Phát hiện gen mcr 1 và xác định độ nhạy cảm với colistin của các chủng e coli phân lập từ phân lợn tại ba vì – hà nội, năm 2016

Trên lâm sang hiện nay, colistin là kháng sinh cuối cùng được sử dụngđối với các trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm đa kháng khángsinh gây ra.. Đáng chú ý là khi gần đây tì

NGUYỄN HỒNG HÀ

PHÁT HIỆN GEN MCR-1 VÀ XÁC ĐỊNH

ĐỘ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH COLISTIN CỦA

CÁC CHỦNG E COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN LỢN

TẠI BA VÌ – HÀ NỘI

Chuyên ngành : Vi sinh

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyễn Vũ Trung

HÀ NỘI - 2017

và Bộ môn Vi sinh – Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Vũ Trung trưởng Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã hết

lòng dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập và trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này, người đã giúp tôi trưởng thành hơn trong con đường nghiên cứu khoa học.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các cán Bộ môn Vi sinh – Trường Đại học Y Hà Nội, các anh chị của Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford - Hà Nội đã hết lòng dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Tôi xin cảm ơn sự động viên, giúp đỡ của bạn bè trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình đã dành cho tôi sự yêu thương, chăm sóc tận tình, đã động viên, giúp đỡ

và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 12 tháng 9 năm

2017

Nguyễn Hồng Hà

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sốliệu, kết quả được nêu trong khóa luận này là trung thực và chưa được công

bố trong bất kỳ một nghiên cứu nào khác

Hà Nội, ngày 12 tháng 9 năm

2017

Tác giả

Nguyễn Hồng Hà

Acid deoxyribonucleicESBL Extended-spectrum beta-lactamases

Enzym beta lactamase phổ mở rộngKPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase

Klebsiella pneumonia sinh enzymcarbapenemase

mcr-1 Mediated colistin resistance – 1

Gen kháng colistin trung gian plasmid - 1MRSA Methicillin - resistant Staphylococcus aureus

Tụ cầu vàng kháng methicillinVRSA Vancomycin - resistant Staphylococcus aureus

Tụ cầu vàng kháng vancomycin

ndm-1 New Delhi Metallo - beta - lactamase -1

Gen quy đinh sinh enzym Metallo betalactamase New Delhi - 1

MBL Metallo - beta – lactamase

Enzym metallo - beta – lactamasePCR Polymerase Chain Reaction

Phản ứng khuếch đại chuỗiMIC Minimal Inhibitory Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểuXDR Extreme Drug Resistance

Kháng thuốc mở rộngBLAST Basic Local Aligment Search Tool

Công cụ tìm kiếm trình tự trên ngân hàng genCLSI Clinical and Laboratory Standard Institute

Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Escherichia coli 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học 3

1.1.2 Mức độ kháng kháng sinh của E coli gây bệnh 6

1.2 Kháng sinh colistin 7

1.2.1 Cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn, dạng sử dụng, thải trừ thuốc 8

1.2.2 Cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn 10

1.2.3 Tình trạng kháng colistin 11

1.2.4 Tình trạng sử dụng kháng sinh colistin trên lâm sàng và trong chăn nuôi 14 1.3 Các nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về tình hình kháng colistin ở E coli 15

1.3.1 Trên thế giới 15

1.3.2 Tại Việt Nam 15

1.4 Các kỹ thuật kháng sinh đồ 16

1.4.1 Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán 16

1.4.2 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn 16

1.5 Xác định gen liên quan đến kháng colistin, mcr-1 của E coli bằng PCR 17

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng và địa diểm nghiên cứu 20

2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 20

2.3 Vật liệu nghiên cứu 21

2.3.1 Vật liệu thu thập và bảo quản mẫu phân 21

2.3.2 Vật liệu nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 21

2.3.3 Vật liệu làm kháng sinh đồ 21

2.3.4 Vật liệu tách DNA vi khuẩn 21

2.4.1 Kĩ thuật thu thập mẫu phân 22

2.4.2 Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 22

2.4.3 Kĩ thuật kháng sinh đồ 23

2.4.4 Kĩ thuật tách DNA 26

2.4.5 Kĩ thuật PCR phát hiện vi khuẩn mang gen mcr-1 26

2.5 Xử lí thống kê các số liệu nghiên cứu 28

2.6 Đạo đức nghiên cứu 28

Chương 3: KẾT QUẢ 30

3.1 Kết quả xác định tỉ lệ mang gen mcr-1 ở các chủng E coli phân lập từ phân lợn tại Ba Vì - Hà Nội, năm 2016 30

3.1.1 Kết quả nuôi cấy và phân lập các chủng từ mẫu nuôi cấy 30

3.1.2 Kết quả PCR 32

3.1.3 Kết quả giải trình tự gen sau PCR đoạn gen sản phẩm 35

3.2 Kết quả xác định mức độ nhạy cảm với colistin của các chủng E coli mang gen mcr-1 phân lập từ phân lợn tại Ba Vì - Hà Nội, năm 2016 39

Chương 4: BÀN LUẬN 43

4.1 Tỉ lệ mang gen mcr-1 ở các chủng E coli phân lập từ phân lợn tại Ba Vì - Hà Nội, năm 2016 43

4.1.1.Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 43

4.1.2 Tỉ lệ mang gen mcr-1 ở các chủng E coli trên mẫu phân lợn 44

4.2 Mức độ nhạy cảm với colistin của các chủng E coli mang gen mcr-1 phân lập từ phân lợn 48

KẾT LUẬN 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Tỉ lệ E coli sinh ESBL ở 14 bệnh viện năm 2009 7 Bảng 3.1 Tỉ lệ chủng E coli mang gen mcr-1 trên mẫu phân lợn 32 Bảng 3.2 Tình trạng mang gen mcr-1 của các chủng E coli trong mẫu phân

lợn theo các xã và thị trấn 33Bảng 3.3 Phân bố MIC các chủng theo xã và theo hộ gia đình 41

