu thỏ và hồng cầu cừu [24, 28] Đồng thời,

loài rong này cũng đã và đang được thu tự nhiên phổ biến ở các vùng khác nhau thuộc tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thuận

Với những kết quả khảo sát sơ bộ và cơ sở nêu trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ rong đỏ Gracilaria eucheumatoides”

 Mục tiêu nghiên cứu:

- Xác định điều kiện thích hợp để tách chiết, tinh sạch lectin từ rong đỏ G

eucheumatoides

- Xác định các tính chất lý, hóa, sinh học của lectin từ rong đỏ G eucheumatoides

và định hướng khả năng ứng dụng lectin này trong các lĩnh vực khác nhau

 Nội dung nghiên cứu:

1.FTách, tinh chế lectin từ rong đỏ G eucheumatoides:

- Chiết và thu dịch lectin thô từ mẫu rong đỏ G eucheumatoides

- Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE- sepharose

- Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200

- Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE

2.ƯNghiên cứu các đặc tính lý hóa và sinh học của lectin từ rong đỏ G

eucheumatoides:

- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin

- Ảnh hưởng của pH đến khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin

- Khả năng gây ngưng kết các loại hồng cầu khác nhau của lectin

- Khả năng liên kết carbohydrate

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rong biển

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển

Rong biển là một loài thực vật sinh sống ở biển Chúng mọc trên các rạn san hô, vách đá hoặc có thể mọc dưới các tầng nước sâu với điều kiện có ánh nắng mặt trời chiếu tới để quang hợp Sự có mặt của rong biển trong thủy vực không chỉ đóng vai trò quan trọng là mắc xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của sinh vật biển mà còn là nguồn cung cấp thức ăn cho các loài động vật ven biển [3]

Rong có kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước từ hiển vi cho đến hàng chục mét, hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay nhiều hình thù rất đặc biệt Hằng năm đại dương cung cấp cho con người khoảng

200 tỷ tấn rong Hơn 90% lượng cacbon trên Trái Đất được tổng hợp hằng năm là nhờ tổng hợp trong môi trường lỏng, trong đó 20% là từ rong biển

Rong biển rất giàu chất dinh dưỡng Ngoài thành phần đạm, rong biển còn chứa rất nhiều khoáng chất, các yếu tố vi lượng và vitamin Trong đó, nổi bật là Iốt yếu tố vi lượng cần thiết cho tuyến giáp, canxi với hàm lượng cao hơn trong sữa, vitamin A cao gấp 10 lần trong bơ, vitamin B2 gấp 7 lần trong trứng, vitamin C, E cao gấp nhiều lần trong rau quả Ngoài ra các hợp chất protein và polysacharide từ rong biển còn là đối tượng nghiên cứu của rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, y dược, nông nghiệp và công nghệ sinh học [3]

Ở nước ta khoảng hơn 1000 loài rong biển, phân bố chủ yếu ở vùng biển các tỉnh phía Nam và phía Bắc Với 200 loài được tìm thấy ở cả hai miền Bắc Nam Trong đó,

có các đối tượng quan trong là: rong Câu (Gracilaria), rong Mơ (Sargassum), rong Đông (Hypnea), rong Mứt (Porphyza) và rong Bún (Enteromorpha) [25]

1.1.2 Phân loại rong biển

Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia thành 9 ngành sau:

1) Ngành rong lục (Chlorophyta)

2) Ngành rong nâu (Phaeophyta)

3) Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

4) Ngành rong trần (Englenophyta)

5) Ngành rong giáp (Pyrophyta)

6) Ngành rong khuê (Bcillareonphyta)

7) Ngành rong kim (Chrysophyta)

8) Ngành rong vàng (Xantophyta)

9) Ngành rong lam (Cynophyta)

Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong lục, rong nâu và rong đỏ Trong

đó, rong đỏ được sử dụng phổ biến nhất với số lượng lớn để phục vụ con người Một số loài có hàm lượng cao về Agar, Carrcageenan, Furcuellaran được sử dụng phổ biến để chế keo rong

1.1.3 Rong đỏ Gracilaria eucheumatoides[14]

 Nguồn gốc và phân loại

Hình 1.1: Rong đỏ G eucheumatoides

 Đặc điểm hình thái

Rong đỏ G eucheumatoides thường mọc ở nước sâu 2-7 m, trên các tảng đá san

hô, có thủy triều chảy suốt Rong câu này có hình bán trụ, hình dẹt Thân cây rong câu dòn, cứng, mọc bò thành đám, thân phân nhánh không theo quy luật, nhánh dẹp, mép có khối u lồi ngắn và nhọn Rong có màu tím đến đỏ thẫm khi sống chổ tối, màu kem đến nâu trắng khi sống ở chỗ sáng

 Phân bố và thu hoạch

 Phân bố:

Chi Gracilaria phân bố ngoài đảo ngoài khơi, cửa sông, cửa biển Gracilaria phân

bố rộng trên toàn thế giới, đa số phân bố khắp các vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới Một số loài đã được trồng với số lượng lớn ở Việt Nam, Đài Loan, Trung Quốc và vài vùng ở Thái Lan

 Thu hoạch:

Thời gian thu hoạch từ tháng giêng đến tháng tám âm lịch hoặc vào những buổi sáng, từ tháng tám đến tháng chạp âm lịch vào lúc nước cạn Dụng cụ để lấy rong là một miếng sắt mỏng vừa tay cầm, bẻ cong một đầu, đầu kia là cán, để cào rong bám trên mặt đá Sau khi lấy về người ta nhặt bỏ vỏ sò, vỏ ốc, đất cát, rửa nước thường cho thật sạch rồi đem phơi nhiều ngày cho thật trắng

 Ứng dụng của rong:

Rong đỏ G eucheumatoides chứa một lượng lớn agar có chất lượng tốt, được sử

dụng trong thực phẩm, công nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học

1.2 Tổng quan về lectin

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin

Cho đến những năm cuối thế kỉ 19, bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho mục đích y tế

Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích được nguyên lý gây độc của các hạt

cam thảo dây Aprus precatoriu Đến năm 1887, Dixson đã xác định được một dịch lỏng

có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein Những

protein như vậy được đề cập dưới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật Các nhà khoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutiin là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường Dorpat (nay là Tartu, Estonia) vào năm 1888

Chất hemagglutiin được Stillmark tách chiết từ hạt cây thầu dầu Ricinus communis và

được đặt tên là ricin, một độc tố mà sau đó được xác định là có bản chất protein

Năm 1980, Goldstein và các cộng sự đã đưa ra định nghĩa “Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” [12] Khái niệm này đồng nhất với định nghĩa về lectin mà Houston và Dooley đã đưa ra năm 1982:

“lectin là protein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó khả năng gây ngưng kết hồng cầu”

Năm 1995, Peumans và Van Damme đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc

có liên quan đến tính chất của lectin: “Lectin là protein có cấu trúc phân tử có chứa ít nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [38]

Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện hoạt tính sinh học, Peumans và cộng sự đã chia lectin thành 3 loại:

- Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm liên kết đường, do đó không có đặc tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa với các hợp chất

liên kết đường Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan (Orchidaceae)

- Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, do đó có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu và tương tác nhiều với hợp chất đường Đó là các lectin phổ biến đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được phát hiện bởi khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng với đường và được gọi là hemagglutinin

- Chimerolectin là những phần tử trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với đường

và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh học) Thuộc về loại này là protein kìm hãm riboxom type 2 (RIP, Type 2) có trong hạt Thầu dầu

(Ricinus communis L.) hoặc hạt cây Cam thảo dây (Abrus precatorius L.)

Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin như sau: “lectin

là glycoprotein hoặc protein không có nguồn gốc miễn dịch, có khả năng liên kết thuận nghịch với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặc glycolipip bề mặt Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau”

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới

1.2.2.1 Lectin trong giới thực vật

Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộng trong các cơ quan như thân, lá, hạt Allen và Brillantine (1969, đã tiến hành điều tra ở

2663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó các cây họ Đậu

(Fabaceae) chiếm trên 600 loài [6] Ngoài ra các cây họ Đậu có số lượng lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ (Minoseae),

họ Thủy tiên (Amaryllidaceae), và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa lectin [7]

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loại có chứa lectin Lectin họ Dâu tằm

(Moraceae), Mít na [4] và một số loài cây khác như Chay (Artocarpus tonkinensis) [2], Sake chi (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao

Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của lectin

ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài nấm (Fungi), địa y (Lichenes) và

rong (Algae) Đến nay đã có hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin từ rong biển

ở nhiều quốc gia khác nhau như: Tây Ban Nha, Nhật Bản, Việt Nam, Ấn Độ [10, 16]

Mặc dù có rất nhiều loài thực vật vẫn chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa học trên đây cũng chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật

1.2.2.2 Lectin trong giới động vật

Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm Lectin trong giới

động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam Mỹ (Limulus polyphemus, 1903) Sau

đó một số loài thuộc lớp giáp xác và các loài động vật ngành ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra

Trong khi đó, ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng được điều tra cơ bản Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia), lớp Bò Sát (Reptila), lớp chim (Aves) và lớp thú (Mammalia) cũng có chứa lectin Ngoài ra,

còn có một số loại huyết tương khác từ cá chình (Aguilla rtiata) hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)

Một số kết quả khác nghiên cứu ở mô người như mô cơ và các cơ quan của cơ thể của người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng chứa lectin Như vậy

có khá nhiều động vật có chứa lectin Đó cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới

1.2.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật

Lectin đầu tiên từ virus được phát hiện năm 1942, khi Hirst và cộng sự tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [1] Sau này một số công trình khoa học của Briody (1948), Bruet (1951) và Stone (1949) cũng phát hiện lectin ở một số loài viruts khác

Trên đối tượng vi khuẩn E coli, Ofek (1987) đã cho biết: trên bề mặt tế bào vi

khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào Hoạt tính này mất đi khi có mặt một số loại đường như galactose và dẫn xuất amin của nó Đó chính là lectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn [37] Dạng lectin này cũng đã được phát hiện ở một số loài vi khuẩn khác như Houssto năm 1983 hay của Smit và công sự năm 1984

1.3 Lectin từ rong biển

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới và trong nước

 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Công trình khoa học đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vào năm 1966, ông đã phát hiện ra rong biển cũng có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu ở người [9] Kể từ đó có rất nhiều công trình công bố sự có mặt của lectin trong rong biển

Năm 1988, Hori đã khảo sát hoạt tính ngưng kết hồng cầu của 31 loài rong biển trên hồng cầu người và động vật Từ kết quả nghiên cứu đạt được ông đã cho rằng hoạt tính ngưng kết hồng cầu đóng vai trò quan trọng trong chức năng sinh lý của tế bào rong biển Và hoạt tính này có thể tồn tại ở nhiều loại rong biển khác nhau [18]

- Tại Tây Ban Nha, Fabregas được xem là một trong những người tiên phong trong việc nghiên cứu lectin từ rong biển Từ năm 1985 đến năm 1992, ông và cộng sự đã khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 90 loại rong biển thuộc 3 dòng rong: rong đỏ, rong nâu và rong xanh Trong đó, hoạt tính ngưng kết hồng cầu từ rong đỏ là phổ biến nhất [11, 25]

- Những năm gần đây, nghiên cứu về lectin từ rong biển đang được khảo sát ở nhiều địa điểm khác nhau trên thế giới với quy mô ngày càng lớn hơn: từ Nam Mỹ, Châu

Âu, Châu Á cho đến các vùng Nam Cực Hơn thế nữa, không chỉ dừng lại ở việc khảo sát sự có mặt của lectin trong rong biển mà những tính chất cơ bản của nó chúng đã được chú ý đến [9, 17]

- Tuy nhiên, cho đến nay số lượng lectin được tinh sạch cũng như khảo sát đặc tính hóa sinh vẫn còn rất khiêm tốn, đặc biệt là khi so sánh với lectin từ thực vật bậc cao Hầu hết trong số đó là các lectin từ rong biển mà chủ yếu là ở các dòng rong đỏ như:

Bryothamnion seaforthii, B triquetrum; Solieria filiformis; Pterocladiella capillacea

[43] Trong số đó, có một vài lectin từ dòng rong đỏ đã được làm sáng tỏ về cấu trúc bậc

1 như: Hypnea japonica và Vidalia obtusiloba [39], Eucheuma serra [19], Kappaphycus

alvarezii [15], Kappaphycus striatum [21], Eucheuma denticulatum [22]

Trong khi đó, mặc dù chức năng sinh học của lectin vẫn chưa được làm rõ, nhưng các nhà nghiên cứu gần đây cho rằng lectin từ rong biển có khả năng điều chỉnh hệ miễn dịch, kháng u, kháng ung thư Đặc biệt, hàng loạt lectin có khả năng liên kết với

glycoprotein N-glycan dạng high manose như: lectin ESA_2 của rong đỏ Eucheuma

sera [19], lectin từ rong đỏ Griffithsia sp [18] hay lectin KAA_2 của rong đỏ Kappaphycus alvarezii [41] có khả năng ngưng kết với bề mặt của các tế bào có

glycoprotein dạng high manose đặc biệt là trên lớp vỏ của virus HIV, HBV và một

số loại virus gây bệnh [25]

Những kết quả đạt được cho thấy rằng, lectin từ rong biển mà đặc biệt từ rong đỏ

là nguồn nguyên liệu hữu ích để sử dụng trong các nghiên cứu hóa sinh và y sinh trong giai đoạn sắp tới

 Tình hình nghiên cứu trong nước

Khác với lectin từ thực vật bậc cao, cho đến nay việc nghiên cứu lectin từ rong biển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu

Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang Từ năm 2008 cho đến nay, các công trình nghiên cứu tại đây đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển khác nhau, thuộc 3 dòng: rong đỏ, rong nâu và rong xanh Kết quả cho thấy, hầu hết các loại rong biển đều có khả năng gây ngưng kết hồng cầu với ít nhất một loại hồng cầu từ động vật như thỏ, cừu, gà, ngựa,

và nhóm máu A, B, O của người Một số tính chất hóa sinh như liên kết carbohydrate, khoảng pH hoạt động, nhiệt độ hay khả năng ứng dụng của các lectin này cũng đang được nghiên cứu [5, 25, 28]

