Hoàn thiện công đoạn tinh chế lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ (tagetes erecta l )

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu chiết tách và tinh chế lutein từ hoa CVT nhằm ứng dụng làm nguyên liệu sản xuất chất màu thực phẩm.. Một trong những nguyên nhân là do hiệu

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÙI THỊ CỦA

HOÀN THIỆN CÔNG ĐOẠN TINH CHẾ LUTEIN

TÁCH CHIẾT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ (Tagetes erecta L.)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học)

Nha Trang – Năm: 2017

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÙI THỊ CỦA

HOÀN THIỆN CÔNG ĐOẠN TINH CHẾ LUTEIN

TÁCH CHIẾT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ (Tagetes erecta L.)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

TS GVC Hoàng Thị Huệ An

Nha Trang – Năm: 2017

PHIẾU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG ĐỀ TÀI

Họ và tên sinh viên: Bùi Thị Của

Lớp: 55CNHH

Chuyên ngành: Công nghệ kỹ thuật hóa học

Đề tài: “Hoàn thiện công đoạn tinh chế lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.).”

Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo:

Hiện vật:

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

Kết luận

Điểm phản biện

Bằng số Bằng chữ

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017

CÁN BỘ PHẢN BIỆN

(Ký và ghi rõ họ tên)

_

Điểm phản biện

Bằng số Bằng chữ

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Ký và ghi rõ họ tên)

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên: Bùi Thị Của

Lớp: 55CNHH

Chuyên ngành: Công nghệ kỹ thuật hóa học

Đề tài: “Hoàn thiện công đoạn tinh chế lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.).”

Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo:

Hiện vật:

NHẬN XÉT

Kết luận

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện

Các số liệu và kết luận nghiên cứu trình bày trong luận văn chưa từng được công bố ở các nghiên cứu khác

Sinh viên thực hiện

BÙI THỊ CỦA

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực Phẩm cùng các Giảng viên Bộ môn Công nghệ Kỹ thuật Hóa học đã hết lòng giảng dạy và truyền đạt những kiến thức và kĩ năng cần thiết cho tôi trong suốt thời gian học tại trường, trang bị cho tôi hành trang tri thức, vững tin bước vào đời

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và các cán bộ Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất về cơ sở vật chất, trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành tốt nội dung đề tài

Đặc biệt, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến

TS Hoàng Thị Huệ An đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết giúp tôi nâng cao kiến thức chuyên ngành, hướng dẫn tôi tiếp cận những phương pháp nghiên cứu hiện đại, rèn luyện kĩ năng thực nghiệm, đồng thời hỗ trợ vật tư và phương tiện nghiên cứu cho tôi

Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Do kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm nghiên cứu cũng như kĩ năng soạn thảo văn bản khoa học còn hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên để tôi có thể hoàn thiện báo cáo tốt nghiệp

Nha Trang, ngày 04 tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện

BÙI THỊ CỦA

Lớp 55CNHH

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về hoa cúc vạn thọ 4

1.1.1 Tên gọi 4

1.1.2 Nguồn gốc - Phân loại 4

1.1.2.1 Nguồn gốc 4

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng chung 5

1.1.4 Ứng dụng 6

1.2 Tổng quan về lutein 7

1.2.1 Cấu tạo phân tử của lutein 7

1.2.2 Tính chất vật lý và hóa học của lutein 8

1.2.2.1 Tính chất vật lý 8

1.2.2.2 Tính chất hóa học 9

1.2.3 Chức năng sinh học của lutein 9

1.2.4 Ứng dụng của lutein 10

1.2.5 Các nguồn lutein tự nhiên 12

1.3 Tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài 13

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.2 Hóa chất 20

2.3 Dụng cụ- Thiết bị 21

2.3.1 Dụng cụ 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Phương pháp thu oleoresin từ hoa CVT 22

2.4.2 Nghiên cứu hoàn thiện công đoạn xà phòng hóa lutein ester dựa theo phương pháp Swaminathan (2009) 24

2.4.2.1 Cách tiến hành xà phòng hóa: 24

2.4.2.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng hỗn hợp xà phòng hóa: 25

2.4.3 Nghiên cứu phương pháp tinh chế lutein thô 25

2.4.3.1 Xác định chế độ rửa lutein thô bằng nước cất nóng 25

2.4.3.2 Phương pháp tinh chế lutein với nước cất và dung môi hữu cơ 27 2.4.4 Thử nghiệm quy trình- Đánh giá chất lượng sản phẩm 29

2.4.4.1 Thử nghiệm quy trình 29

2.4.4.2 Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả xà phòng hóa theo phương pháp Swaminathan (2009): 31

3.2 Kết quả nghiên cứu tinh chế lutein thô bằng phương pháp rửa 32

3.2.1 Chế độ tối ưu rửa lutein thô bằng nước cất nóng 32

3.2.2 Chế độ rửa lutein thô bằng dung môi hữu cơ 38

3.3 Đề nghị quy trình thu nhận lutein thô từ lutein oleoresin 40

3.4 Thử nghiệm quy trình- Đánh giá chất lượng sản phẩm 43

3.4.1 Thử nghiệm quy trình 43

3.4.2 Đánh giá chất lượng sản phẩm 43

3.4.2.1 Phân tích một số chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm 43

3.4.2.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm 45

3.5 Đánh giá hiệu quả kinh tế sản phẩm lutein tinh trong phòng thí nghiệm 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHT Butylated Hydroxyltoluene Chất chống oxy hoa BHT

DAD Diode-Array Detector Detector dãy diode

GC-MS Gas Chromatography-Mass

Spectrometry

Phương pháp sắc ký ghép khối phổ

HPLC High performance liquid

chromatography

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

LDL Low density lipoprotein Chất béo có tỉ trọng thấp LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

R2 Correlation coefficient Hệ số tương quan

ROS Reactive Oxygen Species Các loại oxy hoạt tính

SKBM Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng

UV-Vis Ultraviolet-visible Tử ngoại-khả kiến

max Wavelength of maximum

absorption

Bước sóng hấp thụ cực đại

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Độ tan của lutein tự do trong một số dung môi hữu cơ 8

Bảng 2.1 Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa chế độ rửa lutein thô theo mô hình bậc II phương án CCF 26

Bảng 3.1 Kết quả SKBM hỗn hợp phản ứng theo thời gian 31

Bảng 3.2 Kết quả tối ưu hóa điều kiện rửa lutein thô bằng nước cất nóng 32

Bảng 3.3 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của điều kiện rửa 33

Bảng 3.4 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của điều kiện rửa 34

