Nhiều loại thảo dược, các sản phẩm thiên nhiên được sử dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, hoặc được dùng làm tiền chất cho tổng hợp hóa dược, hoặc cấu trúc của chúng được sử dụng như cá
Trang 1I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1 Đặt vấn đề
Các hợp chất thiên nhiên đã và đang đóng một vai trò ngày càng quan trọng trong cuộc sống, đặc biệt là trong lĩnh vực y dược nhằm nâng cao sức khỏe, phòng và chống các căn bệnh hiểm nghèo Nhiều loại thảo dược, các sản phẩm thiên nhiên được sử dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, hoặc được dùng làm tiền chất cho tổng hợp hóa dược, hoặc cấu trúc của chúng được sử dụng như các chất dẫn đường để tìm kiếm các dẫn xuất mới, có hoạt tính cao phục vụ việc phát triển thuốc chữa bệnh
Sơn trà (Eriobotrya Lindl.) là một chi nhỏ thuộc họ Hoa hồng
(Rosaceae), có xuất xứ từ Đông và Đông nam Châu Á Kết quả nghiên cứu
một vài loài Eriobotrya đã phát hiện ra nhiều hợp chất có cấu trúc hóa học và
hoạt tính sinh học lý thú
Cau chuột (Pinanga Blume) là một chi thực vật quan trọng của họ Cau
(Arecaceae), có nhiều loài đặc hữu của Việt Nam Một số loài thuộc chi
Pinanga được ứng dụng trong y học cổ truyền và cho đến nay, hầu như chưa
có công trình nào công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây trong chi này
Những cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên đã định hướng cho chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học hai loài
Sơn trà (Eriobotrya Lindl.) và một loài Cau chuột (Pinanga Blume) của Việt
Nam”
2 Mục tiêu của luận án
Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Sơn trà poilane (Eriobotrya poilanei), loài Sơn trà nhật bản (Eriobotrya japonica) và loài Cau chuột núi (Pinanga duperreana) để tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc hóa học và hoạt
tính sinh học lý thú nhằm khai thác tốt hơn nguồn tài nguyên thực vật này
3 Nội dung nghiên cứu của luận án
o Thu hái mẫu thực vật, xác định tên khoa học và xử lý mẫu;
o Điều chế các cặn chiết từ các mẫu thực vật thu hái được;
Trang 2o Phân lập các hợp chất từ các cặn chiết;
o Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được;
o Chuyển hóa hóa học hợp chất phân lập được có hàm lượng lớn;
o Thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập và các dẫn xuất chuyển hóa
4 Ý nghĩa khoa học của luận án
Luận án đã đóng góp những kết quả nghiên cứu mới về thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học của 2 loài Sơn trà (Eriobotrya) và loài Cau chuột núi (Pinanga duperreana) của Việt Nam, cùng một số dẫn xuất bán tổng hợp từ
axit ursolic Các kết quả của luận án tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo
về chi Sơn trà và chi Cau chuột nhằm khai thác và ứng dụng có hiệu quả các hoạt tính quý báu của chúng trong lĩnh vực y dược
5 Những đóng góp mới của luận án
- Đây là nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học của loài Eriobotrya poilanei và Pinanga duperreana ở Việt Nam và trên
thế giới
- Trong số các chất phân lập được từ 2 loài Eriobotrya có 7 chất lần
đầu tiên tìm thấy trong chi này, gồm có 5 tritecpen: axit arjunic (125); metyl
2α,3β-dihydroxyolean-12-en-28-oat (132); metyl
2α,3β-dihydroxyurs-12-en-28-oat (133); axit 2-O-axetyl-3β-O-(p-axetyl-trans-coumaroyl) alphatolic
(134) và axit 2α-O-axetyl-3β-O-(p-axetyl-cis-coumaroyl) alphatolic (135); 1
flavolignan: catiguanin B (128) và 1 ancol béo: hexatetracontan-1-ol (129)
và kiến nghị (2 trang) Phần Danh sách các hợp chất phân lập từ 3 cây nghiên cứu và các dẫn xuất chuyển hóa từ axit ursolic (9 trang); Danh mục các công
Trang 3trình khoa học đã công bố trong khuôn khổ luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (11 trang) với 103 tài liệu cập nhật đến năm 2011 Ngoài ra còn có 35 trang phần Phụ lục với các hình phổ
II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN
MỞ ĐẦU
Phần Mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Phần Tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế
1.3 Các hợp chất tritecpen thiên nhiên khung oleanan và ursan
1.4 Chuyển hóa hóa học của axit ursolic
Chương 2 – THỰC NGHIỆM
Phần Thực nghiệm trình bày về nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu, quá trình chiết tách, đặc điểm hóa lý và số liệu phổ của các chất được
phân lập từ lá cây E poilanei, E japonica, thân cây P duperreana và các
chất chuyển hóa được từ axit ursolic
Nguyên liệu: Mẫu cây Eriobotrya poilanei được thu hái tại rừng quốc
gia Bì Dúp, Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng vào tháng 3 năm 2009; mẫu cây E japonica được thu hái tại Tam Đảo, thuộc tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 8 năm 2010; mẫu cây Pinanga duperreana được thu hái tại Ba Vì, tỉnh Vĩnh Phúc
vào tháng 8 năm 2009 Các mẫu thực vật được TS Nguyễn Tiến Hiệp và CN Ngô Văn Trại xác định tên khoa học
Quy trình chiết: Mẫu thực vật được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ
Trang 440 0C, xay nhỏ và ngâm chiết bằng hỗn hợp dung môi metanol/nước (85/15)
ở nhiệt độ phòng sau đó chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan, etyl axetat (diclometan), n-butanol Cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các cặn chiết tương ứng
Phân lập các chất: Tinh chế các cặn chiết thu được bằng phương pháp
sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau như: silica gel, RP-18, sephadex
LH-20 và các hệ dung môi thích hợp
Xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc của các hợp chất được xác định
bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC…)
Phương pháp thử hoạt tính sinh học:
* Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định gồm 3 chủng vi khuẩn gram (-):
Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442, Escherichia coli (Ec) ATCC
25922, Salmonella enterica (Se); 3 chủng vi khuẩn gram (+): Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709, Bacillus subtillis (Bs) ATCC
6633, Lactobacillus fermentum N4 và 1 chủng nấm Candida albicans (Ca)
ATCC 10198
* Hoạt tính gây độc tế bào: các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC, gồm có: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu), ung thư vú (MCF7)
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Các chất phân lập từ cây Eriobotrya poilanei J E Vid
Từ lá cây E poilanei, 12 chất đã được phân lập gồm 7 tritecpen, 2
flavonoid, 2 phytosterol và 1 ancol béo Trong khi tinh chế cặn chiết etyl axetat,
có nhiều phân đoạn chứa hỗn hợp các chất có Rf sát nhau, rất khó khăn cho việc phân lập Do vậy, để tăng khả năng phân tách, phản ứng axetyl hóa các phân đoạn đó đã được tiến hành Vì vậy, trong số các chất phân lập được từ cặn chiết etyl axetat, có 4 chất thu được ở dạng sản phẩm axetyl
Trang 5 Axit ursolic (5): Chất 5 được phân lập dưới dạng bột màu trắng Phổ FT-IR
của nó cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl tại 3448 và nhóm cacboxyl tại 1691 cm-1 Phù hợp với số liệu phổ IR, phổ 1
H và 13C-NMR cho
thấy phân tử chất 5 có chứa 1 nhóm axit (C = 178,23), 1 tín hiệu của nhóm hydroxymetin (H = 2,98 m, C = 76,85 d), 1 nối đôi dạng >C=CH- [H = 5,11
(1H, t, J = 3,4), C = 138,17 s; 124,57 d] và 7 nhóm metyl, bao gồm 5 nhóm metyl bậc ba thể hiện qua các tín hiệu singlet ở H = 0,66; 0,73; 0,85; 0,88; 1,02
và 2 nhóm bậc 2 thể hiện qua các tín hiệu doublet ở H = 0,79 (3H, d, J = 6,4),
0,89 (3H, d, J = 8,7) Ngoài các tín hiệu kể trên, phổ 13C-NMR, DEPT còn cho thấy sự có mặt của 9 nhóm CH2, 3 nhóm CH cũng như 6 cacbon không gắn trực tiếp với hydro trong phân tử Với các số liệu phổ như đã phân tích có thể đưa ra
công thức phân tử của chất 5 là C30H48O3 và cấu trúc của nó được xác định là
axit ursolic nhờ so sánh với số liệu đã công bố
Andehid ursolic (120): Công thức phân tử của chất 120 là C30H48O2 được
rút ra từ pic ion phân tử tại m/z = 441,37346 [M+H]+
trong phổ HR-ESI-MS (theo tính toán cho C30H49O2: 441,37326) Phổ IR cho các đỉnh hấp thụ ở 3421
Trang 6(OH), 1718 cm-1 (CHO) Phổ 1H- và 13C-NMR rất tương tự như chất 5 chỉ có sự khác biệt duy nhất là nhóm axit trong chất 5 được thay bằng nhóm andehid ở chất 120 Điều này được thể hiện qua các tín hiệu ở H = 9,32 (1H, s) và C =
207,4 d Cấu trúc của chất 120 được xác định là andehid ursolic nhờ kết hợp so
sánh với số liệu phổ khối và phổ 1D-NMR trong tài liệu
Axit 3β-O-axetyl pomolic (121): Chất 121 được phân lập dưới dạng chất
rắn màu trắng Phổ HR-ESI-MS cho pic ion phân tử tại m/z = 515,37362
[M+H]+ (theo tính toán cho C32H51O5: 515,37365) Phổ 1
H và 13C-NMR cho thấy nó cũng có khung axit urs-12-en-28-oic, nhưng trong phân tử xuất hiện thêm một nhóm hydroxyl gắn với C-19, điều này thể hiện qua tín hiệu cacbon bậc 3 tại C = 73,09 và tín hiệu singlet của H-18 (H = 2,53) Các số liệu phổ cho thấy trong phân tử chỉ chứa một nhóm axetyl [H = 2,05 (s, 3H); C = 21,30 q; 171,03 s] và do đó suy ra phản ứng axetyl hóa chỉ thực hiện với nhóm hydroxyl
bậc 2 ở vị trị C-3 Số liệu phổ của 121 hoàn toàn phù hợp với dữ liệu phổ của
axit 3β-O-axetyl pomolic trong tài liệu
d 6 )
Chất 120 (CDCl 3 )
Andehid ursolic (CDCl 3 )
Chất 121 (CDCl 3 )
Axit 3 axetyl pomolic (CDCl 3 )
Trang 7 Axit 2-oxo-1,3-O-diaxetyl-19-hydroxyurs-12-en-28-oic (123): Công
thức phân tử của chất 123 được xác định là C34H50O8 từ pic ion phân tử m/z
= 587,35841 [M+H]+ (theo tính toán cho C34H51O8 là 587,35839) trong phổ HR-ESI-MS Phổ 1H, 13C-NMR, DEPT cho thấy phân tử 123 cũng là 1 tritecpen axit khung urs-12-en Sự khác nhau rõ rệt của chất 123 so với các
chất đã nêu là sự xuất hiện nhóm xeton C=O (C = 198,39) và 2 nhóm axetyl (H = 2,15 s, 6H; C = 20,47; 20,99 và 169,77; 169,90) trong phân tử Ngoài
ra, tương tự như chất 121, tín hiệu cacbon bậc 3 cộng hưởng ở 73,04 ppm,
chứng tỏ có nhóm hydroxyl gắn ở C-19 Hai proton của hai nhóm axetoxy metin xuất hiện dưới dạng tín hiệu singlet ở H = 4,37 và 4,33 (mỗi tín hiệu 1H) cho phép dự đoán hai nhóm axetyl được gắn vào C-1 và C-3, và nhóm xeton ở C-2 Các dự đoán trên được khẳng định khi so sánh số liệu phổ của
chất 123 với số liệu đã công bố của axit 2-oxo-1,3-O-diaxetyl-19hydroxyurs-12-en-28-oic trong tài liệu
- Axit 1,2,3-O-triaxetyl-19-hydroxyurs-12-en-28-oic (124): Chất
124 được tách ra ở dạng chất bột màu trắng, cho pic ion phân tử ở m/z =
Trang 8631 [M+H]+ trong phổ ESI-MS Phổ 1H và 13C-NMR của nó gần giống như
của chất 123, chỉ khác nhau nhóm thế ở C-2 Nhóm xeton trong chất 123 được thay thế bằng nhóm axetyl ở chất 124 Điều này thể hiện qua sự mất
tín hiệu của nhóm xeton và xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm axetoxy metin và một nhóm axetyl Tín hiệu triplet ở H = 5,45 (J = 3,7 Hz) được gán cho H-2; hai tín hiệu doublet ở H 4,77 và 4,70 (J = 3,7 Hz) là của H-1
và H-3, tương ứng
Bên cạnh đó, phổ COSY cho thấy tương tác giữa H-2 với H-1 và H-3
và cấu hình của các nhóm thế O-axetyl ở C-1, C-2 và C-3 được xác định thông qua hằng số tương tác 3,7 Hz của các proton H-1, H-2 và H-3 thể hiện mối tương quan axial-equatorial-axial của chúng Từ các số liệu phổ đã phân tích ở trên, cùng với phổ HSQC, HMBC và kết hợp với tài liệu, chúng tôi
xác định chất 124 là axit 1,2,3-O-triaxetyl-19-hydroxy oic
-O-Chất 124
Metyl
1,2,3 triaxetyl-19- hydroxy urs- 12-en-28-oat
Trang 920,47 q 2,15 (s) 2,16 (s)
170,05 s – 20,71 q 2,00 (s) 1,99 ( s)
21,37 q 2,08 (s) 2,08 (s) AcO-C3 169,90 s –
20,99 q 2,15 (s) 2,16 (s)
170,05 s – 20,89 q 2,02 (s) 2,02 (s)
Trang 10tại m/z 511,33940 [M+Na]+ (theo tính toán cho C30H48O5Na: 511,33994), tương ứng với công thức phân tử là C30H48O5 Số liệu phổ khối, kết hợp với
phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho phép dự đoán chất 125 là một tritecpen axit
khung oleanan Các tín hiệu singlet của 7 nhóm metyl bậc 3 ở H = 0,79; 0,84; 0,96; 0,99; 1,02; 1,04; 1,31 (mỗi tín hiệu 3H, s) củng cố cho giả thiết trên Ngoài ra phổ 1
H- và 13C-NMR còn cho thấy sự có mặt của 1 nối đôi dạng >C=CH- [H = 5,30 (1H, t, J = 3,4, H-12)]; C = 124,73 (C-12), 144,70 (C-13)]; 1 nhóm –COOH ở C = 182,65 và 3 nhóm oxymetin ở H = 3,63
(m); 3,28 (d, J = 3,7); 2,94 (d, J = 9,6) và C = 69,53; 82,48; 84,55 Bên cạnh các tín hiệu kể trên, phổ 13
C-NMR, DEPT còn cho thấy sự có mặt của 8 nhóm CH2, 3 nhóm CH cũng như 6 cacbon không gắn trực tiếp với hydro trong phân tử
23, C-24 Điều này càng khẳng định sự gán ghép các tín hiệu phổ là hoàn
toàn phù hợp Ngoài ra, hằng số tương tác giữa H-2 và H-3 khá lớn (J = 9,6
Hz), chứng tỏ 2 nhóm hydroxyl ở C-2 và C-3 không nằm trên cùng mặt phẳng phân tử Với các số liệu đã nêu trên và các tương tác trong phổ 2D-
Trang 11NMR (HSQC, HMBC, COSY), kết hợp so sánh với các số liệu đã công bố,
cấu trúc chất 125 được xác định là axit
2α,3β,19α-trihydroxyolean-12-en-28-oic hay axit arjunic Đây là lần đầu tiên axit arjunic được tìm thấy ở chi
Eriobotrya
Axit 2α,3β-O-diaxetylolean-12-en-28-oic (127):
So sánh phổ của chất 127 với chất 126 ta thấy rằng độ dịch chuyển hóa học và dạng vạch của các tín hiệu rất gần nhau, tuy nhiên phân tử 127 có ít hơn một nhóm hydroxyl so với chất 126 Điều này được thể hiện ở sự mất đi
tín hiệu của một nhóm oxymetin trong phổ 1
H- và 13C-NMR của 127 Tín hiệu
doublet của nhóm oxymetin C-19 ở vùng trường thấp ( δC 80,57) trong chất
126 đã bị thay thế bởi tín hiệu triplet (δC 46,2) ở phía vùng trường cao hơn
Như vậy phân tử 127 không có nhóm hydroxyl thế ở C-19 Mặc dù phổ 13
C-NMR của chất 127 không cho tín hiệu của nhóm cacboxyl, tuy nhiên độ
dịch chuyển của cacbon không gắn trực tiếp với hydro ở C-17 về phía vùng trường thấp (C = 46,51) và pic ion phân tử tại m/z 557,38424 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C34H52O6 trong phổ khối phân giải cao đã chứng tỏ
phân tử chất 127 có nhóm COOH ở C-17 Cấu hình của hai nhóm axetyl
được xác định là 2,3dựa vào giá trị hằng số tương tác lớn của H-2 với H-1
(J 2a-1a = 11,0 Hz) và H-3 với H-2 (J 2a-3a = 10,5 Hz) cùng 1 giá trị hằng số
tương tác nhỏ (J 2a-1e = 4,3 Hz), kết hợp so sánh với các chất tương tự trong tài
liệu Như vậy, cấu trúc của chất 127 được xác định là axit
2α,3β-O-diaxetylolean-12-en-28-oic qua các số liệu phổ như đã phân tích và so sánh với tài liệu đã công bố
3.1.2 Các hợp chất flavonoid
Chất 22:(-)-Epicatechin Chất 128:Catiguanin B
Trang 12 Catiguanin B (128): Chất 128 thu được ở dạng chất rắn, màu cam Phổ
IR của chất 128 cho các đỉnh hấp thụ ở 3413 (OH), 1728 cm-1
(C=O) Công thức phân tử là C25H22O10 được rút ra từ pic ion phân tử ở m/z = 483,12909 [M+H]+ (theo tính toán cho C25H23O10 là 483,12912) trong phổ HR-ESI-MS Phổ 1
H-, 13C-NMR và DEPT cho thấy chất 128 có chứa một đơn vị
epicatechin thể hiện qua các tín hiệu của vòng C, gồm có 2 nhóm metin gắn với oxy ở H = 4,92 (1H, br s, H-2); 4,25 (1H, m, H-3) và C = 80,07 (C-2); 66,83 (C-3); tín hiệu của nhóm metylen CH2-4 ở H = 2,82; 2,92 và C = 29,49 Bên cạnh đó, các proton thơm tương tác kiểu ABX của vòng B cũng được tìm thấy trong phổ 1
H-NMR, gồm có 2 doublet ở H = 6,79 và 7,00 với hằng số tương tác lần lượt là 8,2 và 1,5 Hz; 1 doublet kép ở H = 6,86 (J = 1,5 & 8,2 Hz) Các tương tác giữa H-2 với C-1' (132,08 ppm), C-2' (115,18 ppm) và C-6' (119,20 ppm) trong phổ HMBC khẳng định sự có mặt của đơn
vị epicatechin trong phân tử 128.
Ngoài ra, phổ NMR còn cho thấy các tín hiệu của 1 nhóm metin [H =
4,48 (1H, dd, J = 3,0 & 9,0 Hz) và C = 31,15], 1 nhóm metylen [H = 2,98
(1H, dd, J = 3,0 & 14,8 Hz); 2,50 (1H, dd, J = 9,0 & 14,8 Hz) và C = 44,78], 1 vòng benzen bị thế 4 lần trong đó có 2 nhóm thế là hydroxyl thể hiện qua tín hiệu singlet của 2 proton thơm ở H = 6,47 và 6,62 Bên cạnh đó
6 cacbon thơm trong đó có 2 cacbon dịch chuyển về vùng trường thấp ở C = 142,10 và 146,41 cùng 1 nhóm –COOMe [H = 3,60 s, và C = 174,65 s; 52,03 q] cũng được quan sát thấy trong phổ NMR
Phổ HMBC chỉ ra các tương tác giữa H-9 với C-7, C-8, C-1", C-2" và C=O chứng tỏ rằng C-9 liên kết với C-8 của vòng A và C-1" của vòng thơm
bị thế 4 lần Ngoài ra, các tương tác giữa H-10 với C-9, C-1” và C=O khẳng định sự nối kết của C-10 với C-9 và –COOMe Tương tác của một trong hai proton của nhóm CH2-10 ở 2,98 ppm với H-2’, H-6’ và H-6’’ trong phổ
ROESY chứng minh hóa lập thể của chất 128 như trong hình vẽ Cuối cùng cấu trúc chất 128 được xác định là catiguanin B khi so sánh với số liệu phổ
trong tài liệu.Theo tra cứu tài liệu của chúng tôi, đây là lần đầu tiên
catiguanin B được tìm thấy trong chi Eriobotrya