1.3.2 Cấu tạo của lectin từ rong biển

 Khối lượng phân tử của lectin từ rong biển

Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện di trên gel polyacrylamide, phương pháp siêu ly tâm và phương pháp quang phổ khối ion hóa phun điện tử (electron spray ionizatuon-mas spectrometry) khối lượng phân tử của khá nhiều dạng lectin đã được xác định Kết luận có thể dẫn ra ở đây là khối lượng phân

tử của lectin từ rong biển cũng có sự dao động khá lớn và lectin có nguồn gốc khác nhau thì khối lượng có thể giống nhau và khác nhau

Lectin có nguồn gốc từ rong biển có khối lượng phân tử nhỏ nhất là lectin của

Hypnea japonica thuộc ngành rong đỏ, khoảng 4,2 kDa Trong khi đó lectin có khối

lượng phân tử lớn nhất cũng thuộc rong biển Ptilota plumosa, gồm một chuỗi

polypeptide khoảng 170 kDa

Năm 1991, Rogers đã tinh chế lectin từ rong xanh Codium fragile và đã xác định

khối lượng phân tử của nó là 60 kDa, bao gồm 4 chuỗi polypeptide có cùng khối lượng

là 15 kDa cấu tạo nên [40] Dạng lectin này có điểm đẳng điện trong khoảng từ 3,8 đến 3,9 Bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, Jong Won Han và các cộng sự (2011) đã

xác định khối lượng phân tử của Bryopsis plumosa là 11,5 kDa, lectin này ở dạng đơn

phân [13]

Cho đến nay, có khá nhiều nghiên cứu công bố về khối lượng phân tử của lectin

và đã cho thấy mức độ biến đổi mạnh của chúng Tuy nhiên, so với khối lượng phân tử

của lectin từ thực vật bậc cao như lectin từ hạt đậu ngự (Canavalia ensiformis) là 108 kDa hay lectin từ động vật như sam biển Việt Nam (Achypleus tridentatus) có khối

lượng phân tử lên đến trên 700 kDa thì khối lượng phân tử của lectin từ rong biển lại khá thấp, phần lớn trong chúng dao động tập trung trong khoảng từ 15 đến 45 kDa Các nhà khoa học cho rằng chưa thể tìm thấy được mối liên hệ nào giữa khối lượng phân tử lectin và hoạt tính của nó Khối lượng phân tử của lectin không mang tính đặc trưng cho loài hay cá thể và cũng không phụ thuộc vào mức độ tiến hóa của loài hay cá thể đó [1]

 Cấu tạo phân tử lectin từ rong biển

Khác với các lectin từ thực vật bậc cao, hầu hết lectin từ rong biển tồn tại ở dạng monomer như các lectin từ rong Carrageenophyte, Eucheuma serra [19], Eucheuma

denticulatum [22], Kappaphycus alvarezii [23], Kappaphycus striatum [21] và có trình

tự 20 acid amin ở đầu N tương tự nhau (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Trình tự sắp xếp các axit amin đầu tận cùng N ở rong đỏ Kappaphycus

striatum [21] và các loài rong thuộc chi Eucheuma [29, 30]

(kDa)

Trình tự sắp xếp (20 axit amin đầu N)

lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau Ví dụ như lectin từ rong đỏ Vidalia obtusiloba

có cấu trúc dimer, trọng lượng của 2 chuỗi polypeptide lần lượt là 59,6 và 15,2 Da [39],

trong đó lectin từ rong xanh Codium fragile lại có cấu tạo tetramer với khối lượng mỗi

đơn phân đều là 15000 Da [40]

Về cơ chế hoạt động của lectin từ rong biển nói riêng đến sinh vật tự nhiên nói chung, các nhà khoa học đều thống nhất như sau: “Các trung tâm hoạt động của các phân tử lectin đều có khả năng liên kết các gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận (receptor) trên bề mặt màng tế bào Các liên kết sẽ được hình thành giữa các receptor trên bề mặt màng tế bào với các trung tâm hoạt động của lectin Nhờ các liên kết này

mà lectin đã kết dính các tế bào, tạo nên hiện tượng ngưng kết tế bào

Các dạng lectin khác nhau, khả năng liên kết với các receptor trên bề mặt tế bào cũng khác nhau Giống như enzyme, trung tâm hoạt động của lectin chỉ hoạt động khi

nó nằm trong một chỉnh thể thống nhất, hoàn chỉnh của cấu trúc phân tử Bất kì một tác nhân nào phá vỡ cấu trúc phân tử của lectin cũng đều làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của trung tâm này Chính vì vậy, hoạt động của lectin phụ thuộc chặt chẽ vào một

số tác nhân lý hóa của môi trường” [1]

