Tình hình nhiễm nấm xâm nhập và mức độ kháng thuốc kháng nấm của các chủng nấm phân lập được tại bệnh viện bạch mai từ 2013 đến 2017

Phân bố của các chi/loài nấm gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập được theo bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực...43 Bảng 3.7.. Tỷ lệ nấm gây nhiễm trùng xâm nhập trên tổng số căn nguyên g

NGUYỄN NHỊ HÀ

TÌNH HÌNH NHIỄM NẤM XÂM NHẬP VÀ MỨC ĐỘ

ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHỦNG NẤM PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI TỪ 2013 ĐẾN 2017

những người mà tôi xin phép được gửi lời cảm ơn sâu sắc dưới đây.

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Tiến sĩ Phạm Hồng Nhung, Phó trưởng

Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội, vì sự định hướng và tín nhiệm của Côtrong quá trình học tập của tôi Tôi cũng biết ơn Cô vì những lời khuyên quý báu,

sự hướng dẫn tận tình của Cô cho nghiên cứu của tôi cũng như những phê bìnhchính xác mà nhờ đó nghiên cứu này mới đi đến kết quả thành công

Tôi chân thành cảm ơn các giảng viên của Trường Đại học Y Hà Nội, đặc

biệt là Phó giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Vũ Trung – Trưởng Bộ môn Vi sinh Đại học Y

Hà Nội, Trưởng Bộ môn Vi sinh – Kí sinh trùng lâm sàng Đại học Y Hà Nội, Phógiảm đốc Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương, và các giảng viên Bộ môn Vi sinhĐại học Y Hà Nội, các Thầy Cô đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu về visinh y học mà còn cho tôi những bài học về tác phong sống và làm việc

Tôi cũng xin được cảm ơn lãnh đạo bệnh viên Bạch Mai, Thạc sĩ Trương Thái Phương – Trưởng khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai, các bác sĩ, kĩ thuật viên Khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai, đặc biệt là Cử nhân Chu Thị Kim Dung

vì sự đón tiếp nhiệt tình, sự giúp đỡ tích cực và những hiểu biết quý giá đã chia

sẻ cho tôi

Cuối cùng, tôi muốn thể hiện lòng biết ơn sâu sắc của mình với gia đình vàbạn bè, những người luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập vànghiên cứu của tôi

Tôi là Nguyễn Nhị Hà, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40, Trường Đại học Y

Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh y học, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn củaTiến sĩ Phạm Hồng Nhung

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã đượccông bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 21 tháng 9 năm 2017

Học viên

Nguyễn Nhị Hà

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về nấm 3

1.1.1 Đặc điểm chung của nấm 3

1.1.2 Phân loại nấm 3

1.1.3 Một số loài nấm gây bệnh thường gặp 4

1.2 Chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập 8

1.2.1 Khái niệm nhiễm nấm xâm nhập 8

1.2.2 Triệu chứng lâm sàng nhiễm nấm xâm nhập 9

1.2.3 Xét nghiệm vi sinh y học nhiễm nấm xâm nhập 9

1.2.4 Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập 13

1.2.5 Chỉ số cư trú trong chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập 17

1.3 Điều trị nhiễm nấm xâm nhập 17

1.3.1 Các thuốc kháng nấm 17

1.3.2 Xét nghiệm độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm 19

1.3.3 Một số khuyến cáo trong điều trị nhiễm nấm xâm nhập 21

1.4 Các nghiên cứu về tình hình nhiễm nấm xâm nhập và mức độ đề kháng thuốc kháng nấm 22

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới 22

1.4.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Phương pháp nghiên cứu 24

2.1.1 Thiết kế nghiên cứu 24

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

2.2 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2.1 Đối tượng 24

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu 24

2.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn 24

2.2.4 Tiêu chuẩn loại trừ 24

2.4.2 Tiến cứu 25

2.5 Phương pháp xử lí số liệu 30

2.6 Đạo đức nghiên cứu 30

2.7 Hạn chế của nghiên cứu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 32

3.1 Tình hình nhiễm nấm xâm nhập tại bệnh viện Bạch Mai 32

3.1.1 Tỷ lệ nuôi cấy dương tính với nấm tại bệnh viện Bạch Mai 32

3.1.2 Tỷ lệ nấm gây nhiễm trùng theo bệnh phẩm 33

3.1.3 Các căn nguyên gây bệnh thường gặp theo bệnh phẩm 34

3.1.4 Các căn nguyên nấm thường gặp theo bệnh phẩm 35

3.1.5 Các loài nấm thường gặp theo bệnh phẩm 36

3.1.6 Tỷ lệ nấm gây nhiễm trùng xâm nhập tại một số khoa phòng 40

3.1.7 Tình hình nhiễm nấm xâm nhập tại khoa Hồi sức tích cực 41

3.2 Mức độ nhạy cảm của các chủng Candida spp 46

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 47

4.1 Tình hình nhiễm nấm xâm nhập tại bệnh viện Bạch Mai từ 1/2013 đến 6/2017 47

4.1.1 Tình hình nhiễm nấm xâm nhập tại bệnh viện Bạch Mai từ 1/2013 đến 6/2017 47

4.1.2 Tình hình nhiễm nấm xâm nhập tại khoa Hồi sức tích cực bệnh viện Bạch Mai 56

4.2 Mức độ đề kháng thuốc kháng nấm của các chủng nấm phân lập tại bệnh viện Bạch Mai từ 1/2013 – 6/2017 58

KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

xét nghiệm và lâm sàng)

SDA Sabouraud dextrose agar (Thạch sabouraud dextrose)

Hình 1.2 Một số hình ảnh về Candida tropicalis 5

Hình 1.3 Một số hình ảnh về Candida parapsilosis 5

Hình 1.4 Một số hình ảnh của Candida glabrata 6

Hình 1.5 Một số hình ảnh của Cryptococcus neoformans 6

Hình 1.6 Một số hình ảnh của Aspergillus fumigatus 7

Hình 1.7 Một số hình ảnh của Aspergillus flavus 7

Hình 1.8 Một số hình ảnh của Talaromyces marneffei 8

Hình 1.9 Test mực tàu dương tính với Cryptococcus neoformans 10

Hình 1.10 Hình ảnh dương tính một số test định danh nhanh C albicans 11

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình nghiên cứu 25

Bảng 3.1 Các chi vi khuẩn, nấm gây nhiễm trùng xâm nhập thường gặp nhất

theo bệnh phẩm 34 Bảng 3.2 Phân bố của các chi/loài nấm gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập

tại khoa Hồi sức tích cực theo bệnh phẩm 42 Bảng 3.6 Phân bố của các chi/loài nấm gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập

được theo bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực 43

Bảng 3.7 Phân bố của các loài Candida gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập

được theo bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực 44

Bảng 3.8 Tỉ lệ chủng nhạy cảm/chủng hoang dại theo loài Candida tại bệnh viện

Bạch Mai từ 1/2013 đến 6/2017 46

phân lập được tại bệnh viện Bạch Mai theo năm từ 1/2013 đến 6/2017 32 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ nấm gây nhiễm trùng xâm nhập trên tổng số căn nguyên gây

bệnh phân lập được theo bệnh phẩm 33

Biểu đồ 3.3 Phân bố các loài Candida thường gặp từ bệnh phẩm máu theo

nhập phân lập được tại một số khoa của bệnh viện Bạch Mai 40 Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ nấm gây nhiễm trùng xâm nhập trên tổng số căn nguyên gây

bệnh phân lập được theo bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực 41

Biểu đồ 3.8 Phân bố các loài Aspergillus gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập

được theo bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm nấm xâm nhập là bệnh nhiễm trùng cơ hội, gây bệnh trên các bệnhnhân suy giảm miễn dịch (bệnh nhân AIDS, ung thư), người lớn tuổi có tiền sửdùng thuốc kéo dài, và những bệnh nhân điều trị bằng các liệu pháp nội khoa vàngoại khoa xâm lấn, bao gồm kháng sinh phổ rộng, hóa chất, và ghép tạng [1] Hiệnnay, cùng với sự bùng nổ của đại dịch HIV/AIDS và sự ứng dụng rộng rãi các tiến

bộ về thuốc và thủ thuật trong y học, nhiễm nấm xâm nhập đang bùng phát trên toànthế giới [2], [3], [4], [5], [6] Với vai trò là tác nhân quan trọng trong nhiễm trùngbệnh viện gây bệnh cảnh lâm sàng nặng, triệu chứng đa dạng, khó chẩn đoán, nấmlàm tăng tỷ lệ tử vong, thời gian điều trị, chi phí điều trị của các bệnh nhân nội trú[7], [8]

Thêm vào đó, việc chỉ định điều trị của bác sĩ và tuân thủ điều trị của bệnhnhân nhiễm nấm còn hạn chế do các thuốc kháng nấm có độc tính cao và phác đồđiều trị đòi hỏi điều trị lâu dài Sự ra đời của các thế hệ thuốc kháng nấm mới, độctính thấp hơn, hiệu quả cao hơn so với các thế hệ đầu mới cải thiện tiên lượng củacác bệnh nhân nhiễn nấm xâm nhập nay lại vấp phải sự xuất hiện của các chủngkháng thuốc và đa kháng thuốc khiến việc điều trị gặp nhiều khó khăn [9], [10],[11], [12], [13]

Trong bối cảnh đó, việc nghiên cứu nhiễm nấm xâm nhập và mức độ đềkháng thuốc kháng nấm để đề ra biện pháp dự phòng nhiễm nấm xâm nhập, lựachọn thuốc điều trị phù hợp và dự phòng kháng thuốc đang trở nên bức thiết và đãđược thực hiện tại nhiều quốc gia trên thế giới

Tại Việt Nam, căn nguyên nấm cũng ngày càng được quan tâm, kĩ thuậtnuôi cấy và định danh nấm đã trở thành xét nghiệm thường quy có trong danh mụcxét nghiệm Vi sinh của Bộ Y tế nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về nhiễm nấmxâm nhập được công bố rộng rãi Nhằm đóng góp thêm về hiểu biết về nhiễm nấmxâm nhập và mức độ đề kháng thuốc kháng nấm, chúng tôi thực hiện nghiên cứu

“Tình hình nhiễm nấm xâm nhập và mức độ kháng thuốc kháng nấm của các chủng nấm phân lập được tại bệnh viện Bạch Mai từ 2013 đến 2017” với hai

mục tiêu:

1 Mô tả tình hình nhiễm nấm xâm nhập tại bệnh viện Bạch Mai từ

2013 đến 2017.

2 Xác định mức độ đề kháng thuốc kháng nấm của các chủng nấm men phân lập được tại bệnh viện Bạch Mai từ 2013 đến 2017.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về nấm

1.1.1 Đặc điểm chung của nấm

Nấm, thuộc Giới nấm, là sinh vật đơn bào hoặc đa bào, có nhân thực; thành

tế bào cấu tạo chủ yếu từ chitin và glucan; sống dị dưỡng; sinh sản bằng bào tử [14]

Nấm sinh sản nhanh và dễ dàng phát triển trong mọi mọi môi trường, ngay

cả môi trường hầu như không có chất dinh dưỡng Chỉ cần một phần tử sinh sản làbào tử, nấm cũng có thể phát triển thành một quần thể rất nhiều nấm gọi là khuẩnlạc nấm [14] Nấm có thể phát triển được ở nhiệt độ từ 1 - 370C, nhiệt độ phát triểntối ưu từ 25 – 350C và phát triển mạnh khi độ ẩm môi trường cao (>70%) [15] Mặtkhác, do không quang hợp, nấm phát triển không cần ánh sáng mặt trời [14] Do đó,nấm ở khắp nơi và trên cơ thể vật chủ, nấm có thể xâm nhập vào tất cả các cơ quan,

tổ chức từ nông đến sâu

1.1.2 Phân loại nấm

Giới nấm được phân loại dựa trên cấu trúc sinh sản và phương thức hình thànhbào tử của nấm Alexopous và cộng sự (1996) phân giới nấm thành 4 ngành:

Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota, trong đó, Chytridiomycota

bao gồm các loài không gây bệnh cho người [16]

Bảng 1.1 Phân loại đơn giản của giới nấm quan trọng trong y học

Zygomycota Zygomycetes Mucorales Absidia, Rhizopus Basidiomycota Basidiomycetes Filobasidiales Cryptococcus Ascomycota

Arachiascomycetes Pneumocystidales Pneumocystis

Hemiascomycetes Saccharomycetales Candida

Trong vi sinh lâm sàng, nấm được phân loại dựa trên hình thái sinh dưỡng:

- Nấm men: có cấu tạo đơn bào, hình cầu hoặc trái xoan, kích thước 3 – 15µm

Khuẩn lạc thường nhẵn, giống khuẩn lạc của vi khuẩn Ví dụ: Candida spp

- Nấm sợi: gồm những sợi nấm có cấu tạo đa bào, gồm những sợi có nhánhdài, rõ rệt, tế bào có nhiều nhân Nấm sợi được chia thành 2 loại:

o Nấm sợi có vách ngăn: tế bào được chia bởi các vách ngang hoàn toànhoặc không hoàn toàn, mỗi tế bào chứa 1 hay nhiều nhân

o Nấm sợi không có vách ngăn bao gồm: Rhizopus và Absidia

- Hiện tượng lưỡng hình: hình thể nấm thay đổi tùy theo điều kiện môi trường

Talaromyces marneffei, Histoplasma capsulatum… khi ký sinh hoặc nuôi

cấy ở 370C có dạng men, khi hoại sinh hoặc ở nhiệt độ phòng có dạng sợi

1.1.3 Một số loài nấm gây bệnh thường gặp [17]

- Candida albicans:

o Tế bào nấm men tròn hoặc bầu dục (3,5-7x4-8µm) Trên Tween 80 (CT80) (250C, 72 giờ) các cụm bào từ trần nảy chồi quanhsợi nấm giả (một số sợi thật) Bào tử áo thường đơn lẻ, to, thành dày

Cornmeal-o Mọc nhanh trCornmeal-ong 3 ngày Khuẩn lạc trơn, nhẵn, màu kem Trên môitrường dinh dưỡng (thạch máu hay thạch chocolate), khuẩn lạc thườnglan rộng dạng chân sao Khuẩn lạc xanh trên ChromIDTM Candida

o Là căn nguyên thường gặp nhất gây Candidiasis – nhiễm trùng cấp,bán cấp hoặc mạn tính có thể gặp ở bất kỳ bộ phận nào của cơ thể.Sinh vật này được coi là vi hệ ở da, miệng, âm đạo và đường tiêu hoá

(a) Khuẩn lạc trên thạch máu (b) Khuẩn lạc trên CAN2 (c) Soi tươi (c) Nhuộm Gram

Hình 1.1 Một số hình ảnh về Candida albicans

- Candida tropicalis (trước đây là Candida paratropicalis):

o Tế bào nấm men tròn hoặc bầu dục (3,5-7x5,5-10µm) Trên CT80(250C, 72 giờ) bào tử trần nảy chồi riêng lẻ hoặc nhóm nhỏ, dọc sợinấm giả (có thể sợi thật) Đôi khi có bào tử áo dạng giọt nước

o Mọc nhanh trong 3 ngày Khuẩn lạc dạng kem, bờ nhăn nheo Khuẩnlạc có màu tím trên ChromIDTM Candida

o Gây nhiễm trùng đặc biệt là ở những đối tượng suy giảm miễn dịch,

có độc lực cao ở những người bị bệnh bạch cầu hoặc ung thư khác

Cũng có thể tìm thấy C tropicalis mà không có triệu chứng của bệnh.

o Mọc nhanh trong 3 ngày Khuẩn lạc dạng kem

o Gây nhiễm trùng ở những đối tượng đặc biệt nhạy cảm như trẻ sơsinh, người bị tổn thương hệ miễn dịch, điều trị kháng sinh,corticosteroid hoặc các thuốc gây độc tế bào kéo dài, đặt catheter nộimạch, mắc đái tháo đường hoặc tiêm chích ma tuý

o Trên CT80 (250C, 72 giờ) tế bào nấm men nhỏ, bầu dục (2-3x3-4 µm)

có một chồi ở đầu Đôi khi có chuỗi ngắn các tế bào hình trứng

o Mọc nhanh trong 3-5 ngày, chậm hơn so với các loài Candida khác.

Khuẩn lạc giống nấm men nhỏ, sền sệt, nhẵn, màu trắng hoặc kem

o Thường gây nhiễm trùng máu hoặc tiết niệu sinh dục, đôi khi ở phổi

và các vị trí khác Có ở người khoẻ mạnh, chỉ gây bệnh ở những đốitượng đặc biệt nhạy cảm

(a) Tế bào nấm men trên CT80 (b) Nhuộm Gram

Hình 1.4 Một số hình ảnh của Candida glabrata

(a) Khuẩn lạc trên thạch máu (b) Tế bào nấm men trên CT80 (c) Nhuộm Gram

Hình 1.5 Một số hình ảnh của Cryptococcus neoformans

- Aspergillus fumigatus:

o Sợi có vách; cuống bào đài nhẵn, ngắn (300x5–10µm) Cuống bào tửxếp sát nhau ở 2/3 trên bào đài, đối xứng qua cuống bào đài Bào tửtròn, nhẵn hoặc hơi xù xì, đường kính 2–3,5 µm

o Mọc nhanh trong 3 ngày Bề mặt khuẩn lạc mịn như nhung hoặc cóbột, màu sắc thay đổi từ xanh lá cây có viền trắng hẹp lúc mới mọcsang xám nhạt khi già Bề mặt màu từ trắng tới nâu

o Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là căn nguyên thường gặp nhất của dị

ứng Aspergillus, Aspergillus xâm nhập (IA) và viêm xoang do nấm.

(a) Khuẩn lạc (b) Bào tử nhuộm lactophenol cotton blue

Hình 1.6 Một số hình ảnh của Aspergillus fumigatus

- Aspergillus flavus

o Sợi có vách; cuống bào đài dài (400–800x8–18µm), xù xì điển hình;chúng xòe ra thưa thớt, có thể tập hợp lại thành các cột bào tử khi già.Bào tử đường kính 3–6µm với vách nhẵn hoặc hơi xù xì

o Mọc nhanh trong 3 ngày Khuẩn lạc mịn, bề mặt thường vàng nhạt tớinâu, nhiều bụi vàng; có thể có viền trắng

o Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là căn nguyên phổ biến thứ hai của IA

(a) Khuẩn lạc (b) Bảo tử nhuộm bằng lactophenol cotton blue

Hình 1.7 Một số hình ảnh của Aspergillus flavus

- Talaromyces marneffei (Tên cũ là Penicillium marneffei)

o Ở 25–300C, cuống bào đài nhẵn với 4–5 tiểu bào đài tận, mỗi tiểu bàođài mang 4–6 cuống bào tử Bào tử nhẵn hoặc hơi xù xì và có hìnhtròn đến oval (2–3x2,5-4µm) và tạo chuỗi Ở 35–370C, bào tử tạo cácbào tử vô tính đơn bào từ tròn đến oval (đường kính 3–5µm) váchngăn rõ, dạng giống nấm men, không có chồi

o Mọc nhanh trong 3 ngày (25 – 300C) Trên SDA, khuẩn lạc phẳng, cóbột hay mịn, nâu nhạt, sau chuyển vàng đỏ với viền vàng hoặc trắng;thường xanh xám ở giữa Chất màu màu đỏ đậm khuếch tán vào môitrường sau 3–7 ngày Dạng men phát triển chậm hơn (35 – 370C)

o Gây nhiễm nấm sâu tại chỗ hoặc lan tỏa, chủ yếu ở bệnh nhân suygiảm miễn dịch (HIV dương tính) và các cá thể có đáp ứng miễn dịch

sống hoặc đi du lịch ở vùng dịch tễ của T marneffei (Đông Nam Á).

Loài này có thể được phân lập từ máu, tủy xương, da, phổi, cơ, hạch,nước tiểu, phân, dịch não tủy và nhiều cơ quan nội tạng

(a) Khuẩn lạc trên thạch máu (37 0 C) (b) Nhuộm Gram từ bệnh phẩm (37 0 C)

(c) Khuẩn lạc trên SDA (25 0 C) (d) Bảo tử nhuộm bằng lactophenol cotton blue

Hình 1.8 Một số hình ảnh của Talaromyces marneffei

1.1 Chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập

1.1.1 Khái niệm nhiễm nấm xâm nhập

Bệnh do nấm có thể được phân loại dựa trên vị trí nhiễm nấm: nấm bề mặt,nấm da, nấm dưới da và nấm sâu (hay nấm xâm nhập) Nấm bề mặt, nấm da và nấmdưới da gây tổn thương chủ yếu trên bề mặt, da và dưới da, chủ yếu gây cảm giáckhó chịu, giảm tính thẩm mĩ dẫn đến làm giảm chất lượng sống Trong khi đó, nấmxâm nhập gây nhiễm các cơ quan nội tạng như phổi, thận, lách, màng bụng, xương

và hoặc hệ thần kinh trung ương, và có thể gây rối loạn chức năng sinh lý của các

cơ quan nội tạng, thậm chí đe dọa tính mạng bệnh nhân

1.1.2 Triệu chứng lâm sàng nhiễm nấm xâm nhập

Bệnh nấm xâm nhập là tình trạng bệnh do nhiễm nấm xâm nhập Bệnh nhân

có thể sốt, mạch nhanh, nhiễm độc cấp tính hoặc mạn tính Tuy nhiên, các triệuchứng này không điển hình, khó phân biệt với nhiễm vi khuẩn Các triệu chứng tạichỗ thay đổi, tùy thuộc căn nguyên và đáp ứng miễn dịch của người bệnh [18] Do

đó, việc khám lâm sàng có giá trị định hướng để chỉ định các xét nghiệm phù hợp

1.1.3 Xét nghiệm vi sinh y học nhiễm nấm xâm nhập

Hiện nay có nhiều phương pháp để chẩn đoán căn nguyên nấm [19], [20] Soi tươi

Phát hiện nấm trong mô và bệnh phẩm vô trùng bằng soi trực tiếp có giá trịchẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập [21] Mặt khác, phát hiện các phần tử nấm đặc hiệuqua soi có thể giúp phòng xét nghiệm chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất với

bệnh phẩm Ví dụ, có sợi của một sinh vật lớp Zygomycetes gợi ý việc sử dụng

thạch mạch nha hoặc bánh mì vô khuẩn không có chất bảo quản để phân lập

Kỹ thuật này đơn giản, cho kết quả nhanh Một số căn nguyên nấm có hìnhthái đặc trưng có thể định danh đặc hiệu bằng soi trực tiếp Ví dụ, nếu thấy những tếbào nấm men điển hình, các bào tử hoặc các cấu trúc khác bằng kính hiển vi, có thể

đặt chẩn đoán căn nguyên nhiễm trùng là H capsulatum, Cryptococcus neoformans, phức hợp C immitis và Pneumocystis jiroveci Trong các nhiễm trùng khác như aspergillosis và candidiasis, hình thái học có thể đưa đến chẩn đoán loại căn nguyên

nhưng không định danh được loài của tác nhân gây bệnh Tuy nhiên, soi trực tiếp có

độ nhạy thấp nên đã bỏ sót một tỷ lệ khá lớn (20–40%) các trường hợp bị bệnh Nhuộm soi

Một số kĩ thuật và thuốc nhuộm khác nhau có thể được sử dụng giúp pháthiện sự có mặt của nấm bằng soi trực tiếp Phổ biến nhất là soi bệnh phẩm trongKOH 10–20% chứa thuốc nhuộm huỳnh quang Calcofluor trắng, nhuộm Gram,Giemsa, Periodic Acid Schiff, hoặc phối hợp các phương pháp nhuộm trên

Test mực tàu có giá trị chẩn đoán xác định C neoformans Nhuộm Gram có giá trị phát hiện Candida spp., Cryptococcus spp và các phần tử sợi của nấm sợi như Aspergillus, các loài thuộc chi Zygomycetes, và Fusarium spp Điển hình nấm

bắt màu Gram dương nhưng có thể bắt màu không đều hoặc Gram âm

Hình 1.9 Test mực tàu dương tính với Cryptococcus neoformans

Tuy nhiên độ nhạy của nhuộm soi còn thấp (nhuộm Gram độ nhạy là 54 –73%, nhuộm Giemsa độ nhạy là 54 – 75%) nên vẫn bỏ sót căn nguyên gây bệnh Nuôi cấy phân lập và định danh

Hầu hết các trường hợp cần nuôi cấy để định danh căn nguyên gây bệnh vàđánh giá độ nhạy cảm in vitro với các loại thuốc kháng nấm, nếu có chỉ định

Bệnh phẩm được cấy vào môi trường Sabouraud, để ở nhiệt độ 300C theo dõihàng ngày Hình thái trên kính hiển vi, đặc điểm ở môi trường nuôi cấy, màu sắc,tốc độ phát triển và sắc tố là đặc điểm để nhận định sơ bộ loài nấm.

Phương pháp cấy kinh điển có nhược điểm là đòi hỏi thời gian dài hơn so với

vi khuẩn Nấm có thể mọc sau 2 – 3 ngày Một số loài nấm cần 5 – 7 ngày, thậm chítới 4 – 6 tuần Có nhiều loại nấm khó nuôi cấy hoặc chưa nuôi cấy được

Phiên giải kết quả cấy nấm khó do chúng thuộc vi hệ của một số vị trí trên cơthể (như đường hô hấp, dạ dày ruột và sinh dục tiết niệu) và bệnh phẩm hoặc môitrường nuôi cấy có thể nhiễm các loài nấm có khả năng gây bệnh cơ hội trong môi

trường Trong khi hầu hết các chủng Candida và C neoformans phân lập từ máu có

ý nghĩa lâm sàng, các loài khác như Aspergillus (trừ A terreus) và Talaromyces (trừ

T marneffei) nhiều khả năng là giả nấm máu hoặc nhiễm Aspergillus phân lập từ

bệnh phẩm đường hô hấp đặc biệt khó phiên giải, do sinh vật này phổ biến trongmôi trường và có thể cư trú trong đường hô hấp mà không gây bệnh

Việc định danh nấm tới chi và loài ngày càng quan trọng khi phổ của các tácnhân gây bệnh cơ hội tiếp tục mở rộng Định danh tác nhân gây bệnh có thể có giátrị trong kiểm soát nhiễm trùng Trong trường hợp của các bệnh nấm hiếm gặp hơn,việc định danh căn nguyên đặc hiệu có thể cung cấp thông tin để bác sĩ lâm sàngtham khảo y văn về khả năng gây bệnh và đáp ứng với điều trị tác nhân gây bệnh

Do C albicans chiếm đa số trong các nấm men phân lập được từ bệnh phẩm

lâm sàng, một số xét nghiệm nhanh và đơn giản được đặt ra để phân biệt nó với cácnấm men khác như test mầm giá hoặc sinh bào tử màng dày trên nuôi cấy lam kính

Hình 1.10 Hình ảnh dương tính một số test định danh nhanh C albicans

Một số xét nghiệm có thể sử dụng để chẩn đoán sơ bộ C neoformans gồm

urease (dương tính), nitrate (dương tính) và sinh phenol oxidase (dương tính)

Nhìn chung để định danh xác định nấm men cần thực hiện các test sinh vậthóa học Hiện nay đã có các kit thương mại như API AUX, máy định danh Vitek

Khác với nấm men, định danh nấm sợi chủ yếu dựa trên hình thái như hìnhthái khuẩn lạc đại thể và hình thái vi thể Hình thái khuẩn lạc phụ thuộc vào môitrường hoặc chủng nên đặc điểm này không thể dùng làm tiêu chuẩn định danh đơnđộc Kết cấu bề mặt, hình thể, màu sắc, sắc tố mặt dưới, mọc ở 370C, và nhu cầu cácvitamin đặc hiệu đều là những đặc tính có giá trị Định danh xác định của hầu hếtnấm sợi dựa vào hình thái học vi thể Bệnh phẩm soi kính hiển vi phải được chuẩn

bị bằng phương pháp hạn chế tối đa mọi sự đứt gãy liên kết của bào tử với các cấutrúc sinh sản tương ứng, tốt nhất là nuôi cấy lam kính Sắc tố đen vách tế bào vàtính lưỡng hình khi thay đổi nhiệt độ cũng là những đặc điểm quan trọng

Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh

Mặc dù còn những băn khoăn về sự đào thải nhanh chóng khỏi máu của cáckháng nguyên nấm và độ tin cậy của các xét nghiệm kháng thể trên bệnh nhân suygiảm miễn dịch, các xét nghiệm phát hiện kháng nguyên nấm đặc hiệu, kháng thểvẫn được đặt ra để rút ngắn thời gian chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập

β-D-glucan là thành phần cấu tạo vách tế bào các loài Candida, Aspergillus

và nhiều loài nấm khác Kết quả dương tính thật với β-D-glucan gợi ý khả năngnhiễm nấm xâm nhập Vấn đề chính của xét nghiệm này là độ đặc hiệu thấp vàdương tính giả cao, đặc biệt trên các nhóm bệnh nhân Hồi sức tích cực do ở cácbệnh nhân này thường gặp các yếu tố gây dương tính giả như: nhiễm trùng hệ thống(nhiễm khuẩn huyết do các vi khuẩn Gram âm và Gram dương), một số kháng sinh(amoxicillin – clavulanate dùng đường tĩnh mạch), lọc máu, nấm cư trú, truyềnalbumin hoặc immunoglobulin Do đó xét nghiệm này chỉ có ý nghĩa khi dương tínhnhiều lần liên tiếp hoặc trên những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng hoặc yếu tốnguy cơ đặc trưng gợi ý nhiễm nấm xâm nhập Ngoài ra, thử nghiệm β-D-glucanchưa được nghiên cứu đầy đủ trên trẻ em nên không được khuyến cáo sử dụng trongnhi khoa [21]

Mannan là glycoprotein vách tế bào Candida Độ nhạy/độ đặc hiệu trong chẩn đoán nhiễm Candida xâm nhập của mannan và antimannan IgG đơn độc lần

lượt là 58%/93% và 59%/83% [22] Giá trị của xét thử nghiệm phối hợp là 83% và

86%, tốt nhất với nhiễm C albicans, C glabrata và C tropicalis Tuy nhiên, thử

nghiệm này mới được công nhận tại châu Âu và chưa được sử dủng rộng rãi tại Mỹ

Galactomannan là thành phần vách tế bào Aspergillus Galactomannan huyết thanh và dịch rửa phế quản là chỉ dấu chính xác cho chẩn đoán nhiễm Aspergillus

xâm nhập ở nhóm bệnh nhân người lớn và trẻ em mắc bệnh máu ác tính hoặc ghép

tế bào gốc tạo máu Ở các bệnh nhân đã sử dụng thuốc chống nấm sợi,galactomannan có thể áp dụng với bệnh phẩm dịch phế quản Các xét nghiệm β-D-glucan và galactomannan trong máu hoặc dịch rửa phế quản ở những bệnh nhân

không có triệu chứng hoặc bệnh nhân nguy cơ cao có sốt giúp làm giảm điều trị dựphòng không cần thiết [23].

- Các phương pháp chẩn đoán dựa trên acid nucleic

Các phương pháp chẩn đoán dựa trên khuếch đại acid nucleic cung cấp cáchđịnh danh nấm men và nấm sợi khách quan và nhanh hơn so với các phương pháptruyền thống Gần đây, công nghệ real-time PCR khếch đại đích nhanh, phát hiệntức thời bản sao gắn huỳnh quang và phân tích biểu đồ vừa phát hiện vừa định danhcăn nguyên nấm gây bệnh Hầu hết các kết quả trong y văn cho thấy độ nhạy củachẩn đoán dựa trên PCR bằng hoặc cao hơn các kĩ thuật chẩn đoán đang được sửdụng khác Phương pháp này đặc biệt có giá trị trong định danh các nấm sợi khôngsinh bào tử không thể định danh bằng các phương pháp thông thường Hạn chếchính của cách tiếp cận này là việc thiếu phương pháp chuẩn và dữ liệu phê duyệtphương pháp đa trung tâm

1.1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập

Nhiễm nấm xâm nhập gồm ba mức độ [24]:

- Nhiễm nấm xâm nhập xác định: Có bằng chứng xét nghiệm vi sinh hoặc giảiphẫu bệnh trên bệnh phẩm vô trùng dương tính với nấm (Bảng 1.2.)

- Nguy cơ cao nhiễm nấm xâm nhập: Có yếu tố vật chủ, 1 tiêu chuẩn lâm sàng

và 1 tiêu chuẩn cận lâm sàng nấm học (Bảng 1.3.)

- Có thể nhiễm nấm xâm nhập: Có yếu tố vật chủ, 1 tiêu chuẩn lâm sàngnhưng không có tiêu chuẩn cận lâm sàng nấm học (Bảng 1.3.)

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định nhiễm nấm xâm nhập trừ các bệnh nấm tại chỗ [24]

Vi thể:

Bệnh

phẩm vô

trùng

Giải phẫu bệnh học, tế bào học,

hoặc soi trực tiếpb bệnh phẩm

chọc hút kim nhỏ hoặc sinh

thiết thấy sợi hoặc dạng giống

nấm men bắt màu đen kèm theo

bằng chứng tổn thương mô kèm

theo

Giải phẫu bệnh học, tế bào học, hoặcsoi trực tiếpb bệnh phẩm chọc hútkim nhỏ hoặc sinh thiết từ vị tríthường vô khuẩn (trừ các niêm mạc)thấy các tế bào nấm men – ví dụ, các

loài Cryptococcus là các nấm men có

vỏ có chồi hoặc các loài Candida

sinh sợi giả hoặc sợi thậtc

Phân lập được nấm sợi từ nuôi

cấy bệnh phẩm lấy bằng quy

trình vô khuẩn từ một vị trí

thường vô khuẩn và có bất

thường về lâm sàng hoặc

X-quang phù hợp với bệnh lý

nhiễm trùng, bao gồm dịch rửa

phế quản phế nang, bệnh phẩm

xoang sọ và nước tiểu

Phân lập được nấm sợi từ nuôi cấybệnh phẩm lấy bằng quy trình vôkhuẩn (bao gồm dẫn lưu mới đặt(dưới 24 giờ)) từ mội vị trí thường vôkhuẩn có bất thường về lâm sànghoặc X-quang phù hợp với bệnh cảnhnhiễm trùng

Máu Cấy máu ra nấm sợid (như

Fusarium sp.) trong bệnh cảnh

nhiễm trùng phù hợp

Cấy máu ra nấm men (như các loài

Cryptococcus hoặc Candida) hoặc

nấm dạng nấm men (như các loài

dịch não tủy cho thấy nhiễm

Cryptococcus lan tỏa.

a Nếu có thể nuôi cấy, trả kết quả định danh đến mức độ giống hoặc loài

b Mô và các tế bào lấy cho nghiên cứu giải phẫu bệnh học hoặc tế bào họcnên được nhuộm bạc methenamine Grocott-Gomorri hoặc nhuộm Periodic Acid

Schiff, để dễ quan sát các cấu trúc nấm Bất cứ khi nào có thể, bệnh phẩm từ ổ bệnhliên quan nên được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (như calcofluor hoặcblankophor).

c Candida, Trichosporon và các loài Geotrichum dạng nấm men và

Blastoschizomyces capitatus cũng có thể tạo sợi giả hoặc sợi thật.

d Phân lập được các loài Aspergillus từ cấy máu luôn do nhiễm.

Bảng 1.3 Tiêu chuẩn nguy cơ cao nhiễm nấm xâm nhập trừ các bệnh nấm tại chỗ [24]

- Yếu tố vật chủ:

o Tiền sử giảm bạch cầu gần đây (< 0,5 G/l trên 10 ngày) liên quan đếnthời điểm khởi phát bệnh nấm;

o Bệnh nhân ghép tế bào gốc đồng loài;

o Sử dụng corticoid kéo dài (ngoại trừ các bệnh nhân nhiễm Aspergillus

phế quản phổi dị ứng) với liều trung bình tối thiểu 0,3 mg/kg/ngàyđương lượng prednisone trên 3 tuần;

o Điều trị bằng các chất ức chễ miễn dịch tế bào T đã biết khác,

như cyclosporine, thuốc chẹn TNF-α, kháng thể đơn dòng đặchiệu (như alemtuzumab), hoặc các chất tương tự nucleosidetrong 90 ngày gần đây;

o Thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh nặng (như bệnh u hạt mạn tính hoặcthiếu hụt miễn dịch kết hợp nặng)

- Tiêu chuẩn lâm sàng:

o Bệnh nấm đường hô hấp dướic : Có 1 trong 3 biểu hiện trên CT :

 Tổn thương đặc, viền rõ, có/ không có dấu hiệu quầng sáng;

 Dấu hiệu hình liềm hơi;

o Viêm khí phế quản:

 Có loét khí phế quản, cục nhỏ, giả mạc, mảng bám hoặc vảy

trên soi phế quản.

o Nhiễm trùng mũi xoang: Chẩn đoán hình ảnh cho thấy viêm xoang và

ít nhất một trong ba triệu chứng:

 Đau cấp khu trú (bao gồm cả đau lan lên mắt);

 Loét mũi với mảng bám màu đen;

 Mở rộng các xoang mũi bên qua các thành mũi, bao gồm cảvào ổ mắt

o Nhiễm trùng dịch não tủy: Một trong hai dấu hiệu sau:

 Tổn thương khu trú trên chẩn đoán hình ảnh;

 Dày màng não trên MRI hoặc CT

o Bệnh Candida lan tỏa: ít nhất một trong hai triệu chứng thực thể sau đây sau một giai đoạn nhiễm Candida máu trong 2 tuần trước đó:

 Các ổ apxe nhỏ dạng bia bắn ở gan hoặc lách;

 Xuất tiết võng mạc tiến triển khi khám mắt

- Tiêu chuẩn nấm học:

o Xét nghiệm trực tiếp: (tế bào học, soi trực tiếp hoặc nuôi cấy)

 Nấm sợi trong đờm, dịch rửa phế quản, chải phế quản, hoặcbệnh phẩm hút xoang, cho thấy một trong các dấu hiệu sau:

 Có các phần tử nấm gợi ý nấm sợi;

 Phân lập được nấm sợi từ nuôi cấy (ví dụ Aspergillus,

Fusarium, Zygomycetes, hoặc các loài Scedosporium).

o Xét nghiệm gián tiếp (phát hiện kháng nguyên hoặc thành phần vách

tế bào):

 Aspergillosis : Phát hiện kháng nguyên galactomannan trong

huyết tương, huyết thanh, dịch rửa phế quản hoặc dịch não tủy

- Nhiễm nấm xâm nhập trừ bệnh do Cryptococcus và các nấm lớp

Zygomycetes : Phát hiện β-D-glucan trong huyết thanh.

1.1.2 Chỉ số cư trú trong chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập

Chỉ số cư trú là tỉ lệ số lượng vị trí trong cơ thể không phải là máu có cùng

một chủng Candida spp cư trú trên tổng số vị trí được cấy Chỉ số cư trú ≥ 0,5 cho thấy có tình trạng Candida kí sinh nhiều nơi, bênh nhân có nguy cơ nhiễm nấm xâm

nhập cao gấp 6,82 lần Chỉ số này giúp phát hiện nhiễm nấm xâm nhập sớm hơnkhoảng 6 ngày so với việc chờ có bằng chứng rõ ràng Để tính chỉ số cư trú, bệnhnhân có nguy cơ nhiễm nấm xâm nhập được cấy theo dõi 2 lần một tuần các vị trísau: dịch ngoáy họng hoặc dịch phế quản; dịch dạ dày; phân hoặc tâm bông trựctràng; nước tiểu; mủ vết mổ hoặc dịch dẫn lưu ổ bụng; vị trí đặt catheter

Chỉ số cư trú hiệu chỉnh là kết quả của chỉ số cư trú nhân với tỉ số của ố vị trímọc nhiều (+++ với bệnh phẩm bán định lượng hoặc ≤105 trong nước tiểu hoặc dịch

dạ dày) trên tổng số vị trí dương tính với cùng một loài Candida Với ngưỡng là

0,4, chỉ số này có độ đặc hiệu, khả năng dự đoán dương tính và âm tính cao hơn rấtnhiều so với chỉ số cư trú [25]

1.2 Điều trị nhiễm nấm xâm nhập

1.2.1 Các thuốc kháng nấm

1.2.1.1 Amphotericin B

Amphotericin B, thuộc họ polyen macrolid, gắn vào ergosterol của vách tếbào nấm, tạo nên các ống dẫn làm rò rỉ các ion và các phân tử nhỏ từ trong tế bàonấm ra ngoài, gây chết tế bào Sterol của vách tế bào nấm là ergosterol, còn sterolchính của vách vi khuẩn, tế bào người là cholesterol, nên amphotericin B không cótác dụng diệt khuẩn và không độc với người

Amphotericin B là thuốc kháng nấm phổ rộng, có tác dụng trên hầu hết các

loài nấm men và nấm sợi Tuy nhiên một số loài như C glabrata, C krusei đang

dần giảm nhạy cảm và nhiều loài khác đã xuất hiện các biến chủng đề kháng

Sự giảm nhạy cảm của các chủng nấm với amphotericin B được cho là dothay đổi thành phần và cấu trúc sterol màng, làm giảm khả năng gắn của thuốc Ở

các loài Candida, kháng amphotericin thường do đột biến gen ERG3 làm thay đổi hoạt tính ∆5,6-sterol desaturase, hoặc đột biến ERG11 (gen sản xuất lanosterol 14α-

demethylase) và ERG6 (gen cần cho chức năng bình thường của màng) C glabrata

có thể chứa đột biến ở gen ERG6 làm giảm ergosterol màng và làm tăng các sản phẩm trung gian của sterol Ở các loài Candida khác, như C krusei và C tropicalis,

đề kháng liên quan đến giảm sterol màng [19]

1.2.1.2 Nhóm azole

Cơ chế tác dụng của nhóm azole là ức chế men 14α-demethylase của nấmnên làm giảm tổng hợp ergosterol của vách tế bào nấm, kìm hãm sự phát triển của tếbào nấm Các thuốc nhóm azole là thuốc kháng nấm phổ rộng chống nhiều loại nấmmen và nấm sợi khác nhau Tuy nhiên phổ tác dụng thay đổi do sự khác biệt về khảnăng ức chế men 14α-demethylase và các đích phụ giữa các loài khác nhau

Fluconazole chỉ có tác dụng chống nấm men, có tác dụng tốt với C albicans,

C parapsilosis, C tropicalis, C lusitaniae và C neoformans Tuy nhiên, C krusei

kháng tự nhiên; C glabrata và C guilliermondii đang giảm dần tính nhạy cảm với fluconazole Voriconazole có phổ tác dụng rộng hơn, hiệu quả với cả các chủng C.

albicans, C glabrata và C krusei kháng fluconazole

Đề kháng với nhóm azole có thể xảy ra do thay đổi số lượng hoặc chất lượng

emzyme đích (như đột biến ERG11 – gen mã hóa 14α-demethylase), giảm tiếp xúc

của thuốc với enzyme đích (do hoạt hóa hai loại protein kênh mã hóa bởi gen MDRhoặc CDR bơm chủ động azole ra khỏi tế bào) hoặc kết hợp các cơ chế này [19]

1.2.1.3 Echinocandin

Echinocandin, như caspofungin và micafungin, là các lipopeptide có khảnăng gắn nhanh và không đảo ngược được với 1,3-β-D-glucan synthase làm ức chếtổng hợp 1,3-β-D-glucan ở vách tế bào nấm Echinocandin có phổ tác dụng hẹp, chỉ

có hiệu quả với Candida và Aspergillus, do bị kháng tự nhiên bởi nhiều chi nấm như Cryptococcus, Trichosporon, Fusarium, Tuy nhiên echinocandin nhạy cảm với hầu hết các chủng Candida phân lập được, kể cả các chủng đề kháng

amphotericin B và azole Đề kháng thu được với echinocandin có thể do đột biến ở

gen FKS1, gen mã hóa một tiểu đơn vị của 1,3-β-D-glucan [19].

1.2.1.4 Pyrimidine analog

Flucytosine, thuốc duy nhất của nhóm, sau khi vào trong tế bào, chuyển hóathành chất gắn tRNA, ức chế quá trình tổng hợp protein và chất ức chế thymidylatesynthetase, enzyme thiết yếu của quá trình sinh tổng hợp DNA Phổ tác dụng của

flucytosine rất hẹp, giới hạn cho Candida spp và C neoformans Do đề kháng có

thể xảy ra ở nhiều bước, như vận chuyển vào trong tế bào và giáng hóa thành chất

có hoạt tính, flucytosine chỉ được dùng điều trị phối hợp với các thuốc khác

1.2.2 Xét nghiệm độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm

Pha loãng trong canh thang là phương pháp làm kháng nấm đồ tiêu chuẩn.Tiểu ban về Xét nghiệm Kháng nấm Viện tiêu chuẩn xét nghiệm và lâm sàng(CLSI) đã chuẩn hóa quy trình kháng nầm đồ pha loãng trong canh thang cho nấmmen và công bố breakpoint phiên giải kết quả nhạy cảm, nhạy cảm phụ thuộc liều,trung gian hay đề kháng với một số cặp phối hợp loài – kháng sinh (CLSI M27).Ngoài ra, dựa vào kết quả nghiên cứu phân bố nồng độ ức chế tối thiểu của cácchủng nấm phân lập được, CLSI công bố giá trị cắt dịch tể học phân biệt chủng có

và không có đề kháng thu được và/hoặc đề kháng do đột biến (chủng không hoangdại và chủng hoang dại) Tuy nhiên, kháng nấm đồ pha loãng trong canh thang phứctạp và tốn thời gian, không phù hợp với các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

CLSI cũng đã chuẩn hóa quy trình làm kháng sinh đồ khoanh giấy khuếchtán cho nấm men (CLSI M44) nhưng kĩ thuật này chỉ được khuyến cáo cho phối

hợp Candida spp và các azole hoặc echinocandin, trong đó kết quả cho micafungin

kém tối ưu do quần thể nhạy cảm và đề kháng có sự trùng lặp Kết quả kháng nấm

đồ với số lượng thuốc hạn chế chưa đáp ứng được nhu cầu của lâm sàng

Hiện nay, các phòng xét nghiệm thường sử dụng các sản phẩm thương mại

để làm kháng nấm đồ Xét nghiệm kháng nấm đồ của máy Vitek 2 là phương phápxét nghiệm tự động dựa trên nguyên lí pha loãng trong canh thang được thực hiệntrên thẻ xét nghiệm có 64 giếng, chứa amphotericin B, fluconazole, voriconazole,flucytosine, caspofungin và micafungin Kết quả kháng nấm đồ trên máy Vitek 2 có

độ tương đồng cao với phương pháp pha loãng trong canh thang [26], [27], [28]

Bảng 1.4 Breakpoint Candida spp – thuốc kháng nấm theo CLSI* [29]

AMB: Amphotericin B FLU: Fluconazole VORI: Voriconazole 5FC: Flucytosine

CAS: Caspofungin MICA: Micafungin

1.2.3 Một số khuyến cáo trong điều trị nhiễm nấm xâm nhập

Bảng 1.5 Một số khuyến cáo trong điều trị nhiễm nấm xâm nhập

nguy cơ cao nhiễm Aspergillus

xâm nhập giảm bạch cầu kéo dài

Điều

trị

Fluconazole là liệu pháp thay thế cho

những bệnh nhân không dùng azole

Dùng amphotericin B hoặcechinocandin cho bệnh nhân

kinh

nghiệm

trước đó và không có các chủng

Candida kháng azole cư trú.

giảm bạch cầu kéo dài sốt daidẳng sau điều trị kháng sinh phổrộng

Điều

trị mục

tiêu

Echinocandin là liệu pháp khởi trị

Fluconazole là liệu pháp thay thế cho

nhạy cảm fluconazole hoặc1/và2 cấy

máu âm tính sau điều trị

Voriconazole là liệu pháp khởitrị

Amphotericin B là liệu pháp thaythế

Phối hợp voriconazole và mộtechinocandin ở bệnh nhân cótiền sử nhiễm nấm xâm nhập ởphổi

Can thiệp ngoại khoa loại bỏ cáctổn thương, xử lí biến chứng do

Aspergillus trong trường hợp

viêm xoang, viêm nội tâm mạc,viêm ngoại tâm mạc, viêm cơtim, viêm tủy xương, viêm khớpnhiễm trùng và bệnh thực quản,

dạ dày ruột, gan do Aspergillus.

1Bệnh nhân không giảm bạch cầu trung tính 2Bệnh nhân có giảm bạch cầu trung tính

1.3 Các nghiên cứu về tình hình nhiễm nấm xâm nhập và mức độ đề kháng thuốc kháng nấm

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Bảng 1.6 Một số nghiên cứu về tình hình nhiễm nấm xâm nhập và mức

độ đề kháng thuốc kháng nấm trên thế giới

Nước

Thời gian

Đối tượng

Bệnh viện Chủn g

Chi thường gặp nhất

Loài thường gặp

(n, tỉ lệ nhạy cảm với

fluconazole và voriconazole)

[30]

Cryptococcu s

Mexico

1993–2013

[31]

Nấm nộitạng

1(472)

Candida Mucorales Cryptococcu s

Thụy Điển

2005–2009

[32]

Nấm sợinội tạng

1(101)

Aspergillus Mucorales Fusarium

Hoa Kì

2001–2006

[33]

Nấm nộitạng(bệnhnhân ghép

tế bào gốctạo máu)

23(983)

Aspergillus Candida Zygomycetes

5(4860)

2010–2011

[35]

Nấm men

bề mặt vànội tạng

4(551)

có sự khác biệt về các loài gây bệnh thường gặp ngoài Candida và mức độ đề kháng

thuốc kháng nấm theo vùng Các nghiên cứu này một mặt cung cấp thông tin banđầu về tình hình nhiễm nấm, các căn nguyên chính, phục vụ công tác dự phòng vàchẩn đoán; mặt khác, kết quả của các nghiên cứu này định hướng cho các nghiên

cứu tiếp sau trên các đối tượng cụ thể hơn như các nghiên cứu riêng về nấm menhoặc nấm sợi, hoặc nấm trên các đối tương nguy cơ cao, có giá trị cụ thể gắn vớichẩn đoán, điều trị những ca bệnh cụ thể

1.3.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam

Các số liệu nghiên cứu về nhiễm nấm xâm nhập tại Việt Nam được công bốchưa nhiều, chủ yếu nằm trong các nghiên cứu về căn nguyên gây nhiễm trùng từmột loại bệnh phẩm cụ thể [36], [37], [38] hoặc trên bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS[39], [40], [41]

Gần đây, nhiều nghiên cứu về tình hình nhiễm nấm nói chung được thực hiệnhơn [42] Một nghiên cứu đa trung tâm, trong đó có 4 bệnh viện của Việt Nam, về

tình hình nhiễm Candida máu và mức độ nhạy cảm của các chủng nấm phân lập được tại Châu Á – Thái Bình Dương ghi nhận C albicans và C tropicalis là hai loài Candida gây nhiễm nấm máu chủ yếu tại Việt Nam với tỉ lệ lần lượt là 39,9%

và 39,2%; trong khi các loài Candida khác nhạy cảm hoàn toàn với các thuốc kháng nấm được thử nghiệm, tỉ lệ nhạy cảm với fluconazole và voriconazole của C.

tropicalis lần lượt chỉ là 61,7% và 46,7% [43] Kết quả này đặt ra nhu cầu giám sát

dịch tễ học nấm xâm nhập và mức độ đề kháng thuốc kháng nấm tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu: Hồi cứu và tiến cứu, mô tả cắt ngang

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: từ tháng 5 năm 2016 đến tháng 7 năm 2017

Địa điểm: Khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu

Lấy mẫu thuận lợi

2.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Các chủng nấm gây bệnh phân lập được từ tất cả các bệnh phẩm chỉ địnhnuôi cấy ở Bệnh viện Bạch Mai từ 1/1/2013 đến 30/6/2017

2.2.4 Tiêu chuẩn loại trừ

- Các chủng nấm ở các mẫu bệnh phẩm khác nhau trên cùng một bệnh nhântrùng với chủng đã được chọn từ bệnh nhân đó

- Các chủng nấm phân lập từ các bệnh phẩm bề mặt: da, tóc, móng

2.3 Quy trình nghiên cứu

Sơ đồ 2.1 Quy trình nghiên cứu 2.4 Các bước tiến hành

o India Ink của Becton, Dickinson;

o Lactophenol cotton blue;

o Bộ sinh vật hóa học API AUX để định danh các loài nấm men.

 Bệnh phẩm đờm, dịch phế quản đặc: Dùng pipet vô trùng nhỏ

1 giọt bệnh phẩm lên lam kính sạch Nhỏ 1 giọt KOH 20% vàobệnh phẩm

o Đạy lamen sạch

o Soi dưới kính hiển vi quang học

o Ghi nhận hình thái nấm men, nấm sợi trên lam soi tươi (nếu có).Nuôi cấy, phân lập và chẩn đoán vi nấm

o Các bệnh phẩm sau khi được nhận ria cấy ngay trên SDA, để tủ ấm

300C Đọc đĩa bệnh phẩm hàng ngày trong 5 ngày

o Các bệnh phẩm chỉ có chỉ định nuôi cấy vi khuẩn cấy vào các môitrường phân lập tùy từng loại bệnh phẩm, để tủ ấm 350C

o Nhận định khuẩn lạc nghi ngờ nấm

o Nhuộm soi từ khuẩn lạc để xác định khuẩn lạc nấm

 Dùng pipet vô trùng nhỏ 1 – 2 giọt NaCl 0,9% vô trùng lên lamkính sạch

 Dùng que cấy lấy một đầu khuẩn lạc nghi ngờ nghiền đều trongnước muối sinh lý trên lam kính

 Soi dưới kính hiển vi quang học tìm tế bào nấm men và/hoặcsợi nấm

o Tiêu chuẩn nhận định kết quả nuôi cấy dương tính với từng loại bệnhphẩm

 Bệnh phẩm máu, dịch não tủy, dịch vô trùng: căn nguyên nấmphân lập được từ bệnh phẩm được coi là căn nguyên gây bệnh.

 Dịch tiết hô hấp: nấm sợi và nấm Cryptococcus neoformans

được coi là căn nguyên với số lượng bất kì

 Nước tiểu: phân lập được nấm men với số lượng dưới 105

.

Định danh và làm kháng sinh đồ nấm men

o Test mầm giá (Germ tube test), làm khi xác định là Candida:

 Dùng pipet vô trùng hút 300 – 400 µl huyết thanh cho vào ốngtube nhựa có nắp xoáy vô khuẩn Tốt nhất nên dùng huyếtthanh ngựa, nếu dùng huyết thanh người cần chắc chắn không

có kháng thể kháng nấm

 Dùng que cấy lấy một lượng khuẩn lạc nhỏ, hòa tan hoàn toànvào ống tube đã nhỏ sẵn huyết thanh

 Ủ ở 370C, thời gian khoảng 3 – 4 giờ

 Lấy một giọt dung dịch đó nhỏ lên lam kính sạch, đạy lamenđem soi dưới kính hiển vi quang học

 Nhận định kết quả: Vật kính 10x nhận định sơ bộ, vật kính 40xkhẳng định

o Nuôi cấy lam kính

 Đun cách thủy ống môi trường thạch bột gạo – Tween 80 đếnkhi tan chảy hoàn toàn thành dịch lỏng

 Nhỏ thạch bột gạo – Tween 80 lên lam kính vô trùng

 Chờ giọt thạch nguội, dùng que cấy lấy một lượng khuẩn lạcbằng hạt vừng

 Cấy thành 3 điểm cách đều nhau xung quanh giọt thạch

 Đạy lamen vô khuẩn

 Đặt lam kính vào hộp petri có giá đỡ là que thủy tinh chữ U

 Đặt miếng bông tẩm nước cất vào hộp lồng để tạo độ ẩmDán kín hộp petri bằng băng dính không khí qua được

 Ủ trong tủ ấm 300C, đọc kết quả sau 24 – 48 giờ

 Nhận định kết quả

o Định danh sơ bộ bằng ChromIDTM Candida

 Dùng que cấy lấy một phần khuẩn lạc nấm đã nuôi cấy trênmôi trường SDA hoặc thạch máu 18 – 24 giờ ria trên đĩaChromIDTM Candida

 Nhận định kết quả

o Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng bộ sinh vật hóa học APIAUX: API AUX xác định tính chất lên men 19 loại đường và khảnăng sinh sợi giả trên nuôi cấy lam kính của các chủng nấm men

 Pha khuẩn lạc nấm đã được nuôi cấy trên môi trường SDA từ

18 – 24 giờ trước vào ống chứa 2ml nước muối sinh lý vôkhuẩn sao cho có độ đục McFarland 2

 Hút 100µl huyền dịch nấm vào ống C trong bộ kít

 Trộn đều hỗn dịch trong ống C rồi nhỏ hỗn dịch vào các giếng

ở thanh test đạt độ phồng tối đa

 Ủ ở 29 ± 20C, đọc kết quả

 Đọc kết quả trên http://apiweb.biomerieux.com/ sau 24 – 48 giờ

o Định danh và làm kháng sinh đồ bằng máy Vitek 2

 Lấy thẻ xét nghiệm khỏi tủ lạnh, để ở nhiệt độ phòng 30 phút

 Chuẩn bị huyền dịch để định danh:

 Lấy 3ml nước nuối 0,45% từ Dispenser vào ống nghiệm

và pha huyền dịch vi khuẩn

 Lấy huyền dịch vừa pha xong, lắc đều, đưa vào máyDensichek để đo độ đục sao cho đạt từ 1,8 – 2,2

 Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ (Bỏ qua nếu chỉ địnhdanh):

 Lấy 3ml nước muối 0,45% vào ống nghiệm và đặt vàocassette

 Dùng pipet hút 280µl huyền dịch từ ống nghiệm địnhdanh sang ống nghiệm làm kháng sinh đồ.

 Lấy thẻ từ túi bảo vệ và đặt vào cassette Đưa cassette vàobuồng hút Nhấn Start Fill Chờ đèn báo kết thúc

 Chuyển ngay cassette sang buồng vận hành Loading Station

 Sau 4 – 5 phút, đèn nháy báo kết thúc, mở cửa buồng vận hànhLoading Station lấy cassette ra Đóng cửa Loading Station

 Nhập thông tin cassette và bệnh nhân vào máy

 Chờ kết quả được tự động in ra

o Tiêu chuẩn định danh nấm men theo thứ tự ưu tiên:

 Khuẩn lạc 24 – 48 giờ có hình ảnh “chân sao” trên thạch máu,

test mầm giá dương tính: Candida albicans

 Kết quả định danh bằng API AUX

 Kết quả định danh bằng Vitek 2

Nấm sợi

o Nhận định khuẩn lạc:

 Màu sắc, cấu trúc khuẩn lạc

 Sắc tố trên thạch quanh khuẩn lạc

o Soi bào tử

 Nhỏ một giọt lactophenol cotton blue lên một lam kính sạch

 Cắt một đoạn băng dính trong ngắn, dùng kẹp ép đoạn giữađoạn băng dính lên bề mặt khuẩn lạc nấm sợi

 Dán mặt vừa tiếp xúc với bề mặt khuẩn lạc của đoạn băng dínhlên giọt lactophenol cotton blue trên lam kính

 Đặt lamen lên băng dính để loại bỏ bóng khí

 Nhận định kết quả: Ghi nhận các cấu trúc sợi, bào tử đính, bào

tử và các cấu trúc mang bào tử

o Tiêu chuẩn chẩn đoán: