Phân tích cấu trúc một số hợp chất flavonoid tách chiết từ vỏ hạt đậu xanh (vigna radiata) bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM THỊ THU HẰNG PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH VIGNA RADIATA BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ THU HẰNG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT

TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA)

BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ THU HẰNG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT

TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA)

BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thu Hà

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Văn Tuyến và TS Nguyễn Thị Thu Hà đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng – Viện Hóa học đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Hóa Học - Trường Đại Học Khoa Học Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên cứu khoa học, và các anh chị, các bạn học viên lớp K9B- lớp Cao học Hóa đã trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè và đồng nghiệp của tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Ngày tháng năm 2017

Học viên

Phạm Thị Thu Hằng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN a MỤC LỤC b DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT d DANH MỤC BẢNG f DANH MỤC HÌNH g DANH MỤC SƠ ĐỒ h

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về họ Đậu (Fabaceae), Chi Đậu (Vigna) và loài đỗ xanh (Vigna radiata) 3

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 4

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 4

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 7

1.3 Hợp chất Flavonoid 8

1.3.1 Phân loại 8

1.3.2 Các phương pháp định tính và định lượng 12

1.3.3 Các phương pháp chiết xuất flavonoid 14

1.3.4 Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid 15

1.4 Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các hợp chất tự nhiên 20

1.4.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13 C-NMR 20

1.4.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 22

1.4.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 23

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng 25

2.1.2 Hóa chất 25

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật 26

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên 27

2.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được 28

2.3.1 Hợp chất vitexin (MB1) 28

2.3.2 Hợp chất isovitexin (MB2) 29

2.3.3 Hợp chất luteolin (MB3) 29

2.3.4 Hợp chất Taxifolin (MB4) 30

2.3.5 Hợp chất Catechin (MB5) 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất vitexin (MB1) 32

3.2 Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất isovitexin (MB2) 37

3.3 Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất luteolin (MB3) 40

3.4 Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất Taxifolin(MB4) 43

3.5 Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất Catechin (MB5) 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

1 Kết luận 50

2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu/

Từ viết tắt

Tên tiếng anh Tên tiếng việt

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ

DEPT Distortionles Enhancement by

Polarization Transfer Phổ DEPT COSY Homonuclear Correlated Spectroscopy Phổ COSY

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác di hạt

nhân qua nhiều liên kết

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác trực

tiếp H-C

ESI-MS Electron Inoniziation-Mass Spectroscopy Phổ khối phun

sương mù điện tử

IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại

TLC Thin LayerChromatography Sắc ký bản lớp mỏng DMSO Dimethyl sulfoxide

Kí hiệu/

Từ viết tắt

Tên tiếng anh Tên tiếng việt

δH, δC

Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

dq: doublet of quartets

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB1 34 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB2 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây Đậu xanh (Vigna radiata) 3

Hình 1.2: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ hạt Đậu xanh (Vignaradiata) 7

Hình 3.1 Phổ ESI-MS của hợp chất MB1 32

Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất MB1 33

Hình 3.3 Phổ DEPT của hợp chất MB1 33

Hình 3.4 Phổ HSQC của hợp chất MB1 35

Hình 3.5 Phổ HMBC của hợp chất MB1 36

Hình 3.6 Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC của chất vitexin 36

Hình 3.7 Phổ ESI-MS của hợp chất MB2 37

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB2 38

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB2 39

Hình 3.9 Phổ 13C-NMR của hợp chất MB2 40

Hình 3.10 Công thức cấu tạo của hợp chất isovitexin 40

Hình 3.11 Phổ ESI-MS của hợp chất MB3 41

Hình 3.12 Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB3 42

Hình 3.13 Phổ 13C-NMR của hợp chất MB3 42

Hình 3.14 Công thức cấu tạo của hợp chất luteolin 43

Hình 3.15 Phổ ESI-MS của hợp chất MB4 43

Hình 3.16 Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB4 44

Hình 3.17 Phổ 13C-NMR của hợp chất MB4 45

Hình 3.18 Công thức cấu tạo của hợp chất taxifolin 45

Hình 3.19 Phổ ESI-MS của hợp chất MB5 46

Hình 3.20 Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất MB5 47

Hình 3.21 Phổ DEPT của hợp chất MB5 47

Hình 3.22 Phổ HMBC của hợp chất MB5 48

Hình 3.23 Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất catechin 48

Hình 3.24 Các hợp chất phân lập được từ dịch chiết EtOAc vỏ hạt đỗ xanh (Vigna radiata) 49

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ ngâm chiết vỏ hạt đậu xanh (Vigna radiata) 26

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của vỏ đậu xanh

(Vigna radiata) 28

MỞ ĐẦU

Từ thời xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng và bào chế ra những phương thuốc Y học cổ truyền từ những dược liệu có nguồn gốc tự nhiên Ngày nay cùng với sự phát triển của kỹ thuật tiên tiến và hiện đại, nhiều loại thuốc đã được ra đời Nhờ sự phát triển của hóa học và dược học, một số hoạt chất có trong dược liệu thảo mộc được phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc hóa học, tác dụng dược lý và sử dụng dưới dạng tinh khiết Tuy nhiên, đối với thuốc có nguồn gốc hóa dược, ngoài những ưu điểm nổi bật như hiệu quả điều trị cao,

dễ sản xuất, dễ sử dụng và bảo quản, thì vấn đề hạn chế lớn nhất cần phải quan tâm chính là những tác dụng phụ và độc tính kèm theo, đặc biệt trong trường hợp điều trị lâu dài đối với các bệnh mãn tính Vì vậy ngày nay người

ta có xu hướng trở về với tự nhiên

Do Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và

ẩm, được thiên nhiên ưu đãi nên nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho

sự phát triển của các chủng loại cây cỏ có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng hơn 14.000 loài thực vật bậc cao Trong đó, không ít loại cây được sử dụng làm thuốc rất hiệu quả, theo nghiên cứu có khoảng gần 4.000 loài được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền Nước ta có nền Y học cổ truyền hết sức đa dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử, nền y học dân tộc cũng không ngừng phát triển qua các thời kỳ đó Có những loại dược liệu thảo mộc hết sức thông dụng trong dân gian, nhưng lại được các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị liệu không thua kém gì so với các loại thuốc tân dược hiện nay Chính vì thế việc nghiên cứu để khai thác,

kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta

Cây Đậu xanh (Vigna radiata) là cây thực phẩm quan trọng thứ 3, sau

cây Đậu tương và cây Lạc Ngày càng nhiều các nghiên cứu khoa học cho thấy tác dụng tích cực của hạt Đậu xanh đối với sức khỏe con người Các nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy các hợp chất chính hạt Đậu xanh chứa chủ yếu các hợp chất flavonoid, với nhiều hoạt tính sinh học quí như chống oxy hóa, kháng viêm, chống miễn dịch, chống dị ứng, ngăn ngừa sinh tổng hợp và hấp thu cholesterol Do vậy, sự lựa chọn vỏ của hạt đậu xanh làm

đối tượng nghiên cứu của đề tài “PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA

RADIATA) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI” được đặt

ra với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:

* Mục tiêu nghiên cứu

1 Phân lập được một số hợp flavonoid từ vỏ của hạt đậu xanh (Vigna

radiata)

2 Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại IR; phổ khối lượng MS và đo điểm nóng chảy Mp

* Nội dung nghiên cứu

1 Thu thập mẫu lớn vỏ của hạt đậu xanh (Vigna radiata) để tiến hành

nghiên cứu

2 Phân lập một số hợp flavonoid từ vỏ của hạt đậu xanh

3 Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại IR; phổ khối lượng MS và đo điểm nóng chảy Mp

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về họĐậu(Fabaceae),Chi Đậu (Vigna) và loàiđỗ xanh (Vigna

radiata)

Những cây thuộc họ Đậu, chi Đậu thường là những cây bụi, cỏ, đứng thẳng hay leo trườn Lá đơn hoặc kép 1 lần lông chim Đặc trưng bởi hoa rất không đều (hoa cánh bướm), tràng tiền khai lợp úp; nhị 10, tất cả dính nhau thành ống hoặc chỉ 9 dính với nhau còn chiếc thứ 10 tự do; noãn cong hình móng ngựa và có chân ngắn [1]

Loài Đậu xanh hay đỗ xanh có tên khoa học là Vigna radiata, là loại cây

thảo, mọc đứng cao cỡ 50cm Lá có 3 lá chét, có lông ở cả hai mặt Chùm hoa ở nách lá Hoa màu vàng lục Quả đậu hình trụ mảnh, có lông, chứa nhiều hạt nhỏ hình trụ ngắn, gần hình cầu, thường có màu xanh Hoa tháng 8 - 10; quả tháng 3-

11 Bộ phận thường dùng là hạt, hay còn gọi là Lục dâu đậu xanh [2]

Hình 1.1: Cây Đậu xanh (Vigna radiata)

Nơi sống và thu hái: Cây của vùng nhiệt đới, được trồng rộng rãi ở đồng bằng và vùng núi Ở Việt Nam đậu xanh là loại đậu thường được sử dụng để làm xôi, làm các loại bánh ngọt, bánh đậu xanh, chè, hoặc được ủ cho lên mầm thành giá đỗ để làm thức ăn

Tính vị, tác dụng: Đậu xanh có thành phần dinh dưỡng cao, hạt chứa nước 14%; protid 23,4%, lipid 2,4%, glucid 53,10%, cellulose 4,7% Còn có các nguyên tố vi lượng Ca, P, Fe và các vitamin (tiền sinh tố A, B1, B2, PP,C) Còn có phosphatidyl choline, phosphatidylethanolamine, phosphtidylinositol, phosphatidylserine; phosphatidicacid

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Đậu xanh (Vigna radiata) là cây thực phẩm quan trọng thứ 3, sau cây

Đậu tương và cây Lạc Ngày càng nhiều các nghiên cứu khoa học cho thấy tác dụng tích cực của hạt Đậu xanh đối với sức khỏe con người Cây Đậu xanh là một vị thuốc quý giá mà thiên nhiên ban tặng và được mệnh danh là

“Thực phẩm của tương lai”

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Loài đậu xanh (Vigna radiata) có nguồn gốc ở Ấn Độ và Trung Á, từ

đó lan sang nhiều khu vực khác của châu Á và trên thế giới Cây đậu xanh có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với các vùng có điều kiện khắc nghiệt Ở châu Á cây đậu xanh được trồng nhiều ở các quốc gia như: Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Việt Nam, Campuchia, Lào, Philippines, Malaysia và Indonesia Sau này cây đậu xanh còn được trồng ở Trung Phi, các vùng khô

và nóng ở Nam Âu, phía Đông Bắc châu Úc, Nam Mỹ và miền Nam Hoa

Kỳ Nó được sử dụng như một thành phần trong các món ăn mặn và ngọt

Trong Đông y, hạt Đậu xanh có vị ngọt, hơi tanh, tính mát, không độc, có tác dụng điều hòa ngũ tạng, mát gan và buồng mật, bổ nguyên khí, chữa lở loét, làm sáng mắt Theo Y học hiện đại, Đậu xanh có thành phần dinh dưỡng rất cao với nhiều vitamin, acid folic và các khoáng chất, là nguồn cung cấp chất xơ hòa tan loại bỏ các độc tố trong cơ thể, ngăn ngừa các bệnh ung thư Trong đậu xanh còn có thành phần hạ mỡ máu hữu hiệu, giúp cho cơ

thể phòng chống chứng xơ cứng động mạch và bệnh cao huyết áp, đồng thời làm ổn định lượng đường trong máu nên rất tốt cho người bệnh tiểu đường Chuyên gia dinh dưỡng tại Đại học Kentucky - Lexington (Mỹ) và là tác giả của chương trình “Magic Bean” - hạt đậu xanh kỳ diệu, đã thực hiện rất nhiều nghiên cứu và ghi nhận nếu sử dụng đậu xanh nấu chín mỗi ngày có thể hạ thấp 20% lượng cholesterol trong 3 tuần, giảm đến 40% nguy cơ mắc bệnh tim mạch và huyết áp Các nghiên cứu trong những năm gần đây đã chỉ mầm hạt đậu xanh có các chất chuyển hóa thứ cấp phong phú hơn và hoạt tính sinh học đa dạng hơn dạng hạt ban đầu [3]

Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy hạt và mầm hạt Đậu xanh chứa chủ yếu các hợp chất flavonoid, với thành phần chủ yếu là vitexin (apigenin-8-C-β-glucopyranoside) và isovitexin (apigenin-6-C-β-glucopyranoside), chiếm hàm lượng khoảng 51,1 và 51,7 mg/g; 12 axit phenolic; 21 axit hữu cơ

và 16 chất béo đã được phát hiện bằng phương pháp sắc ký khí/phổ khối (GC/MS) [4]

Trong các ghi chép cổ, đậu xanh được biết đến với tác dụng giải độc và thanh lọc cơ thể Trên mô hình thực nghiệm, các protein, polypeptide, polysaccharides và polyphenol từ hạt, mầm và vỏ của đậu xanh đều cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tiềm năng Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết này trên hệ DPPH và 2,2'-azino-di- (3-etyl-2,3-dihydrobenzthiazoline -6-sulfonate) (ABTS) lần lượt là 11,33 ± 0,24 và 36,65 ± 0,63 mmol/g [5] Các nhà khoa học đã chứng minh khả năng bắt giữ gốc tự do của 100 g đậu xanh tương đương với 36,3 g trà xanh khô và 1462 mg vitamin C Hoạt chất Vitexin ức chế khoảng 60% gốc tự do DPPH ở 100 mg/mL và ngăn chặn hiệu quả các tế bào da chết do tia UV gây ra [6]

Trên mô hình tăng lipid máu, thỏ thử nghiệm được cho ăn một hỗn hợp 70% bột đậu xanh và mầm đậu xanh và kết quả làm giảm triệu chứng của bệnh động mạch vành [7] Khi nghiên cứu trên chuột khỏe mạnh được ăn dịch chiết đậu xanh trong 7 ngày, hàm lượng cholesterol tổng số đã giảm đáng kể Tác dụng này được cho là do thành phần phytosterol của đậu xanh, chúng có khả năng ngăn ngừa sinh tổng hợp và hấp thu cholesterol [8]

Ở liều 600 mg peptide/kg thể trọng, sau khi chuột được tiêm dịch chiết mầm va hạt đậu xanh từ 3-9 giờ đã làm giảm đáng kể huyết áp tâm thu và duy trì trong thời gian thử nghiệm từ tuần 1-4 [9]

Tác giả Yao Y và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu năm 2008 về tác dụng điều trị của dịch chiết mầm và vỏ hạt đậu xanh trên 2 loại chuột bị tiểu đường Các lô chuột được uống trong 5 tuần với nồng độ dịch chiết mầm đậu xanh là 2 g/kg và vỏ hạt đậu xanh là 3 g/kg thể trọng Kết quả cho thấy có sự giảm lượng glucose, cholesterol tổng số, triglycerides và urê máu, đồng thời nồng độ của insulin ở cả 2 lô chuột còn cải thiện rõ rệt [10]

Đậu xanh được chứng minh có khả năng chống tăng sinh tế bào qua thử nghiệm MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] trên dòng tế bào ung thư biểu mô (CAL27) và một số dòng tế bào ung thư khác như DU145, SK-OV-3, MCF-7, và HL-60) [11] Ở nồng độ 10 mmol/L

và sau 72 giờ, trypsin phân lập từ hạt đậu xanh có khả năng làm giảm xấp xỉ 50% sự di căn và tăng sinh của dòng tế bào ung thư ruột kết (SW480) so với nhóm đối chứng [12]

Các nhà nghiên cứu đã phân tích tác dụng chống viêm của dịch chiết cồn hạt đậu xanh bao gồm các polyphenol, acid gallic, vitexin, và isovitexin trên đại thực bào của chuột Kết quả hoạt động của các đại thực bào giảm rõ rệt thông qua việc ngăn ngừa biểu hiện gen gây viêm [13] Điều này cho thấy dịch chiết ethanol có tiềm năng rất lớn để cải thiện các triệu chứng lâm sàng của các bệnh liên quan đến viêm, như bệnh dị ứng và bệnh tiểu đường [14] Ở

nồng độ 20 mg/mL, genistein, acid phytic và acid syringic đã gây phản ứng miễn dịch, thúc đẩy sản xuất IFN-γ, mở ra nhiều triển vọng trong việc sử dụng hạt Đậu xanh để điều chế thuốc miễn dịch [15]

Hình 1.2: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ hạt Đậu xanh

(Vigna radiata)

Dịch chiết polyphenol từ mầm đậu xanh cũng được chứng minh có hoạt

tính kháng vi khuẩn Helicobacter pylori và chủng loại nấm như Rhizoctonia

solani, Coprinus comatus, Mycosphaerella arachidicola, Botrytis cinerea và

F oxysporum [16] Dịch chiết nước từ vỏ đậu xanh thể hiện khả năng kháng

khuẩn trên mô hình in vitro và in vivo [17]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, Đậu xanh đã được trồng từ lâu đời ở các vùng đồng bằng, trung du và miền núi suốt từ Bắc đến Nam Đậu xanh không chỉ là thực phẩm

mà còn được sử dụng làm thuốc chữa bệnh Sách "Nam dược thần hiệu" của

danh Y Tuệ Tĩnh viết: “Đậu xanh không độc, thanh nhiệt, có thể làm sạch mát nước tiểu, chữa lở loét, làm sáng mắt, trị được nhiều bệnh”… Đề cập đến tác dụng chữa bệnh của đậu xanh, đặc biệt là vấn đề giải độc, sách "Bản thảo cương mục" của Lý Thời Trân (đời Minh) có ghi nếu ăn uống bị ngộ độc, buồn bực trong người, có thể dùng đậu xanh để chữa trị Loại thực phẩm này

có tác dụng giải độc khi uống nhầm thuốc (thủy ngân, thạch tín ); uống thuốc quá liều (ô đầu, phụ tử…); giải độc do ngộ độc thức ăn, ngộ độc sắn, nấm

Các nghiên cứu về vỏ hạt đậu xanh ở nước ta cho đến nay cũng không

có nhiều Năm 1996, nhóm nghiên cứu của Trần Lê Vân Hiền và cộng sự đã công bố thành phần hóa học của chủ yếu trong vỏ hạt đậu xanh là flavonoid, chủ yếu là vitexin và isovitexin có tác dụng bảo vệ cơ thể chống phóng xạ, chống đột biến nhiễm sắc thể, ức chế rõ các phản ứng peroxide hóa trong cơ thể Trong một nghiên cứu khác, tác giả Nguyễn Thị Hương cũng đã phân lập được hai hoạt chất

vitexin và isovitexin từ vỏ của loài đậu này [18]

1.3 Hợp chất Flavonoid [19]

1.3.1 Phân loại

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa (màu vàng trong hoa hòe ).Về cấu trúc hoá học Flavonoid có khung cơ bản

là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon,

Isoflavan Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxyl tự do hoặc đã thay thế một phần, vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính axit

Trong thực vật, Flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với glucid (glycozit) Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycozit thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform

Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6 đều có 2 vòng thơm Tuỳ thuộc vào cấu tạo của mạch C trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các nhóm sau:

 Eucoflavonoid: Flavon, flavonol, flavanon, flavanol, chalcon, antocyanin, anthocyanidin

 Isoflavonoid: isolavon, isoflavanon, rotenoid

1.3.1.2 Isoflavonoid

Isoflavonoid bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3-ene, isoflavan-4-ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon, homo-isoflavon

Isoflavonoids tất cả không có màu sắc Nó được tạo thành từ axetat theo cơ chế đóng vòng với phenylalamine, cinnamate dẫn xuất được sát nhập vào vòng B và C-2,3, và-4 của dị vòng

OH Brasilin

4-aryl coumarin

Ví dụ calophyllolid trong cây mù u - Calophyllum inophyllum

1.3.1.4 Biflavonoid và triflavonoid

Những flavonoid dimer và trimer đã có nói đến trong phần flavan-3-ol

và flavan 3,4 diol Những hợp chất đó được gọi là proanthocyanidin Ở đây là những biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol, chalcon, dihydro chalcon, auron, isoflavon Biflavon cấu trúc gồm 2 đơn vị flavon được biết trước tiên Chất điển hình là amentoflavon tạo thành từ 2 phân tử apigenin nối theo dây nối cacbon-cacbon ở vị trí 3', 8''

1.3.2 Các phương pháp định tính và định lượng

1.3.2.1 Định tính

Một số phản ứng định tính (chủ yếu với nhóm euflavonoid)

- Tác dụng của FeCl 3: Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị

trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu

- Tác dụng của kiềm Nếu hơ một tổ chức thực vật như cánh hoa, nhát

cắt của gỗ hoặc tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì có màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương Chalcon và auron có thể cho màu đỏ da cam Một số nhóm khác như flavan-3-ol, flavanon, Error! Hyperlink reference not valid.màu không thay đổi Tuy nhiên nếu thực hiện trong ống nghiệm với dung dịch alkali thì một số dẫn chất flavan-3-ol lại cho màu vì dễ bị oxy hoá, còn flavanon dễ bị isomer hoá thành chalcon nên nếu để một lúc lại cho màu vàng đậm đến đỏ

- Tác dụng của H 2 SO 4 đậm đặc: Axit H2SO4 khi nhỏ lên các dẫn chất flavon, flavonol thì cho màu vàng đậm Đối với chalcon và auron cho màu đỏ,

đỏ thắm, đỏ tươi Error! Hyperlink reference not valid.cho màu đỏ cam rồi đỏ thắm, có thể do chuyển flavanon thành chalcon

- Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater)

Đây là phản ứng khử hay được sử dụng nhất để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm flavonoid Dung dịch flavonoid trong ethanol, thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẩm hoặc đỏ tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon Màu sắc đôi khi

có thể bị thay đổi tùy theo loại, số lượng, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất methoxy flavon (Tangeretin, Nobiletin) thì âm tính Để phân biệt giữa flavonoid glycosid và aglycon của chúng, Bryant đem lắc dung dịch có màu với octanol, nếu màu ở lớp dưới lên hết ở lớp octanol, chất thử là aglycon, nếu lớp octanol không màu, chất thử là glycosid

- Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm

Phản ứng thực hiện trên giấy thấm Nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì acetat trung tính hoặc kiềm Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoid Nếu tiến hành trong ống nghiệm, chì acetat kièm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì acetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm dihydroxyphenol

- Phản ứng ghép đôi với muối diazoni

Các dẫn chất flavonoid có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ

1.3.2.2 Định lượng

Tuỳ vào từng loại Flavonoid mà ta có phương pháp định lượng cụ thể khác nhau

 Flavon hoặc flavonol

+ Phương pháp cân: ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavon hoặc flavonol và dịch chất ít tạp chất

+ Đo màu: bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, Muối titan, chrom…

+ Phương pháp đo phổ tử ngoại

 Chalcon

 Phương pháp phân tích HPLC (sắc kí lỏng cao áp) Với pha động

là dung dịch acetonitrile và acid H3PO4 1% (phương pháp chuẩn trong phân tích)

 Phương pháp so màu: có nhiều phương pháp so màu khác

 Ciocalteu: (hỗn hợp muối phức Phương pháp Folin polyphosphotungstate- molydate)

+ Rất nhạy đối với chất khử, trong môi trường kiềm nhẹ thì sẽ bị khử thành sản phẩm phức molydenium tungsten có màu xanh

+ Sau đó đem đo độ hấp thu A (chalcon chỉ hấp thu mạnh ở 400 nm) Phương pháp Prussian Blue:

+ Hỗn hợp thuốc thử là FeCl3 và K3Fe(CN) 6 bị khử bởi các hợp chất phenol và tạo thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) có màu xanh

+ Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đó đem đo độ hấp thu A

 Phương pháp Diazotized

+ Dựa vào khả năng phản ứng ghép đôi với hợp chất diazo trong môi trường acid tạo thành hợp chất có màu vàng đặc trưng

+ Lắc đều, để yên dung dịch trong 1 giờ, sau đó đem đo độ hấp thu

 HCl: Tạo thành hợp chất có màu đỏ: Phương pháp Vanillin

1.3.3 Các phương pháp chiết xuất flavonoid

Không có phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và các dung môi hữu cơ Các flavonoid glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon

dễ tan trong dung môi kém phân cực Các dẫn chất flavon, flavonol có OH tự

do ở vị trí 7 hòa tan được trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hay etanol Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần lớn các flavonoid

Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết tủa.sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid thì flavonoid được giải phóng Để phân lập từng chất flavonoid người ta áp dụng

phương pháp sắc ký cột.chất hấp phụ thông dụng nhất là polyamid Có thể dùng celluose, silicagel Silicagel dùng để tách các chất flavanon, isoflavon, flavonol Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần

1.3.4 Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid

1.3.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa [20-22]

Quá trình oxi hóa khử là quá trình quan trọng và phổ biến trong mọi cơ thể sống Bình thường, các gốc tự do được tạo ra trong cơ thể để chống lại một

số các loại virut và vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi ở hàm lượng cao, các gốc

tự do này phản ứng với protein, lipit, ADN là nguyên nhân làm tăng tốc độ quá trình lão hóa cơ thể con người và là một trong các nguyên nhân của hơn 60 bệnh thường gặp: ung thư, các bệnh tim mạch như cao huyết áp, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim, mất trí nhớ tuổi già và nhất là quá trình lão hóa cơ thể

Vì vậy, việc đưa các chất chống oxy hoá như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa hoặc hỗ trợ điều trị các loại bệnh này

Flavonoid có hai tính chất quan trọng là bẫy gốc tự do và khả năng tạo phức với kim loại Cả hai chức năng kể trên đều có tính chất chống oxy hóa bằng cách cho electron và bẻ gãy chuỗi phản ứng tạo gốc tự do Cơ sở sinh hóa quan trọng nhất để flavonoid thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa của chúng là khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động Bên cạnh đó flavonoid có khả năng tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp như Fe+2, Cu+2… để chúng không thể xúc tác cho phản ứng Fenton sinh ra các gốc hoạt động nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa Các flavonoid có các nhóm hydroxyl ở vị trí

3, 5, 3', 4' có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại tạo phức oxycromon, oxycacbonyl hoặc 3', 4' orthodioxyphenol

Khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do của một số flavonoid theo thứ tự: myricetin > quercetin > rhammetin > morin > diosmetin > naringenin > apigenin > catechin > 5,7 dihydroxy-3', 4', 5' trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon

1.3.4.2 Tác dụng đối với các bệnh về tim mạch [22-24]

Các flavonoid như catechin và leucoanthocyan rồi đến flavonol, flavanon và một số chalcon… có thể có tác dụng làm bền thành mạch, làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm sức thấm vào mao mạch, có tác dụng dự phòng vỡ mao mạch, gây xuất huyết, gây phù thũng máu

Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc Các dẫn chất anthocyanoside có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và có tác dụng tăng thị lực

Trên hệ tim mạch, nhiều Flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của tim Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống

đỡ và hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng lên các cấu trúc màng tế bào của nó, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch

Các chất kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những người

có biểu hiện rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay cáu gắt…

1.3.4.3 Tác dụng đối với enzym [22-24]

Các flavonoid có khả năng tác động đến hoạt động của nhiều hệ enzym trong cơ thể Khả năng tương tác với protein là một trong những tính chất quan trọng nhất của các hợp chất flavonoid, quyết định hoạt tính sinh học của chúng Phản ứng xảy ra giữa nhóm oxyphenolic và oxycacbonyl của các nhóm peptit để tạo thành liên kết hydro Tính bền vững của liên kết phụ thuộc vào số lượng và vị trí các nhóm hydroxyl và kích thước phân tử của hợp chất phenol

Tuy nhiên, có một số tác giả cho rằng giữa phenol và nhóm amin của protein không có vai trò chính trong việc làm thay đổi hoạt tính enzym, họ đã nghiên cứu quá trình tiếp nhận một số chất polyphenol vào ty thể của gan chuột và kết luận rằng: sự liên kết của các polyphenol với các protein thường kèm theo những thay đổi cấu hình của phân tử protein enzym, bởi vậy một số polyphenol có hiệu ứng dị lập thể (chất điều hòa dị lập thể) đối với nhiều enzym trong tế bào động thực vật

Flavonoid có tác dụng trên nhiều enzym động vật như: protein-tyrozin kinaza, protein kinaza, lipooxygenaza, cyclooxygenaza, phospholypaza ADN topoizomeraza, glutathion S transferaza, aldoz reductaza, monoamin oxydaza, pyruvat kinaza, aldehyd và alcohol dehydrogenaza, amylaza, ARN polymeraza, AND polymeaza, AND ligaza-I ở người, ribonucleaza, hệ cytocrom P450,

elastaza, nitric oxide syntaza, oxydoreductase, peroxydase, caspase…

Bản thân các chất flavonoid khi ở trong cơ thể sống có thể tồn tại ở dạng oxy hóa hoặc khử và chịu nhiều biến đổi phức tạp khác nhau cho nên có thể trong các điều kiện khác nhau nó sẽ thể hiện hoạt tính sinh học khác nhau như kìm hãm hoặc kích thích hoạt động enzym hoặc kích thích có mức độ và

có điều kiện Ví dụ như flavonoid có khả năng:

- Làm tăng hoạt tính prolin hydroxylase, là một enzym quan trọng trong quá trình làm lành vết thương và tạo sẹo

- Kìm hãm các enzym lypoxygenase và enzym tổng hợp prostaglandin, chất chuyển các dạng acid béo không no về các dạng dẫn xuất chứa oxy trong

đó phải kể đến luteolin và 3', 4' dihydroxyflavon là các flavonoid có hoạt tính mạnh đối với cả hai loại enzym này, ở nồng độ 2×10-5M, chúng kìm hãm 50% họat tính lypoxygenaza

Nhờ tác dụng sinh học đối với enzym mà các flavonoid có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, mau chóng làm lành vết thương, giảm các nguy cơ về bệnh tim mạch

1.3.4.4 Hoạt tính kháng khuẩn [25-26]

Gần đây, các hợp chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc thảo mộc đang là đối tượng quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Tác dụng kháng khuẩn của flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới chứng minh

Về tác dụng kháng khuẩn một số tác giả nghiên cứu tác dụng của

anthocyanin, leucoanthocyanin và acid phenolic lên vi khuẩn Salmonella và

thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt Hầu hết các chất này có khả năng kìm hãm

sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza

Các nghiên cứu về cơ chế tác dụng kháng vi sinh của flavonoid còn rất

ít và có thể theo một giả thiết sau:

- Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit (yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc) không tổng hợp được

- Gắn lên màng nguyên sinh chất của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên sinh chất Vì vậy, làm một số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn như nucleotit, pyrimidin, purin lọt qua màng nguyên sinh chất ra ngoài

- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo hai kiểu: phong tỏa mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong tỏa transferaza chuyển acid amin từ ARN vào mạch làm mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra protein bất thường không có tác dụng đối với đời sống của vi khuẩn, làm chúng không sử dụng được

- Ức chế tổng hợp acid nucleic

- Tác dụng vào ADN khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi khuẩn

1.3.4.5 Hoạt tính kháng viêm [27-28]

Flavonoid đã được nghiên cứu và chứng minh có tác động kháng viêm theo nhiều cơ chế khác nhau Về hoạt tính kháng viêm của flavonoid, rất nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố và đã chứng minh sự liên quan giữa khả năng chống oxy hóa với khả năng ức chế enzym cyclo-oxygenase và enzym 5-lipooxygenase trong hoạt tính kháng viêm

Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon, flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon, isoflavon, biflavon, 4-aryl coumarin, 4-aryl chroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm là do các chất này ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin Các prostaglandin được tổng hợp và sử dụng ngay tại các mô với nồng độ rất thấp chỉ khoảng vài nanogam/gam Chúng có mặt ở khắp nơi trong cơ thể, phạm vi tác dụng sinh lý rất rộng lớn nên còn được gọi là hormon tổ chức Một số prostaglandin gây viêm và gây đau, prostaglandin còn làm tăng cảm thụ của thụ cảm thể với các chất gây đau như bradykinin

Hiện nay các flavonoid được nghiên cứu có tác dụng tốt đa phần là các flavonoid thiên nhiên như kaempferol, quercetin, catechin, chrysin… Theo các nghiên cứu, tác dụng sinh học của chúng nhờ vào sự có mặt của nhiều nhóm hydroxyl phenol Tuy nhiên, các nhóm hydroxyl tự do này cũng là nguyên

nhân làm tăng sự phân cực, hấp thu kém nên tác động in vivo thường không tốt như trong in vitro

1.3.4.6 Hoạt tính kháng ung thư [29]

Việc tìm kiếm các thuốc chữa ung thư từ thực vật là hướng đi của thời đại, được khoa học đặc biệt quan tâm Trong vài thập kỷ gần đây, nhiều loại thuốc đã được ra đời phục vụ y học song vấn đề tìm ra các loại thuốc có hiệu lực chữa trị ung thư vẫn còn là câu hỏi lớn đối với các nhà khoa học Trong

các hướng nghiên cứu nhằm tìm ra các hoạt chất có khả nǎng chống ung thư, flavonoid là một trong những lớp chất được quan tâm bởi chúng là những chất

có hoạt tính chống oxy hóa cao, tác dụng đến nhiều hệ enzym và ít độc đối với cơ thể sống Khi đưa vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các biến đổi sinh hóa học bằng cách trực tiếp hay gián tiếp như thông qua hoạt động của các enzym hay hệ thống thần kinh, nội tiết Các kết quả thực nghiệm cho thấy một số flavonoid có tác dụng chống ung thư thông qua khả năng hoạt hoá các enzym trong gan có nhiệm vụ chuyển hoá các chất gây ung thư Những sản phẩm chuyển hoá thường có tính gây ung thư thấp hơn Ngoài

ra, các flavonoid còn tham gia trong việc phòng chống ung thư bằng khả năng chống oxy hoá, loại trừ các gốc tự do có thể gây tổn hại tế bào, chống lại quá trình sao chép, chống sự tân sinh mạch máu

1.4 Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các hợp chất tự nhiên [30-31]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN)là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2

Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt

nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:

Trong đó:νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Trong đó:νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt

trong chất được khảo sát Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm) Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân

không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có

từ tính ở cạnh nhau Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết Giá trị J

phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa

các hợp phần của một vân phổ Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có

thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau

1.4.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e Sau

đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu

Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lượng cao để bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-) Năng lượng bắn phá các phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV Nhưng với năng lượng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn phá các phân tử ở mức năng lượng 70 eV Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá Quá trình này gọi là quá trình ion hóa Các ion ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e, tỉ số m/e được gọi là số khối z Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh Đây là một trong những

thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau

1.4.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất

Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước sóng khoảng 10-4 đến 10-6 m Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến Phần của vùng hồng ngoại được sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm trong giữa 2,5x10-4 và 16x10-6 m Đại lượng được sử dụng nhiều trong phổ hồng ngoại là số sóng (cm-1), ưu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ thuận với năng lượng

Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị

và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết

Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định,

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân

tử Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau

Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng Các pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Vỏ hạt đậu xanh (Vigna radiata) được thu hái tại Hà Nội vào tháng 3

năm 2016 Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hóa sinh ứng dụng, viện

Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Sắc ký cột (CC) sử dụng Silica gel Merck cỡ hạt 40-60 µm

- Sắc ký cột (CC) với pha tĩnh là Sephadex LH-20

- Thuốc hiện trong phân tích TLC: FeCl3, Ceri sulfat, Vanilin/ H2SO4 đặc

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

- Điểm nóng chảy được đo trên máy HMK 70/3159

- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy FTIR Impact-410

- Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC/MSD Agilen series 1100), sử dụng mode ESI và đầu dò DAD

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz với TMS là chất chuẩn nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật

Vỏ hạt đậu xanh (7 kg) phơi trong bóng mát cho khô tự nhiên Mẫu được ngâm chiết với cồn 70% bằng siêu âm trong 30 phút ở 40oC/3 lần, lọc lấy phần dịch và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn EtOH tổng Cặn EtOH tổng được phân bố lại trong hỗn hợp cồn nước, sau đó

chiếtvới dung môi n-hexan/2 lần, thu phần dịch n-hexan để cất loại dung môi thu được cặn n-hexan (120 g) Tiếp theo, axit hóa phần cồn nước bằng axit

HCl và chiết với ethyl acetat 4 lần, thu lấy phần dịch EtOAc, cất loại dung môi thu được cặn etyl acetat (680 g) Loại bỏ nước ở phần dịch còn lại thu

được cặn nước (800 g)

Quá trình ngâm chiết vỏ hạt đậu xanh được trình bày trong Sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ ngâm chiết vỏ hạt đậu xanh (Vigna radiata)

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên

Cặn chiết ethyl acetat vỏ hạt đậu xanh(100 g) được phân tách sơ bộ

trên cột silicagel (150 g) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/EtOAc

gradient rồi đến hệ EtOAc/MeOH gradient, thu được 19 phân đoạn ký hiệu

từ F1 đến F19

Từ phân đoạn F5 (3 g) được rửa giải trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu được 6 phân đoạn nhỏ từ F5.1 - F5.6 Kết tinh phân đoạn F5.2

trong hỗn hợp dung môi n-hexan/EtOAc (8/2) thu được chất MB3 (12 mg)

dưới dạng tinh thể màu vàng Phân đoạn F7 (20 g) được phân tách trên cột

sillicagel với hệ dung môi n-hexan /EtOAc gradient, thu được 12 phân đoạn

nhỏ kí hiệu từ F7.1-F7.12 Từ phân đoạn F7.3 (80 mg), phân tách trên cột Sephadex LH-20 dung môi MeOH thu được 4 phân đoạn nhỏ F7.3.1- F7.3.4 Phân đoạn nhỏ F7.3.1 được tinh chế bằng sắc ký bản mỏng điều chế với hệ

dung môi n-Hexan/EtOAc (3/7) thu được chất rắn màu vàng ký hiệu MB4

(10 mg) Phân đoạn F10 (34 g) được phân tách trên cột sillica gel

CH2Cl2/MeOH gradient, thu được 15 phân đoạn nhỏ kí hiệu từ F10.1-F10.15 Tinh chế phân đoạn F10.3 trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu

được chất MB5 (5mg) Phân đoạn F16 (26g) được phân tách trên cột sillica

gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient được 10 phân đoạn nhỏ F16.10 Từ phân đoạn F16.5 (140 mg) tinh chế trên cột Sephadex LH-20 và sắc ký bản mỏng điều chế thu 3 phân đoạn kí hiệu từ F16.5.1-F16.5.3 ĐCBM

F16.1-phân đoạn F16.5.2 với hệ dung môi EtOAc/MeOH (9/1) thu được chất MB2 (7 mg) và MB1 (10 mg)

Quá trình phân lập các chất từ cặn EtOAc của vỏ hạt đậu xanh được

trình bày trong Sơ đồ 2.2

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của vỏ đậu xanh

(Vigna radiata)

2.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được

2.3.1 Hợp chất vitexin (MB1)

Chất rắn màu vàng, đnc: 247-249ºC

13 C-NMR: (CD3OD, 125 MHz) (ppm) 183,9 (C-4); 166,4 (C-7); 166,0 (C-2); 163,2 (C-9); 159,4 (C-5); 151,0 (C-4’); 147,0 (C-3’); 123,7 (C-1’); 120,3 (C-6’); 116,8 (C-5’); 114,2 (C-2’); 105,3 (C-10); 103,9 (C-3); 100,1 (C-6); 95,0 (C-8)

d, J = 11,5 Hz, H-2)

13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC (ppm) 198,2 (C-4); 169,5 (C-7); 165,3 (C-5); 164,5 (C-9); 147,1 (C-4’); 146,3 (C-3’); 129,9 (C-1’); 120,9 (C-

2’); 116,1 (C-6’); 115,9 (C-5’); 101,6 10); 97,5 6); 96,5 8); 85,1 2); 73,6 (C-3)

(C-2.3.5.Hợp chất Catechin (MB5)