1.3.3 Một số tính chất vật lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển

1.3.3.1 Tính tan và kết tủa

Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển hòa tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng Lectin có bản chất là protein nên chúng dễ bị kết tủa bởi một số tác nhân lý hóa của môi trường như: tác dụng với ethanol, acetone, của một số muối trung tính ở nồng độ cao đặc biệt

là ammonium sunphate

1.3.3.2 Sự tương tác của lectin từ rong biển với các loại đường và dẫn xuất của nó

Qua các thí nghiệm về khả năng liên kết với các dạng đường của lectin được tách chiết từ rong biển, người ta nhận thấy lectin từ rong biển ít liên kết với các loại đường đơn hay đường đa như ở thực vật bậc cao hay động vật mà ngược lại nó liên kết với các glycoprotein dạng N-glycan hay O-glycan như: Porcine stomach mucin, Transferrin, asialofetuin [34, 43]

Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kì quan trọng trong các nghiên cứu về lectin Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì có thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu về cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó [25] Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu Gần đây, dựa vào các loại đường

ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế nhiều loại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực lectin để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học

1.3.3.3 Khả năng gây ngưng kết tế bào

Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật và người Đây là dấu hiệu đặc trưng để nhận biết lectin Số lượng lectin có khả năng ngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nhóm máu là rất ít vì chúng đồng thời có thể gây ngưng kết với nhiều hồng cầu như: thỏ, cừu, gà, dê hay ngựa Theo tác giả Allen và Billantine, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có 90 loài chứa lectin đặc

Ptilota plumosa ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết hồng cầu máu A đã qua xử lý papain mà không thể ngưng kết vời

các nhóm máu người như O, B hay AB [40] Các lectin đặc hiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng

Theo Sharon (1989), lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người

và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi [42]

1.3.3.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ của lectin

 Ảnh hưởng của pH

Mỗi dạng lectin thường có pH thích hợp với hoạt độ của nó, đó là giá trị pH mà

ở đó hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái ổn định pH ở vùng axit và kiềm mạnh, hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển có khoảng pH thích hợp rất rộng, hầu hết pH từ 5 đến 9,

đặc biệt có một số loài rong như B Composite, D Versluysii hay V Fastigiata không

bị giảm hoạt độ trong khoảng pH từ 3 đến 9 [25]

 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Lectin có bản chất là protein và glycoprotein nên nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt

độ của chúng Hầu hết các lectin đều bị mất hoạt độ ở nhiệt độ cao Ở nhiệt độ cao, protein lectin bị biến tính không thuận nghịch Hiện tượng sốc nhiệt cũng có thể làm mất hoạt độ lectin

So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, hoạt độ của lectin từ rong biển khá ổn định với mức nhiệt độ khá cao Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính

ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong Pterocladiella capillacea cho thấy, hoạt độ vẫn

ổn định ở mức 60 oC trong 30 phút, 50% hoạt độ chỉ bị mất đi sau 30 phút ở mức nhiệt

độ là 70 oC và mất hoàn toàn ở 80 oC sau 10 phút [43] Thí nghiệm này cũng có kết quả tương đương với nhiều nghiên cứu của các tác giả khác khi khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển [39]

 Ảnh hưởng của một số nhân tố khác

Enzyme có khả năng tăng hoạt độ lectin Trong nhiều thí nghiệm, các hồng cầu được xử lý bằng các enzyme như trypsin, papain Ví dụ, xử lý hồng cầu nhóm máu O

bằng papain thì hoạt độ của lectin từ dòng rong xanh Ulva lactuca tăng lên 7 - 8 lần

thủy phân giới hạn một số protein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm phơi ra các nhóm carbohydrate của nó, vì vậy lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, dẫn đến hoạt độ lectin tăng lên

Cho đến nay, chưa có một công trình nào nghiên cứu đầy đủ về sự ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin Mặc dù theo kết quả nghiên cứu của Benevides và Fabio thì hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ 2 loại rong

đỏ Enantiocladia duperreyi và Vidalia obtusiloba phụ thuộc vào sự có mặt của các

cation hóa trị II là Ca2+ và Mn2+ [8, 39] Nhưng rất nhiều dẫn liệu khoa học gần đây cho thấy rằng, khác với lectin từ thực vật bậc cao, hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin

từ rong biển không bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại [17, 34]

1.4 Ứng dụng của lectin từ rong biển

Lectin từ rong biển đã và đang ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong đời sống Các ứng dụng đó có thể được tóm tắt như sau:

 Lectin trong huyết học

Sử dụng lectin để phân loại máu là ứng dụng sớm nhất và đến nay vẫn còn được

áp dụng rộng rãi Phương pháp xác định nhóm máu bằng lectin cho kết quả nhanh, chính xác mà không cần huyết thanh mẫu Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi lectin phải tinh khiết và có tính đặc hiệu cao

Việc sử dụng lectin từ rong biển để xác định nhóm máu cũng đã được sử dụng

trong nhiều năm nay Lectin từ rong Ptilota plumosa gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết hồng cầu máu A đã xử lý

papain mà không thể ngưng kết với các nhóm máu khác như A, B, O hay AB [40]

 Lectin trong tế bào học

Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng tế bào và những biến đổi trên bề mặt màng tế bào trong quá trình biệt hóa bệnh lý sự thay đổi thành phần carbohydrate trên bề mặt tế bào

Năm 1988, lectin được tinh sạch từ Codium tomentosum được sử dụng như một

công cụ để phát hiện sự có mặt của nhiều loại glycoprotein khác nhau mà thành phần lớn là N-acetyl-glucosamine

 Lectin trong thuốc bảo vệ thực vật và ngũ cốc

Lectin mà đặc biệt là lectin từ rong biển có khả năng kháng lại nhiều loại sâu bọ

và côn trùng có hại cho cây trồng vì chúng có khả năng liên kết với glycoprotein đường ruột và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tự chết

Bảng 1.2: Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng

Làm côn trùng chậm phát triển, giảm trọng lượng trứng và lượng trứng nở thành con

Fetuin, porcine stomach mucin

Lima at

al 2005 [35]

Gracilaria

ornata (rong

đỏ)

Callosobruchus maculatus

Làm côn trùng chậm phát triển

Fetuin, porcine stomach mucin

Leite at

al 2005 [34]

 Lectin trong y học

Lectin có tiềm năng rất lớn trong nhiều lĩnh vực Lectin được sử dụng như một công cụ chuẩn đoán có hiệu quả Dựa vào khả năng phân biệt và ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật, lectin từ rong biển được sử dụng kết hợp với các xét nghiệm thông thường khác để nâng cao giá trị chuẩn đoán và điều trị bệnh trên sinh vật biển

Dịch chiết lectin từ rong Eucheuma serra và Galaxaura marginata ức chế sự phát triển của vi khuẩn biển gây hại cho cá là Vibrio pelagius và Vibrio vulnificus, 2 loại vi khuẩn này gây bệnh ở cá [35] Lectin từ một số loại rong nâu như Fucus vesiculosus,

Dictyopteris membranacea, Fucus serratus có khả năng ngưng kết và ức chế sự phát

triển của các chủng nấm nhầy gây bênh như Candida guilliermondii

Lectin từ một số loại rong đỏ như Eucheuma serra [19], Kappaphycus alvarezii [15] hay Griffithsia sp [18] Có khả năng liên kết đặc hiệu với glycoprotein dạng high

manose N-glycan ở nồng độ rất thấp, đây là những glycoprotein có mặt chủ yếu trên bề mặt của màng tế bào HIV, do đó có thể kìm hãm hiện tượng nhiễm HIV và hạn chế được khả năng mắc bệnh [25]

Như vậy có thể thấy, lectin đã và đang được nghiên cứu để sử dụng trong chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm và rối loạn trao đổi chất, trong nghiên cứu sinh học và miễn

dịch, làm mitogen trong nuôi cấy tế bào với mục đích chữa bệnh, tăng năng suất trồng trọt, chăn nuôi và bảo quản lương thực [1]

 Lectin trong virus học

Gần đây, lectin từ rong biển đang được xem là nguồn sản phẩm tự nhiên phong

phú, có khả năng kháng virus mạnh mẽ Ví dụ như Griffithsia sp [18], Oscillatoria

agardhii (OAA) (Sato et al, 2007), Eucheuma serra (ESA-2) [19], Kappaphycus alvarezii [15] những lectin này cho thấy hoạt tính rất mạnh kháng lại virus HIV và những

virus khác Không giống như phần lớn các liệu pháp điều trị kháng virus hiện tại, những lectin có khả năng hoạt động qua sự ức chế chu kỳ sống của virus, ngăn chặn sự xâm nhập vào tế bào vật chủ của virus Thêm vào đó, những lectin này thường chịu được nhiệt độ cao, pH thấp, có khả năng liên kết với nhiều loại glycoprotein trên bề mặt của lớp vỏ virus Vì vậy, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu cơ bản và những ứng dụng của chúng trong tương lai

1.5 Phương pháp thu nhận lectin

1.5.1 Các kỹ thuật chiết lectin

Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiết xuất lectin ra khỏi các mô động vật hay vi sinh vật có thể thực hiện dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau như dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,15M, dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl

 Kỹ thuật kết tủa bằng muối

Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số dung dịch muối ở nồng độ cao và có thể hòa tan được trở lại Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị I, anion

đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2SO4…Các protein khác nhau được kết tủa ở nồng độ trung tính khác nhau Người ta sử dụng phương pháp này trong các quy trình chiết lectin

để cô đặc dung dịch protein cần tách

 Kết tủa phân đoạn bằng dung môi

Một số dung môi hữu cơ có thể dễ hòa tan trong như axeton, polyetylenglycol, ethanol làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng có thể bị kết tủa nhanh chóng Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này rất dễ gây biến tính protein, vì

 Thẩm tích

Phương pháp thẩm tích được tiến hành dựa trên nguyên lý màng bán thấm với đặc tính cho qua những phân tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phân tử lớn so với kích thước phân tử của màng Thẩm tích thường dùng để loại muối và những chất phân tử khác ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm tích

1.5.2 Các kĩ thuật tinh chế lectin

 Sắc ký trao đổi ion

Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích Tùy thuộc vào pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như DEAE- sephadex, CM- xenluloza, CM- trisacryl được sử dụng làm chất trao đổi anion Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm như CM-sephadex, CM- xenluloza, CM- trisacryl được sử dụng làm chất trao đổi cation Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi

Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định

 Sắc ký lọc gel

Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thước phân

tử Chất giá thường sử dụng là Sephadex Mỗi hạt Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp Có nhiều loại Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗ xốp khác nhau Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất có kích thước phân tử khác nhau Để tinh chiết lectin, người ta thường dùng loại Sephadex G -

đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ với lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là giải hấp phụ lectin khỏi cột ái lực

Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu: vùng biển Ninh Thuận

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công Nghệ Sinh Học Biển, Viện Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang, số 2 – Hùng Vương, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa

- Thời gian nghiên cứu: từ ngày 18/02/2017 đến ngày 03/06/2017

2.2 Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng

- Rong đỏ Gracilaria eucheumatoides thu ở vùng biển Ninh Thuận, sau khi thu

rong được giữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm Rong được xay nhỏ trong Nitơ lỏng

và cho vào các túi nilong (kích thước 25 x 35 cm), cho vào tủ đông -20 oC để bảo quản

- Máu thỏ, cừu và gà được cung cấp bởi Viện Vaccine Nha Trang Máu người A,

B và O do Bệnh Viện Đa Khoa Tỉnh Khánh Hòa cung cấp

2.2.2 Hóa chất

- BSA (Bovine serium albumin) (Đức)

- Enzyme Trypsin, Papain (Sigma – USA)

- Thuốc thử Folin (Merck-Đức)

- Hóa chất phân tích các loại: NaCl, CuSO4.5H2O, NaH2PO4, Na2HPO4,

(NH4)2SO4, NaOH, Na2CO3,…( Trung Quốc)

- Các loại đường và glycoprotein: D-glucose, D-mannose, D-galactose, rhamnose, L-fucose, D-xylose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine, N-acetyl-D-mannosamine, N-acetylneuraminic acid, Transferrin, Asialo-transferrin, Fetuin, Asialo-fetuin, Yeast mannan, Thyroglobulin, Bovine submaxillary mucin, Asialo-bovine submaxillary mucin, Porcine stomach mucin (Type III), Asialo- Porcine stomach mucin, Trypsin-treated Porcine stomach mucin (Sigma – USA)

L DEAEL sepharose Fast Flow (Pharmacia, UppsalaL Thụy Điển)

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.1: Các máy móc và thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu

STT Thiết bị, dụng cụ Model máy,

vật liệu, dung tích Xuất sứ

6 Khay 96 giếng đáy chữ V Polystyrene Greiner- Đức

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu [17]

 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu (HC) 2%

- Mẫu máu được rửa từ 3-5 lần Sau đó, được định mức lên 50 ml thể tích dung dịch đệm PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7,2) Huyền phù HC 2% được dùng như HC tự nhiên

- Hồng cầu xử lý trypsin được chuẩn bị như sau: 1/10 thể tích của dung dịch trypsin 0,5% (w/v) được cho vào huyền phù HC tự nhiên 2% (v/v) Hỗn hợp được ủ ở

37 oC trong 60 phút Sau khi ủ, hồng cầu được rửa bằng dung dịch đệm PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7,2) từ 3 đến 5 lần và hòa lại bằng đệm PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7,2), ta thu được dịch hồng cầu 2% đã xử lí enzyme

- Tiếp tục cho 25 µl hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin vào tất cả các giếng

- Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng Sau 1 giờ, đọc kết quả

 Đọc kết quả

- Kết quả âm tính: tất cả HC lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ

- Kết quả dương tính: HC trong giếng bị ngưng kết hơn 50%

 Đơn vị hoạt độ

Một đơn vị hoạt độ lectin hay 1 đơn vị hoạt độ ngưng kết hồng cầu (NKHC) viết tắt là HA (hemagglutinin assay) trên 1 ml chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch lectin còn có khả năng làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng Đơn vị (HU/ml)

 Hoạt độ lectin được xác định theo hai chỉ số:

- Hoạt độ tổng số (HĐTS): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất

định Đơn vị: HU

HĐTS = V 2 n Trong đó: V: tổng thể tích (ml)

n: số lần pha loãng

- Hoạt độ riêng (HĐR): là số đơn vị lectin có trong 1 mg protein Đơn vị:

HU/mg

HĐR = 𝐇Đ𝐓𝐒

𝐏𝐫𝐨𝐭𝐞𝐢𝐧 𝐭ổ𝐧𝐠

Trong đó: HĐTS : tổng số đơn vị hoạt tính

Protein tổng : tổng hàm lượng protein

- MAC (minimum agglutination concentration): là nồng độ protein nhỏ nhất có khả

năng gây ngưng kết HC đã được xử lý emzyme Đơn vị: (µg/ml)

MAC = 𝐇𝐚̀ 𝐦 𝐥ượ𝐧𝐠 𝐩𝐫𝐨𝐭𝐞𝐢𝐧

𝐇𝐀

Trong đó: HA: Hoạt độ ngưng kết hồng cầu

2.3.2 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951) [36]

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm 1951, dùng Albumin huyết thanh bò (BSA- Bovine serum albumin) làm chất chuẩn

 Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở phức chất Cu- protein khử hỗn hợp photphomolipden photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong phạm vi nhất định Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750 nm Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein cần phân tích

 Hóa chất

- Thuốc thử A: gồm Na2CO3 2% và NaOH 0,1 M

- Thuốc thử B: Dung dịch Sodium citrate 1% và CuSO4.5H2O 0.5%

- Dung dịch thuốc thử C: hỗn hợp của 2 dung dịch A: B theo tỉ lệ 50: 1 (yêu cầu pha trước khi sử dụng)

- Thuốc thử Folin: pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng

 Xây dựng đường chuẩn

Dung dịch gốc BSA nồng độ 1 mg/ml được pha loãng bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 80, 120, 160, 200 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn

Lấy chính xác 0,5 ml dịch chứa BSA với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch thuốc thử C, lắc đều để yên trong 20 phút Sau

đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút Mẫu trắng (ĐC) thay dịch chứa BSA bằng nước cất, các bước còn lại tiến hành tương tự Sau đó, đem so màu ở bước sóng

750 nm

Thực hiện thí nghiệm, xây dựng đường hồi quy Kết quả được xử lý và đồ thị được dựng bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2013

Hình 2.1: Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry

 Xác định nồng độ protein của các mẫu thí nghiệm

Lấy 0,5 ml dịch protein cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch thuốc thử C, lắc đều để yên trong 20 phút Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút Mẫu trắng (ĐC) thay dịch protein bằng nước cất, các bước còn lại tiến hành tương tự Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm

Kết quả được tính dựa vào đường chuẩn protein

2.3.3 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ rong biển

a Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát

- Dung môi chiết

- Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v)

- Thời gian chiết (giờ)

Sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose

Sắc ký lọc gel Sephacryl S-200

- Khả năng liên kết carbohydrate

Điện di SDS- PAGE

Lectin

b Giải thích quy trình

Mẫu rong sau khi thu về được rửa sạch, xay rong thành bột mịn bằng cối xay inox có bổ sung Nitơ lỏng, chia đều rong đã xay mịn thành các mẫu có khối lượng như nhau để chuẩn bị cho quá trình tách chiết và bảo quản trong tủ đông -20 oC

Cân 2 (g) rong đã cắt, xay nhỏ Tiến hành chiết lectin theo các thông số: nhiệt độ chiết là 4 oC, dung môi chiết, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v), thời gian chiết thích hợp Sau đó lọc, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ cặn lẫn trong dịch chiết, thu dịch trong chuẩn bị chờ quá trình tinh chế tiếp theo

Tiếp đến, quá trình tủa lectin được tiến hành bằng muối amonium sunfate (NH4)2SO4 nhiệt độ tủa là 4 oC và thời gian tủa là 6 giờ Tiến hành ly tâm thu tủa với tốc

độ 6000 vòng/ phút trong 30 phút để thu phần kết tủa Phần tủa được hòa tan trong đệm PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7,5) đến một thể tích nhất định trước khi thẩm tích bằng dung dịch đệm PB (0,02M, pH 7,5) ở 4 oC và để qua đêm Nhằm loại bỏ muối và các phân tử nhỏ không phải là lectin ra khỏi dung dịch Dịch tủa sau thẩm tích được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu phần dịch trong, đây chính là chế phẩm lectin

Tiếp tục tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose