luận văn dòng hóa gen VP2

Phản ứng này được thựchiện qua hai bước: bước thứ nhất chạy PCR với hỗn hợp 21 oligonucleotides, bước thứhai chạy phản ứng PCR với hai mồi chuyên biệt TSV885-FP và TSV855-RP nhằm chèntrì

CBHD: Nguyễn Hùng Anh GVHD: ThS Trần Hồng Bảo Quyên SVTH: Vũ Đình Dũng

Lớp : DHSH4 MSSV: 08220641

Trường Đại học Công nghiệp TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN: ………

HỌ VÀ TÊN: ………MSSV: ………

NGÀNH: ………LỚP: ………

1 Đầu đề luận án: ………

………

………

2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu): ………

………

………

………

……… ………

………

………

3 Ngày giao nhiệm vụ luận án: ………

4 Ngày hoàn thành nhi ệm vụ: ………

5 Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn: 1/……… …… ………

2/……… ………

Nội dung và yêu cầu LATN đã được thông qua Ngày … tháng … năm ………

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) PHẦN DÀNH CHO VIỆN Người duyệt (chấm hồ sơ):………

Đơn vị: ………

Ngày bảo vệ: ……… …………

Điểm tổng kết: ………

Nơi lưu trữ luận án: ………

Trường Đại học Công nghiệp TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ Độc lập – Tự do – Hạnh phúc SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM Ngày … tháng … năm ……

PHIẾU CHẤM BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP (Dành cho người hướng dẫn / phản biện) 1 Họ và tên SV: ………

MSSV: ……… Ngành (chuyên ngành): ………

2 Đề tài: ………

………

………

3 Họ tên người hướng dẫn / phản biện: ……… ………

4 Tổng quát về bản thuyết minh: Số trang: ……… Số chương: ………

Số bảng số liệu: ……… Số hình vẽ: ………

Số tài liệu tham khảo: ……… Phần mềm tính toán: ………

Hiện vật (sản phẩm): ………

5 Tổng quát về số bản vẽ: - Số bản vẽ: ……… Bản A1: ……… Bản A2: ………… Khổ khác: …………

- Số bản vẽ tay: ………

6 Nhận xét: ………

………

………

……… …………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

7 Đề nghị: Được bảo vệ  Bổ sung thêm để bảo vệ  Không được bảo vệ 

8 Câu hỏi SV phải trả lời tr ước Hội đồng (CBPB ra ít nhất 02 câu): a ………

………

b ………

………

c ………

………

Đánh giá chung (Bằng chữ: giỏi, khá, TB): Điểm: ……./10

Ký tên (ghi rõ họ tên)

Trường Đại học Công nghiệp TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ Độc lập – Tự do – Hạnh phúc SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

Ngày … tháng … năm ……

PHIẾU CHẤM BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1 Họ và tên SV: ………

MSSV: ……… L ớp (ngành): ………

2 Đề tài: ………

3 Phần đánh giá và cho điểm của UV hội đồng (theo thang 10 điểm) …………

a – Trình bày: …………

b – Trả lời câu hỏi: …………

c – Thái độ, cách ứng xử, bản lĩnh: …………

Tổng cộng: ………

Điểm trung bình do 1 UVHĐ cho: ………

Ký tên Trường Đại học Công nghiệp Tp HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ Độc lập – Tự do – Hạnh phúc SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM Ngày … tháng … năm …………

PHIẾU CHẤM BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1 Họ và tên SV: ………

MSSV: ……… L ớp (ngành): ………

2 Đề tài: ………

3 Phần đánh giá và cho điểm của UV hội đồng (theo thang 10 điểm) …………

a – Trình bày: …………

b – Trả lời câu hỏi: …………

c – Thái độ, cách ứng xử, bản lĩnh: …………

Tổng cộng: ………

Điểm trung bình do 1 UVHĐ cho: ………

Ký tên

Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Hùng Anh và chị Dương Vân Anh phòng công nghệ sinh học y dược và phòng công nghệ sinh học thuỷ sản đã hướng dẫn và giúp đỡ hết sức tận tình để em có thể hoàn thành bài khoá luận này

Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Sinh học Viện công nghệ sinh học – thực phẩm, ThS Trần Hồng Bảo Quyên đã giúp đỡ, tạo điều kiện để em có thể hoàn thành bài báo cáo này một cách tốt nhất

TÓM TẮT

Protein viral protein-2 (VP2) là protein vỏ virus của virus gây hội chứng Taura ở tôm thẻchân trắng Protein sau khi tinh sạch được sử dụng làm nguồn kháng nguyên nhằm thunhận kháng thể phục vụ cho các thử nghiệm ELISA Đoạn gene VP2 được tổng hợpnhanh và đơn giản bằng phản ứng Assembly PCR (PCR ghép) Phản ứng này được thựchiện qua hai bước: bước thứ nhất chạy PCR với hỗn hợp 21 oligonucleotides, bước thứhai chạy phản ứng PCR với hai mồi chuyên biệt TSV885-FP và TSV855-RP nhằm chèntrình tự nhận biết của hai enzyme BamHI và HindIII vào gene VP2 Quy trình được tối ưu

hoá bằng cách sử dụng enzyme Pfu polymerase (Fermentas, CA, USA) với 20 chu kỳ cho

phản ứng PCR lần 1 ở nhiệt độ bắt cặp là 55 oC và 30 chu kỳ cho phản ứng PCR lần 2.Sau đó tiến hành dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2 (Fermentas, CA, USA) Sáuclone được lựa chọn để tách plasmid và tiến hành giải trình tự, đánh giá tỉ lệ đột biến củaphản ứng Assemby PCR Trong thí nghiệm hoạt hoá đĩa ELISA bằng Self-assemblymonolayers chúng tôi sử dụng hỗn hợp dung dịch 47% HNO3/H2SO4 và APTES để biếnđổi bề mặt polystyren với nhóm chức amin (-NH2) Kháng thể bắt cũng được hoạt hóanhóm carboxyl (-COO) bằng EDC/NHS trước khi gắn lên đĩa Kết quả thu nhận được tínhiệu quang học (OD 595 nm) của phương pháp hấp phụ kháng thể bằng hóa bề mặt caohơn phương pháp hấp phụ kháng thể bằng phương pháp vật lý thông thường, như vậylượng kháng thể hấp phụ lên bề mặt đã được cải thiện đáng kể Cũng bằng phương pháphoạt hoá này chúng tôi thu nhận được giá trị OD đồng nhất và ổn định khi kiểm traELISA với mẫu kháng nguyên GST dạng sigma Hai kỹ thuật này cho phép dòng hóanhanh một đoạn gene hiếm, khó phân tách mRNA và đồng thời tăng hiệu quả củaphươngpháp ELISA

MỤC LỤC

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1

LỜI CẢM ƠN 5

TÓM TẮT 6

MỤC LỤC 7

DANH SÁCH HÌNH VẼ 9

DANH SÁCH BẢNG 10

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT 11

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 12

1.1 Đặt vấn đề: 12

1.2 Mục tiêu đề tài: 13

CHƯƠNG 2: GIỚI THIỆU 14

2.1 Virus Taura và con đường gây bệnh: 14

2.2 Phương pháp Assembly PCR: 14

2.3 Những nguyên nhân gây đột biến trong phản ứng Assembly PCR: 16

2.4 Phương pháp dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2: 18

2.5 Phương pháp cải thiện độ nhạy và tín hiệu của phương pháp ELISA: Self-assembly monolayers (SAMs): 19

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

3.1 Vật liệu: 22

3.1.1 Hoá chất và môi trường: 22

3.1.2 Nguyên liệu: 23

3.2 Phương pháp: 26

3.2.1 Phương pháp Assembly PCR: 26

3.2.2 Phương pháp dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2 (Fermentas, Mỹ): 28 3.2.3 Phương pháp Bradford: 29

3.2.4 Phương pháp hoạt hoá bề mặt polystyren đĩa ELISA: 30

3.2.5 Phương pháp hoạt hoá gốc carboxyl (–COO) của kháng thể bắt: 30

3.2.6 Phương pháp gắn kháng thể mouse anti-GST monoclonal antibody với

HRP (Avrameas, 1969): 31

3.2.7 Phương pháp sandwich ELISA: 32

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33

4.1 Kết quả phản ứng Assembly PCR: 33

4.2 Kết quả dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2 (Fermentas, USA): 34

4.3 Kết quả phân tích đột biến trong PCA: 44

4.4 Kết quả hoạt hoá bề mặt polystyren của đĩa ELISA: 47

4.5 Kết quả gắn mouse anti-GST monoclonal antibody với enzyme HRP: 48

4.6 Kết quả kiểm tra hoạt lực của kháng thể sau khi gắn với HRP: 49

4.7 Kết quả sandwhich ELISA: 50

4.8 Kết quả độ đồng nhất và ổn định của phương pháp ELISA: 52

CHƯƠNG 5: THẢO LUẬN 54

5.1 Tổng hợp gene VP2 bằng phương pháp Assembly PCR: 54

5.2 Phương pháp SAMs tăng độ nhạy và ổn định của phương pháp ELISA: 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH SÁCH HÌNH VẼ

Hình 2.1 Sơ đồ hoạt hoá bề mặt polystyren

Hình 3.1 Cấu trúc vector pJET1.2 (Fermentas, Mỹ)

Hình 3.2 Thang DNA 100 bp và 1 kb (Fermentas, Mỹ) Thang protein 10-250 kDa

Hình 4.1 Kết quả phản ứng Assembly PCR

Hìn 4.2 Kết quả colony PCR của E.coli DH5α pJET1.2-VP2

Hình 4.3 Kết quả kiểm tra bằng phản ứng cắt hạn chế vector pJET1.2-VP2 bằng BamHI vàHindIII

Hình 4.4 Kết quả BLAST các trình tự trên NCBI

Hình 4.5 Kết quả phân tích Rare codon bằng công cụ Rare codon tool

Hình 4.6 Biểu đồ độ hấp thụ của kháng thể lên bề mặt đĩa sau khi hoạt hoá

Hình 4.7 Kết quả gắn kháng thể với enzyme HRP

Hình 4.8 Kết quả kiểm tra hoạt lực của kháng thể sau khi gắn HRP ở các độ pha loãng khác nhau

Hình 4.9 Biểu đồ kết quả ELISA ở bước sóng 415 nm

Hình 4.10 Độ đồng nhất tín hiệu OD 415 nm khi tiến hành gắn đĩa với kháng thể đa dòng thỏ kháng GST bằng các phương pháp khác nhau

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Bảng quy trình xây dựng đường chuẩn protein bằng BSA 1 mg/ml

Bảng 2 Bảng so sánh các giá trị Query coverage và Max identity của sáu clone so với trình

tự gốc (BLZ02TSV, Accession number: AY826052.1) được sử dụng để khuếch đại gene VP2 trong phản ứng PCA

Bảng 3 Tỉ lệ đột biến của 6 clone khi so sánh với trình tự gốc của BLZ02TSV ( Accession number: AY826052.1) trên NCBI

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

AUC: The area under the curve

CAI: Codon Adaptation Index

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

PCR: Polymerase Chain Reaction

PCA: Polymerase Chain Assembly

TSV: Taura Syndrome Virus

ROC: Receiver operating characteristics

SAMs: Self-Assembly Monolayers

virus Picornavirus, thuộc họ Picornaviridae, có dạng hình cầu 20 mặt, kích thước khoảng

31- 32 nm Hệ thống gen là một mạch RNA Virus ký sinh tế bào biểu mô và dưới biểu

mô đuôi Hội chứng Taura thường gặp ở tôm thẻ chân trắng (L.vannamei , Penaeus

vannamei) ở giai đoạn nuôi từ 14-45 ngày tuổi, cỡ 0,05-7,0 g Bệnh TSV cũng có thể

nhiễm trên tôm thương phẩm, tôm sú (P monodon), tôm he Nhật Bản (P japonicus) và

một số loại tôm khác (Lightner D.V et al., 1996)

Từ năm 1999 việc nhập nuôi tôm thẻ chân trắng đã vô tình đưa virus hội chứngTaura (TSV) vào Việt Nam Bệnh TSV trên tôm thẻ chân trắng thường khó phát hiệnbằng mắt thường do đường kính của bệnh phẩm rất nhỏ và trôi nổi trên môi trường nuôi.Dịch bệnh TSV rất nguy hiểm, thời gian ủ bệnh cao, lan truyền rất nhanh, có thể gây chết

từ 50 - 80% ở tôm nuôi (Niti Chuchird et al., 2005) Bệnh có thể chẩn đoán bằng các xétnghiệm lâm sàng, phương pháp mô học hoặc bằng các thử nghiệm ELISA, kiểm tra RT-PCR Đây là những phương pháp giúp xác định nhanh và chính xác tôm nhiễm bệnh.Trong đó, phương pháp ELISA là phương pháp có độ nhạy và độ tin cậy cao, dễ dàngthực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm vừa và nhỏ

Thông thường để dòng hoá một đoạn gene mục tiêu từ genome virus người ta tiếnhành phân lập mRNA mục tiêu từ RNA tổng số của virus ở các vùng mô bị bệnh sau đóthực hiện phản ứng RT-PCR để tổng hợp đoạn cDNA từ mRNA trên Tuy nhiên việcphân lập mRNA thường khó khăn do lượng RNA mục tiêu trong mô bệnh rất ít và dễ bịphân hủy Để giải quyết vấn đề trên, chúng tôi sử dụng phương pháp Assembly PCR

(PCR ghép) hay còn gọi là PCA (Polymerase Chain Assembly) Phương pháp này giúptổng hợp nhanh đoạn gene VP2 mà không cần tách chiết mRNA Phản ứng PCA trải quahai bước: bước đầu tiên là thực hiện phản ứng PCR ghép nối các đoạn oligonucleotide vớinhau thông qua các đoạn overlap để tổng hợp nên đoạn gene mục tiêu, bước thứ hai làkhuếch đại đoạn gene mục tiêu trên bằng cặp mồi chuyên biệt Tuy nhiên phương phápnày cũng cho tỉ lệ đột biến cao.

Để xây dựng một quy trình sản xuất kit ELISA, ngoài việc nắm vững kỹ thuật sảnxuất protein tái tổ hợp và kháng thể Kỹ thuật hóa protein cũng là một phần thiết yếu đểhoàn thiện việc gắn kháng nguyên hay kháng thể lên bề mặt đĩa, giúp tăng độ nhạy, độđặc hiệu của một test ELISA Vì vậỵ, đề tài được thực hiện theo hai hướng Một hướng là

“ Tổng hợp gene VP2 bằng phương pháp Assembly PCR” nhằm phục vụ cho các thínghiệm dòng hoá về sau Hướng thứ hai là “ Tăng độ nhạy và ổn định của phương phápELISA bằng Self-assembly monolayer (SAMs)” để cải thiện tín hiệu của phương phápELISA

1.2 Mục tiêu đề tài:

- Tiếp cận hướng nhân dòng bằng assembly PCR

- Kiểm tra dột biến phát sinh khi sử dụng assembly PCR

- Tiếp cận hướng hoạt hoá bề mặt đĩa ELISA, tăng cường liên kết kháng thể lên bềmặt đĩa polystyren

- Kiểm tra tính ổn định, và độ đồng nhất tín hiệu ELISA

CHƯƠNG 2 GIỚI THIỆU

2.1 Virus Taura và con đường gây bệnh:

Virus Taura là tác nhân chính gây Hội chứng Taura ở tôm thẻ chân trắng Phân tửTSV có đường kính 32 nm, hình khối 20 mặt (icosahedron ) (Bonami et al.,1997) Bộ gencủa TSV bao gồm chuỗi đơn RNA mạch thẳng gồm 10.205 nucleotide không bao gồmđuôi poly-A '3 Nó bao gồm hai khung đọc mở lớn (ORFs): ORF 1 chứa các trình tự củacác protein phi cấu trúc như helicase, protease và RNA polymerase phụ thuộc RNA ORF

2 chứa các chuỗi của protein cấu trúc TSV, bao gồm ba protein vỏ chuyên biệt VP1, VP2

và VP3 (55, 40, và 24 kDa) (Mari J et al.,2002)

TSV lây nhiễm và được nhân đôi chủ yếu ở biểu mô (lớp dưới da) của lớp vỏ bênngoài nói chung, ruột trước, đoạn cuối ruột phôi, mang, các phần phụ và thường trong các

mô liên kết, các mô tạo máu, cơ quan lymphoid (LO), và các tuyến ở râu (Lightner D.V

et al., 1996) Các cơ quan ruột (nội bì có nguồn gốc từ gan tụy, ruột giữa và manh tràngruột, biểu mô niêm mạc ruột) và cơ trơn, cơ tim, cơ vân, và các dây thần kinh ở bụng, cácnhánh và hạch của nó thường không có dấu hiệu mô học của việc nhiễm trùng do TSV vàthường biểu hiện âm tính với TSV bởi ISH (In Situ Hybridization) (Hasson K.W et al.,1999)

2.2 Phương pháp Assembly PCR:

Việc tổng hợp gene VP2 của virus Taura có thể thực hiện từ phản ứng phiên mãngược (RT-PCR) RNA genome virus Tuy nhiên, chúng tôi sử dụng phương phápAssembly PCR để tổng hợp gene VP2 làm kỹ thuật nền cho việc dòng hóa gene sinh tổnghợp kháng thể Đây là một phản ứng biến thể của chuỗi phản ứng polymerase (PCR) dùng

để tổng hợp nhân tạo các trình tự gene dài bằng cách thực hiện phản ứng PCR với cácđoạn oligonucleotide (primers) có các đoạn chồng chéo (overlap) với nhau Phương phápnày giúp tổng hợp nhanh và hiệu quả đoạn gene VP2 mà không cần tách chiết RNA, đoạn

gene mục tiêu được lấy từ một trình tự đã được công bố trên NCBI với mã sốAY826052.1 Hơn nữa phương pháp này giúp tổng hợp được đoạn gene mục tiêu theohướng thuận lợi cho quá trình tạo dòng và biểu hiện Nó cho phép đưa vào gene các trình

tự nhận biết của enzyme cắt hạn chế, các tín hiệu điều hòa và tối ưu hóa các codon sửdụng trong quá trình biểu hiện protein mã hóa trong một tế bào chủ khác loài

Đoạn gene VP2 mục tiêu được tổng hợp dựa trên trình tự gene VP2 (AY826052.1)tách chiết từ protein vỏ virus BLZ02TSV được công bố trên trang NCBI Dựa trên trình

tự đó, 21 đoạn oligonucleotide, mỗi đoạn gồm 60 nucleotide được thiết kế để thực hiệnphản ứng Assembly PCR

Oligo849-20:5' CAGTTCCCGCATGCACAATGGGATAATCGTCATCATATCCGGACTGAGTAGACGGATATA 3'

Oligo849-21:5' CATTGTGCATGCGGGAACTGATGAGGAGTCTTCTAAACAGGGGATTGTC 3'

Trong đó, oligo 1 overlap với oligo 2, oligo 2 overlap với oligo 3,…, oligo 20 overlap với oligo 21 một đoạn 20 nucleotide Các oligo này được trộn lẫn với nhau trong phản ứng PCR đầu tiên Qua các chu trình bắt cặp và kéo dài liên tục các oligo được kéo dài từ đầu 3’ hình thành nên những đoạn gene ngắn, sau đó nhờ các đoạn overlap mà chúng được nối lại với nhau Quá trình này cứ tiếp tục cho đến khi đoạn gene full-length VP2 được hình thành Tuy nhiên, phản ứng Assembly PCR tỉ lệ lỗi tương đối lớn: 2-5 lỗi trên 1000bp (Smith et al.,2003) Lỗi này phát sinh do hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp gene, thứ tự overlap của hai đoạn oligonucleotide kề nhau khôngđúng hoặc đoạn oligonucleotide bị hiện tượng hairpin (Marcus Bode et al., 2009) Chính

vì thế mà phản ứng PCA tạo thành rất nhiều sản phẩm phụ Để giải quyết vấn đề này thì phản ứng PCA được thực hiện qua hai bước Bước thứ nhất là chạy PCR với hỗn hợp các đoạn oligonucleotide, bước thứ hai là dùng cặp mồi chuyên biệt để khuếch đại đoạn gene mục tiêu, mồi xuôi và mồi ngược trong phản ứng PCR thứ hai này được thiết kế với hai đầu có trình tự nhận biết của enzyme cắt hạn chế BamHI và HindIII Các đoạn

oligonucleotide được thiết kế với nhiệt độ bắt cặp từ 52 oC đến 56 oC (Stemmer et al., 1995), tất cả các đoạn oligonucleotide phải được tinh sạch, tỉ lệ G + C nên xấp xỉ 50%, sử

dụng enzyme Pfu để tổng hợp và kéo dài đoạn DNA có độ chính xác cao

2.3 Những nguyên nhân gây đột biến trong phản ứng Assembly PCR:

Nguyên nhân gây đột biến đầu tiên là do quá trình lắp ghép gene Trong phản ứngPCR lần 1các đoạn oligonucleotide bắt cặp với nhau không chính xác nên đoạn gene đượctổng hợp có thể ngắn hơn so với bình thường hoặc trình tự các oligonucleotide lắp ghéplại với nhau không đúng Chính vì vậy mà sản phẩm PCR lần 1 sẽ có nhiều đoạn gene vớikích thước khác nhau và các sản phẩm phụ Tỉ lệ lỗi trong phản ứng PCA này là 2-5 lỗitrên 1000bp (Smith et al.,2003) Ví dụ đối với trường hợp 2 lỗi trên 1000bp thì tổng hợpphân tử DNA của phage λ 48.5kb sẽ chứa gần 97 lỗi, tổng hợp phân tử >100kb sẽ có hơn

200 lỗi và tổng hợp phân tử DNA của nhiễm sắc thể 1Mb thì sẽ có gần 2000 lỗi Với 21đoạn oligonucleotide thì tỉ lệ đoạn gene mong muốn được lắp ráp chính xác chỉ là 1/21! Lỗi này có thể kiểm tra thông qua giải trình tự một số trình tự sau khi dòng hoá vào vectordòng hoá pJET1.2

Nguyên nhân thứ hai là do hoạt động của enzyme DNA polymerase được sử dụngtrong phản ứng PCA làm cho quá trình nhân đôi của DNA xuất hiện các lỗi như sự lắpghép các base không đối xứng với mạch bổ sung, sự xoá, chèn hay chuyển đổi của cácnucleotide (Modrich et al., 1991) Do đó các đột biến điểm sẽ xuất hiện trong suốt quátrình tổng hợp đoạn gene full-length từ 21 đoạn oligonucleotde Có thể dùng công cụBlast trên NCBI so sánh trình tự vừa tổng hợp với trình tự gốc để phát hiện các đột biếnđiểm này

Để giảm tỉ lệ lỗi thì phản ứng PCA cần có một enzyme có hoạt tính 3’-5’exonuclease để giảm bớt sai sót trong quá trình tổng hợp gene, đồng thời loại bỏ các đoạn

hở (nick) giữa các oligonucleotide khi chúng bắt cặp và kéo dài trong phản ứng PCR

Enzyme được lựa chọn ở đây là Pfu DNA polymerase (Fermentas, Mỹ) với tỉ lệ lỗi là

2.6.10-6 trong một chu kỳ của phản ứng PCR Trong phản ứng PCA thì tỉ lệ lỗi của Pfu

cũng nhỏ hơn rất nhiều so với khi sử dụng các enzyme khác, cụ thể là tỉ lệ lỗi của Pfu

thấp hơn 5 lần so với Deep Vent polymerase (Flaman et al., 1994), 50 lần so với Taqpolymerase (Stemmer et al.,1995)

Cũng chính những đột biến trên dẫn đến sự xuất hiện của các codon hiếm hoặc bộ

ba kết thúc trong cấu trúc của gene Các codon hiếm như AGG, AGA, CUA, AUA, CCC

và GGA nằm ở gần đầu N-terminus của trình tự mã hoá là nguyên nhân gây trở ngại khi

biểu hiện trong tế bào E.coli (Nakamura et al.,2000) Mỗi amino acid có thể được mã hóa

bởi nhiều hơn một codon và đối với mỗi loài sinh vật, hệ thống di truyền thường ưa thíchmột số codon này hơn những codon còn lại trong tất cả 61 codon có khả năng mã hóa.Trong từng tế bào, số lượng của mỗi thành phần RNA vận chuyển có liên quan chặt chẽ

đến khả năng mã của mRNA có tính đặc trưng loài Khi muốn sản xuất lượng lớn protein

trong E coli từ một mRNA khác biệt về khả năng mã của vật chủ, lượng sản phẩm

protein tạo ra sẽ không thể nhiều bằng những protein khác được biểu hiện trong cùng hệthống do tế bào không đủ một hoặc một số tRNA nhất định (Kane et al.,1995) Việc thiếutRNA này có thể làm dừng quá trình dịch mã giữa chừng hoặc làm lệch khung đọc dẫnđến thay đổi trình tự amino acid trong sản phẩm protein (Kurlan et al.,1996)

Phân tích đoạn gene bằng Rare codon Analysis

Chỉ số codon thích ứng (Codon Adaptation Index-CAI):

CAI là công cụ đo độ lệch của trình tự gene mã hoá protein với một tập hợp các nghiêncứu về gene bao gồm các gene biểu hiện cao Mức độ biểu hiện protein tương quan vớigiá trị của CAI Chỉ số CAI bằng 1 được xem là lý tưởng trong khi chỉ số CAI > 0.8 đượcđánh giá là tốt cho sự biểu hiện trong tế bào biểu hiện mong muốn (Shoohyun Lee etal.,2010)

Tỉ lệ GC:

Tỉ lệ G và C nhiều ở đầu 5’ của gene cũng làm mRNA được phiên mã ở dạng cấu trúc bậchai làm ảnh hưởng đến quá trình dịch mã và mức độ biểu hiện của protein (Looman etal.,1987) Giới hạn phần trăm lý tưởng cho tỉ lệ GC là từ 30-70% Bất kỳ peak nào nằmngoài phạm vi này sẽ ảnh hưởng đến quá trình phiên mã và dịch mã

Sự phân bố tần suất codon (Codon Frequency Distribution-CFD):

Giá trị 100 được thiết lập cho codon với tần suất sử dụng cao nhất cho một amio acid nhấtđịnh trong tế bào biểu hiện mong muốn Codon với giá trị thấp hơn 30% có thể cản trở hiệu quả biểu hiện

2.4 Phương pháp dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2:

Gene VP2 sau khi khuếch đại bằng phản ứng Assembly PCR với 21 đoạnoligonucleotide và cặp mồi chuyên biệt TSV849-FP và TSV849-RP sẽ có đầu bằng do

hoạt tính 3’-5’ exonuclease của enzyme Pfu polymerase giúp loại đầu 3’-A nhô ra ở cuối

mạch Với hai đầu cắt hạn chế, gene VP2 được tinh sạch từ gel và nối vào vector pJET1.2

(Fermentas, Mỹ) bằng T4 DNA ligase Kết quả dòng hóa được kiểm tra bằng phản ứngcolony PCR, phản ứng cắt hạn chế và giải trình tự

2.5 Phương pháp cải thiện độ nhạy và tín hiệu của phương pháp ELISA:

Self-assembly monolayer (SAM):

Phương pháp Sandwich ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) là phương pháp dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên cần phát hiện Tuy nhiên, người ta nhận thấy rằng các phân tử protein liên kết trên bề mặt

polystyren kị nước bằng cách hấp thụ bị động sẽ làm mất hoạt tính của chúng và bị biến tính một cách đáng kể (Butler et al.,1993) Chính vì thế cần phải hoạt hoá bề mặt đĩa ELISA để tăng khả năng liên kết giữa kháng thể và chất nền, qua đó tăng độ nhạy và tín hiệu của phản ứng ELISA và Self-assembly monolayer là phương pháp được áp dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay

SAM là một lớp tổ chức của các phân tử lưỡng tính, trong đó một đầu của phân tử(head group) có ái lực đặc biệt với cơ chất và một đuôi với nhóm chức năng (functionalgroup) Nhóm chức này sẽ tương tác với các phân tử sinh học và các phản ứng hoá họccủa nó sẽ ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của tương tác SAMs giúp cho việcnghiên cứu các tương tác nội tại, mối quan hệ giữa cấu trúc - tính chất và các phản ứng bềmặt Các phản ứng bề mặt này bao gồm sự cạnh tranh nội phân tử, các tương tác giữa cơchất-phân tử, khả năng hoà tan của phân tử, khả năng dính ướt, bám dính, bôi trơn vàphản ứng ăn mòn

Bề mặt polystyren có thể được biến đổi để tăng tính ưa nước bằng cách gắn kết vớicác nhóm hydroxyl, amin, cacbonyl, cacboxyl trên bề mặt của nó (Zammatteo et al.,1996) Tuy nhiên sự gắn kết của các phân tử hapten với bề mặt polystyren không thể thực

hiện được nếu thiếu các nhóm chức năng trên polystyren Để giải quyết vấn đề này chúngtôi áp dụng phương pháp hoạt hoá polystyren bằng hỗn hợp (HCl, HNO3) cùng vớiAPTES (3-Aminopropyltriethoxy silane) Bề mặt đĩa sau khi biến đổi sẽ chứa nhóm amin

và nhóm amin sẽ tạo liên kết với các kháng thể với nhóm cacboxyl Để tăng khả năng liênkết giữa kháng thể bắt với bề mặt polystyren được amin hoá này chúng tôi thực hiện thêmmột bước đó là xử lý kháng thể bắt này với hỗn hợp EDC (ethyl-aminopropylcarbodiimide) và NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Hỗn hợp này giúp hoạt hoá nhómcarboxyl có trên kháng thể vì thế giúp tăng khả năng liên kết với nhóm amin trên bề mặtđĩa ELISA Chính nhờ tăng khả năng liên kết này mà độ nhạy và ổn định của sandwhichELISA tăng lên đáng kể

Hình 2.1 Sơ đồ hoạt hoá bề mặt polystyren của đĩa ELISA

Để đánh giá độ nhay của phương pháp ELISA, cần phân tích giá trị OD trên đườngcong ROC (Reciever Operating Characteritics) và giá trị AUC (The area under the curve).Phân tích đường cong ROC có thể cho biết ảnh hưởng của các giá trị ngưỡng khác nhautrên độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Mỗi điểm trên đường cong ROC sẽ biểu thị cho

một điểm ngưỡng Khoảng cách từ bất cứ điểm nào trên đường cong tới điểm góc trêncùng bên trái đồ thị (điểm có độ nhạy và độ đặc hiệu là 100%) tỷ lệ nghịch với hiệu quả

kỹ thuật Khi chọn điểm có khoảng cách đến góc ngắn nhất sẽ cho hiệu quả chẩn đoàn caonhất

Biểu đồ ROC thể hiện hai giá trị là độ nhạy và tỉ lệ dương tính giả (1- độ đặc hiệu).Hai giá trị này là hai chỉ số biến thiên ngược chiều nhau Do đó cần một chỉ số dung hoà

cả hai chỉ số nàyMột cách bình quân hóa tốt nhất là ước tính diện tích dưới đường biểudiễn ROC (AUC-the area under the curve) AUC tối thiểu là 0.5 và tối đa là 1 Giá trịAUC = 0 8 trở lên được xem là tốt và hơn 0.9 là rất tốt (Seong Ho Park et al., 2004) Chỉ

số AUC rất có ích trong việc so sánh độ chính xác của hai hay nhiều phương pháp xétnghiệm Giá trị AUC càng cao thì phương pháp đó có độ chính xác càng cao

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu:

3.1.1 Hoá chất và môi trường:

 Các loại enzyme sử dụng:

 Enzyme cắt hạn chế: BamHI, HindIII (New England Biolab, Mỹ)

 Enzyme nối: T4 DNA ligase (New England Biolab, Mỹ)

 Các loại kit sử dụng:

 Kit tinh sạch plasmid từ E.coli (Qiagen, Đức)

 Kit tinh sạch DNA từ gel agarose (MEGA, Hàn Quốc)

 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR:

 Taq polymerase, Pfu polymerase và dung dịch đệm 10X đi kèm, dNTPs mix

10 mM, Water free nuclease (Fermentas, Mỹ)

 Hóa chất dùng trong hóa biến nạp: 80mM MgCl2 – 20mM CaCl2 (COLD buffer)

 Hoá chất sử dụng trong hoạt hoá đĩa ELISA: EDC (Aldrich); NHS (Aldrich); Glycidoxypropyl) trimethoxysilane (GOPS) (Sigma); 3-Aminopropyltriethoxy silane (APTES) (Sigma); 47%HNO3 (v/v) trong H2SO4; MES buffer (2-

(3-morpholinoethane sulfonic acid 0.05M, pH 5.4)

 Hóa chất sử dụng trong sandwhich ELISA: Rabbit anti-GST polyclonal

antibody (GBEC bioenginering, Việt Nam); kháng nguyên Glutathione S- tranferaser dạng sigma (Nguyen HA, cung cấp); mouse anti-GST monoclonal antibody (GE, Mỹ), Horseradish peroxidase (HRP), Glutaraldehyde; 3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine (TMB) (Bangalore Genei, India); PBS buffer (50 mM, pH 7.4); PBS containing 0.1% skim milk (PBSM 0.1%); Carbonate buffer (50 mM,

pH 9.4)

 Hóa chất sử dụng trong điện di SDS-PAGE:

 Dung dịch đơn phân 30%:

Bisacrylamide 1.6 g

Bảo quản ở 0 – 4 oC

 Dung dịch đệm gel gom: 1 M Tris HCl, 0.4% SDS, pH 6.8

 Dung dịch đệm gel phân tách: 1.5 M Tris HCl, 0.4% SDS, pH 8.8

 Dung dịch nạp mẫu 2X (loading deye): 0.125 M Tris HCl, 4% SDS, 20%Glycerol, 0.2 M DDT, 0.02% bromphenol blue, pH 6.8

 Dung dịch điện di 10X (running buffer): 0.125 M Tris HCl, 0.96 M Glycine,0.5% SDS, pH 8.3

 Dung dịch nhuộm Coomassive (0.025% coomassie brillant blue R, 40%methanol, 7% acetic acid)

 Dung dịch giải nhuộm I: 50% ethanol, 10% acetic acid

 Dung dịch giải nhuộm II: 5% ethanol, 7.5% acetic acid

 Thành phần môi trường:

 Môi trường LB Broth: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl

 Môi trường LB Agar: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, 2.5% agar

3.1.2 Nguyên liệu:

 Chủng E.coli DH5α với các đột biến hữu ích cho việc biến nạp và lưu trữ

plasmid tái tổ hợp Kiểu gene là [dlacZ, DeltaM15, Delta (lacZYA-argF), U169,recA1, endA1, hsdR17 (RK-mK +), supE44, thi-1, gyrA96, relA1], cung cấp từtrung tâm công nghệ sinh học TPHCM

 21 đoạn oigonucleotide được tổng hợp bởi hãng Sigma của Mỹ

 Plasmid pJET1.2 (Fermentas, CA, USA):

Hình 3.1 Cấu trúc vector pJET1.2

Đây là vector tạo dòng đầu bằng, có khả năng tiếp nhận đoạn DNA đầu bằng được

tổng hợp từ Pfu DNA polymerase, có trình tự gene mã hóa cho β-lactamase dùng

để chọn lọc tế bào tái tổ hợp trên môi trường có Ampicillin Bên cạnh đó, plasmid

có gene eco47IR gây độc cho tế bào mang vùng trình tự nhận biết của các enzymecắt giới hạn trong khung đọc

 Mồi dùng để colony PCR trong vector pJET1.2 :

Mồi pJET-FP: 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’

Mồi pJET-RP: 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’

 Mồi dùng để colony PCR để khuếch đại đoạn T7 promoter trong vector dòng hoá :Mồi T7-FP:5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’

Điện di kiểm tra kết quả

3.2.2 Phương pháp dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2 (Fermentas, Mỹ):

Sản phẩm PCA lần 2 sau khi điện di tiến hành tinh sạch gene VP2 từ gel bằng kitMEGAquick spin (Intron, Hàn Quốc), đoạn gene VP2 sau khi thu nhận nhờ hoạt tính

3’- 5’ exonuclease của enzyme Pfu polymerase sẽ giúp sửa sai trong suốt quá trình

tổng hợp PCR và tạo đầu bằng Vector pJET1.2 (Fermentas, CA, USA) sau đó đượcnối với gene VP2 bằng enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm nối được biến nạp vào

E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt 42 oC trong 45 giây

Kiểm tra kết quả biến nạp bằng colony PCR với cặp mồi pJET1.2-FP và pJET1.2-RP(Fermentas, CA, USA) Thành phần phản ứng 25 µl gồm PCR buffer 1X, 10 pmolpJET1.2-FP, 10 pmol pJET1.2-RP, 0.2 mM dNTPs, 2U Taq polymerase Chu kỳnhiệt: 1 chu kỳ biến tính 95 oC trong 5 phút, 35 chu kỳ gồm 95 oC trong 30 giây, 55oC

trong 30s, 72 oC trong 1 phút 30 giây, cuối cùng là 1 chu kỳ kéo dài 72 oC trong 10phút Điện di kiểm tra kết quả.

Tiến hành tách chiết plasmid pJET1.2-VP2 bằng bộ kit QIAgene purification kit(QIAGENE, Đức) và giải trình tự

3.2.3 Phương pháp Bradford:

Nguyên tắc của phương pháp Bradford là những phân tử protein hòa tan gắn vớichất nhuộm màu Coomassie Blue G250 hình thành nên phức hợp có khả năng hấp thumàu ở bước sóng từ 465-595nm (Sedmack et al.,1977) Cường độ màu hấp thu tươngquan chặt chẽ với hàm lượng protein trong dung dịch khi hàm lượng protein nằmtrong khoảng 1-1000 mg/l (Spector et al., 1978) Dựa vào tính chất này người ta đolượng protein hòa tan kết hợp với Coomassie Blue G250 ở bước sóng 595 nm rồi quytheo đường chuẩn để suy ra hàm lượng protein

Phản ứng Bradford được thực hiện trên đĩa microplate qua hai bước:

- Bước thứ nhất: sử dụng dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) để lập đườngchuẩn protein Pha loãng dung dịch stock BSA 1 mg/ml với nước cất để đạt cácnồng độ tương ứng từ 0-500 µg/ml

Bảng 1 Bảng quy trình xây dựng đường chuẩn protein bằng BSA 1 mg/ml

- Bước hai là đo mẫu: kháng thể được biến đổi sau khi coating lên đĩa tiến hành bổsung 100 µl thuốc thử Bradford 1X, trộn đều, đợi 15 phút sau đó đo OD ở bướcsóng 595 nm Từ giá trị OD của mẫu quy ra nồng độ kháng thể hấp phụ lên bề mặtđĩa theo đường chuẩn.

3.2.4 Phương pháp hoạt hoá bề mặt polystyren đĩa ELISA:

- Chuẩn bị dung dịch 47% HNO3 (v/v) trong H2SO4

- Cho 250µl dung dịch acid trên vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

để tạo ra nhóm –NO2 trên bề mặt polystyren (PS)

- Rửa đĩa 2 lần với nước cất 2 lần

- Chuẩn bị dung dịch 5% amino propyltriethoxy silane (APTES) Cốc thủy tinhđựng APTES phải được nhúng vào dung dịch GOPS 10% (3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane) trước

- Cho 250µl dung dịch APTES vào mỗi đĩa và ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng để tạonhóm –NH2 trên bề mặt Polystyren (nhóm –NH2 sẽ liên kết với nhóm caboxyl trênkháng thể đưa vào)

- Rửa đĩa 2 lần với nước cất

- Để ở 620C trong 2 giờ để tăng cường khả năng liên kết của APTES với Polystyren

3.2.5 Phương pháp hoạt hoá gốc carboxyl (–COO) của kháng thể bắt:

- Pha EDC 0.4 mg/ml và NHS 0.1 mg/ml trong MES buffer

- Pha hỗn hợp EDC và NHS với tỉ lệ 4:1

- Ủ hỗn hợp 10 µl EDC và NHS với 990 µl kháng thể bắt trong 15 phút ở nhiệt độphòng

- Phủ 100 µl các giếng với kháng thể bắt đã được biến đổi với độ pha loãng 1:1000trong đệm carbonate/bicarbonate (pH 7.4) Thực hiện đồng thời với một mẫukháng thể bắt chưa hoạt hoá và một mẫu đối chứng chứa BSA

- Bao đĩa và ủ qua đêm ở 4 oC