Tiếp nối kết quả này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng in vivo của Crilin T lên tế bào ung thư phổi bằng cách cấy ghép tế bào ung thư phổi của người lên chuột BALB/c nude
Trang 1NGUYỄN THỊ HẢI YẾN
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CRILIN T LÊN SỰ BIỂU HIỆN MỘT SỐ GEN SINH UNG THƯ
VÀ ỨC CHẾ UNG THƯ TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NUDE MANG TẾ BÀO UNG THƯ PHỔI NGƯỜI
Chuyên ngành : Miễn dịch
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS Nguyễn Văn Đô
HÀ NỘI - 2017
Trang 2Học Y Hà Nội, được sự giúp đỡ tận tình của nhà trường và bộ môn, đến naytôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp và chương trình đào tạo Thạc sỹ y khoa.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Sinh lý
bệnh - Miễn dịch Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để
tôi hoàn thành tốt chương trình học tập.
Đảng ủy, Ban giám hiệu, Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch Trường
Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên đã hỗ trợ, động viên, tạo điều kiện
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.
Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến:
TS Nguyễn Văn Đô: Người thầy đã tận tình dạy bảo và dìu dắt tôi từ
những bước đầu tiên trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học, đồng thời đã tận tình hướng dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong quá trình học tập và thực hiện luận văn của tôi.
TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm, công ty Thiên Dược và GS Phan thị Phi Phi đã cung cấp kinh phí và hỗ trợ nghiên cứu; và nhóm nghiên cứu của PGS Nguyễn Lĩnh Toàn, Học viện Quân Y đã thực hiện mô hình nghiên cứu Toàn thể các thầy cô, các anh chị bác sĩ, kỹ thuật viên, các cán bộ nhân viên bộ môn Sinh lý bệnh-Miễn dịch trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập hoàn thành luận văn
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ 2 bên, chồng và con trai, các anh chị đi trước, các bạn bè, đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên và là chỗ dựa vững chắc cho tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để đạt được kết quả ngày hôm nay.
Hà Nội, ngày 08 tháng 9 năm 2017
Nguyễn Thị Hải Yến
Trang 3Tôi là Nguyễn Thị Hải Yến, học viên cao học khóa 24 của Trường Đạihọc Y Hà Nội, chuyên ngành Miễn dịch, xin cam đoan:
1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướngdẫn của TS Nguyễn Văn Đô
2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam
3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơinghiên cứu
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này
Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2017
Người viết cam đoan
Nguyễn Thị Hải Yến
Trang 4Bcl-2 B-cell lymphoma/leukemia-2
Bcl-xl B – cell lymphoma – extra large
cDNA Complementary Deoxyribonucleic DNA bổ sung
CLL Chronic lyphocytic leukemia Bệnh bạch cầu Lympho mạn
tínhDNA Acid Deoxyribonucleic Acid DeoxyribonucleicdNTP Deoxyribonucleotid Triphotphat
FADD Fas-associated death domain Fas liên quan đến vùng chếtMOMP Mitochondrial outer membrane protein Protein màng ngoài ty thểNSCLC Non - Small Cell Lung Cancer Ung thư phổi không phải tế
bào nhỏPCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain
Trang 5ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Những hiểu biết cơ bản về bệnh ung thư 3
1.1.1 Khái niệm cơ bản về bệnh ung thư 3
1.1.2 Gen học và ung thư 3
1.1.3 Quá trình chết tế bào theo chương trình 5
1.1.4 Một số gen liên quan 9
1.2 Những hiểu biết cơ bản về ung thư phổi 17
1.3 Tổng quan về trinh nữ hoàng cung 18
1.3.1 Giới thiệu về cây trinh nữ hoàng cung 19
1.3.2 Các công trình nghiên cứu về Trinh nữ hoàng cung 20
1.3.3 Giới thiệu về Crilin T 21
1.4 Giới thiệu về mô hình nghiên cứu trên chuột BALB/c Nude 22
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24
2.2 Đối tượng nghiên cứu 24
2.3 Phương pháp nghiên cứu 24
2.4 Vật liệuvà dụng cụ nghiên cứu 25
2.4.1 Vật liệu nghiên cứu 25
2.4.2 Dụng cụ nghiên cứu 25
2.5 Quy trình và kỹ thuật nghiên cứu 26
2.5.1 Quy trình nghiên cứu 26
2.5.2 Kỹ thuật nghiên cứu 27
Chương 3: KẾT QUẢ 34
3.1 Đặc điểm mô bệnh học 34
Trang 63.2.2 Kiểm tra chất lượng RNA bằng điện di 36
3.3 Điều kiện tối ưu cho phản ứng RT-PCR đơn mồi 37
3.4 Kết quả phản ứng RT-PCR đơn mồi của gen B2M, Bcl-2, Bax, Bcl-xl, Bak 38
3.5 Sự biểu hiện Bcl-2, Bcl-xl, Bax, và Bak ở mức mRNA ở các nhóm chuột nghiên cứu 39
3.5.1 Sự biểu hiện Bcl-2 ở mức mRNA ở các nhóm nghiên cứu 40
3.5.2 Sự biểu hiện Bcl-xl ở mức mRNA ở các nhóm nghiên cứu 42
3.5.3 Sự biểu hiện Bax ở mức mRNA ở các nhóm nghiên cứu 44
3.5.4 Sự biểu hiện Bak ở mức mRNA ở các nhóm nghiên cứu 46
Chương 4: BÀN LUẬN 48
4.1 Về kết quả tách chiết RNA 49
4.2 Điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đơn mồi 50
4.3 Về quy trình kỹ thuật 51
4.4 Mức độ biểu lộ gen Bcl-2, Bxl-xl, Bax, và Bak ở mẫu sinh thiết u các nhóm chuột nghiên cứu 52
4.4.1 Về mức độ biểu lộ gen Bcl-2 53
4.4.2 Về mức độ biểu lộ gen Bcl-xl 55
4.4.3 Về mức độ biểu lộ gen Bax 56
4.4.4 Về mức độ biểu lộ gen Bak 57
4.5 Mối liên quan giữa sự biểu lộ của các gen nghiên cứu với đặc điểm giải phẫu bệnh 58
KẾT LUẬN 61
KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 7Bảng 2.1 Thành phần của phản ứng PCR đơn mồi 32
Bảng 3.1 Đặc điểm giải phẫu bệnh của các khối u ở các nhóm nghiên cứu 34
Bảng 3.2 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của RNA 36
Bảng 3.3 Sự biểu lộ của gen Bcl-2 ở nhóm chứng 40
Bảng 3.4 Sự biểu lộ của gen Bcl-2 ở nhóm dự phòng 41
Bảng 3.5 Sự biểu lộ của gen Bcl-2 ở nhóm điều trị 41
Bảng 3.6 Sự biểu lộ của gen Bcl-xl ở nhóm chứng 42
Bảng 3.7 Sự biểu lộ của gen Bcl-xl ở nhóm dự phòng 43
Bảng 3.8 Sự biểu lộ của gen Bcl-xl ở nhóm điều trị 43
Bảng 3.9 Sự biểu lộ của gen Bax ở nhóm chứng 44
Bảng 3.10 Sự biểu lộ của gen Bax ở nhóm dự phòng 45
Bảng 3.11 Sự biểu lộ của gen Bax ở nhóm điều trị 45
Bảng 3.12 Sự biểu lộ của gen Bak ở nhóm chứng 46
Bảng 3.13 Sự biểu lộ của gen Bak ở nhóm dự phòng 47
Bảng 3.14 Sự biểu lộ của gen Bak ở nhóm điều trị 47
Trang 8Hình 1.1 Sơ đồ các con đường hoạt hóa chết tế bào theo chương trình 6
Hình 1.2 Cơ chế tham gia tránh chết tế bào theo chương trình và ung thư 8 Hình 1.3 Các thành viên họ Bcl-2 10
Hình 1.4 Sự chuyển vị của gen Bcl-2 11