Bảng 3.5 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng 35

Bảng 3.6 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng 35

Bảng 3.7 Tiên đoán chế độ tối ưu rửa lutein thô bằng nước cất nóng 38

Bảng 3.8 Kết quả thử nghiệm tinh chế lutein thô bằng dung môi hữu cơ 40

Bảng 3.9 Khối lượng nguyên liệu và các sản phẩm thu được từ quy trình 43

Bảng 3.10 Một số thành phần trong sản phẩm lutein tinh chế 44

Bảng 3.11 Kết quả đo hoạt tính chống oxy hóa của lutein tinh 46

Bảng 3.12 Ước tính chi phí nguyên vật liệu để tinh chế lutein từ mẻ 11 kg hoa CVT tươi 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hoa cúc vạn thọ châu Mỹ (Tagetes erecta L.) 4

Hình 1.2 Cấu tạo phân tử lutein dạng all-trans 7

Hình 1.3 Zeaxanthin (3,3’-diol , ’-caroten) 8

Hình 1.4 Sơ đồ quy trình tổng quát thu nhận lutein từ hoa CVT 13

Hình 2.1 Hoa cúc vạn thọ trồng để nghiên cứu ở huyện Diên Khánh (Khánh Hòa) 20

Hình 2.2 Sơ đồ thu oleoresin từ hoa CVT tươi 22

Hình 3.1 Kết quả SKBM hỗn hợp phản ứng theo thời gian 31

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chế độ rửa đến hàm lượng carotenoid tổng số và hiệu suất thu hồi lutein tinh 37

Hình 3.3 Ảnh hưởng của số lần rửa bằng EtOH-H2O 1/1 39

Hình 3.4 Mẫu sau khi rửa bằng EtOH 1/1 (4 lần) và EtOH (1 lần) 39

Hình 3.5 Ảnh hưởng của số lần rửa bằng Hx đến độ sạch của lutein 39

Hình 3.6 Ảnh hưởng của số lần rửa bằng EtOH đến độ sạch của lutein 39

Hình 3.7 Quy trình xà phòng hóa và tinh chế lutein thô 42

Hình 3.8 Sản phẩm lutein tinh chế thu được bằng 2 phương pháp 45

Hình 3.9 Đường chuẩn tổng năng lực khử Fe(III) của vitamin C 45

Hình 3.10 Đường chuẩn hoạt tính chống oxy hóa tổng của vitamin C 46

MỞ ĐẦU

Màu sắc là yếu tố đầu tiên của thực phẩm hấp dẫn người tiêu dùng Do

đó, các nhà chế biến thực phẩm thường sử dụng chất màu để nhuộm màu cho thực phẩm nhằm khôi phục lại màu sắc vốn có của nó đã bị mất đi trong quá trình chế biến

Hiện nay, có hai loại chất màu tự nhiên đang được sử dụng trong chế biến thực phẩm, đó là chất màu tổng hợp (hay chất màu nhân tạo) và chất màu

tự nhiên

Chất màu tổng hợp là các thuốc nhuộm azo được tổng hợp bằng con đường hóa học Chúng có ưu điểm là rẻ tiền, có cường độ màu mạnh, bền màu, dễ tan trong nước, dễ sử dụng Trước đây, phẩm màu nhân tạo được sử dụng rất phổ biến và thiếu kiểm soát ở một số nước, đặc biệt là các nước kém phát triển Hiện nay, một số chất màu hữu cơ tổng hợp (đặc biệt là thuốc nhuộm azo) bị hạn chế sử dụng do người ta nghi ngại về những ảnh hưởng không tốt của nó đối với sức khỏe con người Chẳng hạn, một số nghiên cứu

đã phát hiện những enzyme trong ruột non có khả năng xúc tác cho phản ứng khử các phẩm màu azo để sinh ra các tác nhân gây ung thư Một nghiên cứu của Đại học Southampton (Anh Quốc) năm 2007 đã cho thấy có mối liên hệ giữa việc tiêu thụ một số đồ uống chứa 6 loại phẩm màu tổng hợp gồm màu cam Sunset Yellow FCF (E110), màu vàng chanh Quinoline Yellow (E104)

và Tartrazine (E102), màu đỏ Carmoisine (E122), Allura Red (E129) và đỏ dâu tây Ponceau 4R (E124) với chất bảo quản sodium benzoat với sự rối loạn hành vi của trẻ em (mất khả năng tập trung, tăng động, …) [21] Vì vậy, hiện nay chỉ có một số ít chất màu tổng hợp được các tổ chức quản lý an toàn thực phẩm quốc gia cho phép sử dụng mới được dùng làm chất màu thực phẩm và liều lượng sử dụng phải ở dưới giới hạn cho phép

Chất màu tự nhiên là những chất màu được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu động - thực vật trong tự nhiên Chúng có ưu điểm là không độc, tạo ra màu sắc đẹp cho sản phẩm, đồng thời chúng lại có mùi, vị gần giống như nguồn tự nhiên của chúng Ngoài ra, một số chất màu tự nhiên còn có họat tính sinh học tốt với sức khỏe (như có khả năng chống oxy hóa, tăng cường sức đề kháng của cơ thể…) Do vậy, xu hướng hiện nay của thị trường

là sử dụng chất màu tự nhiên để thay thế cho các chất màu tổng hợp trong chế biến thực phẩm

Một trong số chất màu tự nhiên được chú ý gần đây là lutein Đây là một loại sắc tố carotenoid có màu vàng – cam thường có trong nhiều loài thực vật như súp lơ xanh, rau spina, rau ngót, vi tảo,… Đặc biệt, cúc vạn thọ châu Mỹ

(Tagetes erecta L.) là nguồn nguyên liệu giàu lutein nhất hiện nay: cánh hoa

chứa khoảng 1,6 g carotenoid tổng số/kg (tính theo trọng lượng khô), trong đó trên 95% là lutein [12] Lutein được xem là sắc tố tự nhiên có tiềm năng ứng dụng lớn trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm do không chỉ

có màu vàng sáng đẹp mà còn có tác dụng chống oxy hóa, chống lão hóa, ngăn ngừa bệnh thoái hóa điểm vàng, ngăn ngừa bệnh tim mạch và một số bệnh ung thư, đặc biệt là giảm nguy cơ mù lòa ở người cao tuổi do thoái hóa điểm vàng [19], [21], [23] Chính vì vậy, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chiết tách và tinh chế lutein từ hoa cúc vạn thọ nhằm ứng dụng làm nguyên liệu sản xuất chất màu thực phẩm

Ở nước ta, với khí hậu gần như nắng nóng quanh năm, rất lý tưởng cho việc phát triển các vùng nguyên liệu cúc vạn thọ ứng dụng trong công nghiệp hóa dược và thực phẩm Lutein cũng đã được Bộ Y tế đưa vào danh mục các chất màu thực phẩm được phép sử dụng từ năm 2012 [22] Tuy nhiên, lutein hiện vẫn đang được nhập khẩu với giá khá đắt (lutein tinh khiết 90% khoảng