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ các loài phân lập được từ mẫu phân lợn 31

Biểu đồ 3.2 Số hộ gia đình có E coli mang gen mcr-1 theo các xã 34 Biểu đồ 3.3 Phân bố MIC colistin của các chủng E coli phân lập được

mang gen mcr-1 bằng phương pháp E-test 40

Hình 1.1 Tỉ lệ đề kháng của E coli với một số kháng sinh thường dùng

trong điều trị 6

Hình 1.2 Công thức hóa học của kháng sinh colistin 8

Hình 1.3 Cơ chế kháng colistin của gen mcr-1 11

Hình 1.4 Các bước phản ứng xảy ra trong chu trình nhiệt 18

Hình 3.1 (a) Khuẩn lạc nuôi cấy từ mẫu phân, (b) Khuẩn lạc E coli trên môi trường MAC và môi trường thạch thường 30

Hình 3.2 Kết quả MALDI-TOF mẫu nuôi cấy phân lập E coli 31

Hình 3.3 Kết quả điện di một số mẫu từ E coli phân lập được 32

Hình 3.4 Kết quả giải trình tự gen đoạn gen mcr-1 sau PCR 38

Hình 3.5 Một số kết quả kháng sinh đồ E-test ở các MIC khác nhau 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn kháng kháng sinh đã trở thành mối đe dọa với y tế toàn cầu.Nhiều vi khuẩn gây bệnh đã kháng với nhiều loại kháng sinh thế hệ mới, phổrộng thậm chí nhiều chủng vi khuẩn đã kháng lại với tất cả các kháng sinhtheo khuyến cáo điều trị Các vi khuẩn Gram âm đã và đang là những vikhuẩn gây bệnh thường gặp và kháng kháng sinh với tỉ lệ cao [1] Tại ViệtNam, trong số các vi khuẩn gây bệnh được phân lập, vi khuẩn Gram âm

chiếm đa số với tỉ lệ phân lập được là 78,5%, trong đó, Escherichi coli đóng

vai trò quan trọng trong các nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm màng não,

nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng đường mật E coli là vi khuẩn tồn tại trong

tự nhiên, trong đường tiêu hóa của gia súc Đây là nguồn lây truyền quan

trọng đối với nhiều nhiễm trùng ở người Nhiều chủng E coli đã kháng lại với

các cephalosporin thế hệ 3, 4, thậm chí với cả các kháng sinh nhómcarbapenem [2], làm cho việc lựa chọn kháng sinh điều trị gặp nhiều khókhăn Trên lâm sang hiện nay, colistin là kháng sinh cuối cùng được sử dụngđối với các trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm đa kháng khángsinh gây ra

Đã có các nghiên cứu chỉ ra mối liên quan chặt chẽ giữa việc sử dụngkháng sinh và tính đề kháng kháng sinh trên các chủng vi khuẩn đặc biệt trêncác chủng trên động vật Đáng chú ý là khi gần đây tình trạng kháng colistinđang gia tăng một cách báo động, với sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn

Gram âm trong đó có E coli mang gen mcr-1 Báo cáo đầu tiên về vi khuẩn

mang gen này được Liu và cộng sự đăng trên tạp chí Lancet năm 2015 Sau

đó đã phát hiện các chủng vi khuẩn này ở nhiều nơi trên thế giới như TrungQuốc, Châu Phi, Mỹ, Brazil và nhiều quốc gia khác [3][4][5] Ở Việt Nam,

còn thiếu những nghiên cứu xác định tỷ lệ mang gen mcr-1 và xác định mức

độ nhạy cảm kháng sinh colistin ở các chủng E coli, nhất là các chủng tồn tại

ở gia súc, chính vì lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

“Phát hiện gen mcr-1 và xác định độ nhạy cảm với colistin của các chủng E coli phân lập từ phân lợn tại Ba Vì – Hà Nội, năm 2016.” với

hai mục tiêu:

1 Xác định tỉ lệ mang gen mcr-1 ở các chủng E coli phân lập từ phân lợn tại Ba Vì - Hà Nội, năm 2016.

2 Xác định mức độ nhạy cảm với colistin của các chủng E coli mang gen mcr-1 phân lập từ phân lợn tại Ba Vì - Hà Nội, năm 2016.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 1: Escherichia coli

Escherichia coli (E coli) do Theodore Escherich (1857 - 1911), một nhà

vi khuẩn học người Áo, phát hiện lần đầu tiên năm 1885 Chi Escherichia

thuộc họ vi khuẩn đường ruột, tồn tại và phát triển như vi hệ trong ruột của

người cũng như các loài gia súc Trong các loài thuộc chi này, E coli được

chọn là loài điển hình và có vai trò quan trọng nhất trong y học Chúng có khảnăng truyền từ động vật sang người và trong quá trình đó chúng cũng truyềncác gen kháng thuốc từ động vật sang người

CHƯƠNG 2: Đặc điểm sinh học [6]

Hình thể:

E coli là trực khuẩn Gram âm, có lông quanh thân, di động được, rất ít

khi có vỏ, không sinh nha bào

Nuôi cấy :

 E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt

độ thích hợp 37⁰C, có thể phát triển được ở nhiệt độ 5 - 40⁰C Hiếu và kỵkhí tuỳ tiện

 Môi trường canh thang: Nuôi cấy sau 3 - 4 giờ vi khuẩn phát triển làm đụcnhẹ môi trường, sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng, nhữngngày sau vi khuẩn lắng xuống đáy ống

 Môi trường thạch thường: Nuôi cấy sau 8 - 10 giờ có thể nhìn thấy khuẩnlạc riêng rẽ, khuẩn lạc to, tròn, lồi, mặt nhẵn, bờ đều, đường kính khoảng1,5 mm

 Môi trường chọn lọc, thạch MacConkey khuẩn lạc màu hồng đỏ, khôngmọc trên môi trường SS

Tính chất sinh vật hoá học :

 Lên men các đường glucose, lactose, levulose, galactose, xylose, ramnose,manit, có sinh hơi

 Không lên men đường adonit và inozit

 Nghiệm pháp IMVIC: Dùng để phân biệt E coli với các vi khuẩn đường

ruột khác, gồm có các phản ứng

 Phản ứng sinh indol (I): E coli có I (+).

 Phản ứng đỏ metyl (M): E coli có phản ứng đỏ M (+).

 Phản ứng Voges Proskauer (V): Phản ứng này dùng để kiểm tra khả

năng sinh ra acetyl - metyl cacbinol E coli có phản ứng V (-)

 Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trên thực tế không làm

 Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon từ citrate (C): E coli phản ứng

citrat trong môi trường Simon âm tính C (-)

 Ngoài ra E coli không phân giải được ure, không sinh H₂S sau 48 giờ.

Sức đề kháng

 Đun E coli ở 55°C trong 1 giờ hoặc 60°C trong 30 phút sẽ bị tiêu diệt.

 Dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường

Kháng nguyên

 E coli có các kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K.

 Kháng nguyên O: Có khoảng 157 quyết định kháng nguyên O được đánh

số 1, 2, 3, 4

 Kháng nguyên H: Có tới 52 quyết định kháng nguyên H

 Kháng nguyên K: Gồm có kháng nguyên L và B không chịu nhiệt vàkháng nguyên А, M chịu nhiệt, kháng nguyên bề mặt K thường ngăn cảnhiện tượng ngưng kết О của vi khuẩn sống Nếu đun sôi 1 giờ để phá huỷkháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết О lại xuất hiện Có khoảng 100kháng nguyên K

Phân loại :

 E coli được đánh số theo thứ tự kháng nguyên O, kháng nguyên K và H

Khả năng gây bệnh :

 Gây bệnh ở đường tiêu hoá:

Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli): Là tác nhân gây tiêu chảy giống

tả (V cholerae), có thể gây bệnh bằng một hoặc cả hai độc tố là:

 LT (Labile toxin): Độc tố không bền với nhiệt độ, có kháng nguyên gầngiống choleragen của vi khuẩn tả Nó tác động lên adenylcyclase, làmtăng AMP vòng, dẫn tới hút nước và điện giải vào lòng ruột

 ST (Stabile toxin): Độc tố bền vững với nhiệt độ Tác dụng của nó trênguanylcyclase, làm tăng GMP vòng và dẫn đến hút nước và điên giảivào lòng ruột như tác dụng của AMP vòng

Nhóm EIEC (Enteroinvasive E coli): Gây bệnh bằng sự xâm nhập của

E coli vào đại tràng và gây bệnh bằng nội độc tố giống Shigella Triệu chứng

lâm sàng như bệnh lỵ trực khuẩn

Nhóm EPEC (Enteropathogenic E coli): Trong thực nghiệm, vi khuẩn

thuộc nhóm này tạo ra độc tố tác động trên tế bào vero (từ đó có tên là độc tố

vero) độc tố này tương tự như độc tố của Shigella dysenteriae Nó tác động

vào tế bào biểu mô ruột và phá huỷ nhung mao của tế bào này

EHEC (Enterohaemorhagic Е coli): Cơ chế gây bệnh của nhóm này

chưa được biết rõ Nhưng người ta khẳng định rằng, nó có một độc tố, có

kháng nguyên và cơ chế tác dụng gần như ngoại độc tố của Shigella shiga EAEC (Enteroadherent E coli): Gây bệnh do bám dính vào niêm mạc

ruột làm cản trờ sự hấp thu chất dinh dưỡng

 Gây bệnh ngoài đường tiêu hoá

E coli có thể gây nhiễm trùng đường tiết niệu, sinh dục, nhiễm trùng

đường gan - mật, nhiễm khuẩn vết thương, vết bỏng, viêm phế quản, viêm

phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não mủ ở trẻ sơ sinh, nhiễmkhuẩn huyết.

CHƯƠNG 3: Mức độ kháng kháng sinh của E coli gây bệnh

Tại Việt Nam, E coli gây bệnh đã giảm nhạy cảm với cephlosporin thế

hệ 3 và có tỉ lệ kháng cao với cotrimoxazole dao động từ 60-80% tại hầu hếtcác bệnh viện Tỉ lệ kháng với carbapenems thấp hơn 2%, trừ Bệnh viện BệnhPhổi Trung ương báo cáo tỉ lệ đề kháng đáng xem xét lên tới 47,7% [2]

Hình 1.1 Tỉ lệ đề kháng của E coli với một số kháng sinh thường dùng

trong điều trị [2]

Bảng 1.1: Tỉ lệ E coli sinh ESBL ở 14 bệnh viện năm 2009 [2]

Tỉ lệ sinh ESBL của các chủng E coli và Klebsiella phân lập được tại

các bệnh viện có sự khác biệt, cao nhất ở Bệnh viện bệnh Nhiệt đới Trung

ương với tỉ lệ 54,7% trên E coli, sau đó là Bệnh viện Chợ Rẫy với tỉ lệ 49%

(Bệnh viện đa khoa lớn nhất khu vực phía Nam), Bệnh viện Việt Đức tỉ lệ là57,3% (Bệnh viện chuyên khoa về phẫu thuật), Bệnh viện Bình Định và hai

bệnh viện Nhi (Nhi Trung ương và Nhi đồng I) với tỉ lệ gần 40% trên E coli Đây cũng là các bệnh viện có tỉ lệ E coli kháng cephalosporins thế hệ 3 cao

hơn các bệnh viện khác

CHƯƠNG 4: Kháng sinh colistin

Colistin là kháng sinh thuộc nhóm polymixin (polymyxin E), được pháthiện đầu tiên vào những năm 1940 nhưng đến cuối những năm 1950 mớiđược đưa vào sử dụng Trước đây, colistin đã được sử dụng chống lại nhiễmtrùng gây ra bởi vi khuẩn Gram âm kháng thuốc Tuy nhiên, những báo cáo

về tác dụng phụ gây độc trên thận và độc thần kinh đã khiến các bác sĩ lâmsàng cân nhắc trong việc sử dụng kháng sinh này, đặc biệt với sự xuất hiện

của những loại kháng sinh khác ít độc hơn (như aminoglycosides ) Giữanhững năm 1970 và 1990, colistin không thường được sử dụng và số lượngnhững nghiên cứu phân tích việc sử dụng cũng như dược lực học của colistin

là rất hiếm Tuy nhiên gần đây, kháng sinh này đã được sử dụng trở lại với vaitrò là lựa chọn điều trị cuối cùng đối với những vi khuẩn đa kháng như

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae,

E coli. Do các vi khuẩn Gram âm này ngày càng đóng vai trò quan trọngtrong những trường hợp nhiễm khuẩn và mức độ kháng kháng sinh ngày càngtăng, colistin đóng vai trò ngày càng quan trọng Tuy nhiên hiện nay đã ghinhận những chủng vi khuẩn Gram âm kháng lại colistin Mặc dù cơ chế chínhxác gây ra kháng colistin vẫn chưa được xác định, nhưng có giả thiết cho rằng

hệ thống điều hòa gen PmrA - PmrB và PhoP - PhoQ đóng vai trò trong sự đềkháng colistin Và gần đây nhất đã có những nghiên cứu đưa ra sự liên quan

mật thiết giữa gen mcr-1 trên plasmid vi khuẩn và sự kháng colistin trên lâm

sàng, cũng như cơ chế kháng colistin do gen trên của vi khuẩn [3] [4]

sử dụng, thải trừ thuốc.

Hình 1.2 Công thức hóa học của kháng sinh colistin

Colistin có hai dạng sử dụng colistin sulfate dùng tại chỗ vàcolistimethate natri dùng toàn thân Điều quan trọng cần lưu ý là hai dạng

năy không thí̉ thay thế lẫn nhau Colistin sulfate mang điện tích dương vẵ̉n định, trong khi colistimethate natri mang điện tích đm vă không ổn định vềmặt hóa học cả trong thực nghiệm lẫn trong cơ thí̉ [11],[12] Tuy nhiín,colistimethate natri lă dạng an toăn hơn nín được sử dụng đường tĩnh mạch vìtđ̀n suất gđy độc thấp hơn [13] Vì lă dạng tiền thuốc vă không ổn định về mặthóa học, colistimethate natri dễ dăng bị thủy phđn đí̉ tạo nín những dẫn xuấtsulfomethylate không hoăn chỉnh, có dạng giống như colistin sulfate mộtdạng hoạt động của thuốc [13] Sự thủy phđn colistimethate natri thănhcolistin năy lă một bước quan trọng trong hoạt tính khâng khuđ̉n của thuốc.Trước khi colistin được tạo thănh, colistimethate natri có rất ít hoặc không cóhoạt tính khâng khuđ̉n vă được xem lă dạng bất hoạt của colistin [13].

Colistimethate natri bị thải trừ chủ yếu qua thận, một phđ̀n thuốc sẽ đượcbiến đổi đí̉ tạo thănh colistin có hoạt tính trong cơ thí̉ Colistin được tâi hấpthu tích cực tại ống thận vă vì vậy được lọc bởi những cơ chế ngoăi thận khâc[14],[15]

Cơ chế về khả năng diệt khuđ̉n của colistin được cho lă rất giống với cơchế của polymyxin B, một đại diện khâc của nhóm polymyxin đó lă tâc động

vă lăm thay đổi tính chất lớp măng vi khuđ̉n, gđy tổn thương vă phâ hủy tếbăo vi khuđ̉n [16] Do colistin mang nhiều điện tích dương, vừa ưa nước vừa

ưa lipid, những điện tích dương năy tương tâc theo cơ chế cđn bằng điện tíchvới lớp măng ngoăi của vi khuđ̉n Gram đm vă thế chỗ cho những ion mangđiện tích dương của lớp măng lipid, đặc biệt lă calci vă magie [17] Dẫn đếnphâ vỡ lớp măng ngoăi vă giải phóng lipopolysaccharide [18] Sự thay đổitính thấm của măng tế băo vi khuđ̉n dẫn đến sự rò rỉ thănh phđ̀n trong tế băo

vă sau đó lă ly giải tế băo vă chết tế băo, vì vậy chúng có tâc dụng diệt khuđ̉n[8] [11] Colistin cũng có khả năng gắn kết vă trung hòa phđn tửlipopolysaccharide của vi khuđ̉n, đđy chính lă hoạt tính khâng nội độc tố của

thuốc [7] Colistin có phổ kháng khuẩn hẹp mà hầu như chỉ có tác dụng vớicác vi khuẩn Gram âm thường gặp Quan trọng nhất là colistin có thể chống

lại những vi khuẩn Gram âm đa kháng như A baumannii, P aeruginosa, và

K pneumoniae trong điều kiện thực nghiệm Colistin cũng có hoạt tính chống

lại những vi khuẩn khác như Stenotrophomonas maltophilia, E coli,

Salmonella species, Shigella species, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, và Legionella pneumophila [7].