Hình 1.5 Vị trí của gen Bax 13
Hình 1.6 Cấu trúc của gen Bak 14
Hình 1.7 Sự tương tác chức năng của các thành viên họ protein Bcl-2 ở màng ty thể 15
Hình 1.8 Cây trinh nữ hoàng cung 20
Hình 3.1 Giải phẫu bệnh sinh thiết u nhóm chứng và nhóm điều trị 35
Hình 3.2 Điện di RNA tổng số 37
Hình 3.3 Nồng độ Mg++ tối ưu cho phản ứng PCR đơn mồi của gen Bcl-2 và Bak 37
Hình 3.4 Sự biểu lộ các gen B2M, Bcl-2, Bax 38
Hình 3.5 Sự biểu lộ các gen Bak, Bcl-xl 39
Hình 3.6 Sự biểu lộ gen Bcl-2 ở mô sinh thiết các nhóm chuột nghiên cứu .40 Hình 3.7 Sự biểu lộ gen Bcl-xl ở mô sinh thiết các nhóm chuột nghiên cứu 42
Hình 3.8 Sự biểu lộ gen Bax ở mô sinh thiết các nhóm chuột nghiên cứu 44
Hình 3.9 Sự biểu lộ gen Bak ở mô sinh thiết các nhóm chuột nghiên cứu 46
Trang 9ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, tỷ lệ người mới mắc và tử vong do ung thư
có xu hướng ngày càng tăng ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, nhất là ở cácnước nghèo, các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam Theo Globocan
2012, trên thế giới hàng năm có có khoảng 14,1 triệu người mới mắc bệnhung thư và 8,2 triệu người tử vong do ung thư Tại Việt Nam hằng năm cókhoảng 125000 trường hợp ung thư mới mắc và 97400 người tử vong do ungthư, 5 loại ung thư hay gặp tính chung cho cả hai giới là ung thư gan, phổi, dạdày, vú, đại trực tràng [1] Trong đó ung thư phổi là nguyên nhân hàng đầu trongcác tử vong do ung thư Đến nay, phẫu thuật, xạ trị, hóa trị liệu, và miễn dịch trịliệu là những chiến lược điều trị chủ yếu dành cho ung thư Tuy nhiên, hiệu quảcủa các phương pháp điều trị bị hạn chế và có thể dẫn đến một số tác dụng phụ.Trong thập kỷ qua, tỷ lệ tử vong do ung thư phổi vẫn cao, với tỷ lệ sống 5 năm
<15% [2] Do đó, việc nghiên cứu phương pháp trị liệu mới là một hướng quantrọng, nhằm nâng cao chất lượng và thời gian sống cho bệnh nhân
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu các loại thuốc hỗ trợ điều trịung thư có nguồn gốc từ các cây thảo dược ngày càng được chú ý với mụctiêu nâng cao hiệu quả điều trị, hạn chế các tác dụng phụ và giảm bớt gánhnặng về kinh tế Trinh nữ hoàng cung có tên khoa học Crinum latifolium L làcây thuốc thảo mộc từ lâu đã được sử dụng để chữa các bệnh u xơ, ung thư tửcung, ung thư tuyến tiền liệt và uống dưới dạng nước sắc [3] Hiện nay, người
ta đã phát hiện có khoảng 130 loài khác nhau phân bố ở vùng nhiệt đới với
hơn 150 alcaloid được chiết tách từ loài cây này Cây Trinh nữ Crila Crinum
latifolium L var crilae Tram & Khanh, var n đã được phát hiện và nuôi trồng
từ năm 1990 cho đến nay [4] Kết quả của chùm các công trình nghiên cứu in
vivo và in vitro của các tác giả đã chứng minh một số phân đoạn alcaloid và
Trang 10phân đoạn flavonoid được chiết xuất từ cây là có tác dụng chống oxy hóa vàtăng cường miễn dịch chống khối u gián tiếp hay có tác dụng gây độc tế bàoung thư trực tiếp.
Viên nang Trinh nữ Crila được chiết từ lá cây trinh nữ hoàng cung, thuốc
đã được đăng ký sản xuất, sử dụng rộng rãi ở Việt Nam để điều trị phì đại lànhtính tuyến tiền liệt, u xơ tử cung Ngoài ra, viên Crila còn được nghiên cứu sửdụng để điều trị thực nghiệm các tế bào dòng ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi,tuyến tiền liệt và trên một số bệnh nhân ung thư tự nguyện
Viên nang Crilin T, là một sản phẩm mới của cây Trinh nữ Crila cóchứa các alcaloid và các flavonoid Crilin T có tác dụng tăng cường chức
năng miễn dịch chuyên nhiệm chống ung thư in vitro [5] và cũng làm tăng chế tiết các cytokin IL-2 và TNFα in vitro của tế bào lympho người bình
thường về lâm sàng và của người bệnh ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn
[6] Tiếp nối kết quả này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng in
vivo của Crilin T lên tế bào ung thư phổi bằng cách cấy ghép tế bào ung thư
phổi của người lên chuột BALB/c nude, theo dõi cân nặng, thể tích khối u,đặc điểm mô bệnh học và sự biểu hiện một số gen sinh ung thư (Bcl-2, Bcl-xl) và gen ức chế ung thư (Bax và Bak) ở mức độ mRNA bằng phương phápRT-PCR Đề tài này nhằm mục tiêu:
1 Đánh giá sự biểu lộ mRNA của gen sinh ung thư Bcl-2 và Bcl-xl trên mô hình chuột Nude mang tế bào ung thư phổi người sau điều trị Crilin T.
2 Đánh giá sự biểu lộ mRNA của gen ức chế ung thư Bax và Bak trên mô hình chuột Nude mang tế bào ung thư phổi người sau điều trị Crilin T.
Trang 11Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Những hiểu biết cơ bản về bệnh ung thư
1.1.1 Khái niệm cơ bản về bệnh ung thư
Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào dưới tác động của một số tác nhângây ung thư làm tế bào tăng sinh vô hạn, không có tổ chức và không tuân theocác cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể Người ta đã biết được có hơn
200 loại ung thư khác nhau trên cơ thể người [7]
1.1.2 Gen học và ung thư
Quá trình sinh bệnh ung thư liên quan chặt chẽ đến tổn thương 2 nhómgen, đó là gen sinh ung thư và gen ức chế ung thư Bình thường hai nhóm gennày có vai trò quan trọng trong kiểm soát quá trình sinh sản, biệt hóa và chếttheo chương trình của tế bào, giúp cho sự ổn định sinh học của cơ thể
1.1.2.1 Gen sinh ung thư (oncogene)
Năm 1911 Peyton Rous đã phát hiện ra virut sinh sarcom ở cơ gà và đếnnhững năm 60 người ta mới tìm thấy gen sinh u đó trong virut Rous và đượcđặt tên là src Sau đó hàng chục gen sinh u khác ở nhiều virut khác được pháthiện Giữa những năm 1970, các nhà vi sinh Mỹ John Michael Bishop vàHarold Varmus thử nghiệm giả thuyết cho rằng các tế bào cơ thể khỏe mạnh
có chứa gen gây ung thư của virut không hoạt động, khi được kích hoạt sẽ gâyung thư Họ đã cho thấy rằng gen sinh ung thư được bắt nguồn từ gen tiền ungthư (proto-oncogene) trong các tế bào cơ thể vật chủ của chúng Ở người, gentiền ung thư có thể được chuyển đổi thành gen sinh ung thư bởi đột biến,khuếch đại gen và sắp xếp lại nhiễm sắc thể [8] Người ta cho rằng đột biến ởcác gen này có thể là nguyên nhân làm mất khả năng khiểm soát quá trìnhphân bào và do đó mà sinh u, chính đó là lí do tại sao lại có tên là oncogen[9] Có 3 giả thuyết cho việc hình thành oncogen [10]
Trang 12- Oncogen là những gen để phát triển tế bào, hoạt hóa nhờ yếu tố tăngtrưởng (growth factor) Do rối loạn cơ chế điều hòa, yếu tố tăng trưởng hoạthóa mạnh kích thích oncogen sinh ung thư.
- Oncogen là những đoạn DNA bị tổn thương bởi các tác nhân gây bệnhnhư: Hóa học, sinh học, vật lý Cơ thể đã có những cơ chế sửa chữa nhữngDNA này nhưng không sửa chữa được hoàn hảo nên cùng một tác nhân ungthư nhưng có người bị ung thư có người lại không bị ung thư
- Oncogen là do các bộ gen của virut sinh ra trong tế bào nhiễm, vì người
ta thấy các oncogen này giống với DNA của virus Ví dụ: HPV (cổ tử cung,dương vật), EBV (Burkitt) và HBV (ung thư gan) [11]
1.1.2.2 Gen ức chế ung thư (tumor suppressor)
Gen ức chế ung thư là gen điều hòa sự phân chia tế bào bằng cách làmchậm sự phân bào, sữa chữa các sai sót của DNA, lệnh cho tế bào chết đi(chết tế bào theo chương trình) Khi gen này hoạt động không bình thườnghay bị bất hoạt, làm các tế bào phát triển không kiểm soát được và có thể dẫnđến ung thư Các nghiên cứu về ung thư đã xác định và mô tả đặc điểm củanhiều gen ức chế khối u Năm 1971, nhà nghiên cứu Mỹ Alfred Knudson mặcnhiên công nhận rằng một dạng hiếm của ung thư mắt là nguyên bào võngmạc gây ra bởi đột biến ở một gen Rb [12], [13] Nghiên cứu tiếp theo chothấy các đột biến ở gen này cũng đóng một vai trò trong bệnh ung thư xương,phổi, vú, cổ tử cung, tuyến tiền liệt và bàng quang Một số gen ức chế khối ukhác (chẳng hạn như TP53, mã hóa một protein gọi là p53) đã được xác định.Các dạng đột biến của TP53 đã được liên quan đến hơn 50% của tất cả cácbệnh ung thư Các đột biến trong hai gen ức chế khối u khác là BRCA1 vàBRCA2 trong ung thư vú, chúng được tìm thấy trong 5-10% của tất cả cáctrường hợp và trong khoảng 85% của tất cả các trường hợp ung thư vú ditruyền [14]
Trang 131.1.3 Quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
Trong nhiều thập kỷ qua, những nghiên cứu cơ bản về ung thư đã cho thấy
sự tiến bộ đáng kể trong sự hiểu biết của chúng ta về sinh học ung thư và ungthư di truyền Trong số những điểm quan trọng nhất của những tiến bộ này là
sự nhận thức rằng quá trình chết tế bào theo chương trình và các gen kiểmsoát nó có ảnh hưởng sâu sắc đến kiểu hình ác tính [15]
Chết tế bào theo chương trình là một hiện tượng có tính di truyền của các
tế bào có nhân Chết tế bào theo chương trình được Kerr, Wyllie và Curie mô
tả năm 1972, đó là một hiện tượng phổ biến và cần thiết cho cuộc sống Từ sựphát triển bình thường của cơ thể, sự hằng định của các mô cho đến việc loạitrừ các tế bào bị viêm nhiễm hay sự dung nạp về miễn dịch học [16] Nếuhoạt động có sự thiếu hụt thì sẽ phát sinh ung thư và các dị tật trong cơ thể.Ngược lại, hoạt động quá mức sẽ gây ra các biến đổi thoái hóa cơ và thầnkinh cũng như những rối loạn khác nữa Chết tế bào theo chương trình có thểđược xem như một rào cản quan trọng để phát triển bệnh ung thư, chống lạichết tế bào theo chương trình là một đặc tính của tế bào ung thư và là mộtnguyên nhân chính của thất bại trong điều trị
Quá trình chết tế bào theo chương trình diễn ra theo 2 con đường chính,bao gồm con đường ngoại sinh hay con đường thông qua thụ thể chết và conđường nội sinh hay con đường qua trung gian ty thể [16]
Trang 14Hình 1.1 Sơ đồ các con đường hoạt hóa chết tế bào theo chương trình
(Nguồn http://archive.impactaging.com/)
Con đường thông qua thụ thể chết (the death receptor pathway) hay conđường ngoại sinh, khác với con đường của ty thể Con đường này được khởiđộng bởi các kích thích ngoại bào, chẳng hạn như phóng thích các yếu tố tăngtrưởng kích thích sự gắn của thụ thể chết xuyên màng (một tập hợp thụ thểTNF bao gồm cả TNFR1, Fas/CD95, thụ thể TRAIL-1 và 2) [17] với các phân
tử tín hiệu (ligand) cùng nguồn gốc với chúng Các phức hợp ligand/thụ thể sẽđược trimer hóa và các vùng thụ thể chết sẽ gắn với các protein FADD nhờ sựtương tác với các vùng tương đồng trong bộ chuyển đổi này Ngoài ra, cácFADD còn chứa một vùng hiệu ứng chết tương đồng với nó trong caspase khởiđầu Do gắn với thụ thể chết nên vùng này được lộ ra và được gắn với tiền
Trang 15caspase khởi đầu, thường là với tiền caspase 8 hoặc tiền caspase 10, phức hợpnày còn có tên gọi là “phức hợp tín hiệu cảm ứng chết” (DISC) Chức năng của
nó trong chết tế bào theo chương trình là chuyển các phân tử tiền caspase tớitrạng thái dimer hóa và kích hoạt lẫn nhau Các caspase 8 hoặc 10 kích hoạtkhởi đầu sau đó sẽ kích hoạt caspase thực hiện như caspase 3, 6, 7 làm chophức hợp thực hiện hoạt động ly giải protein chất nền và chết tế bào
Con đường ty thể (mitochondria pathway) là con đường nội sinh liênquan đến tính toàn vẹn của màng ti thể, được kích hoạt bởi các yếu tố như bức
xạ, thiếu yếu tố tăng trưởng, thiếu cytokin, thuốc gây độc tế bào Tiến triểnthông qua con đường này dẫn đến sự ra đời của cytochrom c từ ty thể bị tổnthương, sau đó liên kết với các phân tử chuyển đổi Apaf-1 (yếu tố cảm ứngchết tế bào theo chương trình) và caspase “khởi động” chưa hoạt động, tiềncaspase 9, trong một phức tạp multiprotein gọi là apoptosom Điều này dẫnđến việc kích hoạt các caspase 9, sau đó khởi phát một chuỗi các caspasekíchhoạt (caspases 3 và 7) dẫn đến những thay đổi về hình thái và sinh hóa gắnliền với quá trình chết tế bào theo chương trình [18] Cơ chế điều hòa conđường này rất tinh vi thông qua các hệ thống kích thích và ức chế phức tạp
mà hiện nay y học phân tử đang khám phá Đây là một cơ chế bị chi phối bởi
2 nhóm protein: Một nhóm chống lại quá trình chết tế bào theo chương trìnhnhư Bcl-2, Bcl-xl và Mcl-1 và một nhóm protein làm tăng hiệu ứng chết tếbào theo chương trình như Bax và Bak Ngoài ra còn có một số các protein cóliên quan như Bim, Bad, puma và noxa [19], [20]
Chết tế bào theo chương trình giúp cho cơ thể loại bỏ những tế bàokhông còn cần thiết, hoặc các tế bào bị tổn thương, sai hỏng có thể dẫn tớiung thư [21], [22] Do đó, các tác giả cho rằng sự tránh chết tế bào theochương trình là một điều kiện tất yếu cho sự thay đổi và tăng trưởng bền vữngcủa các tế bào ung thư đã được chấp nhận rộng rãi [23] Có rất nhiều cách để
Trang 16một tế bào ác tính có thể có được giảm quá trình chết hoặc chống lại chết tếbào theo chương trình Nhìn chung, cơ chế để tránh chết tế bào theo chươngtrình bao gồm: Sự mất cân bằng của các protein chống chết tế bào theochương trình và kích thích chết tế bào theo chương trình, sự giảm chức năngcaspase và sự giảm biểu hiện của các thụ thể chết.