8 – 11 triệu VND/kg Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất lutein tinh từ hoa CVT

nhằm phục vụ nhu cầu trong nước là rất cần thiết

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu chiết tách và tinh chế

lutein từ hoa CVT nhằm ứng dụng làm nguyên liệu sản xuất chất màu thực

phẩm TS Hoàng Thị Huệ An và cộng sự (2014) đã thực hiện đề tài

“Xây dựng quy trình công nghệ quy mô phòng thí nghiệm thu nhận lutein từ

hoa cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.) ứng dụng làm chất màu thực phẩm” [2]

Kết quả đã thu nhận được sản phẩm lutein đạt độ tinh khiết trên 90% Tuy

nhiên, theo tính toán sản phẩm có giá thành khá cao (khoảng 16,5 triệu vnđ/kg

khi sản xuất từ nguyên liệu tươi và 8,5 triệu vnđ/kg khi sản xuất từ nguyên

liệu khô) Một trong những nguyên nhân là do hiệu suất của giai đoạn xà

phòng hóa lutein este để thu lutein tự do và quá trình tinh chế lutein thô để thu

sản phẩm tinh chưa cao Ngoài ra, trong giai đoạn tinh chế lutein thô tác giả

đã sử dụng hexan và metanol để rửa lutein thô loại bỏ tạp chất, tuy dư lượng

các dung môi trên trong sản phẩm dưới mức cho phép nhưng có thể gây lo

ngại về tồn dư metanol đối với người tiêu dùng Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải

nghiên cứu nâng cao hiệu suất của công đoạn xà phòng hóa lutein este và tinh

chế lutein thô để có thể thu được sản phẩm lutein an toàn hơn và có giá thành

chấp nhận được Đó là lý do đồ án “ Hoàn thiện công đoạn tinh chế lutein

tách chiết từ hoa cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.)” được thực hiện

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Cho phép đề xuất phương pháp xà phòng hóa lutein este đạt hiệu suất

cao hơn và tạo ra sản phẩm lutein tinh an toàn hơn cho người sử dụng

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Là cơ sở cho việc ứng dụng sản xuất lutein từ nguồn nguyên liệu CVT

trong nước, phục vụ cho công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về hoa cúc vạn thọ

1.1.1 Tên gọi

- Tên tiếng Việt: Cúc vạn thọ

- Tên tiếng Anh: Marigold

- Tên khoa học: Tagetes spp

Hình 1.1 Hoa cúc vạn thọ châu Mỹ (Tagetes erecta L.)

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái

Cúc vạn thọ là loại cây thân thảo, mọc đứng cao 0,6 – 1,0 m, chia nhiều

cành Hoa mọc đơn độc hoặc tụ họp, màu vàng hay vàng cam Đặc điểm hình

thái của CVT tùy theo giống

Có 3 giống CVT chính là:

a) Cúc vạn thọ cao:

Tên khoa học: Tagetes erecta L

Tên tiếng Anh: African Marigold; American Marigold; Aztec Marigold Cây cao 60 - 75 cm, cho hoa lớn có đường kính từ 8 - 12 cm Hoa màu vàng nghệ và vàng hoàng yến, trong đó chứa nhiều sắc tố như 2-cryptoxanthin, antheraxanthin, lutein,…

b) Cúc vạn thọ lùn:

Tên khoa học: Tagetes patula

Tên tiếng Anh: French Marigold

Cây thấp 30 - 40 cm, cho hoa nhỏ có nhiều màu khá đẹp nên thường được trồng để trang trí đường phố Trong hoa CVT lùn có thêm một số hợp chất khác như patulitrin, rubichrome, rubixanthin, violaxanthin…

c) Cúc vạn thọ chanh

Tên khoa học: Tagetes tenuifolia; Tagetes signata

Tên tiếng Anh: Lemon Marigold

Đây là một loại đặc biệt, có nguồn gốc từ Arizona (Mỹ) Hoa nhỏ có mùi chanh, màu vàng cam, nở quanh năm, nhất vào mùa đông xuân

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng chung

Hoa không kén đất trồng thích hợp nhất là đất thịt nhẹ, nhưng nếu là đất cát pha, đất sét pha, đất có lẫn sỏi đá,…cây hoa này vẫn sống được Điều đòi hỏi là đất phải cao ráo, đủ ẩm và không bị ngập nước Tốc độ sinh trưởng nhanh, là cây mọc hàng năm Gieo hạt thì cây sẽ ra hoa sau 70 - 75 ngày, cây giâm ngọn thì phát triển và ra hoa sau 25-30 ngày Có thể trồng hoa quanh năm, nhưng vụ chính là vào dịp Tết Nguyên Đán [20]

1.1.4 Ứng dụng

Trong đời sống:

CVT thường được sử dụng làm trang trí đường phố, lễ hội và thờ cúng Ngoài ra, cây CVT còn được sử dụng như một dược phẩm chữa bệnh Lá và hoa được dùng trong điều trị các bệnh về đường tiêu hóa, kích thích tuần hoàn máu Hoa CVT có chứa nhiều vitamin C, protein và flavonoid [23] Trong dân gian Trung Quốc cũng có một số bài thuốc sử dụng hoa CVT trị bệnh (đau răng, đau mắt, ho gà, khô mắt, mỏi mắt) Tại Ấn Độ, lá và hoa CVT dùng đắp trị mụn nhọt, nước ép từ lá trị đau sưng tai Hoa trị bệnh mắt, loét bao tử, thanh lọc máu cho cơ thể [17]

Một số loài hoa CVT còn được dùng trong các công thức chế biến thức

ăn tại châu Mỹ

Trong chăn nuôi [8]:

Carotenoid chiết xuất từ hoa CVT được sử dụng để bổ sung vào thức ăn nuôi tôm hay cá hồi giúp tạo màu cam cho tôm cá

Nghiên cứu tại Đại Học Universidad Autonoma Iztapalapa, Mexico (1996) đã so sánh tác dụng tạo màu của dịch chiết hoa CVT và astaxanthin tổng hợp pha trộn trong thực phẩm nuôi tôm trắng

Metropolitana-(Panaeus vannamei) Sau 14 ngày cho ăn, tôm nuôi bằng dịch chiết vạn thọ

có màu vàng của thịt đẹp hơn astaxanthin gấp nhiều lần Kết quả cũng cho thấy các carotenoid trong hoa CVT như lutein và zeaxanthin đã được chuyển biến thành astaxanthin trong cơ thể tôm [15]

Trong y học:

Cúc vạn thọ là một trong những cây thuốc có giá trị, có tác dụng bảo vệ chống lại sự phát triển của ung thư, ức chế các tế bào khối u, bảo vệ chống lại các tác dụng phụ do hóa trị và xạ trị, có hoạt tính kháng viêm, chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch và kháng virus [13]

Hoạt chất có giá trị y học quan trọng nhất trong hoa CVT là lutein, nó có khả năng ngăn ngừa các triệu chứng thoái hóa điểm vàng, cải thiện thị lực, phòng và hỗ trợ điều trị bệnh đục thủy tinh thể ở những người cao tuổi

Trong công nghiệp mỹ phẩm

Hoa CVT có chứa lutein ester có tác dụng chống oxy hóa mạnh, có khả năng hấp thụ tia cực tím và ánh sáng xanh, bảo vệ da và làm đẹp da do đó lutein cũng được ứng dụng làm kem dưỡng da, kem chống nắng, son dưỡng môi,…

1.2 Tổng quan về lutein

1.2.1 Cấu tạo phân tử của lutein

Lutein là một loại sắc tố carotenoid có màu vàng cam – dẫn xuất diol của α- β caroten – có công thức phân tử C40H56O2 (khối lượng phân tử 568,88) [8] Trong phân tử nó có chứa 2 vòng đầu mạch (một vòng - và một vòng α-ionone) [11] và chuỗi C40 isoprenoid cơ bản chung cho tất cả các carotenoid [21] Mặc dù chuỗi liên kết đôi có mặt trong lutein có thể tồn tại ở

3,3’-cấu hình cis hoặc trans, nhưng trong tự nhiên phần lớn lutein tồn tại ở 3,3’-cấu hình trans như trong hình 1.2

Hình 1.2 Cấu tạo phân tử lutein dạng all-trans

Các đồng phân cis kém bền và có hoạt tính chống oxy hoá kém hơn đồng phân all-trans Do vậy, việc xử lý nguyên liệu, tách chiết, tinh chế lutein cần

tiến hành trong tối, ở nhiệt độ càng thấp càng tốt để hạn chế quá trình chuyển

đồng phân trans thành dạng cis

Ngoài ra, trong tự nhiên cũng tồn tại một dạng đồng phân khác của lutein

là zeaxanthin (Hình 1.3)

HO

OH

Hình 1.3 Zeaxanthin (3,3’-diol , ’-caroten)

1.2.2 Tính chất vật lý và hóa học của lutein

1.2.2.1 Tính chất vật lý

Lutein tinh thể ở dạng bột chảy tự do có màu đỏ cam Lutein kết tinh ở dạng tinh thể hình kim, khối lăng trụ đa diện, dạng lá hình thoi với điểm nóng chảy 190 – 193oC

Lutein có độ phân cực thấp, không tan trong nước nhưng tan trong một

số dung môi hữu cơ có độ phân cực trung bình (tetrahydrofuran, cloroform, xyclohexanon, etyl ete, dimetylformamit, dimetylsulfoxit, diclorometan, axeton, axetat etyl) và kém tan trong dung môi phân cực (etanol, metanol, axetonitril) hay không phân cực (hexan, xyclohexan)

Bảng 1.1 Độ tan của lutein tự do trong một số dung môi hữu cơ

Dung môi Độ tan

Xyclohexanon 4000 Etyl axetat 800 Metanol 200 Etyl ete 2000 Diclorometan 800 Axetonitril 100 Metyl t-butyl ete 2000 Benzen 600 Xyclohexan 50

Phân tử lutein có mạch nối đôi liên hợp dài với 8 đơn vị isoprenoid nên

có khả năng hấp thụ mạnh ánh sáng màu xanh (max = 445 nm) Do đó, dung dịch lutein có màu vàng (nếu ở nồng độ thấp) hay màu cam đỏ (nếu ở nồng độ cao) [12] Tuy nhiên, cực đại hấp thụ này thay đổi ít nhiều tùy theo dung môi

được sử dụng [5], [12]

1.2.2.2 Tính chất hóa học

Lutein rất nhạy cảm đối với ánh sáng, nhiệt, tác nhân oxy hóa, các ion kim loại và acid nhưng bền vững trong môi trường kiềm Tuy nhiên, lutein trong các mô động vật thường ở dạng liên kết với các acid béo, lipid, lipoprotein,… nên bền hơn lutein dạng tự do

Nhóm hydroxyl ở hai đầu phân tử lutein hoạt động mạnh, dễ dàng tham gia các phản ứng oxy hóa nên lutein có hoạt tính chống oxy hóa khá mạnh, có khả năng hấp thụ và làm giảm sự nguy hại của các gốc tự do gây ra Một số nghiên cứu cho thấy khi cung cấp một lượng lutein vừa đủ trong võng mạc mắt thì gốc tự do gây hại ở mức thấp nhất [16]

Lutein tự do dễ bị oxy hóa nên cần bảo quản trong khí trơ hay chân không, bảo quản ở nhiệt độ thấp, đậy kín, tránh ánh sáng mặt trời [7]

1.2.3 Chức năng sinh học của lutein

Phần lớn chức năng sinh học của chất màu lutein đều liên quan đến khả năng hấp thụ ánh sáng, khả năng dễ bị oxy hóa và khả năng bắt giữ các gốc tự

do của phân tử lutein [15]

Khả năng hấp thụ ánh sáng

Lutein có khả năng hấp thụ tia tử ngoại và tia sáng xanh trong dải bức xạ khả kiến, do đó có khả năng bảo vệ da, mắt khỏi tác hại của các bức xạ này,

ngăn ngừa ung thư da, thoái hóa điểm vàng [15]

Hoạt tính chống oxy hóa

Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng lutein có khả năng bảo vệ cơ thể

khỏi những chứng bệnh hiểm nghèo như các bệnh về mắt, ung thư, bệnh tim mạch, … Người ta cho rằng tác dụng này nhờ vào khả năng chống oxy hóa và bắt giữ các gốc tự do sinh ra trong tế bào của các phân tử lutein Các loại oxy hoạt tính (ROS: Reactive oxygen species) ở trong tế bào và mô có thể gây tác hại đến DNA, protein, cacbohydrat và lipit Sự gây hại này được kiểm soát bởi lutein tự do do nó có khả năng khử các chất oxy hóa và dọn sạch các gốc

tự do Khả năng chống oxy hóa của lutein có thể được giải thích bởi cấu trúc hóa học chứa chuỗi polyen liên hợp của nó Các chất này không có trong cơ thể, chỉ có trong các mô hình thí nghiệm Đặc biệt, lutein có hai nhóm hydroxyl ở 2 vòng đầu mạch nên có tính phân cực mạnh hơn so với β-caroten, lycopen,… do đó nó có khả năng thâm nhập tốt hơn qua màng lipit vào sâu bên trong phần nguyên sinh chất ưa nước của tế bào Vì vậy, lutein có hoạt

tính chống oxy hóa mạnh hơn các caroten

1.2.4 Ứng dụng của lutein

Trong công nghiệp thực phẩm

Lutein được sử dụng như một phụ gia tạo màu thực phẩm hay bổ sung vào thực phẩm như một vi chất dinh dưỡng

Lutein có khả năng tạo màu vàng cam rất đẹp nên có thể dùng làm chất

màu thực phẩm Lutein tách chiết từ hoa CVT châu Mỹ (Tagetes erecta L.)

được các Cục Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm (viết tắt là FDA: Food and Drug Agency) ở Canada, EU, Úc và New Zealand cho phép sử dụng như chất tạo màu vàng tự nhiên (mã số E161b) cho nhiều loại thực phẩm như vỏ ngoài của giò chả, các thành phẩm từ thịt gà, sữa chua có hoa quả, bánh nướng, nước giải khát, nước ép trái cây, ngũ cốc điểm tâm, kẹo cao su, kẹo cứng, các sản phẩm từ sữa, trứng, thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ mới biết đi, chất béo

và dầu, nước thịt, nước sốt và súp hỗn hợp [6], [7]

Trong chăn nuôi

Carotenoid, trong đó có lutein, là những nguồn sắc tố chính quyết định đến màu sắc của cá nuôi (cá cảnh, cá hồi…) Điều kiện nuôi như thức ăn, môi trường sống không tốt sẽ làm màu sắc cá cảnh nhạt đi, kém hấp dẫn người mua Cá giống như các động vật khác không tự tổng hợp carotenoid mà cần phải được cung cấp qua chế độ dinh dưỡng hàng ngày Vì vậy, thường xuyên cho cá ăn thức ăn bổ sung lutein sẽ làm tăng sắc tố trên da cá và cơ thịt cá [18]

Ngoài ra, lutein còn được dùng làm chất phụ gia trong chế biến thức ăn chăn nuôi gia cầm để tạo màu vàng hấp dẫn cho da và lòng đỏ trứng gà

Trong công nghiệp dệt nhuộm

Hiện nay, ngành công nghiệp dệt may sử dụng quá nhiều thuốc nhuộm tổng hợp, ước tính khoảng 10 triệu tấn/năm Việc sản xuất và sử dụng chất màu tổng hợp làm thải ra môi trường một lượng chất thải màu lớn, ảnh hưởng nghiêm trọng và nguy hiểm tới sức khỏe và làm xáo trộn cân bằng sinh thái của thiên nhiên Kể từ giữa những năm 1980, các doanh nghiệp nhỏ đã bắt đầu xem xét đến khả năng sử dụng các loại chất màu tự nhiên để nhuộm màu vải thay cho thuốc nhuộm tổng hợp Lutein cũng đang được quan tâm sử dụng

trong ngành dệt nhuộm do nó có màu vàng rất đẹp [3]

thường Lutein là chất ức chế khối u Lutein đã được chứng minh có tác dụng làm giảm nguy cơ mắc một số bệnh ung thư (ung thư vú, cổ tử cung, gan,

phổi)

Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy lutein có thể giúp duy trì sức khỏe tim mạch do có khả năng ngăn chặn sự gia tăng hàm lượng và sự bám dính của cholesteol xấu (LDL) vào thành mạch máu, ức chế sự xơ vữa động mạch,

do đó có khả năng ngăn ngừa các bệnh tim mạch, đột quỵ Lutein là chất ức chế tắc nghẽn mạch máu, các bệnh tim mạch (như nhồi máu cơ tim), là chất

ức chế viêm khớp thậm chí có thể giúp giảm đau viêm xương khớp

Trong công nghiệp mỹ phẩm

Dưới tác dụng của tia cực tím các gốc tự do được hình thành bên trong

da và có thể gây hại cho tế bào Nhờ khả năng chống oxy hóa và bắt giữ các gốc tự do, lutein có thể bảo vệ làn da khỏi bị tổn thương bởi tia cực tím, do đó

có khả năng ức chế ung thư da Việc thử nghiệm một số loại kem chống nắng

có chứa lutein hay lutein este (được hòa tan cùng với các loại dầu thảo dược

và các hợp chất không no) đã cho thấy lutein có thể dễ dàng thâm nhập vào da

và cho hiệu quả chống nắng tốt

1.2.5 Các nguồn lutein tự nhiên

Nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu lutein nhất hiện nay là hoa cúc vạn thọ

châu Mỹ (Tagetes erecta L.) Do đó, cúc vạn thọ được trồng phổ biến ở nhiều

nước trên thế giới như Peru, Ấn Độ, Trung Quốc, Mexico,… để cung ứng nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất lutein este và lutein tự do [2]

Ngoài ra, các loại thực phẩm chứa nhiều lutein có thể kể đến như cải spina, súp lơ xanh, cải xoăn, bắp, trái kiwi Lutein tập trung ở rau súp lơ xanh

và cải spina nhiều gấp 5 lần so với β-caroten Tuy nhiên, hàm lượng lutein trong các loại rau này ít hơn nhiều so với trong hoa CVT (ở rau cải xoăn thấp

hơn 10 lần, ở cải spina thấp hơn 20 lần) [2] Bột ngô và huyết tương của

người cũng chứa một lượng nhỏ đồng phân cis-lutein

Đặc biệt, lutein là carotenoit có nhiều trong lòng đỏ trứng gà (nhất là loại

gà được nuôi bằng hoa CVT có thể chứa đến 60% lutein trong tổng hàm lượng carotenoit của nó) Tuy trứng chứa ít lutein hơn so với các loại rau nhưng lutein từ trứng được hấp thụ tốt hơn từ cải spina hoặc từ các viên nang

bổ sung lutein [2]

1.3 Tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các quy trình thu nhận lutein tự nhiên thường qua các công đoạn sau đây:

- Chiết lutein este từ nguyên liệu hoa CVT bằng dung môi thích hợp (thường dùng hexan) và cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp để thu sản phẩm dầu nhựa chứa lutein este (gọi là lutein oleoresin)

- Thủy phân lutein este để thu lutein tự do (lutein thô)

- Tinh chế lutein thô để thu lutein tinh

Hình 1.4 Sơ đồ quy trình tổng quát thu nhận lutein từ hoa CVT

Lutein thô

Lutein oleoresin Hoa CVT

Lutein

Chiết – Cô đặc

Tinh chế Thủy phân lutein ester

Quá trình thủy phân lutein este thường được thực hiện bằng phương pháp hóa học, tức tiến hành phản ứng xà phòng hóa (thường dùng KOH trong dung môi hữu cơ) để cắt đứt liên kết este giữa các nhóm –OH trong phân tử lutein với các acid béo Sau khi phản ứng kết thúc, thêm nước cất vào hỗn hợp xà phòng hóa để tinh thể lutein tách ra Lọc lấy lutein tinh thể (lutein thô,

có nhiều tạp chất) rồi tinh chế bằng cách rửa bằng nước cất nóng hay bằng dung môi hữu cơ