CHƯƠNG 6: Cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn

 Một số cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung:

 Đề kháng sinh thông qua các enzym:

Kháng carbapenem: Các vi khuẩn Gram âm đa kháng là có sự xuất hiệncác enzym kháng thuốc ESBL, KPC, hay nhóm enzym MBLs

Kháng aminoside: Do enzym làm biến đổi nhóm Aminoglycoside

 Đề kháng sinh qua thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn

Kháng carbapenem: Do thay đổi protein, porin, bơm đẩy ngược ở màng

tế bào

 Kháng kháng sinh thông qua thay đổi đích tác động

Kháng quinolon: Do đột biến gen gyrA, parC, mexR

 Cơ chế đề kháng colistin chủ yếu là do sự thay đổi tính thấm của màngLipopolysarcarid (LPS) của tế bào vi khuẩn, là đích tác động chủ yếu của

colistin Đây là cơ chế kháng của các loài vi khuẩn đặc trưng như E coli, K.

pneumoniae, và P aeruginosa [19] Một cách khác gây nên kháng colistin là do

sự giảm hoạt động của các kênh protein hoặc các kênh calci, magie ở màngngoài tế bào vi khuẩn hoạt động của những kênh này lại phụ thuộc pH và nồng

độ các ion môi trường [9]

Hình 1.3 Cơ chế kháng colistin của gen mcr-1 [19]

CHƯƠNG 7: Tình trạng kháng colistin

Gần đây theo một số nghiên cứu, hình thái học và cấu trúc tế bào củanhững vi khuẩn kháng colistin được phát hiện là rất khác so với những tế bàonhạy cảm colistin Một nghiên cứu dựa trên kính hiển vi lực nguyên tử đượcthực hiện trên những chủng kháng colistin và cả chủng nhạy colistin ở nhữnggiai đoạn sinh trưởng khác nhau So với những vi khuẩn kháng colistin cóhình cầu ở giai đoạn tăng sinh (theo hàm logarit) sớm và giữa, những tế bàonhạy cảm với thuốc được phát hiện có dạng trực khuẩn hình que, với sự hiệndiện của tiêm mao ở tất cả các giai đoạn Số lượng và độ dài của tiêm mao ởnhững tế bào vi khuẩn kháng colistin giảm nhiều và đây có thể là lý do việcnhững tế bào này kháng colistin liên quan đến việc chúng không có khả năngtạo được biofilm Hơn nữa, những tế bào kháng colistin đa dạng về cấu trúchơn cũng như có kết cấu bề mặt trơn láng hơn Trong giai đoạn ổn định,những tế bào ở dạng L-form được bắt gặp nhiều hơn ở nhóm nhạy cảm vớithuốc, trong nhóm kháng thuốc lại cho thấy những tế bào đa hình thái hơntrong giai đoạn này Điều đáng chú ý là mức độ hủy hoại màng ngoài vikhuẩn sau điều trị bằng colistin là tương tự ở cả tế bào nhạy và kháng thuốc,điều này cho thấy khả năng những tế bào kháng colistin vẫn duy trì sự tươngtác với lớp màng ngoài Những phát hiện này đã minh chứng rằng những

nghiên cứu chuyên biệt nhằm xem xét những cơ chế gen đằng sau sự khácbiệt về hình thái học và cấu trúc tế bào rất cần được thực hiện, để qua đó ta cóthể hiểu được nhiều hơn về sự đề kháng đối với colistin [20].

Như đã đề cập, ở những vi khuẩn đa kháng như E coli, K pneumoniae,

A baumannii và P aeruginosa sự cần thiết của những điều trị thay thế đã dẫn

đến sự trở lại của colistin Mặc dù colistin cho thấy hiệu quả trong điều trịnhiều loại nhiễm trùng khác nhau [8] nhưng việc sử dụng colistin nhằm điềutrị nhiễm trùng gây ra do bốn tác nhân trên gặp khó khăn bởi sự xuất hiện tìnhtrạng kháng thuốc Sự gia tăng đề kháng colistin là một vấn đề rất đáng ngại.Colistin là lựa chọn điều trị cuối cùng đối với những tác nhân gây bệnh này,việc kháng thuốc có thể rất nguy hiểm cho bệnh nhân nếu không còn lựa chọnđiều trị nào khác

Nhu cầu về kháng sinh thay thế trong điều trị E coli, K pneumoniae

ngày càng gia tăng cùng với sự gia tăng của men carbapenemases, men lactamase phổ rộng (ESBL) và men metallo - beta- lactamase (MBL) sản sinh

β-ra từ những chủng khác nhau của những loại vi khuẩn này Mặc dù những báocáo về sự đề kháng colistin của nhóm tác nhân này vẫn còn thưa thớt nhưngchúng vẫn rất có ý nghĩa, bởi những lựa chọn điều trị hiện tại và trong tương

lai đối với E coli, K pneumoniae sinh ESBL và MBL rất hạn chế.

Trong một nghiên cứu tiến hành trên 18 mẫu phân lập được K.

pneumoniae kháng colistin (MIC > 8 mg/L) từ 13 bệnh nhân trong hơn 16

tháng tại một trung tâm chăm sóc đặc biệt ở Hy Lạp [21] Tất cả những bệnhnhân này đều có thời gian sử dụng colistin (trung bình 27 ngày) và nhập việnđiều trị (69 ngày) kéo dài, điều này có thể đóng góp vào việc gia tăng khángthuốc Gần đây nhất, 6,8% (15 trong số 221 mẫu phân lập) [22] và 27,3% (6

trong số 22 mẫu phân lập) [23] mẫu K pneumoniae phân lập được đã cho

thấy kháng colistin lần lượt tại miền nam Hàn Quốc và Australia Cho thấy

tình trạng sử dụng kháng sinh này kéo dài là một điều kiện phát sinh tất yếucác chủng vi khuẩn kháng thuốc.

Gen mcr-1 kháng colistin lần đầu tiên được phát hiện nằm trên plasmid

pHNSHP45 theo bài cáo của Liu và cộng sự [3] Plasmid pHNSHP45 có kíchthước là 64015bp với tỉ lệ GC trung bình chiếm 43%, gồm 60 khung đọc mở

và có khung IncI2 (kích thước khoảng 50 kb) kiểu điển hình mã hóa gen sao

chép, chuyển ngang, duy trì và ổn định các chức năng Gen mcr-1 có kích

thước dài 1626bp với tỉ lệ GC chiếm 49%, thuộc nhóm enzyme vận chuyển

phosphoethanolamine giúp gắn nhóm phosphoethanolamine vào lipid A làm

thay đổi cấu trúc màng vi khuẩn [24] Hiện nay các vi khuẩn mang gen mcr-1

này đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học là do các vi khuẩnmang gen này có khả năng đề kháng với tất cả các loại kháng sinh hiện có vàkhả năng lan truyền không chỉ giới hạn trong một loài mà còn lan truyền mộtcách nhanh chóng thông qua các plasmid sang các loài vi khuẩn khác Đây làmột nguy cơ quan trọng tác động tới sức khỏe con người và làm tăng nguy cơ

lan truyền của vi khuẩn mang gen mcr-1 ở trong cộng đồng Sự xuất hiện của

các vi khuẩn mang gen kháng thuốc này báo hiệu sự mở đầu của một giaiđoạn mới về tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh trên thế giới

Theo báo cáo mới nhất tại Đan Mạch năm 2016, số lượng các chủng E.

coli có gen mcr-1 trong các chủng kháng kháng sinh sinh ESBL và có gen AmpC trong bộ gen là 3% với bệnh phẩm phân lập từ máu người và trong thịt

gà [24] Tại bệnh viện các trường Đại học ở Hy Lạp đã phân lập và thửnghiệm độ nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh với các chủng vi khuẩn khác

nhau, trong đó có E coli với mức độ kháng các kháng sinh trên thử nghiệm

nhạy cảm kháng sinh là kháng impenem 55%, meropenem 25%, doripenem30%, colistin 15%, netilmicin 25%, tigecyclin 25% Tại Đức là một trongnhững nước sử dụng colistin cao nhất ở Châu Âu, các nhà khoa học đã phát

hiện ra mcr-1 ở các chủng E coli phân lập từ lợn và từ vết thương của một

người bị nhiễm trùng kháng carbapenem

CHƯƠNG 8: Tình trạng sử dụng kháng sinh colistin trên lâm sàng và trong chăn nuôi

Tính đến cuối năm 2015, số lượng tiêu thụ của colistin trong chăn nuôiđã lên đến 11,942 tấn (tương ứng với 229,5 triệu USD) Nếu tình hình khôngđược kiểm soát, rất có thể đến cuối năm 2021, con số này sẽ còn cao lên đếnmức báo động 16,500 tấn với tỉ lệ gia tăng hằng năm là 4,75% [3] Trước đây,chúng ta cũng đã từng lo lắng về việc đề kháng kháng sinh như MRSA,VRSA Các nhà khoa học đã cảnh báo về việc vancomycin sẽ trở nên khôngcòn tác dụng đối với các vi khuẩn kháng thuốc Tuy nhiên, thực tế trong vòng

15 năm cho thấy, chỉ có 14 ca trên toàn nước Mỹ là không chữa được với các

vi khuẩn kháng vancomycin Song tình hình hiện tại lại là một cục diện hoàntoàn khác, colistin đã bị lạm dụng quá nhiều trong chăn nuôi, điều này khiếncho việc xuất hiện và lan truyền gen đề kháng từ động vật sang người bị mấtkiểm soát và không hề được chú ý Sự phát triển của các vi khuẩn có khảnăng đề kháng tất cả các loại kháng sinh là hoàn toàn có thể xảy ra, vấn đề chỉnằm ở thời gian Với việc chưa kiểm soát chặt chẽ được lượng thuốc khángsinh sử dụng trong chăn nuôi, Việt Nam cũng không nằm ngoài cục diện này.Năm 2015, theo thống kê có trên 17 loại kháng sinh được sử dụng tại cáctrang trại chăn nuôi Trong đó, các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến lànorfloxacin, tylosin, gentamycin, doxycyclin, tiamulin, colistin vàenrofloxacin

CHƯƠNG 9: Các nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về tình hình

kháng colistin ở E coli

CHƯƠNG 10: Trên thế giới

Đối với kháng colistin ở vi khuẩn Gram âm gây bệnh trên người, y vănchỉ ghi nhận cơ chế đề kháng do đột biến gen trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn.Tuy nhiên, trong một nghiên cứu mới được công bố ngày 18/11/2015 trên tạpchí Truyền nhiễm của Lancet, Yi-Yun Liu, Yang Wang và cộng sự đã công

bố một gen mcr-1 trên plasmid có thể lan truyền gen kháng colistin trên người

và động vật ở Quảng Đông, Trung Quốc Gen mcr-1 được phát hiện ở vi

khuẩn Gram âm từ 15% mẫu thịt sống từ chợ, 21% động vật ở lò mổ trongnăm 2011-2014, và 1% ở các bệnh nhân nội trú bị các bệnh nhiễm trùng Gen

mcr-1 giống với gen phosphoethanolamine transferase, có trong một số vi

khuẩn sinh và vi khuẩn sống trong môi trường [3] Gần đây nhất tại Mỹ, Bộ

Quốc phòng Mỹ thông báo đã xác định được gen kháng colistin đầu tiên mcr-1 ở E coli trên người Ngoài ra họ còn tìm kiếm được gen kháng colistin này của E coli trên các mẫu thức ăn gia súc, thịt, và một mẫu duy nhất từ ruột lợn

[4] Tại Brazil, theo một nghiên cứu mới nhất được công bố ngày 8/8/2016

cũng đã phát hiện ca lâm sàng đầu tiên nhiễm E coli có mang gen mcr-1 [5].

Ở châu Âu đã đưa ra các khuyến cáo về tình trạng gia tăng gen kháng colistin

mcr-1 do việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi trong thức ăn chăn nuôi

và vai trò của việc sàng lọc gen mcr-1 trên các mẫu bệnh phẩm từ người cũng

như các mẫu từ môi trường

CHƯƠNG 11: Tại Việt Nam

Hiện nay còn thiêu những nghiên cứu được thực hiện về việc sàng lọc gen

kháng colistin mcr-1 của E coli trên mẫu ở người cũng như mẫu phân động vật

và xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng mang gen đó

CHƯƠNG 12: Các kỹ thuật kháng sinh đồ [27]

CHƯƠNG 13: Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán

Nguyên lý: Kháng sinh trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào đĩa thạchMueller - Hinton đã được ria cấy các chủng vi khuẩn cần thử nghiệm Mức độnhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh sẽ được biểu hiện bằng đường kính cácvòng ức chế vi khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh

 Ưu điểm: Giá thành rẻ, đơn giản và dễ thực hiện

 Nhược điểm: Kĩ thuật này chỉ phát hiện được mức độ nhạy cảm với nồng

độ kháng sinh đã biết trước và chỉ có tính chất định tính

CHƯƠNG 14: Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn (MIC)

Kĩ thuật kháng sinh hòa đều trong môi trường lỏng hoặc môi trường thạch

Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trong cácống canh thang hoặc trên các đĩa thạch Mueller-Hinton có nồng độ kháng sinhkhác nhau theo tiêu chuẩn của CLSI và được ủ ở 37⁰C qua đêm (khoảng 18giờ) Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác địnhkhi quan sát bằng mắt thường với ống canh thang là sự làm đục môi trườngcủa vi khuẩn, với đĩa thạch là sự xuất hiện khuẩn lạc

 Ưu điểm: Kĩ thuật được chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng độkháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả giúp cácbác sỹ lựa chọn và tính toán liều kháng sinh cho bệnh nhân

 Nhược điểm: Giá thành cao, phức tạp, đòi hỏi trang thiết bị và cán bộ cókinh nghiệm để thực hiện

Kĩ thuật thanh giấy E-test

Nguyên lý: E-test kết hợp nguyên lý của cả hai phương pháp khoanhgiấy khuếch tán và kháng sinh đồ pha loãng

 Ưu điểm: Đơn giản dễ thực hiện, cho được cả kết quả MIC cụ thể

 Nhược điểm: Kết quả bị ảnh hưởng bởi ngoại cảnh như môi trường thạch

kĩ thuật nuôi cấy

Sử dụng hệ thống máy tự động

Nguyên lý: Giống như nguyên lý của kháng sinh đồ pha loãng nhưngđược cài đặt trong hệ thống máy tự động và đọc kết quả sau mỗi 15 phút, kếtquả cuối cùng sẽ đọc sau 18-24 giờ

 Ưu điểm: Tiện lợi, cho kết quả có độ chính xác cao

 Nhược điểm: Chi phí cao do cần dùng trang thiết bị, sinh phẩm hóa chấtđắt tiền, cần có những người được đào tạo mới có thể sử dụng máy

CHƯƠNG 15: Xác định gen liên quan đến kháng colistin, mcr-1 của E.

coli bằng PCR [28]

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) do Karl Mullis và cộng

sự phát minh ra năm 1985 là phương pháp in vitro để nhân lên một đoạnDNA nào đó, có độ nhạy rất cao, mà chỉ cần một số lượng mẫu ban đầu hạnchế

Kĩ thuật này dựa trên nguyên lý tất cả các DNA polymerase khi hoạtđộng tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn đều cần sự hiện diện của nhữngmồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA có độ dài khoảng từ 18-40nucleotit, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNApolymerase sẽ dùng dNTPs nối dài mồi hình thành mạch DNA mới bổ sungvới DNA khuôn (tùy vào mục đích nghiên cứu, sẽ lựa chọn mồi riêng để cóđược đoạn DNA cần tổng hợp) Nhờ đó, từ một khối lượng mẫu ban đầu hạnchế tạo ra đủ lượng DNA cần thiết có thể quan sát được dưới ánh sáng UVsau khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm

3 bước: Giai đoạn biến tính tách đôi sợi DNA (denaturation), giai đoạn bắtcặp (annealing), giai đoạn kéo dài (elongation – extension)

Hình 1.4 Các bước phản ứng xảy ra trong chu trình nhiệt

[thermofisher.com]

 Ứng dụng của kỹ thuật PCR

Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân

tử với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm visinh vật gây bệnh như: vân tay di truyền, chẩn đoán bệnh di truyền, kiểm trahuyết thống, tách dòng gen, kiểm tra đột biến điểm, phân tích các mẫu DNAcổ, xác định kiểu gen của các đột biến …

 Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật PCR

 Ưu điểm:

- Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đạiđược một trình tự

- Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (được thực hiện trong ốngnghiệm nhỏ plastic gồm các thành phần tối thiểu được sử dụngđồng thời).

- Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cần cao

 Nhược điểm

- Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho đoạn cần phải khuếchđại Để có được đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tựnucleotit cần khuếch đại

- Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb

- Khả năng ngoại nhiễm lớn

Có nhiều phương pháp PCR được ứng dụng trên thực tế như: PCRthường, Realtime PCR, RT PCR, Nested PCR… tùy vào mục địch và đốitượng nghiên cứu để chọn phương pháp thù hợp Trong các nghiên cứu được

tiến hành để tìm hiểu về gen mcr-1 các tác giả chỉ tập trung vào hai phương

pháp PCR chính là PCR thường và Realtime PCR [3],[4],[5],[24] Tuy nhiênphương pháp PCR thường được sử dụng nhiều hơn do tính đặc hiệu của phảnứng đã được đánh giá [3]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và địa diểm nghiên cứu

Các chủng E coli được nuôi cấy, phân lập từ mẫu phân lợn thu thập tại

Ba Vì – Hà Nội

Các mẫu phân được lấy từ 48 hộ gia đình, thuộc 11 trên 31 xã tại huyện

Ba Vì – Hà Nội, theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên

2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

Theo công thức ước lượng mẫu dựa trên một tỉ lệ cho trước

∆: Độ chính xác tuyệt đối mong muốn (sai số chọn ∆ = 0,02)

Với tỉ lệ phát hiện chủng có gen mcr-1 là 20,6 % trong nghiên cứu của

Liu và cộng sự trên mẫu động vật [3], chúng tôi ước tính cỡ mẫu cần thiết

khoảng 30 - 40 chủng mang gen mcr-1, tương đương cỡ mẫu khoảng 200

mẫu, vì vậy chúng tôi tiến hành lấy 200 mẫu phân lợn, tại 48 hộ gia đình chănnuôi thộc 11 xã tại Ba Vì- Hà Nội, năm 2016,

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu thu thập và bảo quản mẫu phân

 Ống cryotube sạch loại 2ml có sẵn Glycerol (Thermoscientific)

 Hộp để mẫu lạnh có chia ngăn và đánh số thứ tự theo hàng và cột

2.3.2 Vật liệu nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

 Thạch: Thường (NA), MacConkey (OXOID)

 Que cấy: Ăng kim loại hoặc ăng nhựa (COPAN)

 Tủ ấm 37⁰C môi trường hiếu kị khí tùy tiện (SANYO)

 Máy MALDI-TOF (hãng Bruker), hóa chất matrix (HCCG)

2.3.3 Vật liệu làm kháng sinh đồ

 Môi trường Mueller Hinton (25ml/đĩa 90mm) (OXOID)

 Etest colistin (Bio merieux)

 Dung dịch nước muối đẳng trương (NaCl 0.9%)

 Dụng cụ pha và máy đo độ đục McFarland (Bio merieux)

2.3.4 Vật liệu tách DNA vi khuẩn

 Ống Eppendorf (Epp) loại 1,5ml (Eppendorf)

 Pippette (Eppendorf)

 Các loại đầu côn (Eppendorf, Thermo scientific)

 Máy ủ nhiệt (Bio Lab)

 Nước sinh học phân tử

2.3.5 Vật liệu cho PCR

 Bộ Primer cho gen nghiên cứu [3] (Sigma)

mcr-1 CLR5’-F CGGTCAGTCCGTTTGTTC

 Các thành phần của phản ứng PCR: Taq polymerase, Buffer, dNTP

 Agarose dùng điện di (Invitrogen)

 Gel red (Biotium)

 Máy luân nhiệt PCR (ABI-Proflex)

 Máy điện di (Bio rad)

2.4 Kĩ thuật nghiên cứu

2.4.1 Kĩ thuật thu thập mẫu phân [27]

Thu thập 1 - 2 gam phân rắn hoặc 2 ml phân lỏng từ ngoáy hậu mônlợn bằng tăm bông cho vào lọ sạch không có chất khử trùng hoặc tẩy trùng

có chất vận chuyển là Glycerol, vặn chặt nắp tránh bị rò rỉ Mỗi con lợn chỉlấy duy nhất một mẫu phân Mẫu phân được bảo quản ngay trong môitrường vận chuyển hoặc phích lạnh

2.4.2 Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn [25]

Cấy phân lần 1: Cấy trên môi trường thạch MAC (mục đích: ức chế cầukhuẩn Gram dương) và giữ trong tủ ấm 37°C trong 24 giờ Kết quả thu đượckhuẩn lạc của vi khuẩn Gram âm

Cấy phân lần 2: Nhặt khuẩn lạc riêng rẽ (dòng vi khuẩn thuần) và dựa

trên tính chất khuẩn lạc của E coli trên đĩa thạch MAC, cấy chuyển lên môi

trường thạch thường (cấy trên 2 đĩa thạch thường: 1 đĩa đem định danh vikhuẩn, 1 đĩa dùng để giữ chủng) giữ trong tủ ấm 37°C trong 24 giờ Kết quảthu được đĩa khuẩn lạc thuần và chủng cần giữ Giữ chủng trong môi trườngBHI có 10% glycerol ở nhiệt độ -80°C

Định danh nhanh vi khuẩn bằng máy MALDI - TOF:

 Định danh bằng máy MALDI - TOF (tại khoa xét nghiệm BV BệnhNhiệt Đới Trung ương)

 Các bước tiến hành: Nuôi cấy được khuẩn lạc thuần, sau đó ria khuẩnlạc vào một plate với độ dày vừa nhìn thấy, nhỏ matrix, quan sát khichất nền khô thì đưa plate vào buồng chân không, chất nền và các phân

tử mẫu được gắn với một mạch laser, chúng được hấp thu và ion hóa