Hình 1.2 Cơ chế tham gia tránh chết tế bào theo chương trình và ung thư
(Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12209154)
Do vậy, một sự hiểu biết chi tiết về cái chết của tế bào theo chương trình sẽgiúp hiểu rõ hơn về sự phức tạp của khối u và cải tiến phương pháp điều trị ungthư dựa trên sự hoạt hóa các thành phần của chết tế bào theo chương trình
Trang 171.1.4 Một số gen liên quan
Gia đình gen Bcl-2 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chết tếbào theo chương trình, đến nay được biết có 25 gen khác nhau Hầu hếtchúng đều chứa một vùng vận chuyển màng đầu tận cùng C kỵ nước làmnhiệm vụ neo chúng vào màng Tuy nhiên, cũng có vài thành viên họ nàyxuất hiện ở tế bào chất Các protein họ Bcl-2 được đặc trưng bởi các vùng
BH tương ứng Bcl-2 [24]
Có 4 vùng BH khác nhau và một số protein họ Bcl-2 có chứa tất cả 4vùng Đặc biệt là vùng BH1 và BH2 cho phép sự dimer hóa dị loại(heterodimerization) với Bax để làm thoái lui sự chết tế bào theo chương trình[25] Vùng BH3 xuất hiện với chức năng cho phép sự dimer hóa dị loại giữaBcl-xl và Bcl-2 với các thành viên tiền chết tế bào theo chương trình (Bax,Bak) để thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình Vùng BH4 được duy trìtrong các thành viên chống chết tế bào theo chương trình (Bcl-xl), nhưng
có xu hướng vắng mặt trong các thành viên kích thích chết tế bào theochương trình Vùng BH4 đã được chứng minh là rất quan trọng đối với việcdimer hóa dị loại với Bax và cho hoạt động chống chết tế bào theo chươngtrình [26] Thành viên của Bcl-2 có thể được phân thành các protein chốngchết tế bào theo chương trình và kích thích chết tế bào theo chương trình vàgiữa chúng có sự tương tác với nhau trong việc tăng hiệu ứng hay ức chếchết tế bào theo chương trình Protein chống chết tế bào theo chương trìnhnhư Bcl-2, Bcl-xl, và Bcl-W Chúng ngăn chặn sự chết tế bào bằng cách ứcchế các protein kích thích chết tế bào theo chương trình gồm Bax và Bak.Ngoài ra còn có các thành viên của “chỉ có vùng BH3”, các thành viên nàyhiển thị trình tự tương đồng chỉ trong vùng BH3 và cho đến nay đều là tiềnchết tế bào theo chương trình [27], [28], [29]
Trang 18Hình 1.3 Các thành viên họ Bcl-2 (Nguồn: http://www.nature.com) 1.1.4.1 Gen Bcl-2
Bcl-2 là từ viết tắt của B-cell lymphoma/leukemia-2 Lần đầu tiên đượcphát hiện ở nang lympho B Đây là thành viên thứ hai của một loạt các proteinban đầu được mô tả trong sự hoán vị NST bao gồm NST số 14 và 18 trongnang lympho Phần NST số 18 có chứa vị trí của Bcl-2 đã xảy ra hiện tượnghoán vị với phần của NST số 14 có chứa kháng thể ở vị trí chuỗi nặng [30]
Trang 19Hình 1.4 Sự chuyển vị của gen Bcl-2 (Nguồn:www.biology.com)
Bcl-2 có cấu trúc gồm một lõi kị nước bao quanh bởi một vỏ xoắn, cótrọng lượng phân tử là 27000 dalton Nó được tạo nên từ 4 vùng BH (Bcl-2homology) được đánh số từ BH1-4 Các vùng BH được biết là rất quan trọngtrong chức năng của Bcl-2 Bcl-2 thường được tích hợp trong các màng ngoài
ty thể, nhưng cũng có thể có trong bào tương hoặc lưới nội chất
Vaux cùng các cộng sự (1988) là những người đầu tiên báo cáo rằngBcl-2 có thể ức chế các tế bào chết Sau kích thích chết tế bào theo chươngtrình, các protein tiền chết theo chương trình được hoạt hóa thông qua các sửađổi sau tổng hợp hoặc thông qua những biến đổi về cấu trúc của chúng Bcl-2tạo dị dimer với các thành viên họ Bcl-2 tăng hiệu ứng chết tế bào theochương trình, dẫn đến sự bất hoạt của chúng Bax là một protein liên quan vớiBcl-2, thúc đẩy chết tế bào theo chương trình và là đích sao chép của hạnguồn của p53 Protein Bcl-2 dị dimer hóa với Bax do vậy mà ức chế chết tếbào theo chương trình Mặt khác Bax lại được kích thích bởi các thành viên
“chỉ có vùng BH3” trong khi Bcl-2 lại có tác dụng ức chế các gen này nên khiBcl-2 tăng biểu hiện thì các gen “chỉ có vùng BH3” bị ức chế, do vậy giảm
Trang 20khả năng kích hoạt Bax Hơn nữa, protein Bcl-2 lại có thể can thiệp vàonhững bước quan trọng trong quá trình hợp nhất các tín hiệu tiền chết tế bàotheo chương trình ở mức độ ty thể, qua đó bãi bỏ việc giải phóng cytochrome-
c Bcl-2 cũng có thể điều chỉnh sự hoạt hóa của nhiều caspase như caspase-2.Trong lưới nội sinh chất Bcl-2 điều chỉnh lưu trữ canxi, ở mức độ nội bào đãđược chứng minh là ảnh hưởng đến quá trình chết tế bào theo chương trình
1.1.4.2 Gen Bcl-xl
Bcl-xl (B – cell lymphoma – extra large) là protein đầu tiên được tìm ra
có cùng chức năng với Bcl-2 và cùng thuộc nhóm chống lại chết tế bào theochương trình Cấu tạo của Bcl-xl cũng bao gồm có 4 vùng BH từ 1 đến 4 nằm
ở vị trí NST 20q11.21 Protein Bcl-2 và Bcl-xl có 43% acid amin giống nhau
và có nhiều đoạn tương tự nhau Bcl-2 và Bcl-xl có cùng chức năng trên mộtgiai đoạn của chết tế bào theo chương trình [31] Vị trí nằm ở màng ngoài tythể và quy định sự điều hòa đối với việc mở các kênh ở màng ngoài ty thể.Kênh này quy định điện thế của màng ty thể và do đó kiểm soát việc sản xuấtcủa các chất oxy hóa và giải phóng cytochrom c của ty thể, cả hai đều là chấtgây cảm ứng mạnh của chết tế bào theo chương trình Có tác giả cho rằng,Bcl-xl cũng có thể ức chế chết tế bào theo chương trình bằng cách gắn vàoApaf-1, do đó ngăn cản sự kết hợp với caspase 9 và cytochrom c và sự kíchhoạt tiếp theo của các caspase hiệu ứng hạ lưu, mặc dù vấn đề này hiện nayđang gây tranh cãi [32] Mặc dù Bcl-2 và Bcl-xl dường như không thể phânbiệt được chức năng, có bằng chứng rằng chúng khác nhau trong khả năngcủa mình để bảo vệ tế bào khỏi tác nhân kích thích chết tế bào theo chươngtrình khác nhau [33], [34], [35]
Trang 211.1.4.3 Gen Bax
Hình 1.5 Vị trí của gen Bax
Bax (BCL2-associated X) nằm trên NST 19, có kích thước 21kDa Bax được
mã hóa bởi sáu exon và được tạo nên từ ba vùng BH là BH1, BH2 và BH3
Bax được xác định là yếu tố kích thích chết tế bào theo chương trình đầutiên chống lại chức năng của Bcl-2 Vùng BH3 của Bax đã được chứng minh
là rất quan trọng trong việc hình thành dimer Bax có thể hình thành đồngdimer hoặc dị dimer với Bcl-2, Bcl-xl [36], [37] Trong các tế bào động vật có
vú khỏe mạnh, phần lớn Bax được tìm thấy trong bào tương nhưng khi bắtđầu các tín hiệu tự hủy hoại, Bax trải qua một sự thay đổi cấu tạo và chèn vàocác màng bào quan, chủ yếu là màng ngoài ty thể Bax và Bak có thể hìnhthành các lỗ trên màng ngoài ti thể và làm thay đổi tính thấm của nó Điềunày dẫn đến sự ra đời của cytochrom c và các yếu tố tiền chết tế bào theochương trình khác từ các ty lạp thể, dẫn đến hoạt hóa caspase Bax cũng cómặt trong mạng lưới nội sinh chất nơi mà chúng kiểm soát quá trình chết tếbào theo chương trình thông qua các mức lưu trữ canxi
Bax được kích hoạt bởi nhóm protein “chỉ có BH3” Sự biểu lộ của Baxcũng được quy định bởi protein ức chế khối u p53 (TP53) và Bax đã đượcchứng minh có liên quan trong quá trình chết tế bào theo chương trình đượcđiều hòa bởi p53 Các protein p53 là một yếu tố phiên mã, khi được kích hoạtnhư là một phần của phản ứng của tế bào với stress, điều hòa rất nhiều gen
Trang 22mục tiêu bao gồm Bax Protein p53 tương tác với Bax thúc đẩy Bax kích hoạt
ty thể trong quá trình chết tế bào theo chương trình Bak tương tác và làm tăngtốc độ mở của kênh anion điện áp phụ thuộc vào ty thể, dẫn đến mất sự toàn vẹncủa màng ty thể, thay đổi tính thấm màng và giải phóng ra cytochrom c Proteinnày cũng tương tác với gen ức chế khối u P53 sau khi tế bào bị tổn thương Bakđược điều chỉnh bởi các thành viên khác của gia đình Bcl-2 Ví dụ, một sốprotein “chỉ có vùng BH3” (Bim và Bid) được báo cáo trực tiếp ràng buộc Bak
để chuyển đổi nó thành các dạng kích hoạt, trong khi protein tiền chết tế bàotheo chương trình (ví dụ như Bcl-xl và MCL-1) có thể cô lập sự hoạt động củaBak và do đó ngăn ngừa Bak homo-oligomerization và hình thành lỗ thẩm thấu.Vai trò của Bak ở mạng lưới nội chất là không rõ ràng [39]
Trang 23Hình 1.7 Sự tương tác chức năng của các thành viên họ
protein Bcl-2 ở màng ty thể (Nguồn: http://www.bloodjouRNAl.org) 1.1.4.5 Các nghiên cứu về Bcl-2, Bcl-xl, Bax và Bak trong ung thư
Một nghiên cứu trên 70 trường hợp dạ dày mạn tính, 49 trường hợp dị sảnruột, 64 trường hợp loạn sản và 81 trường hợp ung thư biểu mô tuyến dạ dàycho thấy: Tỷ lệ (+) của Bcl-2 và Bax cao nhất trong loạn sản vừa Trong dịsản ruột và loạn sản tỷ lệ (+) của Bcl-2 và Bax cao hơn trong viêm loét dạ dàymạn tính và ung thư biểu mô tuyến dạ dày Như vậy sự biểu lộ của Bcl-2 cũngnhư Bax có thể có giá trị trong dự báo sớm bệnh ung thư dạ dày cũng nhưtrong những tổn thương tiền ung thư [40] Trong khi Fulda và cộng sự đã báocáo rằng Bcl-2 biểu hiện quá mức dẫn đến ức chế chết tế bào theo chươngtrình trong các tế bào ung thư biểu mô nguyên bào thần kinh, glioblastoma và
vú [41] Ở bệnh nhân u lympho mạn tính, khi các tế bào này được nuôi cấytrong ống nghiệm, chết tế bào theo chương trình do thuốc trong các tế bàolympho B mạn tính tỷ lệ nghịch với tỷ lệ Bcl-2/Bax [29], [42] Cùng với đó,các nghiên cứu khác của Raffo và Mackey đã cho thấy biểu lộ quá mức củaBcl-2, tế bào ung thư tuyến tiền liệt được bảo vệ trước kích thích chết tế bào
Trang 24theo chương trình trong ống nghiệm [43] và tỷ lệ Bcl-2/Bax cao làm tăngnguy cơ ung thư không đáp ứng với xạ trị vì vậy nghiên cứu này cho thấy giátrị tiên lượng của tỉ lệ Bcl-2/Bax như một dấu ấn phân tử tiềm năng để dựđoán khả năng đáp ứng với xạ trị của các khối u tuyến tiền liệt Các nghiêncứu khác đã cho thấy đánh giá của các trạng thái biểu hiện của Bcl-2 bởi khối
u có thể cung cấp thông tin tiên lượng về các biểu hiện lâm sàng của ung thưphổi không phải tế bào nhỏ [44] Kết luận này cũng phù hợp với các nghiêncứu khác đánh giá giá trị tiên lượng của sự biểu lộ Bcl-2 [45], [46]
Nghiên cứu hồi cứu được thực hiện trên những bệnh nhân có khối u hắc tố
ác tính lan tỏa bề mặt (SSM, n = 44) hoặc khối u ác tính dạng nốt (n = 16) có
độ dày 1,5-4 mm Ba mươi bệnh nhân đã sống sót qua theo dõi 10 năm, trongkhi 30 bệnh nhân khác được phát triển di căn Phần khối u đã được phân tíchbằng hóa mô miễn dịch cho sự biểu hiện của các chất điều hòa của chu kỳ tếbào Trong SSM, giảm Bax và Bak được tương quan với tiên lượng xấu: Tỉ lệBax cao có liên quan đến tỷ lệ sống sót trong 10 năm, cụ thể: Bax cao tỉ lệsống sót trong 10 năm là 68%, trong khi Bax thấp chỉ có 26% sống sót, vàBak cao tỉ lệ sống sót trong 10 năm là 62%, trong khi Bak thấp chỉ có 10%sống sót Nghiên cứu này nhấn mạnh vai trò đặc biệt của con đường chết tếbào theo chương trình ty thể và các protein Bcl-2 liên quan cho sự tiến triểnkhối u ác tính [47]
Trong nghiên cứu của Olopade, Bcl-xl được biểu hiện quá mức 18 trong
42 (43%) bệnh ung thư vú xâm lấn khi so sánh với biểu mô vú bình thườngliền kề Phân tích protein bằng kỹ thuật Western blot với tám bệnh ung thư vúnguyên phát, năm dòng tế bào ung thư vú cho thấy Bcl-xl biểu lộ chiếm ưuthế Sự biểu lộ quá mức của protein Bcl-xl ở khối u này liên quan với tăng cấp
độ u và tăng số lượng di căn hạch Không có sự tương quan giữa mức độ biểuhiện protein Bcl-xl và tuổi tác, kích thước khối u, và tình trạng TP53 Tại một
Trang 25trung tâm, người ta theo dõi trong thời gian 216 tuần, thời gian sống nóichung giảm ở bệnh nhân có khối u biểu hiện tốt Bcl-xl Như vậy những pháthiện này cho thấy rằng biểu hiện của protein Bcl-xl được tăng lên đáng kể ởbệnh ung thư vú xâm lấn Ngược lại với biểu hiện Bcl-2, tăng điều chỉnh củaBcl-xl có thể là một dấu hiệu của sự tiến triển của khối u [48].
1.2 Những hiểu biết cơ bản về ung thư phổi
Ung thư phổi được chia làm hai loại chính: Ung thư phổi tế bào nhỏ vàung thư phổi không phải tế bào nhỏ, tùy thuộc vào hình dạng tế bào dưới kínhhiển vi Mỗi loại ung thư phát triển và lan theo những hướng khác nhau
Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ thường gặp hơn ung thư phổi tế bàonhỏ và nó thường phát triển và lan chậm hơn Có ba loại ung thư không phải
tế bào nhỏ chủ yếu Chúng được đặt tên theo týp tế bào từ đó ung thư pháttriển: Ung thư biểu mô tế bào vẩy (còn được gọi là ung thư biểu mô dạng biểubì), ung thư biểu mô tuyến và ung thư biểu mô tế bào lớn
Ung thư phổi tế bào nhỏ ít gặp hơn ung thư phổi không phải tế bào nhỏ.Loại ung thư này phát triển nhanh hơn và hay lan các bộ phận khác trong cơ thể
Những yếu tố nguy cơ của ung thư phổi
Ung thư phổi là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên toàn thếgiới Nguyên nhân gây ra ung thư phổi cho tới nay chưa được hiểu đầy đủ,qua các tài liệu nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy có một số yếu tố liênquan đến nguy cơ phát triển bệnh này Những yếu tố này bao gồm [49]:
Thuốc lá: Hút thuốc lá là nguyên nhân hàng đầu gây ung thư phổi Cácchất có hại được gọi là tác nhân gây ung thư, có trong thuốc lá làm tổn hại tớicác tế bào ở trong phổi Dần dần, những tế bào này có thể trở thành ung thư.Khói thuốc lá đến nay là yếu tố nguy cơ chính và quan trọng nhất đối vớibệnh ung thư phổi Nó gây ra hơn 80% của tất cả các ung thư phổi trên toànthế giới Các chất độc hại trong khói thuốc làm tổn thương các tế bào phổi
Trang 26Theo thời gian, các tế bào bị tổn thương có thể trở thành ung thư Đây là lí dotại sao hút thuốc lá có thể gây ung thư phổi Hít phải khói thuốc lá cũng có thểgây ung thư phổi ở những người không hút thuốc Một người tiếp xúc càngnhiều với khói thuốc lá, nguy cơ bị ung thư phổi càng cao Ngoài thuốc lá, xì
gà và thuốc lá tẩu cũng là một yếu tố nguy cơ Số năm hút thuốc, số lượng xì
gà và thuốc lá tẩu hút mỗi ngày, mức độ hít khói thuốc đều ảnh hưởng đếnnguy cơ bị ung thư phổi
Các yếu tố môi trường khác như khí radon, amiăng, ô nhiễm môi trường:Khi làm việc trong môi trường có tiếp xúc với khí radon, amiăng và các chấtgây ung thư như asen, niken, crom, nhựa đường cũng có thể làm tăng nguy cơnguy cơ ung thư phổi phát triển, đặc biệt nếu là một người hút thuốc Các nhànghiên cứu đã tìm ra mối liên hệ giữa bệnh nhân ung thư phổi và sự tiếp xúcvới một số chất gây ô nhiễm không khí nhất định, ví dụ như các sản phẩm phụsinh ra trong quá trình đốt dầu diesel và những nhiên liệu hóa thạch khác Tuynhiên, mối quan hệ này vẫn chưa được xác định một cách rõ ràng và vẫn đangđược tiếp tục nghiên cứu
Các bệnh phổi và tiền sử bản thân: Một số bệnh phổi như bệnh lao, bệnhphổi tắc nghẽn mạn tính làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư phổi Bỏ hút thuốc
lá sau khi được chẩn đoán ung thư phổi có thể ngăn ngừa nguy cơ bị ung thưphổi lần hai
1.3 Tổng quan về trinh nữ hoàng cung
Cây trinh nữ hoàng cung (TNHC) tên khoa học Crinum latifolium L.Thuộc họ thủy tiên: Amaryllidaceae, có khoảng 130 loài, phân bố ở vùng nhiệtđới Chi Crinum L ở châu Á có 17 loài, trong đó có 6 loài hay gặp ở Việt Nam làCrinum Latifolium L; Crinum amabile Donn; Crinum asiaticum L; Crinumgiganteum Andr; Crinum Ensifolium Roxb; Crinum morei Hoob F [50], [51]
Trang 27Theo tài liệu của Trung Quốc, TNHC còn gọi là: Thập bát học sĩ, Tâynam văn lang, Châu lan, Tỏi lơi lá rộng, náng lá rộng [50], [51] Ở Việt Namcây mọc tự nhiên và trồng nhiều ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và các tỉnhphía nam: Quảng Nam, Bình Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa- Vũng Tàu Nhândân ta dùng lá tươi hoặc phơi khô, một số dùng cả thân và củ để điều trịbệnh u xơ tử cung, u xơ tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư tử cung, ung thưtiền liệt tuyến [3], [51] Cây TNHC có nhiều ở các nước Đông Nam Á vàNhật Bản, gồm Việt Nam, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Philippin,Campuchia, Lào Ở Vân Nam (Trung Quốc) lá được dùngtrị sang lở độc,viêm tuyến vú, lở trĩ [51], [52].
1.3.1 Giới thiệu về cây trinh nữ hoàng cung
Trinh nữ hoàng cung (TNHC) là cây thuốc thảo mộc đã được dùng đểđiều trị bệnh trong dân gian Cây có thân như củ hành tây to cao khoảng 40-60cm, đường kính 10-15mm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài khoảng10-15cm, có chiều lá mỏng kéo dài từ 80-100cm, rộng 3-8cm, hai bên mép lálượn song Gân lá song song mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có mộtsống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím Hoa mọc thành tán gồm6-18 hoa, trên một cán dài 30-36cm Cánh hoa màu trắng có điểm màu đỏ tím.Bao hoa có 2 phần: Phần dưới hàn liền thành ống hơi cong, màu lục nhạt, dài8-10cm, rộng 5-7mm Phần trên là các thùy của đài và tràng gần giống nhau,hình thoi, đầu nhọn, màu trắng, dài 9-11cm Ba lá đài ở vòng ngoài rộng 1,7-2,2cm, mặt trong có vệt màu đỏ tía nhạt chạy dọc ở giũa Ba cánh hoa xếp xen
kẽ ở vòng trong rộng 2,3-2,7 cm, cả 2 mặt đều có vệt đỏ tía nhạt Sáu nhị đính
ở họng của bao hoa Chỉ nhị mảnh và cong, dài 7-8 cm Bao phấn mảnh, đínhlung, dài 1-2 cm Bầu dưới, hình trụ đến hình trứng ngược, dài 1,2-1,8 cm, rộng1-8 mm Vòi nhụy mảnh, dài 19-20 cm, núm nhụy không rõ; phần đầu của vòinhụy và chỉ nhụy đều có màu đỏ tía [51], [52]
Trang 28Hình 1.8 Cây trinh nữ hoàng cung (Nguồn: http://caythuoc.org)
1.3.2 Các công trình nghiên cứu về Trinh nữ hoàng cung
Năm 1984 Ghosal (Ấn Độ) đã phân lập và xác định từ cánh hoa TNHC mộtGluco-ancaloid có tên là Latisolin Thủy phân bằng enzym thu được aglycon cótên Latisodin Năm 1986 Ghosal còn công bố tách được một số dẫn chấtancaloid có tác dụng chống ung thư crinafolin và crinafolidin từ TNHC Năm
1989 ông còn chiết xuất từ dịch ép của cán hoa TNHC được 2 alcaloid mới cónhân pyrrolophennanthridin là: 2-epilycorin và 2-epipancrassidin
Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thànhphần hóa học của cây náng có tên khoa học lá Crinum latifolium L NguyễnThị Ngọc Trâm và cộng sự (1991) đã nghiên cứu chi tiết về cây TNHC: Xácđịnh được 43 alcaloid trong lá cây TNHC sau khi ra hoa, 23 alcaloid trong lácây thời kỳ cây ra hoa, 10 alcaloid thời kỳ đầu của cây Alcaloid Lycorin làchất chính lấy từ Crinum Latifolium L, có tác dụng kích thích tế bào lympho
T trên in vitro và chuột thực nghiệm và làm giảm khả năng sống của các tế
bào u Tách và làm sạch, xác định cấu trúc 2 chất: crinafolin, 1,2 beta epoxyambellin có tác dụng mạnh ở tế bào ung thư và hệ miễn dịch Nước sắcTNHC có tác dụng làm giảm khối u trên chuột thực nghiệm Các thí nghiệm
Trang 29in vitro của các phân đoạn chiết cho kết quả dương tính với cả 3 dòng tế bào:
ung thư gan, ung thư cơ tim và ung thư biểu mô [53]
Trần Công Khánh (1998) đã tổng kết các công dụng và hoạt chất của câyTNHC theo các tác giả Ấn Độ và Nhật Bản Tùy các bộ phận lá, thân hoa, rễhay toàn thân cây có các hoạt chất sau: Glucan, acid hữu cơ, saponin, acidamin, alcaloid [50], [51], [54]
Ngoài ra các nhà nghiên cứu như Nguyễn Công Hào, Trần Thị Việt Hoa,Nguyễn Thị Thùy Dương đã có nghiên cứu chi tiết về TNHC [53]
Nguyễn Xuân Hướng (2001) dùng trà nhúng trinh nữ hoàng cung điều trịphì đại lành tính tuyến tiền liệt Kết quả điều trị 97% có tác dụng tốt [55].Nguyễn Ngọc Dung, dùng trà trinh nữ hoàng cung điều 200 bệnh nhântrong thời gian 3 năm cho nhận xét: 80% bệnh nhân u xơ tuyến tiền liệt có kếtquả tốt Đối với u xơ tử cung, có giảm kích thước, giúp bệnh nhân cầm máu,giảm đau, cơ thể khỏe lên là 100% [56]
1.3.3 Giới thiệu về Crilin T
Cụm công trình nghiên cứu về cây Trinh nữ Crila đã tạo ra sản phẩmthuốc Crila và một số thực phẩm chức năng khác
Nguyễn Thị Ngọc Trâm cùng các cộng sự đã dày công khảo sát về thựcvật, nuôi trồng, thu hái cây TNHC, đặc biệt là đã định lượng được alcaloidtoàn phần trong lá cây TNHC Chiết suất ở lá cây đang nở hoa và sau khi nởhoa (tháng 4 đến tháng 9) để chế tạo thành viên nang Crila
Viên nang Crila đã được thử đã được thử độc tính tại Phòng nghiên cứuKhoa y học cổ truyền của Trường đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh(2002) Tháng 8/2003 thử độc tính bán trường diễn tại Phòng Đông y thựcnghiệm Bệnh viện Y học cổ truyền Trung Ương Kết quả không có sự thayđổi đáng kể về các chỉ tiêu sinh hóa, huyết học ở các lô thực nghiệm trước vàsau 2 tháng thử thuốc Trinh nữ hoàng cung [57]
Trang 30Ngày 30/7/2004 Cục quản lý Dược - Bộ Y tế đã có quyết định số QLD cho phép sản phẩm viên nang Crila được phép lưu hành trong các nhàthuốc bệnh viện [58] Lê Anh Thư (2004), dùng viên nang Trinh nữ hoàngcung điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt kết quả tốt là 96,1% giảm kíchthước tuyến tiền liệt, tăng lượng nước tiểu, giảm nhu cầu tiểu tiện [57].
93/QĐ-Bệnh viện Phụ sản Trung Ương (2005) đã thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1
và 2 về tác dụng của viên nang Crila trong điều trị u xơ tử cung đã có kết luận:Thuốc an toàn, không có tác dụng phụ, hiệu quả điều trị bệnh nhân có u xơ tửcung là 65,6%, giảm các triệu chứng rong kinh, rong huyết do u xơ gây ra [59].Viên nang Crilin T, một sản phẩm mới của cây Trinh nữ Crila (Crinumlatifolium L.var Crilae Trâm vs Khanh, var.n) có chứa các alcaloid và cácflavonoid của cây Trinh nữ Crila Crilin T có tác dụng tăng cường chức năng
miễn dịch chuyên nhiệm chống ung thư in vitro bởi làm tăng số lượng tế bào
Lympho T (đặc biệt là TCD8, TCD4) [5] và cũng làm tăng chế tiết các
cytokin IL-2 và TNFα in vitro của tế bào lympho người bình thường về lâm
sàng và của người bệnh ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn [6]
Sản phẩm này vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu và chưa được công bố
1.4 Giới thiệu về mô hình nghiên cứu trên chuột BALB/c Nude
Chuột BALB/c Nude là chuột không có tuyến ức, trụi lông được mô tảlần đầu tiên vào năm 1966 bởi Flanagan [60] Một đột biến gen duy nhất đãgây nên sự trụi lông vì vậy chúng thường được gọi là chuột “nude” Ngoài ra,đột biến này cũng gây ra sự thiếu hụt tuyến ức và dẫn đến hậu quả là sự suygiảm miễn dịch do sự thiếu hụt trầm trọng lympho T, do vậy dòng chuột nàythường được sử dụng trong nghiên cứu sinh học gồm các bệnh lý ung thư vàghép các ung thư dị gen bằng cách cấy các tế bào ung thư của người để tạo
khối u và nghiên cứu in vivo với nhiều mục đích khác nhau
Trang 31Trên thế giới và tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu đượcthực hiện trên mô hình chuột Nude [61], [62], [63] như công trình nghiên cứucủa Lin Song và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của HGC-MSC
từ mô ung thư dạ dày của con người lên sự phát triển, xâm lấn và quá trìnhchuyển đổi biểu mô-trung mô trong mô khối u của ung thư dạ dày trên chuộtNude [64] Tại Việt Nam, các nhà khoa học của Học viện Quân y đã nghiêncứu, ứng dụng thành công quy trình tạo khối ung thư vú, phổi, gan, và tuyếntiền liệt của người trên chuột nude Mô hình này đã được áp dụng trong nhiềucông trình nghiên cứu và bước đầu đã thu được những kết quả nhất định
Trang 32Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6/2016 - 8/2017
Các mô sinh thiết khối u chuột được thu thập tại Học viện Quân y và bảoquản tại Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch, Trường Đại học Y Hà Nội
Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào, chiết tách và phân tích RNA được thựchiện tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch, Trường Đạihọc Y Hà Nội
2.2 Đối tượng nghiên cứu
- Tế bào ung thư phổi người được cấy ghép trên chuột BALB/c nude đểtạo khối u, lấy mẫu sinh thiết khối u ở các nhóm chuột nghiên cứu vào ngàythứ 60 kể từ ngày tiêm tế bào ung thư phổi người vào chuột Có 10 chuột chialàm 3 nhóm nghiên cứu:
+ Nhóm chứng (n=3): Nhóm có khối u không được điều trị Crilin T+ Nhóm dự phòng (n=3): Nhóm bắt đầu dùng thuốc từ ngày tiêm tế bàodòng gây khối u
+ Nhóm điều trị (n=4): Nhóm dùng thuốc khi khối u đã đủ lớn 270mm3)
(20 Tế bào dòng phổi người bình thường: Tế bào CRL(20 2079 được nuôicấy trong môi trường keratinocyte_SFM và các điều kiện cần thiết khác
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm
Trang 332.4 Vật liệuvà dụng cụ nghiên cứu
2.4.1 Vật liệu nghiên cứu
- Chuột
BALB/c nude, thiếu hụt miễn dịch, thuần chủng, không có tuyến ức,không sản xuất được tế bào T, trụi lông, da bạch tạng Chuột nude và thức ănnuôi chuột được mua từ Hoa Kỳ, chuột được nuôi trong điều kiện vô khuẩntại Học viện Quân y (có màng lọc khuẩn không khí phòng chuột và mọi thaotác, dụng cụ, vật liệu xử dụng đều vô khuẩn)
- Thuốc
Viên nang Crilin T có hàm lượng 250mg do Công ty TNHH Thiên dượccung cấp được dùng đường uống với nồng độ cao là 0.08mg/ml môi trườngnuôi cấy (tương ứng liều 80mg/kg cân nặng)
Trang 342.5 Quy trình và kỹ thuật nghiên cứu
2.5.1 Quy trình nghiên cứu
Tách RNA
Điện di sản phẩm PCR và chụp ảnh
Tế bào ung thư phổi người/chuột Nude
Nhóm chứng
(Có u không điều
trị Crilin T)
Nhóm dự phòng (Bắt đầu dùng thuốc
từ ngày tiêm tế bào dòng gây khối u)
Nhóm điều trị (Dùng thuốc khi khối u đã đủ lớn)
Mẫu sinh thiết (Sau 60 ngày tiêm tế bào ung thư phổi gây khối u) Nhuộm HE
Thu thập thông tin và xử lí số liệu
Tế bào dòng phổi người bình thường
Điện di, đo OD
cDNA
PCR
Trang 352.5.2 Kỹ thuật nghiên cứu
2.5.2.1 Phương pháp gây ung thư phổi người trên chuột BALB/c nude:
Tiêm 7x106 tế bào ung thư phổi vào dưới da đùi mỗi chuột Theo dõitrong 15-18 ngày đến khi khối u đạt thể tích 18-272 mm3 thì cân chuột, đokích thước khối u và chụp ảnh chuột Tổng số 10 chuột được chia làm 3nhóm, bao gồm nhóm nhóm chứng (n=3), nhóm dự phòng ung thư (n=3) vànhóm điều trị ung thư (n=4)
Nhóm chứng được theo dõi sự phát triển của khối u
Nhóm dự phòng được uống Crilin T với liều 80mg/kg cân nặng/ngày,uống hàng ngày trong 7 ngày liên tục Thời gian bắt đầu uống cùng ngày vớitiêm tế bào ung thư phổi người
Nhóm điều trị là nhóm uống Crilin T với liều lượng và cách uống nhưnhóm dự phòng khi khối u đã phát triển đến kích thước như quy định (20-270mm3)
Sau đó cứ 3-5 ngày cân chuột và đo khối u một lần và giết chuột ở ngàythứ 60 kể từ khi tiêm tế bào ung thư phổi
2.5.2.2 Phương pháp nhuộm hematoxylin-eosin
Các bệnh phẩm khối u chuột sau sinh thiết qua nội soi được cố định bằngformon trung tính 10%, chuyển đúc trong paraffin Tất cả các khối nến(paraffin) được cắt bằng máy có độ dày 3-4µm và được tiến hành nhuộm tiêubản theo phương pháp H.E Các tiêu bản được đọc và đánh giá theo các tiêuchí: Sự phát triển của tế bào ung thư, sự thâm nhiễm của của tế bào lympho
và tổ chức liên kết trong u, đếm số lượng mạch máu tân tạo
Tiến hành
- Tiêu bản tẩy paraffin trong 3 lần xylen, mỗi lần 2’
- Loại xylen bằng cồn 100o, cồn 95o mỗi lần 2’
- Rửa nước chảy 5’
Trang 36- Nhuộm nhân trong một dung dịch Alum hematoxylin
- Rửa kỹ trong nước chảy cho tới khi mảnh cắt có màu xanh (khoảng 5’)
- Biệt hóa trong cồn acid 1% (1ml HCL nguyên chất trong 100ml cồn 70o)
- Rửa trong nước chảy cho tới khi mảnh cắt có màu xanh trở lại (khoảng 10’-15’)
- Nhuộm trong dung dịch Eosin Y 1% 10’
- Rửa nước chảy 3’
- Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối, làm trong và gắn lamelle
- Đọc kết quả
2.5.2.3 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dòng phổi người bình thường
- Tế bào sau khi được rã đông được cho vào môi trường nuôi cấy:Keratinocyte_SFM, Gentamycin 5µg/ml, DPBS 20µg/ml
- Để vào tủ ấm 37oC có 5% CO2
- Theo dõi hàng ngày trên kính hiển vi ngược
- Sau 5-7 ngày khi tế bào đã mọc kín vi trường thì tiến hành thu hoạch
Thu hoạch
- Hút bỏ dịch nổi
- Cho 10ml DPBS vào chai nuôi cấy sau đó hút bỏ
- Cho 1ml Trypsin1% vào chai, ủ ở tủ 370C trong 5-10 phút
- Soi trên kính hiển vi ngược khi > 90% tế bào bong ra khỏi bề mặt chai
- Hút dịch vào ống ly tâm thêm 1ml DPBS Ly tâm 1500 vòng trong 5phút ở 4oC
- Lấy cặn tế bào
2.5.2.4 Kỹ thuật xác định biểu lộ gen Bcl-2, Bcl-xl, Bax, và Bak ở mức độ mRNA
Bước 1: Chuẩn bị mồi
Mồi là một chuỗi các nucleotid tổng hợp (oligonucleotid) có độ dài từ18-30 nucleotid, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự 2 đầu mạch khuônmẫu Mỗi cặp mồi gồm mồi xuôi và mồi ngược, các mồi này phải không
Trang 37được tự bổ sung cho nhau, không hình thành cấu trúc kẹp tóc và đảm bảo
đủ dài để bắt cặp chính xác và đặc hiệu Trình tự các cặp mồi trong nghiêncứu này như sau:
a, Gen nội chuẩn B2M (Beta 2 microglobulin)[65]
Mồi xuôi, B2M -F: 5’-TCACCCCCACTGAAAAAGATG -3’
Mồi ngược, B2M -R: 5’- ATGATGCTGCTTACATGTCTCG -3’
b, Gen Bcl-2[66](NM_000633.2)
Mồi xuôi, Bcl-2_F: 5’-TCC ATG TCT TTG GAC AAC CA-3’
Mồi ngược Bcl-2_R: 5’-CTC CAC CAG TGT TCC CAT CT-3’
Kích thước: 203bp
c, Gen Bcl-xl [67](NR_131907.1)
Mồi xuôi, Bcl-xl_F: 5′-GTAAACTGGGGTCGCATTGT-3’
Mồi ngược, Bcl-xl_R: 5′-TGCTGCATTGTTCCCATAGA-3’
Kích thước: 198bp
d, Gen Bax [66](NM _001100121.1)
Mồi xuôi, Bax_F: 5’-TGTCTGTCTTGTCCCCTTCC-3’
Mồi ngược Bax_R: 5’-ACCTTGAGCACCAGTTTGCT-3’
Kích thước: 301bp
e, Gen Bak [68] (XM_011514779.2)
Mồi xuôi, Bak_F: 5′-TGAAAAATGGCTTCGGGGCAAGGC-3’
Mồi ngược, Bak_R: 5′-TCATGATTTGAAGAATCTTCGTACC-3’
Trang 38 Lấy mẫu sinh thiết từ tủ lạnh -80oC, khối lượng khoảng từ 50-100mg
và cho vào cối nghiền thủy tinh đã tiệt trùng
Cho 1ml Trizol vào cối và nghiền mảnh sinh thiết cho đến khi khôngcòn nhìn thấy mảnh tổ chức
Chuyển dịch nghiền tế bào sang tube nhựa 1,5ml và ủ ở nhiệt độ phòng 5’
Thêm 0,2ml dung dịch cloroform, đậy nắp, lắc đều 15” và để đứngtube ở nhiệt độ phòng 5’
Ly tâm không quá 12000 vòng x 15’ ở máy ly tâm lạnh +4ºC
Hút phần trên cùng sang tube mới, và bỏ phần phenol-chloroform ở dưới
Cho 0,5ml 2-propanol vào phần dịch thu được, trộn đều và ủ ở nhiệt
độ phòng 10’
Ly tâm không quá 12000 vòng x 15’ ở máy ly tâm lạnh +4ºC
Hút bỏ dịch phía trên và giữ lại cặn RNA
Cho 1ml cồn 75% vào tube, lắc đều bằng votex
Ly tâm 7500 vòng x 5’, ở 4ºC
Loại bỏ cồn, giữ lại cặn và để khô cặn RNA ở nhiệt độ phòng
Hòa tan RNA trong nước không có RNAase, khoảng 50-100µl tùytheo khối lượng mảnh sinh thiết, cất giữ RNA ở -80ºC
Bước 3: Kiểm tra sản phẩm RNA
RNA sau khi tách được đo OD bằng máy Smartspec Plus, để đảm bảonồng độ RNA và độ tinh sạch
Cách tiến hành
Việc kiểm tra chất lượng RNA có thể được thực hiện ngay sau khi chiếttách hoặc RNA lấy ra từ -80oC Hút 2µl dung dịch chứa RNA và nhỏ vào gelthạch agarose 0,8% trong 1xTBE và điện di bằng dòng điện một chiều.Nhuộm gel thạch bởi ethidium bromide và đọc kết quả dưới ánh sáng đèn