Sau đây là một số quy trình xà phòng hóa và tinh chế lutein đã được sử dụng:

- Khachik, F (1995) [9] đã nghiên cứu xà phòng hóa oleoresin thương

mại chiết xuất từ hoa CVT bằng KOH để thu nhận lutein tự do tinh thể Dịch

xà phòng hóa được đồng thể hóa trong dung dịch nước - etanol 2,3:1 (v/v) ở 5

- 100C trong 30 phút Lọc lấy lutein tinh thể rồi rửa bằng nước cất đến khi dịch rửa không màu và pH gần như trung tính, sau đó rửa bằng etanol lạnh (0- 50C), rồi bằng hexan Lúc này thu được lutein tinh thể tinh khiết 70% Để thu sản phẩm lutein có độ tinh khiết cao, tiến hành kết tinh lại bằng hexan - diclorometan (chứa 1% trietylamin) 1:1 (v/v) ở -200C trong 3 giờ Tinh thể lutein sau đó được lọc, rửa bằng hexan lạnh (00C) rồi làm khô dưới áp suất thấp ở 500C trong 3 ngày Sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao (chứa 90-97% carotenoit) và không có tạp chất độc hại, có thể dùng làm chất chuẩn phân tích hay chất màu thực phẩm cho người Nhược điểm của quy trình này

là tốn khá nhiều thời gian sấy chân không để loại bỏ dư lượng hexan và diclorometan trong sản phẩm

- Ausich, R.L và Sanders, D.J (1997) [4] đã xà phòng hóa lutein este

bằng cách hòa tan oleoresin với propylen glycol ở 50- 600C, sau đó thêm từ từ dung dịch KOH 45% rồi đun nóng ở 65-800C trong 3-10 giờ Sau khi phản ứng kết thúc, thêm nước vào sao cho tỷ lệ oleresin/propylen glycol/dung dịch

KOH/nước là 4:4:1:1, w/w/w/w Lutein tự do tinh thể sẽ kết tinh ngay trong môi trường phản ứng Lọc lấy lutein tinh thể rồi rửa bằng nước khử ion ở 70 -

900C để loại bỏ tạp chất tan trong nước rồi làm khô bằng cách sấy lạnh, cô chân không hoặc dùng dòng khí N2 nóng Quy trình này khá đơn giản, ít tốn thời gian, hạn chế sử dụng các dung môi hữu cơ để kết tinh lại Sản phẩm thu được chứa 0,5-5% nước, 70-85% carotenoit tổng số (trong đó 85-95% là

trans-lutein, 0,2-1,5% là các dạng đồng phân hình học của lutein, 2,5-8%

zeaxanthin) và một số tạp chất là các muối của axit béo Sản phẩm thu được thích hợp cho ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Nhược điểm của quy trình này là carotenoit este khó tan trong propylen glycol nên bước xà phòng hóa cần tiến hành trong thời gian dài, do đó các hợp chất carotenoit có thể bị phân hủy thành các sản phẩm không mong muốn

- Kumar, S.T.K và cs (2004) [10] đã xà phòng hóa lutein este bằng dung

dịch KOH trong isopropanol ở 65-800C trong 3 giờ với tỷ lệ oleoresin/dung dịch KOH/ isopropanol là 1/0,25/3 (w/w/v) Sau đó, hỗn hợp xà phòng hóa được cô chân không để thu hồi isopropanol rồi chiết lutein tự do bằng axetat etyl Dịch chiết acetat etyl được cô chân không và kết tinh lại bằng cách khuấy trong hỗn hợp hexan/axeton 80/20 v/v ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi lọc lấy lutein tinh thể Rửa tinh thể lutein thu được bằng metanol rồi cô chân không ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ Kết quả thu được tinh thể chứa

86,23% xanthophyll tổng số, trong đó trans-lutein chiếm 91,43% Sản phẩm

có thể dùng làm dược phẩm ngăn ngừa các bệnh thoái hóa võng mạc, ung thư phổi Nhược điểm của quy trình này là các bước xà phòng hóa và cô đuổi isopropanol đều phải thực hiện ở nhiệt độ khá cao (70 - 800C) nên có khả

năng dẫn đến sự chuyển hóa trans-lutein thành dạng đồng phân cis- hay phân

hủy lutein thành các carotenoit khác làm giảm hoạt tính sinh học của sản

phẩm Ngoài ra, sản phẩm có thể chứa dư lượng dung môi hữu cơ sử dụng trong quá trình tách chiết, tinh chế

- Swaminathan (2009) [14] đã xà phòng hóa oleoresin bằng cách đun nhẹ

oleoresin (< 450C), khuấy đều cho chảy lỏng ra, sau đó thêm 1,2 - 2,0 phần thể tích dung dịch KOH 13 - 15% trong etanol rồi đun ở 70 - 800C không quá

30 phút, tiếp tục đun thêm 10 phút nữa Sau đó, thêm nước nóng 65 - 750C vào hỗn hợp xà phòng hóa đến thể tích gấp đôi Khi đó tinh thể carotenoit được tạo thành, còn tạp chất xà phòng, lipit, chất béo, các hợp chất hữu cơ khác bị hòa tan Bơm hỗn hợp thu được qua máy lọc ép rồi rửa chất rắn trên đĩa lọc bằng nước nóng đến pH 7,0 Lượng carotenoit tinh thể được dàn ra rồi làm khô dưới áp suất khí quyển ở 50 - 550C hoặc sấy chân không ở 40 - 450C trong 3 - 4 giờ đến độ ẩm dưới 1% để loại các vết dung môi Sản phẩm thu

được chứa carotenoit trên 90%, trong đó all trans-lutein chiếm trên 90%, all

trans-zeaxanthin 3-8%, các carotenoit khác dưới 1% Hiệu suất thu hồi

carotenoit trong sản phẩm cuối cùng khoảng 55 - 80% Ưu điểm của quy trình này là thời gian xà phòng hóa rút ngắn xuống chỉ còn 30 phút nhưng hiệu suất

xà phòng hóa lên đến trên 99%, hạn chế sử dụng dung môi hữu cơ Sản phẩm

có thể dùng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm

Phương pháp xà phòng hóa ít tốn kém nhưng tiến hành ở nhiệt độ cao nên có thể gây ra sự phân hủy lutein tự do Do đó, một số tác giả khác nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học trong đó sử dụng enzym lipaza để thủy phân lutein este ở nhiệt độ phòng nhằm hạn chế sự phân hủy hoạt chất [25] Tuy nhiên, phương pháp này hiện nay không được áp dụng rộng rãi do enzym đắt tiền nên hiệu quả kinh tế không cao

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, hầu như các chất màu thực phẩm ở Việt Nam đều phải nhập khẩu từ nước ngoài Lutein cũng đã được Bộ Y tế đưa vào danh mục các chất

màu thực phẩm được phép sử dụng từ năm 2012 Tuy nhiên, chất màu này hiện vẫn đang được nhập khẩu với giá khá đắt (lutein tinh khiết 90% khoảng

8 – 11 triệu vnđ/kg (chưa kể thuế nhập khẩu, phí chuyển hàng) Trong khi đó, nhiều địa phương trong nước đặc biệt là các vùng Nam Trung Bộ và Nam Bộ,

có khí hậu gần như nắng nóng quanh năm rất lí tưởng cho việc trồng hoa CVT Tuy nhiên, cho đến nay số công trình nghiên cứu liên quan đến vấn đề này ở nước ta rất ít

TS Hoàng Thị Huệ An (2007) [1] đã xây dựng quy trình tách chiết và tinh chế lutein từ hoa CVT một cách rất hệ thống từ khâu chọn giống đến thu nhận lutein tinh thể Theo quy trình này lutein este được chiết từ hoa CVT bằng axeton 15/1 (lít/kg) ở nhiệt độ phòng; sau đó chiết lutein este sang ete dầu mỏ rồi cô dưới áp suất thấp để thu lutein oleoresin Tiếp đó, xà phòng hóa lutein este bằng KOH trong isopropanol (600C; 3 giờ, nồng độ oleoresin là 0,43 g/ml, nồng độ KOH từ 4 - 12% w/v) Sau khi cô đuổi isopropanol, chiết lutein tự do từ cặn còn lại bằng acetat etyl, cô chân không để thu lutein thô rồi tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại với diclorometan-hexan Lutein tinh thể được sấy chân không (500C; 24 giờ), rồi sục khí N2 (30 phút) Sản phẩm lutein có độ tinh khiết cao (chứa gần 98% lutein trong tổng số carotenoit) Tuy nhiên, quy trình này tốn nhiều dung môi, mất thời gian Nguyên nhân là

do tế bào chứa sắc tố trong nguyên liệu CVT bị bao bọc bằng một màng cellulozơ phức hợp làm carotenoit rất khó khuếch tán vào dung môi; quá trình chiết lutein este lại thực hiện ở nhiệt độ phòng nên cần phải chiết nhiều lần, đặc biệt khi chiết nguyên liệu khô Do đó, quy trình chỉ phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm

Để khắc phục nhược điểm trên, trong đề tài cấp tỉnh (2012 - 2014) [2], tác giả Hoàng Thị Huệ An và cộng sự đã xử lý hoa CVT tươi bằng Viscozym

để phá hủy tế bào nguyên liệu trước khi chiết lutein este, sau đó chiết trựctiếp

lutein este bằng hexan Dịch chiết lutein este được cô dưới áp suất giảm để thu lutein oleoresin, xà phòng hóa bằng KOH 12% w/v trong etanol ở 600C trong 3h Lutein được chiết từ hỗn hợp xà phòng hóa bằng axetat etyl, cô đuổi dung môi để thu lutein thô Tinh chế lutein thô bằng cách rửa với metanol 4/1 v/w (3 lần) và hexan 4/1 v/w (2 lần), sau đó sấy chân không ở 500C qua đêm

để loại bỏ dung môi Sản phẩm lutein thu được có hàm lượng carotenoit tổng

số > 96% nhưng có một số nhược điểm sau:

- Giá thành cao do hiệu suất thu hồi lutein trong quá trình xà phòng hóa

và tinh chế chưa cao (52,83%) Nguyên nhân có thể là do nồng độ KOH, nhiệt

độ, thời gian xà phòng hóa chưa đủ để xà phòng hóa hoàn toàn lutein este, lượng chất béo trong sản phẩm lutein thô còn lại khá nhiều làm sản phẩm khó kết tinh và tốn nhiều hexan để loại chất béo

- Sử dụng axetat etyl để chiết lutein từ hỗn hợp xà phòng hóa và dùng hexan, metanol trong quá trình tinh chế lutein thô (rửa tinh thể) Tuy kết quả phân tích cho thấy dư lượng các dung môi nói trên trong sản phẩm đều dưới ngưỡng quy định nhưng vẫn có thể gây tâm lý lo ngại cho người tiêu dùng, đặc biệt là tồn dư metanol trong sản phẩm

Như vậy, cần nghiên cứu cải tiến các công đoạn xà phòng hóa lutein este

và tinh chế lutein thô

Qua việc tổng quan tài liệu có thể thấy rằng đa số tác giả đều tiến hành

xà phòng hóa bằng KOH trong dung môi ethanol, riêng Ausich và cs (1997) thì xà phòng hóa trong propylen glycol Trong một nghiên cứu trước đây (2016) chúng tôi đã thử nghiệm xà phòng hóa theo phương pháp của Ausich nhưng kết quả cho thấy rất khó lọc hay ly tâm thu lấy lutein tinh thể sau phản ứng xà phòng hóa (nguyên nhân là do propylen glycol có độ nhớt rất cao nên tinh thể không thể sa lắng được) Do đó, trong đề tài này sẽ thử nghiệm áp dụng phương pháp xà phòng hóa của Swaminathin (2009) để thủy phân lutein

este Tuy nhiên, sẽ khảo sát để chọn thời gian cần thiết để xà phòng hóa lutein este triệt để nhất

Ngoài ra, trong công đoạn tinh chế lutein thô sẽ nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp để rửa lutein thô (tỷ lệ dung môi rửa/lutein thô, số lần rửa) bằng 2 loại dung môi rửa sau đây :

- Nước cất nóng 60-70oC

- Hỗn hợp của nước cất với dung môi hữu cơ

Sau đó sẽ thử nghiệm quy trình và đánh giá chất lượng sản phẩm

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu sử dụng để tinh chế lutein thô trong nghiên cứu này là cánh

hoa CVT Tagetes erecta L có màu cam đậm được trồng tại huyện Diên

Khánh (Khánh Hòa)

Hình 2.1 Hoa cúc vạn thọ trồng để nghiên cứu ở huyện Diên Khánh

(Khánh Hòa) 2.2 Hóa chất

- EtOH 96o, EtOH tuyệt đối, hexan, axetat etyl, axeton, hexan, toluen, metanol: hóa chất tinh khiết phân tích (Chemsol, Việt Nam)

- KOH và Na2SO4 khan: của hãng Xilong, Trung Quốc

- Butylat hydoxytoluene (BHT): tinh khiết cho tổng hợp (Merck, Đức)

- Viscozym L (Novozymes, Đan Mạch): là enzym hỗn hợp chứa chủ yếu beta-glucanase (endo-1,3(4)-) và một phần xylanazơ, hemicellulazơ, cellulazơ giúp làm mềm thành tế bào thực vật Chế phẩm này là một chất lỏng hơi sánh,

có màu nâu, được pha chế sẵn trong dung dịch hỗn hợp natri clorua,

saccharozơ, kali sorbat ở pH 5 Viscozym lỏng được bảo quản ở 40C và chỉ pha loãng đến nồng độ thích hợp ngay trước khi dùng

- Nước cất 1 lần được chưng cất tại phòng thí nghiệm

- Bình tam giác 250 ml, 500 ml cổ nhám (ISOLAB, Đức)

- Bộ dụng cụ thực hiện phản ứng xà phòng hóa gồm: bình cầu đáy bằng 2000ml, ống sinh hàn hồi lưu

- Đĩa pettri

- Đũa khuấy thủy tinh

- Ống đong và cốc thủy tinh các cỡ (BOMEX, Trung Quốc)

- Pipet và micropipet các cỡ

- Phễu chiết (250 ml; 500 ml; 1000 ml; 2000 ml (ISOLAB, Đức)

2.3.2 Thiết bị

- Cân phân tích điện tử  10-4 g (SATORIUS, Nhật)

- Cân phân tích điện tử  10-4 g (OHAUS, Trung Quốc)

- Cân kỹ thuật  10-3 g (OHAUS, Trung Quốc)

- Quang phổ kế UV-Vis Cary 50 (Varian, Úc)

- Quang kế Vis (CECIL, Anh)

- Bộ chưng cất phân đoạn thu hồi dung môi (Đức)

- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA, Đức)

- Máy ly tâm để bàn EBA 21 (Hettich, Đức)

- Thiết bị chiết kiểu thùng quay bằng inox 304 tự chế tạo (60 L, 20 rpm)

- Thiết bị cô chân không RV 10 Control V (IKA, Đức)

- Thiết bị sấy chân không UNB (Memmert, Đức)

- Tủ đông -200C (SANAKY, Việt Nam)

- Tủ lạnh HITACHI (Thái Lan)

- Tủ hút khí độc (Việt Nam)

- Tủ sấy mẫu UNB 400 (Memmert, Đức)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu oleoresin từ hoa CVT

Hình 2.2 Sơ đồ thu oleoresin từ hoa CVT tươi

Tiến hành như sau:

Chuẩn bị nguyên liệu

Hoa CVT tươi sau khi thu hoạch được cắt lấy cánh, loại bỏ phần hư hỏng, sau đó trộn đều, cân thành từng mẫu có khối lượng xác định sau đó cho vào các xô nhựa lớn để xử lý enzym

Dung môi hexan

+ Xử lý Vicozym (0,89% v/v; 0,2 v/w; 4 h) + Ly tâm

+ Rửa (H 2 O 1/1, v/w; 3 lần) + Làm khan (EtOH 1/1, v/w; 1 lần)

Cánh hoa CVT tươi

Lutein oleoresin

Bã ly tâm

+ Chiết (Hexan 2/1 v/w; 24 h/lần, 2 lần) + Cô chân không (< 400C)

Sau khi xử lý enzym, ly tâm loại bỏ dịch Bã ly tâm được rửa bằng nước cất với tỷ lệ 1/1 v/w (1 lít/kg tính theo nguyên liệu tươi ban đầu) Sau đó, ly tâm lấy bã Nếu chưa dùng ngay thì cho vào túi polyetylen, bảo quản ở -200C đến khi sử dụng Nếu đem chiết carotenoit ngay thì ngâm trong EtOH tuyệt đối 1/1 v/w (1 lít EtOH/1kg nguyên liệu tươi) trong 30 phút để làm khan mẫu Sau đó, ly tâm lấy bã, chuẩn bị cho công đoạn chiết lutein este

Chiết lutein este

Chiết lần 1:

Cho bã hoa CVT đã chuẩn bị như trên vào máy chiết thùng quay bằng vật liệu inox Thêm vào đó hexan có BHT 0,1% vào theo tỉ lệ 2/1 v/w (tính theo khối lượng nguyên liệu tươi ban đầu) Đậy kín thùng quay Tiến hành chiết lutein este bằng cách cho thùng quay với tốc độ 20 rpm ở nhiệt độ phòng, trong 24 h

Sau khi chiết, hút dịch chiết (kết hợp lọc qua một lớp vải thưa) vào bình chứa mẫu của thiết bị cô chân không Cô dịch chiết ở 380 C, tốc độ quay

80 rpm đến hết lượng dịch hexan

Chiết lần 2:

Cho dung môi hexan vào bã nguyên liệu còn lại sau khi chiết lần 1 và lặp lại quá trình chiết như lần 1

Cô lutein este

Để tận dụng dung môi ta cho lượng hexan vừa thu hồi ở bình hứng sau khi cô lần 1 quay trở lại thùng quay chứa nguyên liệu đã chiết lần 1

Cô lần 2:

Sau khi chiết lần 2, lại hút dịch chiết vào bình cô quay (đã có chứa sẵn lượng oleoresin của lần chiết 1) Tiếp tục cô dịch chiết tương tự như lần 1 nhưng đến lúc dịch chiết còn khoảng 200 ml thì ta chuyển vào bình cầu đáy bằng cổ nhám 2000 ml (đã cân trước) Dùng hexan tráng sạch lượng oleoresin trong bình cầu cô quay, gộp chung vào bình cầu 2000 ml Tiếp tục cô đến hết hexan để thu lutein oleoresin

2.4.2 Nghiên cứu hoàn thiện công đoạn xà phòng hóa lutein este dựa theo phương pháp Swaminathan (2009)

2.4.2.1 Chọn thời gian thích hợp xà phòng hóa theo phương pháp Swaminathan

Cân chính xác một lượng lutein oleoresin cho vào bình cầu 2 cổ 500 ml Đun nóng lượng oleoresin đến 400C cho chảy lỏng ra Thêm từ từ dung dịch KOH 15% w/v vừa mới pha trong ethanol (có chứa 0,1% BHT) theo tỷ lệ 2/1 v/w Lắp sinh hàn hồi lưu vào bình cầu, đun ở 750C- 800C vừa đun vừa khuấy đều (dùng máy khuấy từ gia nhiệt) Cứ sau 1 h lại lấy mẫu ra chạy sắc ký bản